CENTRO DE ESTUDIANTES DE VETERINARIA UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES

FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS

VIROLOGÍA
GUÍA DE LECTURA

2011
SECRETARIA DE PUBLICACIONES
 Indice

Página

¿Qué es un virus?........................................................................................................................... 1

Historia de la Virología.................................................................................................................. 2

Taxonomía de los virus....................................................................................................... ........... 8

Estructura de los virus.................................................................................................................... 32

Genética viral............................................................................................................... .................. 49

Ciclo infeccioso............................................................................................................. ................ 64

Efectos de los virus sobre la función celular.................................................................................. 105

Virus y Apoptosis............................................................................................................................113

Virulencia....................................................................................................................................... 117

Respuesta inmune específica e inespecífica a las infecciones virales........................................... 121

Tipos de interacción entre virus y células...................................................................................... 139

Antivirales.................................................................................................................. .....................154

Evolución de las enfermedades virales.......................................................................................... 163

Esterilidad, Desinfección, Bioseguridad.........................................................................................167

Cultivos Celulares...........................................................................................................................176
..
Aislamiento.................................................................................................................. ...................180

Cuantificación............................................................................................................... ..................186

Microscopia Electrónica.................................................................................................................189

PCR.......................................................................................................................... .......................195
 ¿Qué es un virus?

- Un virus es un parásito intracelular obligatorio, muy pequeño e infeccioso,

constituido por proteinas, ácidos nucleicos y, a veces, fosfolípidos.

- El ácido nucleico, que puede ser RNA o DNA, constituye el genoma viral.

- Dentro de una célula huésped apropiada, el genoma viral es replicado hasta obtener
múltiples copias del mismo. A su vez, el genoma viral dirige la síntesis de las
proteinas virales utilizando la maquinaria biosintética de la célula.

- La progenie viral se forma a partir del ensamblaje de las proteinas y ácidos

nucleicos virales.

- La progenie viral es el vehículo para la transmisión del genoma viral a una nueva
célula o animal, donde su desensamblaje inicia un nuevo ciclo infeccioso.

Los virus son mucho más simples que los microorganismos más pequeños y carecen
de de los sistemas generadores de energía y biosintéticos necesarios para una vida
independiente. Pero no por ello los virus son los agentes más sencillos. Por ejemplo,
los viroides son moléculas de RNA que infectan (y enferman) a una variedad de
plantas de importancia económica. Los priones son simples moléculas de proteinas
capaces de inducir enfermedades desvastadoras en los animales y el hombre.

1
 Historia de la Virología

La caracterización de los virus mencionada arriba necesitó décadas de

investigación. En rigor, hasta la Segunda Guerra Mundial sólo sabiamos que los virus
eran agentes infecciosos muy pequeños: producían enfermedad y atravesaban filtros que
retenían a las bacterias. Inicialmente, el término virus se empleaba con cierta
ambigüedad para referirse a distintos agentes, pero hacia el final del primer cuarto del
siglo XX su uso se limitó a los agentes filtrables.
Para apreciar el contexto en que surge el concepto de virus debemos
retrotraernos a los años en que se define el concepto mismo de infecciosidad. Hacia el
último cuarto del siglo XIX ocurrieron tres avances seminales en la historia de la
Microbiología: 1) Louis Pasteur demuestra que la generación espontánea de organismos
no existe, 2) Robert Koch valida la teoría de los gérmenes como agentes causales de
enfermedad, 3) Joseph Lister obtiene un cultivo puro de bacterias. Estos conceptos se
volvieron el paradigma dominante de la microbiología médica hacia fines de siglo y, al
mismo tiempo, establecieron una metodología experimental a emplear en todas las
situaciones: el agente debía aislarse de las lesiones, cultivarse en estado puro y
reproducir la enfermedad luego de la inoculación experimental.
En 1892, Dimitri Ivanowski publica la primera evidencia de un agente
infeccioso filtrable. Con un extracto de hojas de tabaco enfermas pasado por un filtro de
porcelana (que retiene la mayoría de las bacterias y hongos), Ivanoswki pudo transmitir
la enfermedad a plantas sanas. Uno de los postulados de Koch (que el agente infeccioso
debe ser aislado en cultivo puro) no pudo ser satisfecho por el trabajo de Ivanowski y
este opta por pensar que algo falla en sus métodos1. Siete años más tarde, Martinus
Beijerinck repite los experimentos de Ivanowski y los extiende observando que el
agente puede reproducirse en tejido vivo pero no en medios artificiales como los
utilizados con bacterias. Denomina al agente contagium vivum fluidum. Con ello
comienza un largo debate acerca de la naturaleza del agente: no era microscópicamente
observable; era muy pequeño para ser una bacteria. El hecho que se reproduzca (en las
hojas de tabaco) excluía la posibilidad de que se trate de una toxina.
El desconocimiento de su naturaleza no impidió el hallazgo de nuevos agentes
filtrables en un breve periodo. Así se descubre el agente de la fiebre aftosa que causa
enfermedad pustular en el ganado (Loeffler y Frosch) y, poco después (1901), Walter
Reed reporta el primer agente filtrable que causa enfermedad en humanos, el virus de la
fiebre amarilla. Diez años después Francis Peyton Rous demuestra que ciertos agentes
filtrables causan sarcomas en las gallinas y en 1915 Frederick Twort descubre
accidentalmente agentes filtrables capaces de matar bacterias (bacteriófagos). Así, en el
término de 15 años sabemos que los agentes filtrables infectan muchos organismos
diferentes (eucariotas y procariotas), que algunos son transmitidos por artrópodos
(fiebre amarilla), y que otros pueden causar tumores (virus del sarcoma de Rous). Para
la década del ´30, el término “virus” comenzaba a reemplazar al de agentes filtrables,
pero su naturaleza seguía siendo un misterio.
Fue un virus de plantas, el virus del mosaico del tabaco (TMV) objeto de estudio
de Ivanowski, quién jugó un rol decisivo en la determinación de la naturaleza y
propiedades de los virus. A principios del siglo XX se desarrollaron las técnicas para
purificar enzimas. Los virus purificados podían moverse en un campo eléctrico de
manera similar que las enzimas. Cuando el virus era inoculado en conejos, se producían
1
Curiosamente, casi un siglo más tarde, el mismo apego a los paradigmas dominantes sembró de dudas
los trabajos que llevaron al descubrimiento de los priones por Prusiner y sus colaboradores.

2
anticuerpos que neutralizaban su infectividad en las plantas. Estos hallazgos apuntaban
a que los virus eran de naturaleza proteica. Trabajos con bacteriófagos demuestran la
presencia de ácidos nucleicos. Esta fue la primera sugerencia de la naturaleza
nucleoproteica de los virus2.
En 1935, Wendell Stanley cristaliza al TMV de la misma manera que los
químicos cristalizaban proteinas. Los cristales forman bastoncitos de diámetro
constante. En 1941 la forma de bastón del virus es confirmada mediante microscopía
electrónica. Al promediar el siglo XX sabíamos que el TMV estaba representado por
partículas formadas por subunidades que se ensamblan para originar los bastoncitos de
las electromicrografías. Químicamente, está compuesto por proteinas y RNA. Es más,
los bastoncitos podían ser desagregados en subunidades proteicas y RNA a partir de los
cuales podía reconstituirse virus infeccioso. Se debieron esperar algunos años más para
comprender con mayor exactitud como proteinas y RNA se ensamblan para constituir
una partícula viral.
Para entonces se tenía en claro que el TMV, como todas las entidades vivas y
replicativas, podía mutar y que por lo tanto tenía material genético. Simultaneamente,
los experimentos de Avery con bacterias y de Hershey-Chase con fagos habían
finalmente demostrado que la información genética reside en el DNA de los
organismos. En 1953, Watson y Crick resuelven la estructura atómica del DNA. Fue en
la década del ´60 (la misma en que se descifra el código genético, se reconoce al
ribosoma como fábrica de proteinas y al RNA como el mensajero intermediadrio)
cuando se demuestra que la información genética del TMV reside en el RNA viral: no
sólo el DNA podía servir como depósito de la información genética. Quedaba claro que
los virus podían almacenar la información genética en DNA (virus a DNA) o en RNA
(virus a RNA).

En 1949, Enders, Weller y Robbins desarrollan un método para replicar virus in

vitro. Utilizan tejidos humanos para crecer virus de la poliomelitis y con ello
revolucionan la forma con que los virólogos aislan y analizan las propiedades de los
virus. El requerimiento de los virus de células vivas para replicarse los vuelve parásitos
intracelulares obligatorios y así los distingue de la mayoría de los agentes infecciosos.
Desde 1950 hasta 1975 se producen avances extraordinarios en el estudio de los
bacteriófagos. Entre otras cosas se analiza el efecto de la infección en la síntesis
macromolecular de las células, observándose que el virus codifica nueva información
expresada como proteinas en la célula infectada, y que el virus puede existir en dos
estados, lítico y lisogénico.

La segunda mitad del siglo XX y con el impulso dado por los estudios en fagos,
se produce un avance expectacular en el campo de los virus, a tal punto que la Virología
emerge como una disciplina por derecho propio. La cantidad de nuevos virus aislados
(asociados o no a entidades previamente reconocidas) aumenta exponencialmente y se
observa gran variabilidad en su tamaño, resistencia a agentes físicos y químicos y el tipo
de enfermedades que producen. El empleo del microscopio electrónico demuestra que,
pese a las diferencias de tamaño, los virus caen en unas pocas categorías morfológicas.
Los trabajos de Enders y col disparan el desarrollo de los cultivos celulares para
la propagación de virus animales. Para cuando hacen su aparición las técnicas de
Biología Molecular, los virólogos cuentan ya con sofisticados métodos de cultivo
celular que les permiten analizar el ciclo replicativo de los virus en las células a nivel
2
Tengamos en cuenta que aún se desconocía que los ácidos nucleicos constituían el material hereditario
de los organismos.

3
molecular, cuantificar precisamente las preparaciones virales, e incluso elaborar
vacunas con mayor eficiencia.

Los biólogos celulares tomaron pronto nota de la relativa simplicidad de los

virus y de su potencial para el análisis de las funciones celulares. Muchos avances en
Biología Celular provinieron de estudios con virus animales: el splicing del RNA, los
oncogenes, los factores de transcripción, la transcripción reversa, el tráfico
macromolecular endocelular, la fusión de membranas biológicas, la replicación del
DNA, los enhancers, etc. El desarrollo de la Virología estuvo tempranamente asociado
al de la Inmunología y ambas ramas de la ciencia nos han iluminado en la descripción
del complejo escenario que se monta durante la infección de un animal así como de las
estrategias para prevenirla. Aunque los cultivos celulares permitieron examinar las
interacciones virus-célula, su relativa simplicidad no pudo reemplazar a los modelos
animales para el análisis de las interacciones entre los virus y los tejidos y sistemas del
huésped, especialmente el sistema inmune. Los virus han tenido mucho que ver con los
grandes avances en el campo de la respuesta inmune mediada por células T. Fue un
virólogo, F. Burnet, quien formuló la teoría de la tolerancia inmunológica. Jack Miller,
trabajando con retrovirus descubrió que la ausencia del timo al nacimiento lleva a
ciertos tipos de inmunosupresión. En 1973, Rolf Zinkernagel y Peter Doherty,
trabajando con el virus de la coriomeningitis linfocitaria murina (LCMV), postulan la
restricción en el reconocimiento antigénico por células T impuesta por las moléculas de
histocompatibilidad.
La Virología se encuentra en perpetuo movimiento. El cambio de milenio nos
encuentra con resonantes éxitos: e.g erradicación deliberada del primer virus humano
(viruela; último caso reportado, Somalia, 1977). Y con desafíos enormes: en 1999 se
reportaron 5,8 millones de nuevas personas infectadas con el virus del SIDA (HIV).

4
 Hallazgos más importantes en el campo de la Virología

1798 Desarrollo de la vacuna contra la viruela E. Jenner

1885 Producción de la vacuna contra la rabia L. Pasteur.

1892 Transmisión de una enfermedad viral en D. Ivanowski

Plantas.
1898 Los virus se reconocen como agentes M.W. Beijerinck
responsables de enfermedades de las F. Loeffler and P. Frosch
plantas (TMV) y los animales (aftosa).

1908 Identificación de un virus causante de la V. Ellerman and O. Bang.

leucemia aviar.

1911 Identificación de un virus causante del P. Rous

sarcoma aviar.

1915 Descubrimiento de los bacteriófagos. F.W. Twort, F. D´Hérelle.

1933 Identificación de un virus causante de R.E. Shope.

cáncer en mamíferos. (papiloma del
conejo).

Aislamiento del virus de la influenza W. Smith, C.H. Andrews, and P. Laidlaw.

humana.

1937 Reconocimiento de la naturaleza F.C. Bawden, N.W. Pirie.

nucleoproteica de un virus de las plantas.

1938 Datos comparativos de los tamaños de los W.J. Elford, R. Doerr, C. Hollauer.
virus.

1939 Visualización electromicroscópica de un G.A. Kausche et al.

virus. (TMV).

1940 Elucidación del ciclo replicativo de un M. Delbruck

fago.

1942 Descubrimiento de un virus RNA J.J. Bittner

tumorigénico para mamíferos (MMTV)

1949 Desarrollo del cultivo de células para el J.F. Enders et al.

crecimiento del virus polio.

1950 Demostración de la inducción del fago A. Lwoff et al.

lisogénico.

1952 Demostración de que el DNA de fago es A.D. Hershey et al.

infeccioso.

1955 Cristalización de polivirus. F.L. Schaffer and C.E. Schwerdt.

1956 Demostración de la infectividad de RNA H. Fraenkel-Conrat and R.C. Williams.

5
1958 Demostración de la inducción química de A. Gierer and K.W Mundry
mutaciones (TMV)

1959 Descubrimiento de los parvovirus. L. Kilham and L. Olivier

1960 Establecimiento de la secuencia de Tsugita et al.

aminoácidos de una proteina de cápside
(TMV)

1962 Establecimiento de la estructura icosaédrica D. Kaspar and A. Klug

de muchos virus.

1963 Se descubren los virus RNA de doble P.J. Gomatos and I. Tamm
cadena (reovirus).

1967 Establecimiento de la naturaleza de los T.O. Diener W. Raymer

viroides.

1968 Demostración de la segmentación del P.H. Duesberg

genoma del virus de la influenza.

1970 Demostración de la presencia de un oncogen P.H. Duesberg and P.K. Vogt

en el virus del sarcoma de Rous.

Descubrimiento de la transcriptasa reversa H. M. Temin, S. Mizutani, D.Baltimore

1973 Demostración de la transducción estable de E.M. Scolnick et al.

información viral de la célula a un virus.

1976 Se demuestra que un oncogen viral (src) J.M. Bishop.

tiene su contrapartida en las células.

Determinación de la secuencia nucleotídica W. Fiers et al.

de un virus (fago)

1977 Se descubre el splicing de RNA en L.T. Chow et al.

adenovirus.

1978 Secuencia de DNA de un virus animal W.Fiers, V. Reddy.

(SV40).

1980 Descubrimiento de un retrovirus asociado B.J. Poiesz et al.

con leucemia en humanos.

Erradicación de un virus epidémico World Health Association

virulento de humanos (viruela).

1981 Fabricación de una vacuna por medio de D.G. Kleid et al.

tecnología de DNA recombinante (aftosa).

1982 El virus vaccinia utilizado para expresar D. Panicali, G.L. Smith

antígenos de otros patógenos.

1983 Aislamiento de un retrovirus humano F.Barre-Sinoussi et al

asociado con el SIDA

6
1985 Retrovirus como vectores para insertar H.Patten et al.
genes en la línea germinal.

Estructura cristalina de rinovirus con una M.G. Rossmann et al.

resolución de 3 A.

1986 Demostración de la estructura tipo viroide K.Wang et al, Chin et al.

del agente de la hepatitis delta del humano.

1983-
1988 Evolución del concepto de prión. S.B. Prusiner

7
 Taxonomía de los virus
En los sistemas biológicos complejos formados por numerosos miembros, se
impone necesariamente la clasificación. En Virología, inicialmente los sistemas de
clasificación se basaban en caracteristicas tales como las propiedades patogénicas de los
virus o el tropismo tisular. Por ejemplo, el grupo de los “virus de la hepatitis” comprendía
varios virus de propiedades bastante distintas que poseen la caracteristica común de
producir enfermedad hepática en humanos: virus de la hepatitis A, virus de la hepatitis B,
virus de la hepatitis C, virus de la fiebre amarilla, virus de la fiebre del Valle del Rift.
Actuamente, todos ellos pertenecen a grupos distintos de virus y la propiedad de inducir
hepatitis es una de las pocas características que comparten. Para la década del ’60 y ante
el descubrimiento exponencial de nuevos virus de animales, plantas y bacterias junto a la
necesidad creciente de un sistema universal de clasificación, surgen varios comités de
nomenclatura y clasificación de virus. Los mismos proponen un sistema de agrupamiento
en base a propiedades comunes que utiliza taxones clásicos como familias, subfamilias,
géneros y especies. En este año (2005) el Comité Internacional de Taxonomía de Virus
(ICTV) ha propuesto la existencia de, 3 órdenes, 73 familias, 9 subfamilias, 287 géneros
y 1938 especies de virus1. De las 73 familias, cerca de 24 incluyen patógenos del hombre
y los animales.
La Taxonomía, al igual que los virus, evolucionan. A medida que sabemos más de
los virus podemos refinar más la posición de un virus dentro de un grupo dado. Entonces
no es inusual que un virus que hace 5 o 10 años pertenecía a un género dado, hoy
pertenezca a otro. A medida que se perfeccionen los métodos para el análisis de los virus,
nuevos cambios son de esperar. Por otro lado, existen numerosos virus que aún no se han
estudiado profundamente y que por lo tanto no han sido asignados a ningún grupo en
particular (virus huérfanos).
La forma en que los virus son caracterizados con fines taxonómicos cambia
rapidamente. En el pasado, se utilizaban unas pocas caracteristicas tales como la
morfología del virión, el tamaño, la estabilidad frente al pH o la temperatura, y la
antigenicidad. Una técnica que tuvo gran impato en la clasificación de virus fue la tinción
negativa para el exámen por microscopía electrónica (Brenner and Horne, 1959). La
técnica permite determinar en una misma preparación el tamaño, forma, estructura de la
superficie, presencia de envoltura y simetría de los virus. La última adquisición de los
sistema taxonómicos fue la incorporación de los datos provenientes de la secuenciación
de los ácidos nucleicos virales. La secuenciación del genoma (total o parcial) se realiza
hoy al principio del proceso de tipificación de un virus, incluso con fines diagnósticos.
Actualmente se disponen de bases de datos accesibles vía Internet donde se encuentran
las secuencias genómicas de los principales miembros prototipos de todos los taxones. El
impacto de esta innovación fue tal, que la secuenciación de DNA o RNA viral ha
promovido por sí sola la creación de familias y/o géneros antes de que se dispongan de
otros datos acerca del virus. La secuenciación de los ácidos nucleicos derivó en el
conocimiento de la organización de los genomas y estrategias replicativas, ambas
caracteristicas que hoy en día también se utilizan con fines taxonómicos. Las secuencias
genómicas son cruciales para el avance de la taxonomía filogenética tal cual veremos
1
Ver la lista completa de virus con nombre en: www.virology.net/Big_Virology/BVViruslist.html

8
después. En la fig. 1 se resumen las propiedades de los virus utilizadas con fines
taxonómicos.

Figura 1: Propiedades de los virus utilizadas en taxonomía

Propiedades del virión

Morfología
Tamaño del virión
Forma del virión
Presencia de peplómeros
Presencia o ausencia de envoltura
Simetría y estructura de la cápside
Propiedades físicoquímicas
Masa del virión
Densidad de flotación
Coeficiente de sedimentación
Estabilidad al pH
Estabilidad térmica
Estabilidad ante cationes, solventes, detergentes, irradiación, etc
Genoma
Tipo de ácido nucleico
Tamaño del genoma
Presencia de una o dos cadenas
Linear o circular
Sentido
Número y tamaño de fragmentos
Secuencia de nucleótidos
Presencia de secuencias repetidas
Presencia de isomerización
Contenido en GC
Presencia o ausencia y tipo de cap 5`
Presencia o ausencia de proteina covalentemente unida a extremo 5`
Presencia o ausencia de polyA en 3`
Proteinas
Número, tamaño, y funciones de proteinas estructurales
Número, tamaño, y funciones de proteinas no estructurales
Secuencia de aminoácidos
Glicosilación, fosforilación, miristilación,
Mapeo de epitopes
Lípidos
Contenidos, tipo
Carbohidratos
Contenido, tipo
Organización del genoma y replicación
Organización del genoma
Estrategia replicativa
Número y posición de marcos de lectura
Características de la transcripción
Características de la traducción
Sitio de acumulación de proteinas virales
Sitio de ensamblaje del virión
Sitio y naturaleza de la maduración y liberación de viriones

Propiedades antigénicas
Relaciones serológicas,

9
Propiedades biológicas
Rango de huésped natural, tropismo
Modo de transmisión en la naturaleza
Relaciones con el vector
Distribución geográfica
Patogenicidad

Cuando se aisla un nuevo virus se siguen una serie de procedimientos generales

tendientes a ubicar la nueva entidad en alguno de los taxones conocidos. Uno de los
procedimientos es la tinción negativa para microscopía electrónica la cual brinda
rapidamente información acerca de la estructura del virión. En muchos casos, esto es
suficiente para asignar virus en algunas de las familias. De no serlo, puede recurrirse a la
determinación del ácido nucleico viral, la caracterización antigénica y/o a la
secuenciación parcial del genoma seguida de la comparación con secuencias existentes en
los bancos de datos. Estas comparaciones son útiles ya que permiten rapidamente asociar
la nueva entidad con grupos pre-establecidos de virus.

La clasificacion de Baltimore
En 1971, David Baltimore sugirió un esquema de clasificacion viral basado en la forma
en la cual un virus produce su mRNA durante la infeccion. Todos los virus deberan
producir un mRNA para la síntesis de proteinas pero la forma en que lo hacen dependera
del tipo de genoma viral ( tipo de acido nucleico y polaridad). Asi surgen:
Clase I: DNA doble cadena
ClaseII: DNA simple cadena polaridad positiva
Clase III: RNA doble cadena
Clase IV: RNA simple cadena polaridad positiva
Clase V: RNA simple cadena, polaridad negativa.
Clase VI: RNA simple cadena, polaridad positiva, con retrotranscripcion a DNA.

En realidad, el numero para cada clase no se aplica usualmente pero la division según
acido nucleico y polaridad es uno de los criterios mas importantes utilizados hoy en dia,
junto con las caracteristicas morfologicas de la capside y la presencia o no de envoltura.

El sistema universal de taxonomía viral

El sistema se basa en la existencia de niveles jerárquicos. Las familias de virus

ocupan la jerarquía superior2 y las mismas se denotan empleando el sufijo viridae. Una
familia comprende un grupo de virus que comparten caracteristicas comunes que los
diferencian de los miembros de otra familias (tabla 1). La mayoría de las familias de virus
tienen una morfología, organización genómica y estrategia replicativa caracteristicas,
indicando una asociación filogenética3. En cuatro familias de virus se han incorporado
2
En rigor, los órdenes ocupan ese sitio. Sin embargo, hasta el presente sólo un órden de virus ha sido
asignado y por ello no nos extenderemos más al respecto. El órden Mononegavirales comprende las
familias Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, y Filoviridae. Notar el sujijo virales utilizado para designar
órdenes.
3
Ello no quiere decir que dentro de una familia, dos virus muestren una gran distancia filogenética. Aún en
ese caso, la distancia que los separa será menor que la existente con un tercer virus perteneciente a otra
familia.

10
subfamilias para permitir una jerarquía más compleja de taxones entre virus que muestran
relaciones más complejas entre sus miembros. Las subfamilias se denotan con el sufijo
virinae.
Los géneros de virus representan agrupamientos de virus que poseen
caracteristicas comunes pero distintas de los miembros de otros géneros. Los géneros se
designan con el sufijo virus. Los criterios para definir un género varían entre familia y
familia.
El taxón “especie” ha sido el más difícil de caracterizar en Virología. Después de
años de controversia, la ICTV aceptó la siguiente definición de especie: “una especie de
virus se define como una clase politética (esto es, definida por más de una propiedad) de
virus que constituye un linaje replicativo y ocupa un nicho ecológico particular”. Esta
definición acomoda la variabilidad inherente de los virus y no depende de ninguna
caracteristica única del virus. Queda claro que el término especie es definido de manera
similar al término virus, pero en varias ocasiones el término virus se corresponde mejor
con subespecies, cepas o variantes. Muchas veces, al aislar un virus y caracterizarlo, es

Tabla 1. Familias que contienen virus de humanos y animales

Familia Caracteristicas Familia Caracteristicas

Virus RNA Virus DNA
Picornaviridae RNA simple cadena Hepadnaviridae DNA doble y simple cadena
Caliciviridae polaridad positiva Con envoltura
Astroviridae sin envoltura Conversión de RNA genómico
a DNA
Togaviridae RNA simple cadena
polaridad positiva Circoviridae DNA simple cadena
Con envoltura Parvoviridae sin envoltura

Coronaviridae RNA simple cadena

Polaridad positiva Polyiomaviridae
Con envoltura Papillomaviridae DNA doble cadena
Transcripción discontinua Adenoviridae sin envoltura

Paramyxoviridae RNA simple cadena Herpesviridae DNA doble cadena

Rhabdoviridae polaridad negativa Poxviridae con envoltura
Filoviridae con envoltura Iridoviridae
Asfarviridae:
Orthomyxoviridae RNA simple cadena
Bunyaviridae polaridad negativa o

11
Arenaviridae en ambos sentidos Agentes subvirales: satélites, viroides y
Genoma segmentado Priones
Con envoltura
Género huérfano: Deltavirus RNA simple cadena
Reoviridae RNA doble cadena Polaridad negativa
Birnaviridae polaridad positiva Defectuoso, satélite
Genoma segmentado
Sin envoltura Taxón sin definir: agentes de las encefalitis
espongiformes (nombres a asignar)
Retroviridae RNA simple cadena Sin ácido nucleico
Polaridad positiva Priones (“proteinas
Conversión a DNA autoreplicativas”)

difícil determinar si el mismo debe ser designado como una especie o como una cepa de
una especie. Para ilustrar los problemas asociados a la definición de especie,
mencionaremos el caso de dos retrovirus que afectan a los ovinos, el virus del tumor
nasal enzoótico (ENTV) y el virus del Jaagsiekte (JSRV). El ENTV causa tumores en la
cavidad nasal mientras que el JSRV causa tumores pulmonares. El genoma de ambos
virus posee una longitud promedio de 7000 bases y la comparación de las secuencias
revela una similaridad del 95%. Cabe preguntarse si un 5% de diferencias es suficiente
como para catalogar a dos virus como entidades diferentes. Sin embargo, al inocular el
ENTV en una oveja se desarrollan tumores nasales y no pulmonares, y al inocular el
JSRV se desarrollan adenomas pulmonares pero no tumores nasales. Según nuestra
definición de especie, se trata de virus distintos, muy similares, pero distintos. Cada uno
se relaciona con dos patologías caracteristicas. Es interesante considerar que parte de ese
5% de diferencias se concentran en los genes que codifican para la proteina que usan los
retrovirus para ingresar a las células.
Los virus RNA son un verdadero problema para la noción de especie. Durante la
infección natural del huésped por un virus RNA se producen muchas variantes genómicas
(por razones que trataremos oportunamente). Cada una de estas variantes tiene el
potencial de adaptarse rapidamente a distintos ambientes. Actualmente se refiere a estas
variantes naturales con la denominación de “cuasiespecies”.
El siguiente es un ejemplo de la terminología taxonómica aplicada al virus de la
rabia: Orden Mononegavirales, familia Rhabdoviridae, género Lyssavirus, virus de la
rabia. Muchas veces se emplean términos vernáculos como, por ejemplo, “los
paramixovirus”, pero aquí no sabemos a ciencia cierta si se está haciendo referencia a la
familia Paramyxoviridae, al género Paramyxovirus, o a alguna de las especies del
género.

Taxonomía filogenética

Como los virus no dejan fósiles, se pensó que nunca se encontraría evidencia para
probar que dos taxones tenían raices evolutivas comunes. Cuando surgió la secuenciación
del genoma como herramienta para la clasificación, fue evidente que existían muchos
dominios funcionales conservados en sus proteinas. A pesar de que los genomas

12
pertenecientes a especies de distintas familias son muy diferentes, también es obvio que
virus distintos (incluso familias distintas) poseen ciertas semejanzas a nivel genético (ya
sea la organización de sus genes, o la existencia de secuencias para dominios proteicos
que poseen funciones similares). Estas relaciones filogenéticas empezaron a reflejarse en
el esquema taxonómico. Por ejemplo, la razón por la cual se creó el órden
Mononegavirales surgió al reconocer que los genes para las proteinas del nucleocápside
de las familias constituyentes se organizaban de manera similar y sus productos eran
parecidos. A medida que más y más similitudes se reconozcan, mayor será la tendencia a
construir órdenes de virus. Nosotros volveremos sobre estos temas más adelante en el
curso a propósito de tratar la evolución de los virus.

Para una completa lista de la clasificación actual, entrar a la página:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/Ictv/fr-fst-g.htm

Lista de virus de los animales domésticos

Virus Especie Enfermedad

Papilomavirus Bovino Fibropapiloma

bovino tipo 1 cutaneo
idem caballo Sarcoide

Tipo 2 bovino Fibropapiloma

cutaneo
idem caballo Sarcoide

Tipo 3 bovino Papiloma cutaneo

Tipo 4 bovino Papiloma digestivo

Tipo 5 bovino Fibropapiloma del

pezon
Tipo 6 bovino Papiloma del pezon

Papilomavirus ovino Fibropapiloma

ovino cutaneo
Papilomavirus equino Papiloma cutaneo
equino
Papilomavirus porcino Papiloma cutaneo
genital porcino
Papilomavirus perro Papiloma oral
oral canino
Papilomavirus conejo Papiloma cutaneo
del conejo
Adenovirus caballo Leves infecciones 2 serotipos
respiratorias

13
Adenovirus perro Hepatitis infecciosa
tipo 1 canina
Adenovirus perro Traqueobronquitis
tipo 2 infecciosa canina
Adenovirus pollo Raramente hepatitis
y sindrome caida de
puesta
BoHV-1 bovino IBR Subfamilia alfa

BoHV-2 bovino Mamilitis Subfamilia alfa

Herpesvirus cabra Conjuntivitis, Subfamilia alfa

caprino 1
Pseudorabia cerdo Seudorabia Subfamilia alfa

Herpesvirus caballo Aborto Subfamilia alfa

equino 1
Herpesvirus caballo Rinoneumonia Subfamilia alfa
equino 4

Herpesvirus caballo Exantema coital Subfamilia alfa

equino 3
Herpesvirus perro Enfermedad Subfamilia alfa
canino 1 hemorragica de los
cachorros
Herpesvirus gato Rinotraqueitis virica Subfamilia alfa
felino 1 felina
Herpesvirus pollo Laringotraqueitis Subfamilia alfa
aviar 1 infecciosa
Herpesvirus bovino ¿ Subfamilia beta
bovino 3
Herpesvirus equino ¿ Subfamilia gama
equino 2
Herpesvirus cerdo Rinitis Subfamilia gamma
porcino 2
Herpes ovino 2 bovino Fiebre catarral Subfamilia gama
maligna
Virus de Marek pollos Paralisis, Subfamilia alfa
linfomatosis
Poxvirus bovino Pseudoviruela bovina Parapoxvirus
ovino Viruela ovina Capripoxvirus
cerdo Viruela porcina Suipoxvirus

Bovino, gato, Ortopoxvirus

elefante, conejo
pollos Viruela Avipoxvirus

Parvovirus cerdo Aborto, muerte

porcino perinatal
Panleucopenia gato Enteritis, hipo.
felina Cereb.

14
Parvovirus perro Enteritis, miocarditis
canino
Enterovirus bovino Infecciones Picorna
bovino tipos 1 subclínicas Entero
a7
Enterovirus porcino Idem pero el 1 Picorna
porcinos 1 a 11 produce Entero
polioencefalomielitis
Enfermedad porcino Enfermedad Picorna
vesicular vesicular porcina Entero
porcina
Enterovirus Pollo Encefalomielitis Picorna
aviares aviar Entero
Pato, pavo Hepatitis
Virus de la Mamiferos en Raro:encefalomiocar Picorna
encefalomiocar contacto con ditis Cardio
ditis roedores
Rinovirus bovino Rinitis
bovinos 1-3
Rinovirus equino Rinitis
equinos 1-3
Virus de la Rumiantes y cerdo Fiebre aftosa
fiebre aftosa: 7
tipos
Virus del cerdo Vesiculas
exantema
vesicular
Calicivirus gato Enfermedad
felino respiratoria alta,
neumonia, ulceras
Virus de la Equino (hombre) Encefalitis
encefalitis
equina del este,
oeste y
Venezuela
Virus Getah Equino Fiebre

Virus de la Bovino, ovino Signos respiratorios

diarrea viral y entericos
bovina
Virus de la cerdo Infeccion
peste porcina generalizada
Virus de la equino Aborto, inf.
arteritis equina Generalizada
Virus de Oveja (hombre) Encefalitis
louping ill
Virus de la Oveja (hombre) Inf. Generalizada,
enfermedad de aborto
Wesselsbron
Virus de la Cerdo (hombre) Encefalitis, aborto
encefalitis
japonesa
Influenzas Cerdo, caballo, Respiratorio
porcina, pollo, resp.

15
equina, aviar

V. Conejo, roedores Respiratorio

parainfluenza 1
: parainfluenza perro Respiratorio
2 (SV5)
V. rumiantes Respiratorio
parainfluenza 3
Virus de aves Signos nerviosos
Newcastle
Virus de la rumiantes Generalizado
peste bovina
Virus de la Oveja, cabra Generalizado
peste de los
pequeños
rumiantes
Virus del Canidos y otros General, nervioso
moquillo
canino

Virus respiratorio Vaca, oveja respiratorio Paramixovirus, pneumo

sincitial bovino
Virus de la Cerdo gastroenteritis Coronavirus, grupo 1
gastroenteritis
transmisible porcina
Virus de la peritonitis Gato Peritonitis, neumonia, Coronavirus, grupo 1
infecciosa felina (PIF) meningoencefalitis,
Coronavirus canino Perro enteritis Coronavirus, grupo 1

Virus de la hepatitis del Raton Hepatitis, Coronavirus, Grupo 2

ratón encefalomielitis, enteritis
Coronavirus bovino Vaca gastroenteritis Coronavirus, Grupo 2

Virus de la Cerdo Vomitos, consuncion, Coronavirus, Grupo 2

encefalomielitis encefalomielitis
hemaglutinante porcina
Virus de la bronquitis Pollo Traqueobronquitis, Coronavirus aviar grupo 1
infecciosa aviar nefritis
Virus de la cresta azul Pavo enteritis Coronavirus aviar, grupo 2

Fiebre del Valle del Oveja, cabra, bufalo, Hepatitis, aborto Bunyavirus, phlebo
Rift hombre
Akabane Vaca congenita Bunyavirus, bunya
(mosquito)
Valle del Cache Vaca, oveja congenita Bunyavirus, bunya
(mosquito)
Enfermedad ovina de Oveja, cabra enteritis Bunyavirus, nairo
Nairobi (mosquito)
Fiebre hemorragica de Rumiantes, hombre ninguno Bunyavirus, nairo
Crimea (garrapata)
Andam Roedores, hombre ninguno Bunyavirus, hanta

16
Estomatitis vesicular, Caballos, vacas, cerdo vesiculas Rabdovirus, vesiculo
muchos serotipos
Rabia Mamiferos encefalitis Rabdovirus, lyssa

Rabdovirus de peces Peces varios Rabdo, lyssa y vesiculo

(5)
Virus de la leucosis Pollo Linfomas, leucemia, Retrovirus, alfaretrovirus
aviar anemia, osteopetrosis (v-onc -)
Virus del sarcoma Pollo sarcoma Retrovirus, alfaretrovirus
aviar (v-onc +)
Virus de la Pollo Linfomas, anemia, Retrovirus gamaretrovirus
reticuloendoteliosis sarcoma (v-onc +)
Virus de la leucosis Vaca leucemia Retrovirus,deltaretrovirus
bovina (v-onc -)
Virus del sarcoma Cerdo sarcoma Retrovirus
porcino (v. onc +)

Virus de la leucemia Gato leucemia Retrovirus,gamaretrovirus

felina (VleF) (v onc -)
Virus del sarcoma Gato sarcoma Retrovirus, gamaretrovirus
felino (v onc +)
Virus de maedi- Oveja Neumonia progesiva Retrovirus, lentivirus
visna
Virus de la artritis Cabra Artritis, encefalomielitis Retrovirus, lentivirius
encefalomielitis
caprina
Virus de la anemia Caballo anemia Retrovirus, lentivirinae
infecciosa equina
(EIA)
Virus vacuolizante Vaca ninguno Retrovirus, spumavirinae
bovino
Virus vacuolizante Gato ninguna Retrovirus, spumavirinae
felino
Ortoreovirus aviares Pollo Artritis, nefrosis, enteritis, Reovirus, ortho
etc
Virus de la lengua Rumiantes Lengua azul Reovirus, orbi
azul
Virus Ibaraki Vaca Parecido a lengua azul Reovirus, orbi

Virus de la peste Caballo, asno, cebra, peste Reovirus, orbi

equina africana mula
Virus de la Caballo Aborto, encefalitis Reovirus, orbi
encefalosis equina
1-5
Rotavirus La mayoria enteritis Reovirus, rota

Bursitis infecciosa Pollo Diarrea, deshidratacion Birnavirus

aviar

17
Virus de la necrosis Peces hemorragias birnavirus
pancreatica de los
peces

18
 Estructura de los virus
Cada partícula individual de virus recibe el nombre de virión. Las partículas
virales están diseñadas para la transmisión efectiva del genoma viral de una célula a la
otra o de un animal a otro. Una función del virión es proteger al genoma viral de la
ruptura o de la mutación durante su fase extracelular. En particular, la cápside del virión
cumple un rol fundamental en la protección del genoma. Las proteinas de la cápside
poseen sofisticados plegamientos y se hallan empaquetadas de forma muy compacta, de
tal forma que resisten la digestión por las enzimas proteolíticas.

Al referirnos a la estructura de un virión es conveniente distinguir entre los siguientes

términos:

- Protómero (o unidad estructural): conjunto de proteinas (iguales o distintas) que

forman el bloque unitario de un ensamblaje mayor. Por ejemplo, VP1, VP2, VP3 y
VP4 son cuatro proteinas distintas que constituyen los protómeros del virus de la
polio o poliovirus.
- Unidad de ensamblaje: conjunto de proteinas o de protómeros que operan como
intermediarios en la formación de una estructura mayor (ej, el pentámero de VP1 en
el virus SV40).
- Unidad morfológica (capsómero): se refiere a las regiones o “clusters” observables
sobre la superficie del virión con el microscopio electrónico. Generalmente se trata de
las partes de las proteinas que se proyectan desde la superficie viral alrededor de los
ejes de simetría.
- Cápside: la cubierta proteica que rodea al genoma viral. Los términos ingleses coat o
shell se refieren a la cápside.
- Nucleocápside: se refiere al complejo completo de proteinas y ácido nucleico que
suele utilizarse especialmente en casos donde la nucleocápside es una subestructura
de partículas virales más complejas.
- Envoltura: bicapa lipídica y proteinas asociadas que rodean muchos tipos de
partículas virales.
- Virión: la partícula viral completa.

¿Cómo se estudia la estructura de los virus?

En principio, cualquier técnica destinada al estudio de la estructura de los virus

requiere la obtención de una suspensión pura de virus. En la figura 1 se muestra un
protocolo clásico para producir virus libre de restos celulares.
La microscopía electrónica es la mejor manera de determinar la estructura general
de los virus. Aunque pueden examinarse cortes ultradelgados de tejidos infectados, se
obtiene mayor detalle cuando se emplean suspensiones virales purificadas que han sido
teñidas negativamente con, por ejemplo, fosfotungstato de potasio. Mientras que en un
corte podemos observar partículas virales en diversos grados de maduración, cuando se
examinan suspensiones de virus purificado predominan las formas maduras o completas.
La microscopía crioelectrónica es una variante en la cual la muestra se congela a
muy bajas temperaturas (-160 oC) y se mantiene así durante la observación. No se

32
Figura 1: Esquema de un protocolo de propagación y purificación de virus

33
requiere fijación ni tinción. Los contrastes bajo el microscopio dependen de las propias
subestructuras virales y no del efecto de la tinción negativa. Cuando el material está bien
preservado, las micrografías pueden ser sometidas a análisis de imágenes con la ayuda de
softwares apropiados. Tales análisis permiten la reconstrucción tridimensional a partir de
micrografías con una resolución del órden de los 30-40 Å1, esto es, lo suficiente como
para poner en evidencia unidades de ensamblaje proteicas2. El fundamento de tales
reconstrucciones es el siguiente. Bajo el microscopio electrónico, una única molécula de
proteina da una señal muy débil y borrosa. Una forma de solucionar este problema es
combinar la información proveniente de muchas moléculas idénticas de tal forma de
poder promediar y sustraer los déficits de las imágenes individuales. Tal situación se da
en los virus porque están constituidos por subestructuras repetitivas. Las micrografías de
suspensiones virales incluyen miles de partículas y es posible utilizar los analizadores de
imágenes para computar la imagen promedio de una macromolécula individual,
revelando detalles usualmente oscurecidos por el “ruido” de la micrografía original. En la
figura 2 se muestran las reconstrucciones tridimensionales de algunos virus con simetría
icosaédrica (ver más abajo).
Aunque la microscopía electrónica ofrece gran detalle, este nunca es suficiente
como para visualizar la forma en que las proteinas individuales del virus interactúan entre
sí en la partícula. Esto ocurre porque los átomos de una molécula están separados por
distancias del órden de 0.1-0.2 nm. Tal resolución a nivel submolecular sólo puede
lograrse mediante métodos de difracción de rayos X. Como la luz, los rayos X son una
forma de energía electromagnética pero con una longitud de onda mucho más pequeña. Si
se dirige un haz de rayos X a un cristal de proteina (con millones de moléculas de
proteina pura), un porcentaje de los rayos serán difractados por los átomos de la muestra.
En ciertos puntos, las ondas difractadas se reforzarán entre sí y formarán puntos de
difracción que serán captados por un detector. La posición e intensidad de cada punto
contiene información acerca de la posición de los átomos en el cristal. El producto
inmediato de un análisis de difracción es un complejo mapa de densidad electrónica
tridimensional. Su interpretación requiere conocer la secuencia de la proteina del cristal.
Con ayuda de una computadora, el mapa y la secuencia son cotejados hasta obtener la
máxima coincidencia. La fidelidad del modelo atómico final depende de la resolución de
los datos cristalográficos originales. Por ejemplo, una resolución de 5 Å produce una baja
resolución del esqueleto de la proteina, mientras que una resolución de 1,5 Å permite
posicionar todos los átomos de la proteina (excepto los de H). Muchas clases de proteinas
han sido analizadas de este modo. Algunos virus no envueltos, al igual que las proteinas,
pueden purificarse y formar cristales de suficiente calidad como para analizarlos
mediante difracción de rayos X. Así, se ha determinado la estructura tridimensional del
virus de la fiebre aftosa con una resolución de 2 Å y la del parvovirus canino con una
resolución similar. Es importante recalcar que el éxito completo de cualquier estudio
estructural a este nivel requiere el conocimiento previo de las macromoléculas
constitutivas del virus y sus proporciones relativas, de la misma manera que necesitamos

1
Un diámetro atómico equivale a 2 o 3 Å; una hélice alfa de aminoácidos = 10 Å, y la doble hélice de
DNA, 20 Å. 1 Å = 0,1 nm (nanómetros), 1nm= 10 -9 m, 1 Å= 10-10 m.
2
Para observar reconstrucciones coloreadas y animaciones de distintos grupos de virus, visitar
www.bocklabs.wisc.edu/virusviztop.html

34
la secuencia de aminoácidos en el caso de las proteinas puras. Virus más complejos no
han podido cristalizarse aún. En esos casos, las partículas son disociadas en unidades de
ensamblaje menores las cuales sí pueden purificarse y cristalizarse. Estos datos suelen
combinarse con los obtenidos por análisis de crioelectro-micrografías de partículas
completas para obtener una imagen completa y detallada de la estructura del virión.

Fig 2: A) Virus Sindbis (RNA, envuelto, Togaviridae). Vista de la superficie del virión. Derecha: corte
transversal mostrando las glicoproteinas de la envoltura (periferia más clara) y la nucleocápside por dentro.
Debajo se muestra la superficie de la nucleocápside. B) La cápdide de un calicivirus (RNA, no envuelto,
Caliciviridae). C) Rotavirus (RNA, no envuelto, Reoviridae). La partícula tiene tres capas concéntricas de
proteinas. Las espículas que emanan de la superficie están formadas por la proteina VP4 la cual está
implicada en el reconocimiento del receptor celular. D) Herpesvirus (DNA, envuelto, Herpesviridae). La
envoltura no se incluye a los fines de mostrar la nucleocápside cuya superficie contiene una proteina
estructural principal, VP5. (de Fundamental Virology, Fields, B et al, 3 ra edición).

35
Morfología y estructuras virales

Existe una gran variedad de tipos morfológicos entre los virus. En la figura 3 se
muestra un esquema sencillo de una partícula viral con sus componentes. El elemento
más externo corresponde a la envoltura, cuya estructura general es idéntica a la de
cualquier membrana biológica. Como no todos presentan membrana, los virus se
clasifican en virus envueltos y virus no envueltos. Rodeada por la envoltura se encuentra
la cápside, de naturaleza proteica y presente en todos los virus. La cápside sirve a su vez
de cubierta protectora para el genoma viral, RNA o DNA, el cual está asociado a otras
proteinas. Como la cápside y el genoma viral de ciertos virus están íntimamente
relacionados, suele utilizarse el término nucleocápside para referirse al complejo
completo de proteinas-ácidos nucleicos. En algunos virus, la envoltura se halla
fuertemente asociada a la nucleocápside. En otros, por el contrario, se describe un espacio
(tegumento) que es ocupado por otro set de proteinas. Las variaciones sobre esta
arquitectura básica, que pueden ser significativas, se verán oportunamente al tratar
individualmente las distintas familias de virus.
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Figura 3: Componentes de la partícula viral.

La envoltura

La envoltura está constituida por una bicapa de lípidos y proteinas asociadas. La

presencia de la envoltura no sólo es un rasgo morfológico, sino que imprime al virus con
un estilo de penetración en la célula target o blanco y con una manera de interactuar con
la rama efectora del sistema inmune.
Las proteinas de la envoltura pueden ser transmembrana o asociarse con la bicapa
por otras modalidades. La cadena polipeptídica de las proteinas transmembrana
atraviesan una o más veces la bicapa. Típicamente presentan tres dominios: uno interno,
uno transmembrana y otro externo. Si se trata de una glicoproteina (gp), las cadenas de
oligosacáridos se unen al dominio externo. Los dominios externos son particularmente
importantes pues contienen los sitios de unión a los receptores celulares, evento que
marca el inicio de la penetración de los virus en las células. Por lo tanto, la integridad de
la envoltura es esencial para la infectividad de los virus envueltos. Los dominios externos

36
son importantes en otro sentido: son los blancos predilectos de la rama efectora de la
respuesta inmune.
El rol de las proteinas de la envoltura en la penetración, no se limita a la unión a
los receptores. Para que el genoma viral pueda expresarse en la célula, debe desprenderse
de las estructuras que lo rodean. Los virus envueltos se deshacen de su membrana, ya sea
en la superficie celular o en los endosomas, al fusionarse con la membrana de la célula.
La fusión entre las membranas dependen de las aptitudes fusogénicas de algunas
proteinas de la envoltura.
¿Cuántos tipos diferentes de proteinas de membrana tienen los virus? Ello
depende del virus en cuestión. Por ejemplo, el virus de la rabia (Rabdovirus, RNA), posee
sólo dos tipos, la glicoproteina G y la proteina M. Existen unas 1200 copias de gp G por
virión. La gp G es una proteina transmembrana con un peso molecular de 63 Kd3, y es
responsable de la unión a los receptores y de la fusión de la envoltura con la membrana
plasmática. La proteina M (26 Kd, 1800 copias por virión) se encuentra del lado interno
de la envoltura y realiza contactos con la nucleocápside. En los paramixovirus (RNA), la
glicoproteina HN se encarga de la unión a los receptores mientras que la gp F es el factor
fusogénico. Otros virus más complejos, como ciertos virus DNA, contienen mas de 10
tipos de proteinas distintas en su envoltura. Observese, que el reconocimiento de los
receptores celulares y la fusión de membranas son funciones que pueden recaer sobre un
tipo de proteina o bien repartirse entre dos o más proteinas distintas.
Otras funciones importantes de las proteinas de la envoltura son la destrucción de
receptores e intervenir en el denudamiento de la nucleocápside, aunque las mismas están
restringidas a un número menor de virus.

La envoltura es adquirida en las etapas finales de la infección, antes de la

liberación de la progenie viral. El proceso por el cual la nucleocápside adquiere la
envoltura se conoce como gemación (“budding” en inglés) y puede ocurrir en la
membrana plasmática, en el aparato de Golgi o en el retículo endoplásmico, según el
virus. Las proteinas de envoltura se congregan en la membrana relevante y las
nucleocápsides luego “arrastran” la membrana resultando envueltas en el proceso. ¿Cómo
“saben” las proteinas virales que deben congregarse en un compartimiento determinado?
Las proteinas virales usan los mismos códigos de segregación que las proteinas celulares.
Por ejemplo, si un virus gema a través de la membrana del retículo endoplásmico, las
proteinas de la envoltura viral deberán tener señales que las retengan específicamente en
la membrana del retículo. Por otro lado, ciertas proteinas de la envoltura viral juegan un
papel decisivo en el proceso mismo de gemación.
Mientras que las proteinas virales están codificadas por el genoma del virus, la
síntesis de los fosfolípidos no lo está. Como consecuencia, la composición de lípidos de
la envoltura viral suele ser un reflejo de la membrana celular de la cual se originó. Ello no
quita que algunos virus, por mecanismos poco claros, puedan enriquecer sus bicapas en
ciertos fosfolípidos durante la gemación. Tampoco se conoce bien como en la gemación
se excluyen las proteinas celulares.

3
Kd= kilodalton

37
La cápside

La cápside es esencialmente una cubierta formada por repetición de unas pocas

proteinas (de un solo tipo de proteina en algunos virus). La estructura de la cápside debe
ser lo suficientemente estable como para proteger el genoma ante ambientes hostiles.
Pero una vez en el interior celular, debe ser lo suficientemente inestable como para
permitir la liberación del genoma, paso esencial para la replicación. Por lo tanto, las
partículas virales son estructuras metaestables, esto es, aún no han alcanzado una
conformación que represente el estado de mínima energía libre. Esta última condición se
logra cuando se promueven cambios de conformación irreversibles asociados con la
adhesión y entrada de la partícula a la célula.
La cápside es la estructura más expuesta en los virus no envueltos, lo cual implica
que contiene los sitios necesarios para reconocer los receptores celulares.
Aun en los virus envueltos, la forma de la cápside suele determinar la forma
global del virión. Sin embargo, en virus más complejos otras estructuras subvirales
pueden incidir en la forma de la partícula. Aunque la cápside generalmente está
constituida por una capa única de proteinas, ciertos virus presentan cápsides
estratificadas. El número de proteinas distintas presentes en la cápside varía de virus a
virus. En algunos pocos, la repetición de un solo tipo de proteina basta para conformar la
cápside. En la mayoría de los virus, tres o cuatro proteinas forman los bloques de
construcción con los cuales se forman las estructuras de ensamblaje de mayor jerarquía.
Una forma conveniente de describir la estructura de los virus es a través de sus
ejes de simetría rotacional. En este sentido, predominan dos tipos: los de simetría
icosaédrica y los de simetría helicoidal. Muchos virus esféricos poseen simetría
icosaédrica mientras que muchos virus bastoniformes presentan simetría helicoidal.
El icosaedro es una de las figuras platónicas. Se caracteriza por tener 20 caras
cada una de las cuales es un triángulo equilátero. La simetría del icosaedro incluye ejes

Figura 4. Icosaedro mostrando los ejes de rotación. La mayoría de los virus con simetría icosaédrica no
tienen forma de icosaedro, pero sí poseen los ejes de rotación dobles (2), triples (3) y quíntuples (5) que
caracterizan al icosaedro. (de Fundamental Virology, Fields, B et al, 3 ra edición).

38
dobles, triples y quíntuples de rotación, un patrón que parece ser la forma más eficiente
para la disposición de subunidades estructurales en una conformación cerrada (figura 4).
Existen exactamente 60 elementos idénticos en la superficie de cualquier estructura con
simetría icosaédrica que se relacionen entre sí por ejes de rotación dobles, triples y
quíntuples. Esto significa que si una cápside está formada por 240 unidades, las mismas
deben estar agrupadas en 60 sets idénticos.
En la figura 5, las unidades, representadas por comas, se disponen obedeciendo a
las leyes del icosaedro. Las comas relacionadas por ejes dobles de simetría contactan por
sus cabezas, las relacionadas por ejes triples, por sus cuellos, y las relacionadas por sus
ejes quíntuples, por sus colas. La simetría del icosaedro establece que sólo 60 (como en la
figura) o un múltiplo de 60 unidades idénticas pueden acomodarse en la estructura. En la
mayoría de los virus, cada unidad (coma) está formada por más de una cadena
polipeptídica. En algunos, se trata de cadenas de la misma proteina mientras que en otros
las cadenas son químicamente distintas.

Figura 5. Estructuras con simetría icosaédrica conteniendo 60 (a) o 180 (b) subunidades .
(de Fundamental Virology, Fields, B et al, 3ra edición).

El múltiplo de 60 unidades que utiliza un virus para conformar su cápside viene

indicado por el valor T. Así, un virus con un valor T= 4 indica que posee 240 unidades
totales agrupadas en 60 sets idénticos. El valor T también se conoce como valor de
triangulación por que da idea del modo en que la superficie del icosaedro puede ser
subtriangulada para acomodar un gran número de unidades.
Los virus con cápsides más grandes generalmente emplean diferentes tipos de
subunidades para formar los vértices con ejes quíntuples de rotación (hay 12 de tales
vértices en un icosaedro) y presentan además otros tipos de complejidad.
En algunos virus envueltos, los dominios internos de las proteinas de membrana
presentan contactos con la cápside. En estos casos se piensa que la movilidad lateral de
las proteinas en la bicapa está restringida, y que las proteinas se ordenan siguiendo los
principios de la simetría del icosaedro.

39
Ejemplos de estructura viral

Picornavirus (RNA, no envueltos)

Debido a su pequeño tamaño y a la falta de envoltura, varios virus RNA de

polaridad positiva4 han podido cristalizarse y su estructura tridimensional determinarse
con precisión. En la figura 6 se muestra la organización estructural de la cápside en
Picornaviridae. Contiene 60 unidades estructurales o protómeros. Cada protómero
contiene cuatro subunidades, las proteinas VP1, VP2, VP3 y VP4 (del inglés Virion
Polypeptide). Como hay 180 de tales subunidades en el virión, organizadas en 60
protómeros idénticos, T=3.

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Figura 6: Organización de la cápside de picornavirus. (de Fundamental Virology, Fields, B et al,

3ra edición).

Aunque VP4 se señala en la figura, esta proteina se encuentra enterrada en la cápside y

no contribuye a la superficie del virión. Cuando se tratan viriones purificados con una
solución de HCl 0.1 M, pH 6, el virión se disocia liberando el genoma de RNA, VP4 y 12
pentámeros compuestos por 5 protómeros cada una. Los pentámeros pueden disociarse en
presencia de urea 2 M en sus protómeros constituyentes (figura 7).

4
Esto es, cuyo RNA actúa como un mRNA dentro de la célula.

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Figura 7. Disociación del virión en picornavirus.

Este esquema de disociación sugiere el mecanismo de ensamblado.

Tanto VP1, VP2 como VP3 poseen un dominio común de unos 200 aminoácidos,
organizado como hoja plegada ß y denominado “barril ß” de la cápside. La forma en que
se pliega la cadena polipeptídica se muestra en la fig 8. Las cadenas ß forman dos hojas
(B, I, D, G y C, H, E, F). Las doble mayúsculas (BC, HI, etc) indican los “loops” (partes
del polipéptido que unen las regiones ß y que pueden adoptar varias configuraciones)
donde se encuentran las mayores diferencias entre las VPs. Los cilindros indican regiones
de hélices. Aunque los barriles ß son comunes a muchas proteinas, el tamaño y
disposición de los loops son exclusivos de las proteinas virales. La forma de estos
dominios les permite empaquetarse firmemente alrededor de los ejes de rotación. De
hecho, dominios similares se encuentran en las cápsides de muchos tipos de virus.

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Figura 8: modelo de barril ß de las proteinas de la cápside.

Los loops así como los extremos carboxi-terminales protruyen hacia la superficie
externa del virión contribuyendo así a la antigenicidad del virión y al reconocimiento de
los receptores celulares. Alrededor de los ejes quíntuples de rotación, cinco moléculas de
VP1 interactúan (fig. 6, centro de la figura), se forma una depresión denominada cañón.
En los rinovirus, el cañón es el sitio de interacción con el receptor celular ICAM-1, una
proteina de adhesión de la superfamilia de las inmunoglobulinas. Los extremos N-
terminales de los barriles se encuentran en el lado interno de la cápside interdigitandose y
formando una red que dirige y estabiliza el ensamblado.

41
 En algunos picornavirus, el virión sufre un cambio conformacional al interactuar
con la superficie celular. El cambio es de tipo expansivo, va acompañado de la pérdida de
VP4 del interior, y sería disparado por la unión a uno o unos pocos receptores. Por lo
tanto, la unión con el receptor no sólo promueve la adhesión específica del virus a la
célula, sino que inicia el desensamblaje.

Adenovirus (DNA, no envueltos)

Los adenovirus (Adenoviridae) poseen una estructura más compleja que la

descripta anteriormente (fig.9). La estructura tridimensional de la partícula fue
determinada con una resolución de 35 Å mediante reconstrucción tridimensional a partir
de micrografías crioelectrónicas. Las partículas de adenovirus son icosaédricas y miden
entre 70 y 100 nm (unas tres veces más que los picornavirus).

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Figura 9. Diagrama de la partícula de adenovirus

Análisis electroforéticos indican la presencia de unos 11 polipéptidos diferentes en el

virión, 7 de los cuales están en la cápside formando 252 subunidades o capsómeros (240
hexones y 12 pentones).
Cada hexón es un trímero de un mismo polipéptido de 110 Kd (polipéptido II), el
cual posee dos dominios con una configuración global semejante a la del barril ß. Los
loops del barril se proyectan hacia fuera interactuando firmemente con los loops de los
otros barriles del hexón. Los loops contienen los principales determinantes antigénicos
específicos de cada tipo de virus.
El pentón está formado por una base pentamérica (polipéptido III) y una fibra
trimérica (polipéptido IV) y se localiza en los ejes quíntuples de rotación (12 por
partícula)5. Cada base está rodeada por 6 hexones . La proteina de la fibra posee 22
5
Los nombres de hexón y pentón derivan del hecho de que cada uno está rodeado por 6 y 5 elementos
idénticos, respectivamente.

42
repeticiones que conforman el largo tallo y un extremo C-terminal de 181 aminoacidos
que forman la dilatación en el extremo. Se piensa que tanto la fibra como la base son
importantes para ingresar a la célula. La dilatación de la fibra media la unión inicial y la
base refuerza la unión al interactuar con integrinas de la célula.

Simetría helicoidal

En los virus con simetría helicoidal, las unidades de la cápside forman una hélice
alrededor del genoma con un eje de rotación coincidente con el eje de la hélice. Por
ejemplo, el TMV es un bastoncito rígido de 300 nm de largo por 18 de ancho. Las 2130
unidades de la cápside se disponen en una hélice hacia la derecha con 161/3 unidades por
vuelta. El RNA se localiza entre las vueltas sucesivas de la hélice (fig.10).

Figura 10. Estructura helicoidal del virus del mosaico del tabaco (TMV) (de Fundamental Virology, Fields,
B et al, 3ra edición).

¿Cómo identificar las proteinas del virión?

Los virus codifican en su genoma las proteinas que necesitan para replicarse,
ensamblarse, formar el virión, etc. Cuando hablamos de proteinas del virión nos estamos
refiriendo a aquellas proteinas virales que forman parte de la partícula viral,
diferenciandolas de otros productos virales que, aunque esenciales para la replicación del
virus, no integran las mismas. La mayoría de las proteinas del virión, como hemos visto,
cumplen roles estructurales y, a veces, proteinas del virión y proteinas estructurales del
virus se utilizan como términos equivalentes. Algunos virus poseen enzimas incorporadas
en el virión. Por ejemplo, los retrovirus poseen en la capside varias copias de la enzima

43
transcriptasa reversa la cual cumple un papel decisivo en el cilo de vida de este grupo de
virus.
La forma más directa de identificar las proteinas del virión es purificandolo,
disociando sus proteinas y separandolas luego mediante electroforesis. Una forma de
lograr esto es infectar cultivos celulares en un medio en el cual la metionina normal
presente en su composición es reemplazada por 35S-metionina. En estas condiciones,
todas las proteinas que incorporan metionina (y la gran mayoría lo hace) van a ser
radioactivas, y por extensión, las partículas virales que se forman. Luego se cosecha el
virus y se lo purifica siguiendo algún protocolo de purificación. La purificación es
importante ya que también las proteinas celulares serán radioactivas y si no se las separa
el gel contendrá tanto bandas correspondientes a proteinas celulares como virales. La
suspensión viral luego se trata con un detergente como el SDS (dodecil sulfato de sodio)
el cual disocia las proteinas del virus y anula sus cargas. Las proteinas disociadas luego
se separan mediante electroforesis en gel de poliacrilamida. En estas condiciones, la
separación de las proteinas en el gel es una función de su tamaño relativo, y el mismo
puede estimarse si se corren simultaneamente proteinas con pesos moleculares conocidos
(marcadores de peso molecular). Transcurrida la electroforesis, el gel de seca y se pone
en contacto con un film. La radioactividad emitida por las bandas proteicas impresiona la
emulsión del film y tras el revelado se detecta como una mancha negra. Este último
procedimiento se denomina radioautografía (fig. 11).

Figura 11. Polipéptidos de rotavirus en partículas purificadas.

Otro método muy utilizado que también emplea marcación metabólica con un
aminoácido radioactivo, requiere la producción previa de anticuerpos específicos para
proteinas virales. En esta técnica, denominada inmunoprecipitación, las células
infectadas y marcadas son lisadas con un detergente. A este lisado (que contiene tanto
proteinas celulares como virales) se le agrega un anticuerpo específico acoplado a
partículas inertes. En el lisado, los anticuerpos se unirán a una proteina viral de tal forma
que se formarán complejos proteina-anticuerpo-partícula, los cuales pueden separarse del
resto de los componentes del lisado mediante centrifugación. Las proteinas virales
pueden luego fraccionarse en un gel de poliacrilamida y visualizarse mediante
radioautografía.
La técnica de inmunoblotting (o Wester blott) también se basa en reacciones
entre anticuerpos y proteinas virales pero en formato distinto y sin la necesidad de

44
marcación metabólica. Se infectan células, se lisan con detergente y se separan mediante
electroforesis. Posteriormente, el gel se pone en contacto con una membrana sintética
que posee afinidad por las proteinas y, con ayuda de un aparato especial, las bandas de
proteinas del gel son obligadas a transferirse a la membrana ocupando las mismas
posiciones que guardaban en el gel. Notese que hasta aquí, no hubo ninguna selección:
tanto bandas celulares como virales son transferidas a la membrana. Luego se coloca la
membrana en una cuba llena de buffer que contiene anticuerpos contra una proteina viral
determinada. Estos anticuerpos se unirán a la banda transferida que contenga la proteina
contra la cual fueron generados los anticuerpos, pero no al resto de las bandas de la
membrana. Para poner en evidencia la banda en cuestión, se recurre a uno de varios
protocolos de inmunotinción como, por ejemplo, los basados en los sistemas peroxidasa o
avidina-biotina.
Tanto la inmunoprecipitación como el inmunoblotting van más allá de la simple
detección de proteinas virales. Solas o combinadas pueden usarse para estudios de
cinética, localización subcelular, o asociación de proteinas virales con otros productos. El
inmunoblotting es así mismo un método muy sensible de diagnóstico.

El genoma de los virus

El genoma viral suele encontrarse en el centro de la partícula asociado a proteinas.
Durante el ensamblaje, cortas secuencias del genoma actúan como señales de
empaquetamiento las cuales dirigen la encapsidación. En algunos virus, la replicación del
genoma está coordinada con el empaquetamiento.
El genoma viral no suele estar “desnudo”, por el contrario, ciertas proteinas se
unen para neutralizar las cargas negativas de los grupos fosfato del RNA o DNA. En
algunos virus pequeños a DNA como los poliomavirus, el cromosoma viral está
empaquetado por histonas celulares, no teniendo necesidad el virus de codificar proteinas
de empaquetamiento. Los virus a DNA con mayor capacidad genómica (herpesvirus,
adenovirus), utilizan proteinas especiales codificadas por el virus. En muchos virus RNA
las mismas proteinas de la cápside interaccionan con el RNA. En general, el genoma viral
no parece adoptar una configuración única dentro de la cápside. Po ello, no se suelen
obtener datos cristalográficos de estas estructuras.

Los genomas virales comparten rasgos comunes con los genomas de otros
organismos. Como ya se había mencionado, una de las caracteristicas de los genomas
virales que los diferencia del resto es que la infomación genética puede almacenarse tanto
en la forma de DNA como en la de RNA. Así, los virus se dividen en dos grandes
grupos: virus DNA y virus RNA. Las diferencias entre los dos grupos van mas allá de la
mera distinción química entre sus ácidos nucleicos. Por ejemplo, los virus RNA se
replican en el citoplasma mientras que los virus DNA lo hacen en el núcleo. Siempre hay
excepciones: los virus de la influenza (RNA, Orthomyxoviridae), por ejemplo, se replican
en el núcleo.
La capacidad de los genomas virales (o sea, el número de genes que contienen)
está limitada por la capacidad de empaquetamiento de la cápside. Incluso los virus más
complejos no suelen tener más de 300 genes, mientras que los más simples sólo poseen 5
o 6!! . Una bacteria como E. Coli posee 2400 genes y una célula de mamífero, unos

45
 70000, lo cual ilustra la relativa simpleza de los virus. En este contexto, sorprende la
manera en que los genes virales dominan la escena de la expresión génica una vez dentro
de las células. En la figura 12 se compara la cantidad de DNA entre diversos organismos.

3500

1 5 0
3000

2500

1 0 0 2000

Milones
1500
Milones

5 0 1000

500

0
0

v
i
rus b
a
ct
er
ia
sl
eva
d
ur
asm
os
c
a m
o
s
ca m
a
mí
f
ero

Figura 12. Cantidad de DNA en diversos organismos (en millones de pares de bases)

Las restricciones espaciales de los virus obligan a una alta densidad génica, esto
es, disponer de muchos genes en un corto tramo de ácido nucleico, mientras que en la
célula eucariota los genes están separados por largas secuencias no codificantes. En los
virus más sencillos, los genomas contienen genes para las proteinas estructurales y poco
más. En los más complejos, como los grandes virus DNA, el genoma se expande para
aceptar genes para enzimas del metabolismo nucleotídico, la replicación del DNA, e
incluso para proteinas destinadas a modular al gran enemigo: el sistema inmune. No
existe correlación entre el número de genes de un virus y la severidad de la enfermedad
que ocasionan. Virus con un bajo número relativo de genes pueden ser desvastadores para
el huésped, e.g. el HIV, mientras que virus con un número relativo alto de genes (e.g.
poxvirus) pueden ocasionar enfermedades benignas. No debemos perder de vista la
premisa de que los virus solo “buscan” perpetuarse en la naturaleza adaptandose al nicho
que mas le convenga. Ello puede requerir de una cantidad variable de productos virales
de acuerdo a la estrategia utilizada.
El pequeño tamaño de los genomas virales ha permitido la secuenciación
completa de incontables virus de plantas, bacterias y animales. La organización de los
genomas suele representarse con diagramas de distinto tipo, siguiendo ciertas
convenciones. En la figura 13 se esquematizan dos versiones de la organización
genómica del virus de la papilomatosis bovina 1 o BPV-1 (DNA, Papilomaviridae). El
genoma del BPV-1 es una molécula de DNA circular de doble cadena con 7946 pares de
bases. Su organización puede esquematizarse en su versión circular nativa (A) o en su
versión linearizada (B). El BPV-1 posee 10 genes. Algunos se expresan temprano durante
la infección y reciben el nombre de genes E (Early= temprano), los otros se expresan
tarde durante la infección y reciben el nombre de genes L (Late= tardíos). Una
característica de todos los papilomavirus es que todos sus genes están codificados en una
sola de las dos cadenas de DNA.

46
Figura 13. Mapa genómico del BPV-1. Arriba) Versión circular. El círculo interno representa el genoma
completo de DNA de doble cadena. 7946/1 indica la posición de la unión del primer y último par de bases
que, por convención, se coloca a las 12 hs de un hipotético reloj. Las bases van aumentando hacia la
derecha en el sentido de las agujas del reloj. Las líneas curvas externas representan las posiciones de los
distintos genes dentro del círculo. Por ejemplo, el gen E6 está codificado entre las bases 1 y 500,
aproximadamente, el gen E4 entre las bases 3000 y 3500, etc. Las flechas que se apoyan sobre el círculo
indican dos cosas: 1) la posición del sitio donde se inicia la transcripción del gen, 2) el sentido (hacia la
derecha o hacia la izquierda) en que se transcriben. Por ejemplo, P 890 indica el sitio donde comienza a
transcribirse el gen E1; P indica que hay un promotor y 890 es la primer base transcripta para E1. Nótese
que todas las flechas señalan hacia la derecha indicando que, en este virus, todos los genes están
codificados en la misma cadena del DNA. PL es el promotor para los genes tardíos y LCR (Long Control
Region, región de control larga) es una región del genoma viral que no contiene genes pero sí señales para
el control de la transcripción y la replicación del DNA. A L y AE (posiciones 7175 y 4203) indican señales
de poliadenilación para genes L y E, respectivamente. Adviertase que en muchos casos existe
superposición de genes E. Los genes E6 y E7 son particularmente interesantes ya que se asocian con la
transformación celular. Abajo) Versión lineal. En la parte inferior se muestra la escala de bases del DNA.
Arriba se muestran los genes como bloques con sus límites en número de bases. Como en A, la elección del
lugar donde empieza el genoma es arbitraria. La dirección de la transcripción es de izquierda a derecha por
lo que se deduce que el extremo 5´de la cadena codificante está a la izquierda y el extremo 3´ a la derecha.
(Fundamental Virology, 3ra ed., Fields et al.,1995).

47
 Los genomas de los virus vienen en varios formatos. En la figura 14 se muestran
los más comunes entre los virus de animales.

DNA RNA
ejemplos ejemplos

circular, papilomavirus lineal Picornavirus, Togavirus

doble cadena polyomavirus simple cadena Coronavirus, Rabdovirus
Paramyxovirus

lineal lineal, segmentado,

herpesvirus Orthomyxovirus, Bunyavirus,
doble cadena simple cadena
poxvirus Arenavirus

lineal lineal, segmentado,

parvovirus Reovirus
simple cadena doble cadena

circular, parcialmente
hepadnavirus
doble cadena

Figura 14. Diversos formatos de los genomas virales. El cuadro corresponde a los genomas tal cual se
encuentran dentro de las partículas virales, ignorando el hecho de que algunos pueden cambiar de
configuración durante el ciclo infectivo dentro de la célula. Nota: los esquemas no tienen en cuenta las
diferencias de tamaño entre los genomas de los distintos grupos de virus.

¿Cómo se determina si el ácido nucleico de un virus es DNA o RNA? La forma

más sencilla es purificando virus como, por ejemplo, se ilustra en la figura 1, y luego
separando el ácido nucleico de las proteinas virales mediante cualquier procedimiento de
extracción de ácidos nucleicos (aunque estos procedimientos no son exactamente iguales
para el RNA o DNA). Estos son luego incubados con DNasa o Rnasa las cuales digerirán
selectivamente el DNA o el RNA, respectivamente. El efecto de la digestión puede
seguirse electroforéticamente o espectrofotométricamente.

48
 Genética de los virus

La razón última por la cual nos interesa la genética de los virus en Ciencias
Veterinarias es comprender cómo funcionan los genes virales en el contexto del huésped
y cómo manipulearnos para nuestro provecho. El conocimiento de la función génica es
indispensable para comprender los mecanismos íntimos por los cuales los virus producen
enfermedad. De hecho, los virus, por su relativa simplicidad, constituyen una oportunidad
única para descifrar las bases genéticas del parasitismo. Este conocimiento, a su vez,
puede sugerir nuevas estrategias para combatir o prevenir las infecciones virales.
La genética de los virus ha pasado rapidamente de la genética clásica a la basada
en las modernas técnicas de Biología Molecular. Una de las formas más poderosas para
conocer la función de un gen viral es producir un virus que no pueda expresar ese gen y
por lo tanto producir su proteina. Este mutante puede ser usado para infectar cultivos de
tejidos y/o animales y luego comparar el fenotipo de la infección con el del virus normal.

Supongamos que se construye un virus mutante al cual se le deleciona (se le

quita) un gen, el gen W. Cuando infectamos células cultivadas con el virus mutante
observamos que no se produce progenie viral. Esto puede deberse a una de muchas
razones: 1) el gen W codifica para la proteina encargada de reconocer al receptor celular,
2) el gen W codifica para una proteina esencial para el desmantelamiento de la cápside,
3) el gen W codifica para un factor de transcripción viral, 4) etc. Cualquiera de estas
razones podría justificar el fenotipo observado, esto es, la falta de producción de
progenie. En el primer caso, el virus no puede entrar a la célula; en el segundo, no puede
liberar su genoma; en el tercero, no puede expresar sus genes y por lo tanto producir las
proteinas del virus. Supongamos ahora que se toman micrografías electrónicas de las
células infectadas y, sorprendentemente, se observan partículas completas en el lugar
adecuado en tiempos tardíos de la infección. Una línea de razonamiento nos llevaría a
pensar que las posibilidades 1, 2 y 3 son falsas, y que el gen W debe cumplir algún rol en
la liberación de las partículas ya maduras. Refinamientos posteriores nos llevarán a
conocer en qué fase del ciclo infectivo el gen W resulta crucial. Por lo tanto, no nos
sorprendería constatar que cuando infectamos un animal con el virus mutante, éste no se
enferma pues el virus no puede replicarse. Provisoriamente podemos concluir que el gen
W (o si se quiere, la proteina por él codificada) es esencial para el virus, pues sin él el
virus fracasa en su objetivo: replicarse.
Supongamos ahora que se construye otro mutante del mismo virus, pero esta vez
se deleciona el gen Z. Cuando infectamos células con el mutante no encontramos
diferencias al compararlo con el virus normal. Produce progenie en la cantidad esperada y
en los tiempos esperados. Decimos que Z es un gen no esencial para la replicación viral.
Sin embargo, cuando inoculamos animales con el virus mutante, los síntomas tardan en
aparecer y la enfermedad es mucho más benigna que la causada tras la inoculación con el
virus normal o salvaje. La conclusión es que el gen Z no es esencial para la replicación
viral in vitro pero sí es importante para producir la enfermedad. La conclusión se vería
reforzada si comprobasemos que el mutante Z se replica a niveles normales en los tejidos
del animal, reforzando la idea de que las diferencias en el fenotipo no se deben a un
inconveniente en la replicación. Entonces deberiamos pensar que el gen Z cumple algún
rol modulando la interacción del virus con su huésped, quizás a través del sistema

49
inmune. Por ejemplo, la proteina Z podría interferir con alguna citokina interfiriendo con
la respuesta inmune. Al estar ausente el gen Z el sistema inmune puede eliminar mas
rapidamente al virus impidiendo que induzca patología severa. El concepto a retener es
que muchos genes virales que no parecen esenciales in vitro pueden ser cruciales para la
inducción de enfermedad en el animal.
En el pasado, los virus mutantes se obtenían accidentalmente en el laboratorio, o
se inducían específicamente con algún tratamiento. En la actualidad, con el conocimiento
de las secuencias de los genomas virales y la capacidad de alterarlos de manera
predecible mediante técnicas de DNA recombinante, los mutantes virales pueden
obtenerse sobre una base racional, ya fuera para conocer las funciones de lo genes o para
producir cepas vacunales.

Terminología

Los términos cepa, tipo, variante, y mutante se suelen emplear en Virología sin
demasiada discriminación para indicar un virus que difiere de manera heredable de una
forma parental o salvaje (“wild type” en inglés). En la mayoría de los casos, un virus
salvaje es una cepa adaptada en el laboratorio a partir de la cual se obtienen versiones
mutantes y con la cual se compara el comportamiento de dichos mutantes. Por lo tanto, el
término salvaje es un término arbitrario que se asocia a una población específica de virus.
Sabemos que en muchos casos lo que consideramos salvaje puede que no refleje con
exactitud al virus predominante en la naturaleza. Para subsanar esta arbitrariedad se
diferencia claramente entre cepas salvajes de laboratorio y nuevos aislamientos de campo
a partir del huésped natural los cuales se designan como aislamientos de campo o
simplemente aislamientos.
El término cepa (“strain” en inglés) se usa para designar diferentes versiones
salvajes del mismo virus. Por ejemplo, las cepas Orsay y New Jersey del virus de la
estomatitis vesicular, VSV (RNA, Rhabdoviridae). El término tipo se ha transformado
con el tiempo en sinónimo de serotipo, tal cual se determina con ensayos de
neutralización de la infectividad, por ejemplo los serotipos A, C, O, etc del virus de la
fiebre aftosa (RNA, Picornaviridae). El término variante se usa generalmente para
indicar un virus que es fenotípicamente distinto del salvaje pero del cual se desconoce la
base genética de la diferencia.

I) Mutaciones

I-A) Mutaciones espontaneas vs mutaciones inducidas

Algunos virus producen una alta proporción de mutantes durante la propagación

en ausencia de mutágenos. Cuando estas mutaciones espontaneas se acumulan en el
genoma terminan reflejandose en el fenotipo. La tasa de mutación en los virus DNA es
del órden de 10-8, esto es, se produce una mutación cada 100.000.000 de nucleótidos
incorporados en el genoma durante la replicación. En los virus RNA, la tasa es de 10-4, un
error cada 10.000 nucleótidos incorporados. Existe consenso en atribuir la gran tasa de
mutación de los virus RNA a la baja fidelidad de la replicación de los genomas RNA. La
baja fidelidad depende de la falta de actividad “editora” (proofreading) de las enzimas

50
que replican el RNA1. Por lo tanto, los genomas de los virus DNA son estables mientras
que los genomas de los virus RNA son inestables, a tal punto que se vuelve difícil aplicar
el concepto de “especie” cuando tratamos de un virus RNA. Para ilustrar este importante
concepto tengamos en cuenta que cuando infectamos un animal con ciertos virus RNA, es
frecuente aislar del mismo animal una población heterogenea de virus con diferencias
sustanciales a nivel genómico.
Los virólogos constantemente propagan virus en cultivos de tejidos o en animales.
Con el tiempo, las mutaciones espontaneas se van acumulando y, como resultado, las
preparaciones de virus se vuelven heterogeneas, con la subpoblación de virus salvage
representando solo una fracción del total. Para paliar este inconveniente y mantener una
población homogénea de virus, los virólogos recurren a la clonación periódica de sus
preparaciones. Aún así, probablemente se trate de una utopía mantener poblaciones de
virus genéticamente homogéneas.

La forma más sencilla de inducir mutaciones es agregar un mutágeno al medio de

cultivo durante la propagación de virus. Entre los mutágenos más usados se encuentran
los agentes alkilantes, el ácido nitroso, y los agentes intercaladores, cada uno con su
mecanismo particular de acción. El problema de esta estrategia reside en que
generalmente se obtienen múltiples mutaciones y no es posible atribuir un determinado
fenotipo a una lesión puntual del genoma. Una propiedad de las mutaciones es la
capacidad de revertir al estado salvaje, y cada mutación tiene una frecuencia
característica de reversión.

I-B) Mutaciones por diseño

Como habíamos mencionado anteriormente, las técnicas de Biología Molecular

permiten hoy introducir cualquier tipo de mutación en muchos virus. El primer paso en
esa dirección es clonar la secuencia de interés (la que queremos mutar) en un vector. El
segundo paso es someter a nuestra secuencia a algún método de mutagénesis in vitro.
Luego debemos introducir la secuencia mutada en el genoma del virus. Finalmente,
debemos asegurarnos de que cualquiera sea el fenotipo observado, el mismo se debe a la
mutación diseñada. Las técnicas para generar virus mutantes por diseño varían entre los
grupos de virus ya que el tipo de genoma y las características del virus determinan la
estrategia a seguir. Examinemos brevemente las estrategias más frecuentes.

1) Para clonar la secuencia de interés, de alguna manera debe aislarse un

fragmento del genoma que la contenga. La manera usual de hacerlo es cortando el
genoma con enzimas de restricción y separando el fragmento deseado mediante
electroforesis en agarosa. El fragmento es luego ligado en un vector, por ejemplo un
plásmido, y las moléculas recombinantes son introducidas en bacterias para su
amplificación (ver fig. 15). Mientras que este procedimiento es apropiado para virus

1
Por el contrario, las polimerasas de DNA poseen actividad editora, esto es, la capacidad de detectar un
nucleótido incorporado por error e intercambiarlo por el correcto. El hecho de que el 80% de los virus
animales sean virus RNA indica que la falta de edición no es un impedimento para tener éxito en la
naturaleza. Sin embargo, la falta de edición parece ser una limitante para el tamaño de los genomas: los
genomas de los virus RNA no sobrepasan las 32 Kb.

51
DNA de doble cadena, los de simple cadena así como los virus RNA requieren pasos
adicionales ya que las enzimas de restricción no operan sobre ellos. Por ejemplo, los
genomas de virus RNA pueden transformarse en cDNA (copia de DNA) mediante
incubación con la enzima transcriptasa reversa.
2) Una vez clonada la secuencia de interés, es posible introducir la mutación. Tres
tipos básicos de mutación pueden introducirse. La más sencilla es la deleción, en la cual
se remueve un fragmento de DNA de nuestra secuencia mediante incubación con enzimas
de restricción. La deleción es la mejor manera de obtener mutaciones nulas, que

Figura 15. Ejemplo de clonación de un gen viral

completamente inactivan la función de un gen (ver más abajo). También resultan de

interés cuando queremos averiguar la función de una parte de una proteina (en estos
casos en vez de remover el gen entero se remueve una segmento del mismo). Sin
embargo, no siempre los genomas contienen sitios de restricción adecuados para el
investigador. Para estos casos existen métodos alternativos como la mutagénesis dirigida
por oligonucleótidos o el PCR (reacción en cadena de la polimerasa), requiriendo ambos
un conocimiento previo de las secuencias involucradas. Un segundo tipo de mutaciones

52
son las llamadas mutaciones por inserción, en las cuales no se remueven secuencias del
genoma viral sino que se insertan secuencias foráneas en un lugar determinado de la
secuencia viral de interés. Un caso particular es aquel en el cual se insertan pequeñas
secuencias de DNA dentro de la región codificante del gen, que causan terminación
prematura de la cadena polipeptídica. Como resultado pueden obtenerse virus que
producen polipéptidos de largo variable con actividades parciales. El tercer tipo de
mutaciones son las denominadas mutaciones puntuales diseñadas para explorar la función
de un aminoácido en particular o de alguna secuencia regulatoria que opera en cis. En
contra de lo supuesto, la sustitución de una sola base de una secuencia puede tener
enorme repercusión en el fenotipo. La manera más frecuente de obtener una mutación
puntual es mediante mutagénesis dirigida a un sitio. Existen métodos basados en el
empleo de vectores a base de fagos como el M19 (fig. 16) o basados en PCR.
Todos los métodos mencionados tienen sus ventajas y desventajas y la elección
depende del problema que se desea estudiar. Generalmente la combinación de distintos
métodos permite contestar con mayor exactitud la pregunta formulada.

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Figura 16. Mutagénesis dirigida a un sitio para crear mutaciones por deleción (arriba) o puntuales (abajo)
de DNA viral.

3) Una vez generada la mutación debe ser introducida en el genoma viral. Existen
diversos métodos para este fin y, nuevamente, la elección del método depende del

53
sistema bajo estudio. En virus DNA medianos o pequeños el método más común es ligar
el fragmento conteniendo la secuencia mutada directamente con el genoma viral. Para
grandes virus DNA el método de la transferencia del marcador es uno de los más usados
y se basa en el proceso de recombinación homóloga. La idea central es introducir DNA
genómico viral dentro de células junto con el fragmento de DNA que contiene la
secuencia mutada. La forma más corriente de hacerlo es mediante transfección. Con baja
frecuencia, el fragmento con la secuencia mutada será insertado en el genoma viral
reemplazando al fragmento con la secuencia normal (recombinación homóloga). Para que
ello ocurra, es crítico que la secuencia mutada en el fragmento esté flanqueada por
secuencias normales. El problema aquí es cómo detectar el virus mutante producido por
las células. Como la recombinación homóloga es un fenómeno raro, dentro de la progenie
el virus mutante estará menos representado que el salvaje. Por lo tanto se debe recurrir a
algún método de búsqueda de esas raras especies. Unos pocos genes, debido a su
particular función, permiten directamente seleccionar en favor o en contra de su
expresión. Para la mayoría de los casos, pueden introducirse ciertos genes foráneos (e.g.
el gen bacteriano ß galactosidasa) junto con la secuencia mutada. La expresión de ß
galactosidasa en el virus permitirá su selección ya que las placas originadas por el virus
mutante se teñirán de azul en presencia de un sustrato cromogénico como el X-gal.
La introducción de secuencias en ciertos virus RNA se ha visto facilitada con la
producción de clones infecciosos. Básicamente, se obtiene cDNA a partir del RNA
genómico y el mismo se clona entero en un vector apropiado. De esta forma se manipula
el genoma como un vector y pueden introducirse secuencias mutadas mediante enzimas
de restricción. Luego se transfecta el vector en células las cuales producirán virus mutado
(si la mutación es viable). Otros métodos fueron desarrollados para la introducción de
mutaciones en virus RNA de polaridad negativa.
4) La necesidad de asegurarse de que los fenotipos observados son resultado de la
mutación diseñada se debe a que durante los métodos mencionados arriba pueden
introducirse cambios en otras partes del genoma. Para reducir estos problemas pueden
seguirse diversas caminos. Uno de ellos es manejarse con secuencias cortas, con el fin de
comprobar por medio de secuenciacón que no se han producido otras mutaciones. Es
conveniente obtener aislamientos virales independientes del mismo plásmido mutante. Si
los aislamientos independientes exhiben el mismo fenotipo, es probablemente debido a la
mutación diseñada. La forma más convincente, sin embargo, es mapear la mutación para
demostrar que la mutación que confiere el fenotipo se encuentra en una secuencia
definida.

I-C) Tipos de mutaciones

Se pueden obstener distintos tipos de virus mutantes. Los mejores son aquellos
fáciles de evaluar, razonablemente estables y portadores de una única mutación.
Mutaciones nulas: inactivan la función del gen. En principio, distintos cambios en los
ácidos nucleicos (deleciones, inserciones, mutaciones por cambio de marco de lectura)
pueden generar el fenotipo nulo, aunque también es posile que esos cambios dejen
intactos segmentos de la proteina que retienen la función o parte de la misma. Incluso es
posible que los cambios introducidos sean eludidos por mecanismos de traducción. Por
ello, cuando se diseñan mutaciones, conviene delecionar el gen entero, cuando esto es

54
posible. Las mutaciones nulas son especialmente convenientes para determinar si un gen
es esencial o no para un proceso en particular.
Mutaciones sensibles a la temperatura (ts): históricamente, las mutaciones ts han sido
muy útiles en Virología debido a su fenotipo condicional/letal. Las mutaciones ts pueden
producirse mediante tratamiento con mutágenos seguido de selección por temperatura. En
estas condiciones el virus crece a la temperatura permisiva (37 C) pero no a la no
permisiva (por ejemplo, a 42 C). A la temperatura no permisiva se presupone que la
proteina del gen mutado se ve impedida de alcanzar una configuración funcional,
mientras que a la temperatura permisiva adquiere dicha configuración y el mutante puede
ser propagado. En algunos virus como los reovirus y ciertos orthomyxovirus, las
mutaciones ts han servido para identificar todos los genes virales.
Mutaciones de morfología de placa: estos mutantes producen placas en cultivo con una
morfología alterada debido a alguna diferencia metabólica entre el virus mutante y el
virus salvaje. Se han obtenido mutantes sincitiales en algunos virus que causan que las
células vecinas se fusionen en vez de sufrir los cambios citolíticos usuales. Estos
fenotipos pueden proveer marcadores genéticos útiles y los mutantes pueden emplearse
para estudiar procesos tales como la fusión de membrana y el egreso del virus.
Mutaciones de escape a los anticuerpos: pueden seleccionarse mutantes con alteraciones
en las proteinas de superficie por la resistencia del virus a la neutralización por un
antisuero contra esas proteinas. Estos mutantes de escape a la neutralización pueden
luego analizarse por medio de la secuenciación del DNA para determinar las posiciones
de las mutaciones. Por medio de su reactividad frente a un panel de anticuerpos
monoclonales se pueden determinar los efectos sobre epitopes específicos. Los mutantes
de escape han sido muy útiles para analizar las proteinas de la superficie de muchos virus.

I-D) Reversión de la mutación

La reversión de un virus mutante al fenotipo salvaje puede ocurrir por 3 vías

distintas: 1) reversión por una mutación que restituye el nucleótido correcto en el sitio
original (reversión verdadera), 2) la mutación puede ocurrir en un segundo sitio del
mismo gen restaurando el fenotipo salvaje (supresión intragénica), 3) la reversión es
mediada por una segunda mutación en un gen distinto (supresión extragénica). Observese
que en los dos últimos casos se mantiene la mutación original, pero la segunda mutación
suprime el defecto resultando en un virus con genotipo alterado pero con fenotipo salvaje.
Estos dos casos son referidos como seudorevertantes para distinguirlos de los revertantes
verdaderos. La supresión extragénica tiene su utilidad en la detección y análisis de
interacciones entre proteinas o entre proteinas y DNA. El método se basa en el hecho que
el fenotipo mutante de una proteina o de una secuencia reguladora de DNA es suprimido
por medio de interacción física con una segunda proteina mutante (supresor). Esto
requiere que el supresor sea específico de alelo. El aislamiento de supresores para
mutaciones en el origen de replicación del DNA del virus SV40 (DNA, Papovaviridae),
permitió mapear la mutación dentro del antígeno T (un gen de SV40), demostrando que
el antígeno T interactúa con el origen de replicación in vivo.
En algunos virus RNA, la frecuencia de supresión extragénica es muy alta. Ello
suiere que en estos virus la supresión es un mecanismo por el cual los virus RNA eluden
los efectos de mutaciones deletereas. Otro aspecto en el cual la supresión se vuelve un

55
mecanismo importante es en producción de vacunas. Durante un ensayo de vacunación
con una vacuna del virus de la influenza que había sido atenuada por la presencia de
mutaciones ts, se originó un seudorevertante. Ensayos realizados con voluntarios
revelaron que el seudorevertante había adquirido el fenotipo salvaje como resultado de
una supresión (o supresiones) de las mutaciones atenuantes.

I-E) Heterocigosis en los virus

En genética de organismos superiores la heterocigosis implica que los

cromosomas diploides difieren en marcadores alélicos en uno o más locus. Este tipo de
fenómeno no suele observarse en los virus de los animales porque, salvo excepciones, los
genomas de estos virus son haploides. Una excepción importante son los retrovirus
(RNA, Retroviridae). El genoma de los retrovirus consiste en dos moléculas idénticas de
RNA de simple cadena. Por lo tanto, los retrovirus pueden ser heterocigotas para todos
los marcadores. Algunos virus DNA como los herpesvirus (Herpesviridae) poseen
secuencias repetidas en su genoma lo cual permite que algunos genes estén presentes en
dos copias. Aunque las copias en el genoma son generalmente idénticas, se han
demostrado casos de heterocigosis donde la misma afecta la isomerización del genoma
que ocurre en los herpesvirus.

I-F) Base genética de la adaptación

En la mayoría de los casos, los investigadores deben propagar los virus fuera del
huésped natural para facilitar sus estudios. Ello requiere propagación en animales de
laboratorio o en líneas celulares para los cuales los virus aislados no se encuentran
adaptados. Cuando se usan animales de laboratorio (ratón, rata, hamster, conejo, etc) se
observan diversas situaciones. Estos animales pueden o no reflejar la enfermedad tal cual
se presenta en el huésped natural. Si la reflejan, puede que solo lo hagan en las
inoculaciones iniciales. En algunos casos, el animal de laboratorio no reproduce las
características de la enfermedad pero, con los pasajes sucesivos, las mismas aparecen. De
la misma manera, muchos aislamientos crecen pobremente en líneas celulares pero, con
los pasajes sucesivos, se llegan a obtener altos títulos virales.
Cualquiera sea el método utilizado, se llega a una etapa en la cual el virus se
adapta al sistema de propagación. La adaptación va acompañada de cambios genéticos
que, en general, atenúan al virus respecto a su huésped natural. Por ejemplo, el pasaje
sucesivo del virus de la hepatitis canina (DNA, Adenoviridae) en células de riñón porcino
disminuye la patogenicidad del virus para el perro. Las mutaciones que acompañan a la
adaptación pueden caracterizarse por alguno de los métodos mencionados en este
capítulo y suelen revelar genes que son importantes para la patogenicidad en el huéped
natural.

56
II) Interacciones entre virus que afectan el fenotipo

II-A) Mezcla de fenotipos

Cuando se infectan células con dos virus distintos pero relacionados (por ejemplo,
poliovirus y virus Coxsacky, RNA, Picornaviridae), la progenie resultante contiene
proteinas estructurales provenientes de ambos virus parentales. Esta mezcla de genomas y
proteinas estructurales produce partículas virales en las cuales las propiedades fenotípicas
del virión no reflejan el potencial fenotípio del genoma. Sin embargo, en una infección
subsecuente la expresión del genoma resulta en progenie con genotipos y fenotipos
cognados. Por lo tanto, la mezcla de fenotipos es un fenómeno transitorio. Se observa con
mayor frecuencia en pequeños virus sin envoltura. ¿Ocurre la mezcla de fenotipos en la
naturaleza? ¿cuáles podrían ser sus consecuencias?

II-B) Partículas defectuosas e Interferencia

Aunque existen muchos tipos de interferencia entre virus, desde el punto de vista
genético la de mayor interés es la interferencia homóloga que ocurre dentro de la célula
entre virus estrechamente relacionados.
En cualquier preparación de virus, el virus infeccioso representa sólo una fracción
del virus total. Aunque el virólogo no lo desea, las preparaciones comienzan a acumular
partículas defectuosas. Esto es más notorio cuando se pasan de manera seriada virus a
alta multiplicidad (esto es, alta proporción de viriones relativo al número de células
presentes)2. En estas condiciones se observa que la cosecha de virus infeccioso es menor
con cada pasaje sucesivo. Esto se interpreta como una interferencia con la población
infecciosa de nuestra preparación. Cuando se analizan las preparaciones se puede
demostrar que muchas partículas poseen genomas con deleciones. Se postula que los
mutantes de deleción interfieren con la replicación del virus salvaje (infeccioso) al
competir por los componentes del aparato de replicación. Por ello, estas partículas se
conocen como partículas defectuosas o partículas DI (del inglés Defective Interfering
particles). El hecho que las partículas DI posean defectos genómicos hace que no puedan
crecer autónomamente. Para hacerlo, requieren la presencia de virus completo el cual
aporta las funciones faltantes en las partículas DI. Así, el virus salvaje se comporta como
un virus “colaborador” o “helper”. Estrictamente hablando, si las células usadas para
propagar el virus defectuoso aportaran las funciones virales faltantes, no sería necesaria
la presencia de un virus helper. De hecho, líneas celulares capaces de expresar genes
virales se producen con frecuencia en los laboratorios. Estas líneas son ideales para
propagar virus con lesiones genéticas letales.
Las partículas DI también se forman durante la infección de animales pero se
desconoce como contribuyen al curso de la enfermedad. También se han encontrado
partículas DI en preparaciones de vacunas atenuadas vivas, disminuyendo la eficacia de
la inmunización.
Un caso particular de virus defectuosos son los virus satélites los cuales requieren
de otros virus, a menudo no relacionados, para su replicación. El ejemplo clásico son los
virus asociados a adenovirus (AAV, Adeno-associated virus, DNA, Parvoviridae),
2
Por ello es deseable propagar los virus a baja multiplicidad de infección.

57
pequeños virus icosaédricos cuyo genoma codifica solo para tres proteinas, todas de la
cápside. Estos virus sólo pueden replicarse en el núcleo celular si coexisten en la célula
adenovirus o herpesvirus. Al hacerlo, interfieren con la replicación del virus helper. El
virus hepatitis delta (RNA, sin familia asignada) es un virus satélite de humanos que
requiere la presencia del virus de la hepatitis B (HBV, DNA, Hepadnaviridae) para su
replicación. Su presencia en personas se asocia con las formas más severas de hepatitis
crónica y aguda.

III) “Mapeo” de genes y de mutaciones

En la jerga genético-molecular “mapear” (del inglés, mapping) una mutación

significa asignar un fenotipo mutante a un gen específico. Muchas veces, el proceso
puede conducir a la identificación misma de un gen. Inicialmente, el mapeo de
mutaciones se basó en el proceso de recombinacón, esto es, en la interacción física entre
genomas virales dentro de la célula. En virus DNA, la forma más común en que esto
ocurre es por ruptura y pegado de secuencias. Si se coinfectan células con dos virus
mutantes, se forma progenie con genomas que contienen información genética en
combinaciones no parentales. En virus con genomas monopartitos, la probabilidad de
ocurrencia de un evento de recombinación entre dos mutaciones es proporcional a la
distancia física que separa a las mutaciones en el genoma. Esto permite ubicar las
mutaciones en mapas lineales.

P
a
r
en
t
al
es R
e
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t
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te
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Figura 17. Cruzamiento intertípico entre mutantes ts de reovirus. Se muestran diagramáticamente los
segmentos genómicos parentales luego de la electroforesis en poliacrilamida (izquierda). Cada serotipo
parental tiene un patrón único de corrida. En los reasortantes puede deducirse el origen de cada segmento
de acuerdo a su movilidad.

58
 En virus con genomas segmentados tales como los de reovirus o el virus de la
influenza (RNA, Reoviridae y Orthomyxoviridae, respectivamente), la recombinación
adquiere un sentido diferente. Cuando se coinfectan células con dos mutantes de reovirus,
los segmentos genómicos son segregados al azar entre la progenie; aquí no hay ruptura y
pegado de secuencias. En la literatura inglesa se utiliza el término reassortment
(reasociación) para referirse al proceso. En la figura 17, se esquematiza un experimento
de “cruzamiento” entre dos mutantes ts de reovirus (cruzamiento intertípico).

Actualmente, el mapeo de mutaciones se basa en métodos moleculares, sobretodo

en la secuenciación de ácidos nucleicos. El análisis posterior de las secuencias seguida de
experimentación ha revolucionado la forma en que identificamos los genes virales y las
mutaciones. Por ello lo trataremos con algún detalle en la siguiente sección.

IV) Secuenciación de DNA

Determinar la secuencia de un virus tiene varias ventajas. Actualmente existen

programas de computación que permiten analizar la secuencia y extraer información
relevante. Por ejemplo, es posible una inmediata aproximación al número total de genes
virales. Al leer una secuencia estos programas pueden detectar un marco de lectura
abierto u ORF (Open Reading Frame) que, si no son interrumpidos por señales de
terminación, sugieren la presencia de secuencias codificantes (genes). Incluso ORFs
cortos que pueden solapar otras secuencias codificantes pueden codificar proteinas,
particularmente por vía del splicing del RNA. El virus del SIDA (HIV-1, RNA,
Retroviridae) es un claro ejemplo de un virus que hace uso extensivo del solapamiento de
ORFs cortos.
Una vez detectados los ORFs (potenciales genes3), se puede tener idea de la
función de la proteina codificada usando otros programas que comparan la secuencia de
la proteina viral con otras proteinas (virales y no virales) de secuencia similar y función
conocida. Por ejemplo, un análisis semejante del genoma del virus vaccinia (DNA,
Poxviridae) detectó un ORF similar al utilizado por factores de crecimiento celulares. La
predicción era que el virus codifica para un factor de crecimiento, lo cual fue
posteriormente corroborado. El análisis de la secuencia predecida de la proteina puede
revelar otros rasgos importantes. Por ejemplo, las glicoproteinas de membrana poseen
una serie de señales características. Si estamos tratando con un virus envuelto, cualquier
secuencia con esas caracteristicas es candidata a pertenecer a una glicoproteina de la
envoltura. De la misma manera, es posible detectar señales típicas de promotores, señales
de splicing, señales de poliadenilación, etc, ya que las mismas han sido conservadas a lo
largo de la evolución del universo eucariota4.
A pesar que tales análisis de secuencia tienen gran valor predictivo, no dejan de
ser justamente predicciones. El virólogo sabe que luego del análisis le sigue la
experimentación, esto es, demostrar que un gen hipotético es un gen real, que la

3
Los llamaremos potenciales hasta que experimentalmente constatemos que codifican una proteina
4
Como los virus animales han coevolucionado con sus huéspedes, no es de extrañar que conserven los
mecanismos básicos utilizados para la expresión de sus genes.

59
secuencia asignada como gen, realmente termina expresada en forma de una proteina con
una secuencia de aminoácidos acorde a los codones del ORF. En este sentido son
fundamentales los mapeos de transcriptos, o sea, mRNAs, para interpretar los datos del
análisis de secuencias. Ténicas como la extensión del primer o el mapeo S-1 brindan
datos acerca del comienzo del transcripto y la estructura de exones e intrones del gen. Los
métodos de traducción in vitro pueden usarse para mapear proteinas presentes en las
células infectadas a regiones específicas del genoma viral.
La determinación final de la función de un gen y de su regulación solo es posible
mediante uno o varios métodos, algunos de los cuales se describen a continuación.

V- Determinación de la función génica

V-A. Complementación

La complementación se refiere a la interacción de productos génicos virales en

células co-infectadas que resulta en la producción favorecida de uno o ambos mutantes
parentales al tiempo que sus genotipos permanecen inalterados. Esta definición refleja el
hecho de que uno o los dos virus mutantes proveen una proteina que le falta al otro,
permitiendo que uno o ambos virus se repliquen en la célula. Si los dos virus son
defectuosos en la misma proteina, ninguno va a poder complementar al otro.
De esta manera, el ensayo de complementación puede usarse para reunir mutantes
virales en grupos funcionales o grupos de complementación. Si dos mutantes no se
complementan decimos que tienen el defecto en el mismo gen. En teoría, pueden haber
tantos grupos de complementación como genes tiene el virus, pero como muchas
mutaciones son letales y algunos genes no son esenciales, siempre se obtienen menos
grupos que genes.
La forma más fácil de realizar el ensayo de complementación es con mutantes ts.
Supongamos que tenemos dos mutantes, ts1 y ts2. Infectamos algunas células con ts1, otras
con ts2, y un tercer grupo con ambos mutantes a la vez. Se incuban las células infectadas a
la temperatura no permisiva y después de un tiempo se determina la producción de virus
en los tres casos a la temperatura permisiva. Con los tres valores se calcula un índice de
complementación, como se muestra a continuación:

título en la infección mixta IC

título con ts1 + título con ts2

En teoría, cualquier valor mayor que 1 indica complementación, pero generalmente se

usa el valor 2 como límite para corregir el efecto de otros factores.
Se observan dos tipos de complementación. La más típica es la denominada
complementación no alélica o intergénica en la cual mutantes en dos genes diferentes se
asisten mutuamente para replicarse. La complementación no alélica ha sido muy útil en la
cacarterización de genes en virus animales. La complementación alélica o intragénica,
mucho menos frecuente, ocurre cuando el producto génico (proteina) defectuoso en
ambos mutantes es una proteina multimérica, y cada mutante tiene defectos en distintos
dominios de la misma proteina.

60
 En conclusión, el virólogo que desea caracterizar los genes de un virus empieza
por inducir mutaciones ts, por ejemplo, utilizando un mutágeno en el medio de cultivo.
Luego de seleccionar los mutantes de acuerdo a su comportamiento frente a los cambios
de temperatura, realiza ensayos de complementación tal cual lo describimos, y termina
con sus mutantes encasillados en grupos de complementación. Un resultado típico se
muestra en la figura 18. Estos ensayos son extremadamente útiles en virus en los cuales
no hay recombinación, como en los togavirus, rhabdovirus y paramyxovirus (RNA).

De acuerdo a lo visto en II-B, la complementación es un fenómeno que ocurre

durante el pasaje de los virus en cultivo de células. Las partículas DI se mantienen en la
población por complementación con un virus helper. Otro ejemplo son los retrovirus
(RNA, Retroviridae). Un subgrupo denominado retrovirus agudos suelen poseer
deleciones que los vuelven defectuosos. Para propagar estos virus se requiere de un virus
relacionado pero competente para la replicación que “rescate” al defectuoso por
complementación.
.

Nivel de complementación en infecciones mixtas con

Grupo de com-
plementación Mutante

Figura 18. Complementación entre mutantes ts del virus Sinbdis

V-B Estudio de genes virales fuera del genoma viral

Rescate del marcador: este método es una variante de la complementación, pero en vez
de usar dos virus mutantes se usa uno solo. Básicamente, se infectan células con el
mutante y, a continuación, se introduce en las células un fragmento de genoma del virus
salvaje por transfección5. Supongamos que tenemos un virus mutante pero no sabemos

5
Transfección es el término que alude a la introducción de ácidos nucleicos dentro de las células. Para ello
se requiere purificar el DNA (e.g. un vector conteniendo un fragmento de DNA viral) para luego
adicionarlo al medio de cultivo en forma de coprecipitado con fosfato de calcio (método del fosfato de

61
donde se localiza la mutación. Podemos purificar DNA genómico viral a partir del virus
salvaje y cortarlo en fragmentos con enzimas de restricción, de tal manera que los genes
virales quedan ahora repartidos entre distintos fragmentos de DNA. Infectamos varias
placas de cultivo con el virus mutante (el cual es defectuoso y por lo tanto no producirá
progenie viral) y, a continuación, transfectamos cada placa con un fragmento distinto de
DNA del virus salvaje. En aquellas placas en las cuales no detectamos virus, los
fragmentos salvajes de DNA no han podido suplir el defecto en el mutante. Si en una
placa detectamos producción de virus, interpretamos que el fragmento de DNA de la cepa
salvaje contiene el gen en el cual el mutante es defectuoso. En otras palabras, el
fragmento “rescata” el defecto del mutante y le permite replicarse (fig 19).
La ventaja del método es que permite una asignación cuasi-inmediata ya que el
fragmento que complementa al mutante ya está clonado y lo único que resta es la
identificación del gen (e.g. mediante secuenciación). La estrategia ha tenido y tiene sus
utilidades adicionales. Hemos mencionado que existen mutaciones en los virus que son
letales, esto es, no son toleradas por el virus. Estos mutantes son difíciles sino imposibles
de propagar y, por lo tanto, de examinar funcionalmente. Una forma de solucionar el
problema es transfectar establemente células con la versión normal del gen, de tal forma
que las células expresen constitutivamente la proteina viral. Al infectar estas células con
el virus mutante, las células complementan el defecto y se obtiene progenie viral6.

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Figura 19. Diagrama mostrando un caso hipotético donde el gen B complementa el defecto del virus
mutante.

calcio) o en asociación con liposomas. Un porcentaje de las células captura el DNA y lo expresa en su
proteina correspondiente. Como el DNA foraneo no se integra a los cromosomas celulares, la expresión es
transitoria, alcanzando su pico a las 48-72 hs. Otros métodos existen para forzar la integración y permitir la
expresión prolongada del gen (transfección estable).
6
Observese que la lesión génica del mutante no resulta corregida. La única razón por la cual puede
replicarse es porque las células operan como un helper aportando la función faltante.

62
Interferencia de los productos génicos: aunque la construcción de mutantes por diseño es
actualmente el método de elección para el análisis de las proteinas de los virus, otros
métodos promisorios están en desarrollo con el fin de aplicarlos en virus donde no es
sencillo obtener mutantes. Uno de tales métodos es la interferencia de genes virales
específicos mediante ácidos nucleicos. Supongamos que queremos conocer el efecto de
una proteina viral específica en la fisiología celular o en la replicación viral. Se puede
sintetizar en el laboratorio moléculas de RNA antisentido7. Cuando se introduce el RNA
antisentido en células infectadas, el mismo se uniría al mRNA por complementariedad de
bases formando un duplex de RNA. El mRNA en estado de duplex no puede ser
traducido por los ribosomas. La especificidad del RNA antisentido por su mRNA
complementario garantiza que sólo la proteina de interés va a resultar bloqueada.
Animales transgénicos: una forma de analizar la función de productos virales en el
contexto no ya de una célula cultivada, sino del organismo, es la producción de animales
que expresen una determinada proteina viral. Básicamente, un fragmento conteniendo el
gen viral bajo el control de secuencias regulatorias apropiadas, es introducido en oocitos
fecundados (generalmente de ratón) mediante microinyección. Los embriones son luego
transferidos a hembras receptoras. Con cierta frecuencia, el gen viral (transgen) es
integrado tempranamente en el genoma del embrión y ,como consecuencia, va a estar
presente en todas o algunas células del animal. Un ejemplo del uso de estas técnicas en
Virología fue el análisis del gen para la proteina T (antígeno T grande) del virus SV40
(Simian Virus 40, DNA, Papovaviridae), un oncogen viral. Se microinyectaron
embriones con distintos segmentos del gen T y se correlacionó el fenotipo de los tumores
en los animales transgénicos con los distintos dominios de la proteina T.

Vectores virales

Los virus son un excelente vehículo para introducir genes virales (o celulares) en
células de mamífero. Dependiendo del virus utilizado como vector, los genes pueden
expresarse de manera transitoria o estable. Los adenovirus, herpesvirus y retrovirus se
utilizan para transferir genes dentro de las células. Sin embargo, para convertirlos en
verdaderos vectores, estos virus deben modificarse genéticamente para atenuar aquellas
funciones que los vuelven líticos para las células.
Los vectores virales se utilizan en dos áreas principales: 1) para estudios de
inmunología y construcción de vacunas; 2) para introducir genes celulares con fines
terapéuticos (terapia génica). Trataremos con más detalle este tópico al final del curso.

7
En la literatura anglosajona, las dos cadenas complementarias del DNA se indican como sense (sentido) y
antisense (antisentido). La cadena sense es la que tiene la misma secuencia que el mRNA (excepto que las
U del RNA están representadas por T en el DNA) ; la antisense es la que sirve de templado para la
transcripción y su secuencia es complementaria a la cadena sense y al mRNA. Por lo tanto, un RNA
antisense tiene una secuencia complementaria al mRNA e idéntica a la cadena antisense del DNA.

63
 Ciclo infeccioso de los virus
Los virus requieren células intactas para multiplicarse. En este sentido,
las envolturas del virión deben visualizarse como un dispositivo para: 1)
proteger al genoma viral durante la fase extracelular del virus, 2) garantizar la
entrega del genoma viral a la maquinaria biosintética celular apropiada. Una
vez dentro de la célula, el virus usurpa esta maquinaria para replicar su
genoma y producir las proteínas del virión. Como consecuencia, la célula,
privada de materiales esenciales y expuesta a productos virales potencialmente
tóxicos, muere, al tiempo que la progenie viral es liberada. Este esquema
típico de multiplicación viral ha sido analizado al detalle en cultivos celulares
infectados.
En la fig. 1 se muestran las tres etapas típicas del crecimiento viral en cultivos
celulares. Durante un tiempo luego de la inoculación con el virus parental 1,
solo pequeñas cantidades de virus pueden detectarse. Este periodo,
denominado fase de eclipse, dura unas horas dependiendo del tipo de virus, y
en ese lapso el virus parental se adhiere y penetra las células. Luego le sigue
un intervalo en el cual la progenie viral comienza a acumularse
exponencialmente en las células o fuera de ellas. Es la fase de maduración y
liberación. A medida que la cantidad de virus de progenie aumenta, las células
comienzan a morir y, con ello, decrece la producción viral (fase de
decaimiento). El ciclo descripto describe el comportamiento de virus líticos
(e.g que inducen la muerte celular) durante una infección productiva, esto es,
que resulta en la producción y liberación de progenie. La cantidad de virus
producido varía con el tipo de virus pero puede oscilar entre 20.000 y 100.000
partículas por célula infectada.
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Figura 1. Ciclo infectivo de los virus en cultivos celulares

1
En oposición al virus de la progenie, producto de la multiplicación en el cultivo.

64
 No todos los virus son líticos ni todas las infecciones son productivas,
lo cual sugiere que la modalidad del ciclo infectivo es variable. Es más,
algunos virus resultan líticos para algunos tipos celulares y no líticos en otros.
El tipo o tipos celulares infectados por un virus se conoce como rango de
huésped2. Existen virus con rangos de huésped amplios, mientras que otros
solo pueden infectar un tipo celular (o especie animal). La capacidad de un
tipo celular (o especie animal) de ser infectado por un virus viene especificado
por el término susceptibilidad. Así, podemos decir que las células epiteliales
son susceptibles al virus influenza A, o que el ratón no es susceptible al
herpesvirus bovino. Que un tipo celular sea susceptible a un virus no implica
necesariamente que produzca y libere progenie viral. La capacidad de un tipo
celular de garantizar la multiplicación completa del virus se indica con el
término permisividad.
La infección de células susceptibles puede ser productiva, abortiva,
restrictiva o latente. La infección productiva ocurre en células permisivas.
Aunque la célula sea susceptible puede no ser permisiva para el virus: el virus
puede entrar en la célula pero ningún gen o solo unos pocos genes virales
pueden expresarse. En este caso estamos frente a una infección abortiva. En
otros casos, las células pueden ser permisivas transitoriamente y las
consecuencias son que el virus permanece en las células hasta que las mismas
se vuelvan permisivas, o bien solo una fracción de las células de la población
producen virus en un momento determinado. Este tipo de infección se conoce
como restrictiva. En la infección latente, el genoma viral persiste pero no
existen partículas virales dentro de la célula. En algunos casos de persistencia
viral, los genes virales interfieren con las funciones celulares que controlan el
crecimiento resultando en la transformación celular. No solo la célula no se
muere como producto de la infección sino que la misma se multiplica
descontroladamente.
La cadena de eventos que ocurren desde que un virus toma contacto con
una célula, hasta la progenie viral la abandona, se denomina ciclo infeccioso
celular y, para su estudio, se ha dividido en las siguientes fases:

1. Adhesión/Anclaje: Las proteínas de cápside o envoltura del virus

establecen su primer interacción con una molécula celular.

2
También se usa el término para indicar la especie o especies animales infectadas por el virus.

65
2. Entrada: Componentes del virión cruzan la barrera de la membrana
citoplasmática.

3. Denudamiento: Liberación del ácido nucleico en el sitio de replicación

4. Replicación: Producción de nuevas proteínas y ácidos nucleicos virales

para formar nuevos viriones

5. Ensamble o ensamblaje: Reunión y ordenamiento de todos los

componentes virales neosintetizados para la formación de nuevos viriones

6. Maduración: Reorganización de algunos componentes del virión para que

se convierta en infectivo

7. Egreso/Salida: Liberación de los nuevos viriones al espacio extracelular

Adhesión

Receptor: Molécula a la que el virus se une para ingresar a una célula.

Para algunos virus el receptor es la única molécula con la que necesita

interactuar para entrar en la célula. Para otros, solo la unión al receptor no es
suficiente para desencadenar el ingreso, en estos casos requieren la interacción
con otras moléculas de la superficie celular, a las cuales se las denomina
Correceptores.
La susceptibilidad de una célula a la infección depende de la disponibilidad
de receptores (y correceptores) en la superficie celular. Las células de pollo
no son susceptibles a la infección con el virus de la polio (RNA,
Picornaviridae) porque no poseen receptores para el virus. Pero si se inyecta el
genoma viral dentro de estas células, se produce progenie viral en gran
cantidad. Por lo tanto, las células de pollo son permisivas a la infección.
Evolutivamente los virus parecen haber seleccionado como receptores
moléculas que son muy abundantes en las células del huésped (incluyendo las
permisivas y las no permisivas) o aquellas que solo están presentes en
determinado tipo celular (a pesar de que otros tipos celulares puedan ser
permisivos). Por ejemplo, el virus de influenza utiliza como receptor una
molécula de ácido siálico la cual esta ampliamente distribuida por el
organismo, sin embargo no todas las células del cuerpo son permisivas, en este
caso el tropismo esta determinado por factores intracelulares. En las cepas
altamente patógenas de influenza aviar, uno de los principales factores

66
implicados en la patogenia, es la capacidad de estas cepas de aumentar su
tropismo, e infectar productivamente órganos que comúnmente no son
afectados por las cepas de baja patogenicidad, que sólo tienen tropismo
respiratorio y digestivo. En otros casos, como el Virus de Hepatitis B (HBV) o
los Virus de Inmunodeficiencia Humana (HIV) y Felina (FIV), los receptores
solo están presentes en un determinado tipo celular (hepatocitos y células de
sistema inmune respectivamente) lo cual no implica que sean las únicas
células permisivas.
Vemos entonces que el tropismo de un virus por determinado tejido no es
solamente causa de la presencia o ausencia de receptores en la membrana
celular.
Debido a que los receptores son moléculas con variada función celular, la
unión a ellas no solo permite la entrada del virus sino que, en muchos casos,
desencadena una cascada de señales citoplasmáticas que favorecen la
infección.
La interacción virus-receptor, puede ser de tres tipos:
A. Receptor simple: un solo receptor es el mayor responsable del ingreso
a la célula. Es el caso del receptor Pvr de Poliovirus, y el ácido siálico
para Influenza (Fig 2)

Figura 2. Estructura del Acido Siálico. Molécula utilizada como receptor

por el virus Influenza

67
B. Co-receptor: hay un receptor principal pero se requiere de otra
molécula para asegurar la entrada. En HIV la proteína gp 120 se une al
receptor CD4 en todas la células que infecta. Pero aquellas cepas que
infectan macrofagos requieren de la interacción con Ccr5 para poder
ingresar al citoplasma. Las cepas que infectan linfocitos T utilizan
tambien gp120 como receptor pero un correceptor distinto (CXCr4).
(ver fig.3)

Figura 3. Receptores y Correceptores utilizados por distintas variantes

de HIV

C. Receptores alternativos: Un virus puede utilizar más de un receptor en

el animal o en diferentes especies animales. El virus rábico se une al
receptor de la acetilcolina en la placa neuromuscular, pero también
utiliza las NCAM (Neural Cell Adhesion Molecule) para ganar acceso
al SNC.
También es posible que algunos virus que poseen baja afinidad por un
receptor que no es el habitualmente utilizado, muten sus proteínas de
superficie hasta alcanzar una afinidad igual o mayor a la que tenían por
su receptor original. Esto puede lograrse en el laboratorio infectando
células que normalmente no son susceptibles luego de varios pasajes
ciegos o muchas veces es lo que ocurre cuando los virus “saltan de
especie” e infectan huéspedes que no eran susceptibles con
anterioridad.

68
Los virus también pueden ingresar a células que no posean receptores
específicos mediante dos procesos: por fusión de células sanas con células
infectadas y por medio de la formación de complejos antígeno-anticuerpo que
luego son fagocitados por células permisivas.( ver fig. 4)

Fig. 4. Vias de entrada alternativas. ADEV (entrada mediada por anticuerpos)

FMDV (Virus de Fiebre Aftosa) EBV ( Virus Epstein Barr )

Entrada

En algunos casos la entrada y el denudamiento pueden estudiarse como

eventos diferentes, pero en otros, puede considerarse que ocurren en
simultaneo.
Es ampliamente aceptado que la membrana plasmática no es permeable a
partículas del tamaño de los virus, sin embargo los virus deben atravesarla sin
producir daño en la misma, y de esta forma, mantener la integridad celular.
Para esto, utilizan mecanismos de transporte que la célula normalmente utiliza
para incorporar grandes moléculas.

69
La célula posee mecanismos inespecíficos (fagocitosis, pinocitosis) y
específicos (endocitosis mediada por receptor) para ingresar partículas al
citoplasma. Todos estos procesos no son pasivos sino que requieren un gasto
de energía e involucran procesos fisiológicos de la célula como endocitosis,
fusión de membranas, transporte al núcleo, etc.
La mayoría de los virus ingresan en las células por mecanismos específicos,
especialmente endocitosis mediada por receptor.

Virus Envueltos

Todos los virus envueltos deben fusionar su envoltura con alguna membrana
celular para poder ingresar a la célula.
En algunos casos la fusión ocurre a nivel de la membrana citoplasmática (fig.
5a y b) y en otros puede ocurrir a nivel endosomal o lisosomal (fig. 5c).
Pero la fusión de membranas no es un proceso que ocurre al azar. Ocurre todo
el tiempo dentro de las células o incluso entre células y por lo tanto esta
finamente regulado. De otro modo las células constantemente se fusionarían
entre sí, las organelas celulares se fusionarían y la célula sería un caos. Incluso
los virus envueltos se fusionarían entre sí y perderían infectividad.
Todas las membranas (celulares y envolturas virales) contienen proteínas
integrales que pueden interactuar con proteínas de otras membranas. Alguna
de estas proteínas portan lo que se conoce como péptido de fusión, una
porción hidrofóbica capaz de anclarse a otra membrana y permitir el
acercamiento estrecho de las mismas. El péptido de fusión no esta siempre
expuesto y listo para ejercer su función, sino que se encuentra oculto o
enmascarado dentro de la proteína hasta que algún estimulo especifico
(cambio de PH, acción enzimática, interacción con otras proteínas) produzca
un cambio conformacional y lo exponga.
Muchas de las reacciones de fusión de membrana que ocurren normalmente
dentro de la célula, fueron esclarecidas a partir de estudios con proteínas de
fusión virales.
En algunos casos el péptido de fusión puede estar en la misma proteína que el
virus utiliza para su anclaje y en otros estar en una proteína distinta (también
de envoltura), veremos ejemplos de estas variantes a continuación.

70
 Figura 5. Diferentes mecanismos de entrada a la célula.

Entrada por fusión a nivel de membrana plasmática

Proteínas de anclaje y fusión separadas: El ejemplo mas estudiado de

medicina veterinaria son los Paramixoviridae (Distemper, Newcastle). La
proteína HN es la encargada de proveer el anclaje a la célula y la proteína F es
la portadora del péptido de fusión. Como puede verse en la Fig. 6a, F tiene dos
subunidades F1 y F2. El péptido de fusión se encuentra en el extremo de la
porción F1 oculto por la porción F2. Para algunos paramixovirus, la sola
interacción de HN con su receptor parece ser suficiente para provocar un
cambio conformacional de F de modo que el péptido de fusión puede
insertarse en la membrana celular. En otros paramixovirus, esta comprobada la
necesidad de una segunda proteína celular que interactúa con F y es
responsable del reordenamiento proteico que conlleva a la fusión.
Este proceso ocurre siempre a PH neutro por lo tanto debe estar muy bien
regulado para que ocurra en tiempo y lugar correcto.

71
 Figura 6. Mecanismos de fusión a nivel de membrana citoplasmática.

Una única proteína como mediadora de anclaje y fusión: un ejemplo de

virus que utilizan esta estrategia es el de los Retroviridae. (fig. 6b)
La glicoproteína Env está formada por 2 subunidades, SU y TM (portadora del
péptido fusión). Reconoce su receptor a través de SU y en ese momento se
produce un desplazamiento de las subunidad TM que permite acercar el
péptido de fusión a la membrana celular. Este modelo se aplica, por ejemplo,
al Virus del sarcoma y luecosis aviar (ASLVs) mientras que los virus FIV y
HIV necesitan que la SU interactúe, además, con un correceptor (CCR) para
que se produzcan los cambios en la TM.

Entrada por vía endocítica

Otros virus envueltos entran por endocitosis mediada por receptor y por lo
tanto deben traspasar, en este caso, la membrana endosomal para ingresar al
citoplasma (fig. 5c).
El caso mas ampliamente estudiado y que tomaremos como ejemplo es el del
virus Influenza.

72
Este virus interactúa con su receptor (Acido Siálico) por medio de su principal
glicoproteína de envoltura, la hemoaglutinina (HA) (fig. 7). Esta proteína fue
una de las primeras proteína de fusión descubiertas y por ende fue estudiada
en detalle. La HA se encuentra en la envoltura del virus formando un
homotrímero (tres proteínas idénticas), en el cual cada monómero presenta dos
subunidades (HA1 y HA2) unidas por un puente disulfuro. HA1 forma una
cabeza globular y contiene el sitio de reconocimiento para el receptor, es la
porción genéticamente más variable de la proteína y sus mutaciones son las
responsables de las variantes antigénicas que año tras año escapan a la
inmunidad adquirida por la población. HA2 tiene forma fibrilar, uno de sus
extremos contiene una porción de trasmembrana responsable de la unión a la
envoltura y el otro contiene el péptido de fusión en una región que se
encuentra oculta por HA1 cuando el virus se encuentra fuera de la célula.

Fig. 7. Estructura de la proteína HA de Influenza.

73
Cuando HA1 toma contacto con el receptor se produce una cascada de
señalización intracelular que desencadena la endocitosis (fig. 8). Una vez
formado el endosoma, el mismo se acidifica por importación de iones H+ y
este cambio de PH produce un cambio conformacional de la HA dejando
expuesto el péptido de fusión lo que desencadena la entrada de las
Ribonucleoproteínas virales (vRNPs) al citoplasma. En este caso se produce
en simultaneo el denudamiento que también es dependiente de PH. La
envoltura viral contiene una proteína M2 que es un canal de iones (el más
pequeño descripto hasta el momento) por lo tanto a medida que se acidifica el
endosoma también lo hace el interior del virión y como consecuencia las
vRNPs se disocian de la proteína de matriz M1 quedando libres para poder
ingresar al núcleo.

Figura 8. Mecanismo de fusión de virus Influenza

Virus No Envueltos

Los virus carentes de envoltura deben traspasar las membranas celulares sin la
posibilidad de utilizar un proceso de fusión. Deben romper estas barreras sin
comprometer la integridad de la célula de la cual depende para su posterior
replicación. Se reconocen entonces dos mecanismos principales para sortear
este obstáculo, producir pequeños poros en las membranas o desintegrar

74
algún componente membranoso que no sea vital para la célula (p.e. el
endosoma). Para graficar estos mecanismos presentaremos algunos ejemplos.

Ruptura de la membrana endosomal: Un caso bien estudiado de virus que

utilizan esta estrategia es el de los Adenoviridae.
Recordemos que la cápside de los mismos se caracterizan por poseer proteínas
que protuyen de la misma en forma de fibras (proteína IV) (ver fig. 9).
El extremo de dichas fibras es el encargado del reconocimiento del receptor,
mientras que la parte basal se encuentra anclada a un pentámero de una
segunda proteína que recibe el nombre de “base pentamérica” (proteína III).
Esta ultima es responsable del reconocimiento del correceptor, evento
indispensable para desencadenar la endocitosis del complejo. Una vez dentro
del endosoma, y como consecuencia del descenso de PH, la cápside se
disgrega parcialmente y alguna/s proteína/s que se desprenden (aparentemente
la III) tedrían una función lítica de membrana activada por ácido. De esta
forma el endosoma pierde su integridad y es resto del virión gana el acceso al
citoplasma.

Figura 10. Mecanismo de entrada

utilizado por Picornaviridae

Figura 9. Entrada de Adenovirus

75
Poro en la membrana plasmática: Otros virus desnudos como es el caso de los
Picornaviridae (virus de Poliomelitis y Fiebre Aftosa) utilizan este tipo de
estrategias un poco mas “conservadoras”(fig. 10).
La interacción de la proteína VP1 con el receptor altera la estructura del virión
exponiendo regiones de la cápside que hasta entonces se encontraban ocultas.
Se pierde la VP4 que es una proteína de cápside interna con funciones de
estabilización y quedan expuestas regiones de VP1 que son altamente
hidrofóbicas y tienen capacidad de insertarse en la membrana. De esta manera
se forma un poro por el cual puede ingresar el vARN unido solo a la proteína
VPg. Como puede deducirse en este caso también entrada y denudamiento son
simultáneos.
Para el caso de Poliovirus esta reorganización de la cápside parece ser
independiente de PH y por lo tanto puede llevarse a cabo a nivel de la
membrana citoplasmática sin necesidad de endocitosis. Sin embargo, para el
Virus de Fiebre Aftosa, los cambios estructurales de VP1 solo se producirían a
PH ácido una vez dentro del endosoma.

Denundamiento a nivel del lisosoma:

Como vimos en ejemplos anteriores, muchos virus entran a la célula utilizando
la vía endocítica, y la mayoría abandonan la misma antes de llegar al
compartimento lisosomal. Esto es lógico ya que los lisosomas portan proteasas
y nucleasas que degradarían el material viral. Contrariamente, otros, como los
Reovirus (p.e. Virus de Lengua Azul) toman provecho de estas enzimas
lisosomales. Este virus se caracteriza por tener una doble cápside muy
resistente y por lo tanto también bastante difícil de desacoplar. La cápside es
atacada parcialmente por proteasas lisosomales, quedando entonces expuestas
regiones que antes no lo estaban (fig. 11). Las proteínas que resisten la acción
del lisosoma protegen al ARN de la acción de las nucleasas y junto con el
mismo conforman lo que se conoce como “partícula subviral infecciosa”
(ISVP), que por mecanismos aun no aclarados es capaz de atravesar la
membrana del lisosoma. Experimentos realizados con partículas subvirales
aisladas demuestran que las mismas son capaces de permeabilizar membranas
y permitir el paso de distintas toxinas o incluso traspasar directamente la
membrana citoplasmática y ser infectivas (aunque este no es su mecanismo
natural de infección).

76
 Figura 11. Entrada de reovirus a nivel del lisosoma.

Transporte hacia el núcleo

Para aquellos virus de replicación citoplasmática hemos visto como acceden

directamente al lugar indicado sin necesidad de pasos adicionales.
La mayoría de los virus ADN y algunos ARN como Retrovirus e Influenza
requieren además que sus ácidos nucleicos ingresen al núcleo para su
replicación, comportándose la membrana nuclear como una nueva barrera
semipermeable que cruzar.

77
Para cumplir este objetivo pueden sencillamente esperar que la membrana
nuclear se disgregue como ocurre durante el proceso de mitosis de la célula
(p.e. Oncoretrovirus). Como consecuencia de ello, esto virus solo podrán
replicar en células en división.
Pero la mayoría de estos virus que deben llegar al núcleo utilizan un
mecanismo mucho mas específico que, una vez mas, es propio de la fisiología
de la célula.
Recordemos que la estructura de la membrana nuclear esta conformada por
una doble bicapa lipídica interrumpida por poros, los cuales permiten el paso
selectivo de determinadas macromoléculas hacia un lado u otro de la
membrana mediante mecanismos finamente regulados.
Todas las proteínas celulares son sintetizadas en el citoplasma pero algunas
cumplen su función en el núcleo (p.e DNA polimerasa) y por lo tanto deben
ser importadas dentro del mismo. Para ello estas proteínas portan “señales de
localización nuclear”(NLS), regiones de aprox. 20 aminoácidos de carga
básica, que van a ser reconocidas por otras proteínas (“importinas”)
encargadas de transportarlas dentro del núcleo. (ver Fig. 12)

Figura 12. Entrada al núcleo. Complejo del poro nuclear.

78
Muchos virus tienen entre sus proteínas (p.e, NP de Influenza), motivos que
imitan a las NLSs y que permanecen unidas al ácido nucleico u a otras
proteínas virales que deben ingresar al núcleo. De esta forma la importinas
celulares ingresan esta proteína (y todo lo que permanezca unido a ella) al
núcleo.
Otros retrovirus, los Lentivirus, no requieren células en división sino que
también poseen proteínas estructurales con NLSs (en este caso la integrasa)

También hay virus que tienen un mecanismo propio, independiente de los

celulares, para colonizar el núcleo. El ejemplo típico es el de los Adenovirus
en los cuales alguna proteína de cápside tiene afinidad por proteínas que
conforman el poro nuclear, se unen al mismo y el genoma es “inoculado” en el
interior del núcleo. (ver Fig. 9)

Replicación

Cualquiera sea el virus que se trate, todos deben ser capaces de ofrecer sus
mRNAs al aparato de traducción celular. Recordando la variabilidad genómica
viral, tenemos que tener en cuenta que 1) las células carecen de las enzimas
para producir mRNA a partir de RNA, por lo tanto, los virus RNA deben
poseer alguna estrategia para suplir el déficit, 2) las células no pueden
replicar DNA en el citoplasma. Por lo tanto, solo los virus DNA que replican
en el núcleo (y la mayoría lo hacen) pueden aprovechar la maquinaria celular
para generar mRNA. 3) el aparato celular de traducción solo es capaz de
operar con transcriptos monocistrónicos ya que no reconoce sitios internos de
iniciación de la traducción. Por lo tanto, los virus deben sintetizar un mRNA
individual para cada proteína. De lo contrario, como ocurre en muchos virus
RNA, se sintetiza un solo mRNA que sirve para la síntesis de una poliproteína
la cual es luego clivada para generar las proteínas virales individuales. 4) las
células tienen sus propios mRNAs. En la infección los virus deben imponer
sus propios mRNAs ya sea otorgándoles una ventaja competitiva o
selectivamente bloqueando los mRNAs celulares.

Los virus RNA pueden ser de dos tipos: de polaridad positiva (+) y de
polaridad negativa (-). Los genomas de polaridad (+), una vez dentro de la
célula, operan directamente como mRNA, esto es, se unen a los ribosomas y
son traducidos a proteína. Los de polaridad (-) no pueden ser leídos
directamente por los ribosomas y deben ser primero copiados a mRNA. Un
corolario de esta diferencia es que, cuando se introduce el genoma purificado
de un virus RNA (+) en células, el mismo es infeccioso, generando progenie

79
viral. Por el contrario, siguiendo el mismo procedimiento, los genomas de
virus RNA (-) no son infecciosos. Esto sucede porque las enzimas necesarias
para transformar RNA (-) en (+) se encuentran en el virión y son excluidas
cuando se introduce el genoma purificado.

A continuación, describiremos las principales estrategias replicativas de los

virus, basándonos para ello en la clasificación de Baltimore, lo cual permitirá
un estudio mas ordenado.
El fundamento de la clasificación de Baltimore se basa en como los virus
generan su mARN. Por lo tanto recordando a que grupo pertenece cada virus
se podría tener una idea de cómo será su replicación.

Clasificación de Baltimore

Grupo I : Virus ADN doble cadena

Grupo II: Virus ADN simple cadena
Grupo III: Virus ARN de doble cadena
Grupo IV: Virus ARN de polaridad (+)
Grupo V: Virus ARN de polaridad (-) y de doble sentido
Grupo VI: Retrovirus

80
1) Virus RNA (+), Clase IV

Cuando estos virus se desnudan, el genoma es directamente traducido a

proteína en los ribosomas. O sea que el primer paso en la replicación es la
TRADUCCIÓN (Fig. 13). El producto de la traducción es siempre 1 (una)
proteína, ya que el aparato de traducción celular, como ya mencionáramos,
solo produce una proteína de un mensajero (monosistrónico).
Picornavirus y Flavivirus: En estas flias, en realidad, lo que se traduce
directamente del mRNA es una poliproteína que es luego clivada en proteínas
individuales. Para el aparato de traducción es una sola proteína ya que solo
tiene un codón de inicio y uno de stop y por lo tanto se traduce de corrido.
Pero, por autoclivaje, la misma genera fragmentos cada uno con funcionalidad
distinta (enzimas, cápside) (Fig. 14)
El RNA es, además, utilizado como templado para la síntesis de RNA (-)
complementario, por acción de la polimerasa viral, uno de los productos de
clivaje de la poliproteína. El RNA (-) sirve a su vez de templado para generar
copias de RNA (+) (RNA genómico). El RNA (+) se usa: 1) para sintetizar
más poliproteína, 2) de templado para producir más RNA (-), 3) como genoma
viral para su encapsidación (Fig. 15)
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Figura 13 . Diagrama de la replicación de virus RNA (+). A la izquierda se

muestra el caso de los virus RNA (+) que codifican un único mRNA de
tamaño genómico. A la derecha se muestra la replicación de aquellos que
codifican para un mRNA de tamaño genómico y, además, uno o más mRNAs
subgenómicos.

81
Fig. 14. Mapa genético y clivaje de la poliproteína de Picornaviridae.

Figura 15. Replicación del

genoma de Picornaviridae

82
Togavirus, coronavirus y calicivirus usan una estrategia distinta.
El genoma de estos virus en realidad mRNA polisistrónico, o sea, contiene
varios codones de inicio con sus respectivos stops. Es decir, contiene varios
marcos abiertos de lectura (ORFs).
Al denudarse las partículas, solo el codón de inicio más cercano al extremo 5`,
podrá ser reconocido como tal y por ende ser traducido. Los productos de este
primer round de síntesis copian (transcriben) el RNA genómico en un RNA (-)
el cual sirve de templado para formar dos tipos de moléculas RNA (+): a)
mRNAs de largo subgenómico que codifica para los genes no traducidos en el
primer round de síntesis, nuevamente, cada uno utilizado como mRNA
monosistrónico b) RNA (+) de largo genómico que es empaquetado en
viriones (Fig 13 y 16).
En el caso de los Togavirus, solo contienen 2 ORFs pero los Coronavirus, por
ejemplo, contienen varios mas. (fig. 17)
Este tipo de estrategia permitiría al virus una producción mas secuencial de los
distintos tipos de proteínas, retrasando, por ejemplo, la síntesis de proteínas de
cápside o envoltura (reconocidas por el sistema inmune) hasta tanto haya
garantizado la replicación del genoma.

Figura. 16. Replicación de Togavirus

83
Fig. 17. Organización Genómica
y transcriptos de Coronavirus

2 Virus RNA (-), Clase V

Los virus RNA (-) poseen genomas RNA de simple cadena, monopartito (una
sola molécula) o segmentado (mas de una molécula). Cuando un virus RNA (-
) penetra en la célula, debe transcribirse para generar RNAs (+). Como
adelantábamos, las células carecen de enzimas para copiar RNA a partir de
RNA. Por lo tanto, la enzima viene incorporada en el virión como una
proteína estructural más (RNA pol RNA dependiente). El primer paso en la

84
replicación de estos virus es la transcripción mediada por una enzima viral. La
transcripción genera varios mRNAs (subgenómicos) que son traducidos.
También se forman cadenas (+) de longitud genómica que sirven de templados
para generar nuevos RNAs (-) . (Fig 18)

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Figura 18. Replicación de virus RNA (-).

Virus de la Estomatitis Vesicular (VSV), es el prototipo de virus RNA (-)

monopartito, dentro de los cuales se encuentran muchos virus de interés
veterinario y zoonótico. Como, a pesar de pertenecer a flias distintas, tienen
estrategias replicativas similares, se los ha agrupado bajo el Orden
Mononegavirales.
Dentro de la célula, la RNApol de VSV comienza a sintetizar RNA de
polaridad +, partiendo siempre desde el extremo 3` del RNA genómico (ver
Fig. 19). Cuando la enzima llega a la región intergénica encuentra una
secuencia que la hace “tartamudear” y de esta manera genera un poliA, con la
liberación de un mRNA y, al azar, puede continuar con la generación del
próximo mRNA o liberarse y empezar de nuevo del extremo 3`. Esto genera
mRNAs y por ende proteínas en las siguientes proporciones N>NS>M>G>L.
Cuando hay una concentración alta de N en el citoplasma la misma se va
complejando con el vRNA y evita que la RNApol “tartamudee”. De esta
manera no se generan poliAs ni interrupciones y comienza a producir RNA

85
(+) de lago genómico que servirán como molde para los RNAs (–) genómico
que serán parte del virión.

Figura 19. Estructura y replicación de

VSV

Virus de Influenza, es el virus RNA (-) segmentado de mayor importancia.

Cada segmento contiene un gen, por lo tanto al ingresar en la célula cada uno
es transcripto por la RNApol viral en un RNA (+) que funciona como mRNA.
Dos de los ocho mensajeros generados deben sufrir splicing para poder
expresar todas las proteínas virales (8 segmentos dan origen a 10 proteínas).
Como el virus no porta ni codifica ningún factor de splicing se ve obligado a
ingresar al núcleo para tener acceso a la maquinaria de splicing celular, a pesar
de ser un virus RNA. (ver Fig. 20)

86
Figura 20.
Orthomyxovirus
Replicación nuclear
De virus Influenza

3 Virus RNA de doble sentido, Clase V

Los arenavirus (dos segmentos de RNA (-)) y unos pocos miembros de los
bunyavirus (tres segmentos RNA (-)) contienen RNA de doble sentido. Nótese
que a pesar de que parte de su genoma es de polaridad (+) y podría ser
traducido directamente, se encuentran agrupados con los RNA (-) porque el
primer paso en la replicación es la transcripción dependiente de una enzima
viral. (Fig. 21)
Primero se forma RNA (+) de tamaño subgenómico, a partir de la región de
polaridad (-) que se utiliza como mRNA para la síntesis de ciertas proteínas.
Estas proteínas se encargan de sintetizar RNA de largo genómico, el cual sirve
de mensajero para la síntesis de las proteínas que están codificadas en la
región (+) y como RNA progenie. (Fig. 22)

87
Figura 21. Esquema replicativo de virus ARN doble sentido.

Figura 22. Replicación de Arenavirus

88
4 Virus RNA de doble cadena, Clase III

Este grupo está integrado por los Reovirus y los Birnavirus cuyos
genomas poseen 10 a 12 segmentos de doble cadena. A pesar de que cada
segmento posee una hebra de polaridad (+), la estabilidad de este tipo de
moléculas impide la separación completa de las hebras, lo cual sería necesario
para que cumpla función de mRNA. Entonces necesitan generar RNAs simple
cadena (+) para comenzar a producir proteínas. Esta acción solo puede ser
llevada a cabo por una RNApol incluida en el virión. En el caso particular de
los Reovirus, esto ocurre dentro de la cápside que nunca se desensambla
totalmente. (ver Fig. 23) Los mRNAs resultantes son traducidos a proteínas
y/o se ensamblan parcialmente con las proteínas de la cápside y allí sirven de
templados para la síntesis de la cadena complementaria. El resultado es la
formación de segmentos de doble cadena.

Figura 23. Ciclo replicativo de Reovirus

89
5 Virus DNA, Clase I y II

La mayoría de los virus DNA se replican en el núcleo. Como estos virus

hacen uso de la maquinaria de transcripción celular, el DNA viral purificado
introducido en las células suele ser infeccioso (aunque no esta muy claro como
son dirigidos al núcleo).
Los virus DNA simple cadena, como los Parvovirus, pueden portar la cadena
de polaridad (+) o (-) indistintamente, ya que una vez en el ambiente nuclear
son “reparados” por enzimas celulares transformándose en doble cadena.
Como regla general, cuanto más corto sea el genoma del virus más
dependiente será de la replicación celular. Siguiendo con el ejemplo de los
Parvovirus, requieren infectar células que estén en división ya que ni siquiera
codifican una DNA polimerasa entre sus genes.
Otro rasgo común a muchos virus DNA, es la expresión temporal de genes, es
decir, 2 o mas ciclos de transcripción de proteínas virales. En los primeros
ciclos se transcriben genes relacionados con el control de la expresión génica
viral, el control del ciclo celular o la replicación del genoma viral. En fases
mas tardías de transcripción se originan los mRNAs para las proteínas
estructurales del virión. (Figs. 24 y 25)

Fig. 24. Ciclo replicativo de Herpes Simplex Humano

90
 Fig. 25

Los genes expresados en forma temprana suelen estar bajo el control de

promotores muy potentes y utilizar factores de transcripción celulares
mientras que los tardíos, dependen de la presencia de alguna proteína viral
(temprana) como factor para permitir su transcripción.
Una importante excepción dentro de los virus DNA la constituyen los
Poxvirus, los cuales se replican en el citoplasma. Por lo tanto, estos virus
codifican para todos los factores necesarios para la transcripción y
replicación del genoma. No sorprende entonces que los poxvirus posean los
genomas más grandes dentro de los virus animales.

6 Retrovirus, Clase VI

Los retrovirus contienen un genoma bipartito de RNA, dos segmentos

idénticos de simple cadena. Por lo tanto, el genoma de los retrovirus es

91
diploide. Las partículas de estos virus contienen una enzima, la transcriptasa
reversa (RT), capaz de sintetizar DNA a partir de RNA. Luego de la infección,
el RNA viral es convertido en DNA lineal de doble cadena (DNA Copia
(cDNA)) por la RT en el citoplasma (ver Fig. 26). El DNA viral es luego
traslocado al núcleo donde se integra en los cromosomas celulares también
por acción de una enzima estructural (integrasa). A partir del genoma
integrado se sintetizan RNAs de largo genómico así como mRNAs mas cortos
(por splicing) que son traducidos a poliproteínas y proteínas virales como si
fuera cualquier gen celular. Las poliproteínas son luego clivadas por proteasas
virales (fig. 27). Algunos retrovirus codifican sus propios factores de
transcripción que regulan el orden temporal de expresión y la abundancia de
las proteínas virales.

Figura 26. Replicación en Retroviridae.

7 Hepadnavirus (fig. 28)

La estrategia replicativa de esta familia se aclaró recientemente, es por eso que

ha quedado fuera de la clásica clasificación de Baltimore.
El genoma de este virus esta compuesto por DNA lineal con una cadena de
polaridad (-) completa y otra de polaridad (+) incompleta. Se dice que es doble
cadena parcial. Además, porta en el virión una enzima retrotranscriptasa
parecida a la de los retrovirus. Pero siendo un virus DNA, ¿ para qué
necesitará una RT para replicar?. Una vez dentro de la célula el DNA ingresa
al núcleo donde enzimas celulares se encargan de completar la hebra (+).
Luego la molécula se circulariza pero no se integra al genoma celular. Puede

92
quedar como episoma dentro del núcleo por mucho tiempo produciendo
infecciones persistentes.
A partir de esta molécula doble cadena circular de DNA se generan los 4
mRNAs que son exportados al citoplasma para ser traducidos a proteínas
virales. Uno de estos mRNAs, llamativamente, tiene un largo mayor al
genómico y se lo denomina pregenómico ya que va a ser retrotranscripto a
DNA por la RT. Este DNA sintetizado en el citoplasma puede reingresar al
núcleo para generar nuevos mRNAs o ensamblarse con el resto de los
componentes del virión para salir de la célula.

Figura 27. Ciclo replicativo de Retroviridae

93
 Figura 28. Replicación de Hepadnavirus

Ensamblaje

Ya sea en el núcleo o en el citoplasma, un virus debe generar todos los

componentes de los nuevos viriones. Pero también debe ser capaz de asegurar
la correcta reunión de todos sus componentes que están diseminados dentro de
la célula y, además, entremezclados con proteínas, ácidos nucleicos y
membranas celulares.
Estos componentes virales, son procesados por la célula mimetizados como
elementos propios de la misma y es así que sufren modificaciones y siguen las
rutas normales de cualquier molécula celular.

94
Vemos, entonces que el proceso de ensamblaje también depende de la
maquinaria celular, no solo para la síntesis sino también para transportar
todas las partes hacia el sitio indicado y de esta forma generar un
microambiente favorable (altas concentraciones de todos los componentes del
virión en el mismo sitio y al mismo tiempo).

Formación de envoltura

Los virus envueltos deben utilizar como envoltura alguna membrana de origen
celular, ya que ningún virus posee maquinaria biosintética de lípidos.
Todas aquellas proteínas virales que formen parte de la envoltura, y que
tendrán, entonces, como destino final una membrana, deberán ingresar al
sistema reticuloendoplásmico cuando sean traducidas (fig. 29). Para ello, al
igual que las proteínas celulares de membrana, las mismas deberán portar un
“péptido señal” (20 aa, hidrofóbico) que indica a la célula que la proteína
naciente debe continuar su traducción en el retículo endoplásmico rugoso. Una
vez dentro de este compartimento podrá sufrir todas las modificaciones
postraduccionales que caracterizan a una proteína celular como glicosilación,
formación de puentes disulfuro, plegamiento, oligomerización (muchas
proteínas virales son oligomeros), etc.
Una vez que salen del RE viajan por la célula a través del sistema de
transporte vesicular, pasando por el golgi en donde son direccionadas al
compartimento adecuado.
En la mayoría de los virus la membrana citoplasmática es el sitio de formación
de la envoltura. En algunos casos (p.e. herpesvirus) la envoltura se adquiere a
partir de membranas internas. Esto traería aparejada la ventaja de no exponer
las proteínas de envoltura en la superficie celular donde podrían ser
reconocidas por el sistema inmune.

Ensamblaje de la cápside

La cápside es una estructura metaestable, debe tener la suficiente robustez

para proteger el material genético viral en el medio ambiente extracelular y
también tener la suficiente debilidad para ser desensamblada rápidamente una
vez dentro de la célula.
En algunos casos, la formación de la cápside esta coordinada con la asociación
de ciertas proteínas virales al ácido nucleico (Ensamble coordinado). En otros,
se forma primero una estructura enteramente proteica que luego va a
incorporar al ácido nucleico (Ensamble Secuencial).Comparado con otros
pasos del ciclo replicativo, la formación de la cápside es relativamente simple.

95
Las unidades estructurales (capsómeros) tienen un numero limitado de
proteínas (entre 2 y 6 para la mayoría de los virus) que

Figura 29. Tráfico de proteínas virales dentro de la célula

deben asociarse correctamente. Luego estos capsómeros deben asociarse entre

sí. Sin embargo, en algunos casos, proteínas adicionales son necesarias para
asistir estas asociaciones.

Ensamblaje a partir de proteínas individuales: Esta estrategia es

utilizada por muchos virus. Las proteínas de cápside intecatúan entre si al
azar, sin necesidad de interactuar con otras proteínas. De esta forma la
estructura más probable de dicha interacción es la que corresponde a la
cápside. Este tipo de cáspides puede ser reconstituido in vitro si ponemos
todas las proteínas constitutivas en un mismo tubo.
Las proteínas virales sintetizadas individualmente deben encontrarse dentro
del espacio intracelular donde también hay altas concentraciones de
proteínas celulares. Entonces, la probabilidad de que ocurran interacciones
inespecíficas es alta, por lo que las proteínas virales deben generarse en

96
exceso, es decir, se sintetiza mucha mas proteína de cáspide que la que sale
de la célula.
Un ejemplo claro de esto, es el de Adenovirus (fig 30A). La proteína IV y
la proteína III se sintetizan independientemente en el citoplasma. Luego 3
proteínas IV se reúnen y forman un trímero y 5 proteínas III forman un
pentámero, ambos caspsómeros luego se encuentran para formar parte de la
cápside del virión.
Los acúmulos de este tipo de proteínas en el interior de las células es lo que
comúnmente se visualiza en el microscopio como cuerpos de inclusión.

Figura 30. Distintas estrategias de ensamblado de cápsides

Ensamblaje a partir de poliproteínas: Este tipo de ensamblaje es menos

dependiente del azar que el anterior, ya que cada capsómero se forma a
partir de una poliproteína. De este modo las interacciones no ocurren entre
proteínas distintas que dependen del azar para encontrarse, sino que la
interacción es intramolecular. La poliproteína interacciona consigo misma
en sus diferentes dominios y luego, es clivada en las distintas proteínas
para permitir la correcta conformación del capsómero. (ver Fig. 30B)

97
El caso mas estudiado es el de los Picornavirus donde las proteínas
constitutivas de la cápside (VP1, VP2, VP3 y VP4) se sintetizan como un
precursor poliproteico (P1) que, luego de plegarse por afinidad entre las
distintas partes, es clivado por otra proteína viral (3LCDpro)

Ensamblaje asistido por proteínas chaperonas celulares o virales: En

algunos casos existen proteínas que direccionan a las proteínas de cápside
para que se produzca su correcta reunión. Este tipo de proteínas
denominadas chaperonas en algunos casos son proteínas propias de la
célula que los virus utilizan a su favor, y en otros, son proteínas específicas
codificadas en el genoma del virus.
Algunos virus, también codifican proteínas scaffolding o de andamiaje. La
función de estas proteínas es generar una especie de esqueleto alrededor
del cual se van a ensamblar las proteínas de cápside. Una vez conformada
la misma, estas proteínas de andamiaje son removidas y no forman parte
del virión. Es lógico pensar que este tipo de proteínas solo está presente en
virus grandes que poseen cápsides complejas y que tienen capacidad
genética suficiente como para codificarlas.
Parte del ensamblaje de los Adenovirus requiere de proteínas chaperonas,
en este caso de origen viral (L4), que se encargan de reunir tres proteínas
(proteína II) para formar un trímero que luego va a encontrarse con el resto
de los componentes de la cápside. Este trímero no puede formarse
eficientemente en ausencia de L4 (fig. 30C)
Los Herpesvirus (fig. 31) requieren, para ensamblar sus cápsides, de la
acción de proteínas de andamiaje (VP22a, VP21). Estas inteactúan entre si
y con las proteínas estructurales de cápside para organizar el proceso de
ensamble. Una vez constituida esta “procápside”, las proteínas de
andamiaje son removidas por una proteasa viral (VP24) y la cápside vacía
queda disponible para recibir el ADN del virus.

Empaquetamiento

Se denomina empaquetamiento a la incorporación del genoma en partículas

ensambladas. Este proceso requiere el reconocimiento, por parte de algún
elemento del virión, de señales específicas dentro de la molécula de ácido
nucleico (señales de empaquetamiento).
El empaquetamiento puede ocurrir de 2 formas. Para algunos virus el
empaquetamiento ocurre conjuntamente con el ensamblaje, es decir, el
ácido nucleico debe asociarse a las proteínas de cápside para que se forme
correctamente la cobertura proteica. Este es el caso, por ejemplo, de los
Rhabdovirus (fig. 32), en los cuales el ARN de conformación helicoidal

98
sirve de esqueleto para ir incorporando las subunidades proteicas de la
cápside.

Figura 31. Ensamblado de la cápside de Herpesvirus utilizando proteínas

de andamiaje.

En otros virus, en cambio, primero se forma la cápside y luego es

incorporado el ácido nucleico. Un caso interesante de virus que usan este
mecanismo es el de los Herpesvirus (fig. 33). Los nuevos genomas se
sintetizan como una molécula de ADN larga que contiene genoma tras
genoma en forma continua. Al reconocer la señal de empaquetamiento, el
extremo de la molécula es ingresado a la cápside, hasta que reconoce una
segunda señal de empaquetamiento que indica el comienzo de otro
genoma. En este momento la molécula es cortada, de modo que una
molécula de largo genómico queda dentro de la cápside y otra que contiene
múltiples genomas continuos queda libre para ingresar a otras cápsides ya
formadas.

99
Figura 32.

Empaquetamiento y
ensamblaje de
Rhabdovirus.

Figura 33. Empaquetamiento del ADN

de Herpesvirus

100
Egreso

La mayoría de los virus abandonan la célula infectada por 1 de los

siguientes 2 mecanismos.
1. Son liberados al espacio extracelular (por lisis o por brotación)
2. Son transferidos directamente a una nueva célula.

Es correcto pensar que la mayoría de los virus desnudos deben inducir la

lisis celular para poder liberar su progenie. De esta forma pueden cruzar
nuevamente la membrana de la célula pero esta vez, sin la necesidad de
garantizar la supervivencia de la misma.
Pero esto no es regla para todos los virus desnudos. Por ejemplo, el virus
polio es extremadamente citopático y puede producir lisis celular en
aproximadamente 8 horas. Sin embargo, cuando se lo cultiva en células
polarizadas, por ejemplo, epitelio intestinal, es capaz de salir por la
membrana apical sin destruir la célula utilizando, para ello, las vías
secretorias propias de la misma.
También es correcto pensar que los virus envueltos salen de las células
infectadas por brotación a partir de la membrana citoplasmática (fig 34).
Esto implica que no es necesario que la célula muera para que el virus
pueda salir. Sin embargo, muchos virus envueltos también producen lisis
celular. Aunque la muerte de la célula no es necesaria en estos casos, la
misma suele ocurrir como consecuencia de la brutal inhibición de su
metabolismo.
Existen virus que pueden salir de diferentes formas en distintas situaciones
o en distintas células. Un caso particular, y que cabe mencionar, es el de
los Poxvirus. El mas estudiado de ellos es el virus Vaccinia (ver Fig.35).
Este, adquiere una doble membrana en aparato de Golgi. Comúnmente se
lo denomina en este estadio como virión inmaduro (IV). Luego de sufrir
alguno cambios conformaciones se transforma en un virión intracelular
maduro (IMV). El IMV sólo puede salir de la célula cuando ocurra la
destrucción de la misma, pero una vez en el espacio extracelular es
infectivo. Sin embargo, una proporción de los IMVs adquiere una
cuádruple envoltura en un sitio posterior al golgi (obviamente antes de la
muerte celular). La más externa de estas envolturas es capaz de fusionarse
con la membrana citoplasmática y permitir la liberación de un virión con
triple envoltura. Ambos tipos de viriones liberados tienen envolturas con
distinta composición proteica y pueden reconocer distintos receptores, lo
que aumenta el rango de células a infectar.
Pero Vaccinia posee un tercer mecanismo por el cual abandonar la célula
infectada. El IMV tiene la capacidad de reorganizar el citoesqueleto de

101
Figura 34. Egreso de virus Influenza.

actina y generar de esta forma prolongaciones de la membrana que

penetran en células vecinas. Este mecanismo permite a este virus infectar
células que ni siquiera poseen los receptores necesarios.

Maduración

El proceso de maduración consiste en el clivaje de alguna/s proteína/s

estructural/es del virión ensamblado. Ocurre siempre como un paso
posterior al ensamblaje. Puede ser antes, durante, o después del egreso y
siempre es llevado a cabo por proteínas virales. Sin mediar este proceso,
los viriones son inmaduros e incapaces de infectar otra célula.
No todos los virus requieren de un paso de maduración.
Los caso mas conocidos los constituyen el HIV e Influenza

102
 Figura 35. Distintos mecanismos de egreso del virus Vaccinia.

En HIV la poliproteína Gag debe ser clivada una vez en el espacio

extracelular, caso contrario, el virión no podrá desesamblarse al ingresar en
una nueva célula susceptible (Fig. 36).
En el caso de Influenza, la enzima neuraminidasa se encarga de remover
los residuos de ácido siálico presentes en las glicoproteínas de envoltura.
Como sabemos, el ácido siálico funciona como receptor para este virus y,
por lo tanto si este no fuera removido de la superficie de los viriones, los
mismos agregarían entre sí y perderían infectividad.

103
Figura 36. Ensamblado, egreso y maduración de Retroviridae

104
 Fisiopatología de las infecciones virales.

1.- Ciclos patogénicos de los virus

La patogénesis de las infecciones producidas por virus puede resumirse en la
dilucidación de los mecanismos que emplean los agentes virales para producir injurias en
poblaciones discretas de células en diferentes órganos, de manera tal que un huésped
particular manifieste signos de enfermedad. Por otra parte, es destacable resaltar que la
aparición de enfermedad es un evento relativamente inusual como consecuencia del
encuentro entre un virus y un huésped (analizar las variantes que surgen de la interacción
virus / células o huésped, Figura 1). Tan es así, que en muchas infecciones con virus
“virulentos”, las infecciones subclínicas o inaparentes sobrepasan en varios cientos de
veces las enfermedades sintomáticas. Un caso testigo son las epidemias de encefalitis
producidas por el virus de la EEO, en las cuales las infecciones documentadas por
serología centuplican las encefalitis agudas (tanto en equinos como en humanos).Sin
embargo, en algunas infecciones virales clásicas, como rabia, influenza, o anemia
infecciosa equina, casi todos los individuos infectados desarrollan la enfermedad.
Mas allá de las infecciones agudas como resultado de la interacción
virus/huésped, existen otros desenlaces para este evento, como pueden ser las infecciones
persistentes, latentes o inclusive oncogénesis.

En cualquiera de los escenarios planteados, debemos recordar que los diferentes

virus pueden mantener diferentes ciclos, o etapas. El principal ciclo (y quizás menos
comprendido) es el ciclo ambiental o ciclo I, en el cual los virus se mantienen en la
naturaleza a través de sus formas de resistencia estructurales o por medio de huéspedes

105
reservorios o intermediarios. Se puede considerar también como un ciclo poblacional, ya
que el virus debe encontrar un medio de subsistir entre la infección de un huésped hasta
encontrar otro. El ciclo II hace referencia a todas las etapas que debe atravesar un agente
viral desde la puerta de entrada a un huésped, hasta el egreso o excreción viral de ese
mismo individuo. Por último, el ciclo III ya ha sido descrito anteriormente, y se resume
en el clásico ciclo viral pero a nivel celular. Una comparación entre estos dos últimos
ciclos es presentada en la Tabla 1, y Figuras 2 y 3.

Tabla 1: Etapas en patogénesis viral

Animal Células
Entrada al huésped Adsorción
Replicación primaria Penetración
Diseminación dentro del huésped Uncoating
Tropismo celular y/o tisular Transcripción
Respuesta inmune del animal Traducción
Replicación secundaria Replicación
Injuria celular Ensamblaje
Persistencia Liberación

Figura 2: Ciclo patogénesis viral a nivel celular

106
Figura 3: Ciclo de patogénesis viral a nivel animal

Ya enfocados en la posibilidad del encuentro entre un virus y su huésped, surgen una

cantidad de factores que influyen para que se inicie efectivamente una infección. Entre
dichas factores podemos mencionar variables ambientales, variables relacionadas al virus
y variables relacionadas al huésped en sí mismo. Todos estos elementos no constituyen
sino obstáculos que debe sortear un determinado virus para concretar su objetivo: entrar a
su querida célula. Por lo tanto, un trayecto exitoso del virus a través de todos los

107
obstáculo redunda en enfermedad, mientras el fracaso puede traducirse en infecciones
abortivas, no productivas o ausencia de infección.
En términos simplistas, el estudio de la patogénesis viral puede pensarse en varios
niveles. A nivel de un animal, la patogénesis debe involucrar preguntas como ¿Cómo
hace un virus para entrar al huésped?, ¿Dónde va el virus luego de la replicación inicial?,
¿Cómo se transmite entre los animales?, ¿Por qué afecta determinados tejidos? etc. El
siguiente nivel de inquietud es el nivel celular, donde nos cuestionamos ¿Cuál es el
receptor natural de dicho virus?, ¿Qué mecanismo emplea para entrar a la célula?, ¿De
qué forma la infección viral afecta la homeostasis celular?, etc. Con el cúmulo de
conocimiento en biología molecular actual, el siguiente nivel de investigación de la
patogénesis viral deberá responder preguntas concernientes al rol que juegan
determinados genes en ciertas funciones virales (virulencia, persistencia, transformación,
etc).

2.- Efectos de los virus sobre la función celular

Como los virus son parásitos intracelulares obligatorios, su ciclo de vida está
íntimamente relacionado con el de las células huésped. Los virus utilizan distintos
mecanismos celulares para penetrar y replicarse, la mayoría de las veces privando a las
células de funciones vitales. Como consecuencia, la replicación viral suele terminar con
la vida de la célula. En otros casos, la replicación viral es compatible con la fisiología
celular. Finalmente, algunos virus no destruyen las células target pero las transforman
promoviendo la formación de tumores u otras condiciones proliferativas. Los virus más
complejos contienen genes cuyos productos modulan las funciones celulares en su propio
beneficio.
Aunque conocemos varios efectos virales sobre la fisiología celular, no siempre es
sencillo determinar cómo contribuyen los mismos al resultado de la infección
(destrucción, persistencia, transformación). Por ejemplo, varios virus utilizan receptores
celulares cuya función es señalizar a la célula frente a determinados ligandos. Al unirse a
estos receptores, los virus disparan señales que mimetizan en mayor o menor grado al
ligando fisiológico. El HIV-1 (Retroviridae) se une a la glicoproteína CD4 de los
linfocitos T la cual forma parte del complejo receptor para el antígeno (TCR). Se
especula que la interacción HIV-CD4 señalizaría inapropiadamente al linfocito
conduciendo a la apoptosis o muerte celular programada (ver más adelante).

Efectos de los virus sobre la transcipción celular

La inhibición de la síntesis de macromoléculas celulares es una de las

consecuencias más comunes de la infección viral. Muchas clases diferentes de virus
inhiben la transcripción celular, esto es, la síntesis y procesamiento de RNA (figura 28).
Esta puede ser una acción directa sobre la transcripción o puede ser una consecuencia
indirecta de la inhibición de la traducción (ver más adelante), ya que la transcripción
depende de una serie de factores proteicos y enzimas.
El poliovirus inhibe la transcripción por las tres RNA polimerasas celulares, I, II,
y II. Una de las proteasas virales (3C) directamente cliva a TBP (TATA Binding Protein),

108
y por lo tanto impide que se inicie la transcripción1. El virus de la estomatitis vesicular
(VSV, RNA, Rhabdoviridae) induce una fuerte inhibición de la transcripción celular. La
proteina M del VSV es responsable de este efecto pero se desconoce el mecanismo de
acción. Además, VSV, y también el virus de la influenza, interfiere con el splicing del
RNA precursor para formar mRNA maduro. En el caso del virus de la influenza, una de
sus proteinas no estructurales (NS1), directamente se une al spliceosoma bloqueando el
splicing de los RNAs celulares. Recordemos que un paso esencial para la síntesis de
RNA viral del virus de la influenza es “robar” los extremos 5’ de los transcriptos
celulares (p. 69). Los mismos son luego utilizados como primers para la síntesis de RNA
por el complejo polimerasa viral. Como consecuencia, muchos transcriptos celulares
nunca son traducidos.
Así como algunos virus inhiben la transcripción celular, otros la activan o
modulan. Ello depende de que algunas proteinas virales son factores de transcripción que
también afectan la transcripción de genes celulares. Por ejemplo, la proteina Tax
codificada por dos retrovirus inductores de leucemia, HTLV-1 (human T cell
lymphotropic virus) y BLV (Bovine Leukemia Virus), es un factor de transcripción que
regula la expresión de los genes virales. Tax también afecta la expresión de ciertos genes
celulares y dicha activación podría tener importantes implicancias en la patogenia de la
infección. Como veremos con mayor detalle más adelante, los virus inducen la
transcripción de los genes para interferones, proteinas que bloquean la replicación viral.

1
TFIID es un complejo de proteinas que incluye a TBP y que forma parte del aparato basal de
transcripción. TBP tiene alta afinidad por el elemento TATA presente en la mayoría de los promotores
activados por RNA Pol II, la polimerasa que genera el mRNA celular. El clivaje de TBP impide que se
ensamble el aparato basal y por lo tanto no se inicia la transcripción.

109
Modulación de la síntesis de proteínas

Una de las características más notables de las infecciones por virus es la

inhibición (“shutoff” en inglés) de la síntesis de proteínas celulares al tiempo que la
síntesis de las proteínas virales continua. Miembros de las familias Picornaviridae,
Togaviridae, Orthomyxoviridae, Rhabdoviridae, Adenoviridae y Herspesviridae tienden
a inducir un bloqueo global de la traducción de las proteínas celulares. Cada uno de ellos
tiene uno o más mecanismos para asegurar que los mRNAs virales sigan traduciéndose
eficientemente. Estos mecanismos incluyen la inactivación de factores de la traducción,
degradación de mRNAs celulares, producción de factores que inhiben específicamente la
traducción de mRNAs celulares, etc. Las células, a su vez, presentan mecanismos para
bloquear la síntesis de proteínas virales y, por lo tanto, muchos virus poseen mecanismos
que suprimen el bloqueo impuesto por la célula.
La síntesis de proteínas se divide en tres fases: iniciación, elongación y
terminación. Casi todos los mecanismo de shutoff de los virus apuntan a la iniciación de
la traducción. Las reacciones que caracterizan la iniciación se resumen en la figura 29.

La iniciación de la traducción comienza con la unión del Met-tRNA (RNA de

transferencia para metionina) a la subunidad 40S del ribosoma. Ello requiere la asistencia
de varios factores: eIF-2, 3 y 4 (eIF= eukaryotic initiation factor) y GTP (fig. 29, arriba,
izquierda). La formación de este complejo es regulada celosamente por la célula,
principalmente a través de la fosforilación de los factores mencionados. El complejo es
uno de los principales targets para la inhibición viral.
eIF-2 es una GTPasa trimérica que intercambia su GTP por GDP más tarde en la
iniciación. La fosforilación de eIF-2 tiene un efecto negativo en la iniciación de la
traducción ya que la misma previene el reciclaje de la forma GDP a la GTP. La enzima
responsable de la fosforilación es la protein kinasa R o PKR (fig. 29, abajo). PKR es
activada por RNA de doble cadena, un intermediario muy común durante la replicación
de los virus RNA.
Los mensajeros celulares (y muchos de los virales) poseen un nucleótido
modificado en su extremo 5’ denominado “cap”. El cap es reconocido por una proteina
denominada eIF-4E (CBP, Cap Binding Protein) la cual a su vez es reconocida por otros
factores (eIF-4G, A, etc) que reclutan al mRNA al complejo de iniciación (fig.29, arriba,
derecha). Este paso es vulnerable a la infección viral ya sea por clivaje de alguno de los
factores o por fosforilación de los mismos.
La estructura de la región 5’ no traducible de los mRNAs es un determinante
importante de la eficiencia de la traducción ya que cuanto mayor sea la estructura
secundaria de esta región menor será la eficiencia de la traducción. Los virus suelen
tomar ventaja de este hecho sintetizando mRNAs que poseen escasa estructura secundaria
en la región 5’. Como consecuencia, los mRNAs virales se encuentran en ventaja
competitiva frente a los mRNAs celulares.
La mayoría de los Picornavirus inhiben la síntesis proteica celular a las pocas
horas de la infección mientras que las proteinas virales siguen siendo traducidas. Los
mecanismos empleados para el shutoff son múltiples. Durante la infección por
picornavirus se observa que los mRNAs celulares son incapaces de asociarse con las
subunidades menores de los ribosomas. Ello se debe a que el virus cliva al factor eIF-4G

110
por acción de la proteasa 2A (o proteasa L, en el caso de los aftovirus), la misma
involucrada en el clivaje temprano de la poliproteína viral. La mayoría de los
picornavirus carecen de mensajeros con cap. Estos virus inician la traducción por un
mecanismo que es independiente de cap. Básicamente, la región no traducible del
extremo 5’ de los mRNAs virales posee un sitio llamado IRES (Internal Ribosomal Entry
Site) que permite al mRNA asociarse con el ribosoma (fig 30). Adicionalmente, algunos
picornavirus impiden que PKR bloquee la iniciación de la traducción. Por ejemplo,
poliovirus inactiva la PKR mediante clivaje al inducir una proteasa celular.

Alteración de las membranas celulares

Las membranas celulares participan en varias fases del ciclo de los virus. Los
virus pueden alterar la permeabilidad de las membranas, afectar el intercambio de iones a
través de las membranas, inducir neosíntesis de membrana o redistribuir las membranas
pre-existentes. Los complejos replicativos virales frecuentemente se asocian con
membranas celulares y los virus envueltos insertan sus glicoproteínas en distintos
compartimientos membranosos. El HIV-1 induce fragmentación del aparato de Golgi y
este fenómeno coincide con el ensamblaje de viriones.
Células infectadas por diversos virus muestran un aumento de la permeabilidad de
la membrana celular. En algunos casos existe una clara relación entre el aumento de la
permeabilidad y la actividad de proteínas virales que funcionan como canales iónicos
(proteína M2 de influenza, gp 41 de HIV). Cambios en la concentración de K+ y Ca++ son
frecuentemente observados en células infectadas. La capacidad de los citomegalovirus
(DNA, Herpesviridae) de inducir agrandamiento celular se relaciona con un aumento de
la entrada de Na+ a la célula, presumiblemente como consecuencia de la interferencia con
la bomba de Na+ y K+.
Varios virus envueltos ingresan a las células mediante fusión de la membrana
viral con la membrana celular o los endosomas. Estos virus cuentan con proteínas
fusogénicas capaces de insertarse en la membrana target e inducir fusión. Cuando las
proteínas fusogénicas se expresan en la membrana celular pueden inducir fusión entre
células vecinas y formación de sincitios. Células infectadas con paramyxovirus o con
HIV muestran esta tendencia.

111
Figura 29. Iniciación de la traducción en eucariotas (de Viral Pathogenesis, N. Nathanson)

Figura 30. Bloqueo de la traducción celular por picornavirus.

112
 Virus y apoptosis
Una notable característica de los organismos multicelulares es su capacidad de
programar la muerte de sus propias células. La muerte celular programada o apoptosis
contrasta con la muerte en respuesta a lesiones mecánicas, químicas o físicas súbitas que
culminan con la necrosis celular. Mientras que los cambios apoptóticos son consecuencia
de la puesta en marcha de una maquinaria específicamente diseñada para eliminar la
célula, la necrosis resulta de una injuria directa del agente agresor sobre las estructuras
celulares.
¿Por qué planificar la muerte celular? La apoptosis juega un rol relevante en todas
las fases de la vida de un organismo. Por ejemplo, durante el desarrollo se producen
varias estructuras transitorias que luego deben ser eliminadas o reducidas a vestigios. Es
conocido también que en el embrión se forman más neuronas de las que finalmente se
encuentran en el sistema nervioso adulto. Aquellas que fracasan en establecer uniones
sinápticas funcionales son finalmente eliminadas. La apoptosis juega un rol relevante en
ambos procesos y, por lo tanto, debe ser considerada como un mecanismo fisiológico que
asegura que el organismo controle la cantidad de células y el tamaño de sus tejidos y
órganos. En la vida adulta, la respuesta inmune hace uso de la expansión clonal para
dotar al organismo de una población de linfocitos competentes. Cuando el agente agresor
es eliminado, sólo una población de células con memoria permanece en el organismo
mientras que la mayoría de las células efectoras son eliminadas. Aquí, la apoptosis
aparece como un importante regulador de la respuesta inmune.
Los ejemplos mencionados ilustran el hecho de que la apoptosis es un mecanismo
fisiológico tan importante como la mitosis o la diferenciación celular y que cualquier
falla en su regulación puede promover enfermedad.
Las células que sufren apoptosis sobrellevan una serie de cambios estructurales
comunes como la condensación y segregación de la cromatina, el plegamiento de la
superficie celular, y la fragmentación celular en pequeños cuerpos citoplasmáticos con
restos nucleares (cuerpos apoptóticos) (fig. 31). Los cuerpos apoptoticos son rapidamente
eliminados por fagocitos locales, por lo tanto no suelen generarse respuestas
inflamatorias del tipo de las que acompañan a la necrosis. Otra característica de la
apoptosis es el clivaje del DNA en fragmentos de tamaño nucleosómico. Hoy sabemos
que gran parte de estos cambios depende de la activación de una familia de proteasas
celulares conocidas como caspasas, las cuales se encuentran normalmente como
zimógenos inactivos en el citoplasma. Las caspasas son los ejecutores más importantes de
la apoptosis al promover el clivaje de proteinas celulares esenciales para la vida celular.
Lejos de tratarse de un clivaje masivo e inespecífico, las caspasas clivan un set
restringido de proteinas celulares. El clivaje generalmente determina la inactivación del
sustrato, pero otras veces promueve su activación. Un claro ejemplo de esto último es el
clivaje y activación de la nucleasa CAD (caspase-activated Dnase) encargada de cortar al
DNA entre los nucleosomas. El clivaje mediado por caspasas de la proteina nuclear
lamina es el responsable de gran parte de los cambios morfológicos observados en el
núcleo de las células en apoptosis. Las caspasas también pueden activar otras caspasas
mediante clivaje.

113
 Figura 31. Aspectos morfológicos de la necrosis y la apoptosis.

Si las caspasas son las ejecutoras de la apoptosis, ¿quién activa a las caspasas?. En
principio, tanto estímulos intracelulares como extracelulares pueden disparar la
activación de caspasas y, por lo tanto, la apoptosis. El daño en el DNA es un ejemplo de
un disparador interno de la apoptosis. Por mecanismos aun desconocidos, el daño en el

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.
Figura 32: Principales vías regulatorias de la apoptosis.

114
Figura 33. Ejemplos de receptores para ligandos proapoptóticos. Tanto el receptor Fas (CD95) como el
receptor para TNF (Tumor Necrosis Factor) poseen dominios intracelulares capaces de activar a las
caspasas

DNA (léase ruptura de una o ambas cadenas en múltiples sitios) promueve la activación
de ciertas proteinkinasas las cuales fosforilan y estabilizan a p53. Esta proteina es
conocida por su capacidad para detener el ciclo celular hasta que el DNA sea reparado, en
un intento de evitar la propagación de lesiones genéticas. Sin embargo, p53 es también
capaz de disparar el programa apoptótico mediante la activación de proteinas pro-
apoptóticas como Bax (fig. 32, derecha). Se desconoce la forma en que p53 decide operar
como detenedor del ciclo o como inductor de apoptosis.
El caso mejor estudiado de apoptosis inducida por un ligando extracelular es el
mediado por el receptor CD95 (o FAS) de los linfocitos al unirse al ligando CD95L. Esta
interacción activa al receptor y el receptor activado recluta a una molécula adaptadora,
FADD, y a la procaspasa 8 (fig. 33, izquierda). Esta última es activada proteolíticamente,
se desprende del complejo como caspasa 8 y cliva varias proteinas celulares activando a
la caspasa 3 en el proceso (fig. 32).
Tanto las vías extra como intracelulares suelen converger en las mitocondrias a
través de la activación de proteinas pro- o anti-apoptóticas de la familia Bcl-2. Estas
proteinas (Bcl-2, Bax, Bcl-XL, etc) se congregan en la superficie mitocondrial para
regular la liberación del citocromo c (Fig. 32). Si los factores pro-apoptóticos ganan, el
citocromo c es liberado y se combina con otras proteinas (incluidas ciertas caspasas) para
formar un complejo denominado apoptosoma.

Desde el punto de vista del control de la infección, la apoptosis puede ser

considerado como un mecanismo de defensa ya que el suicidio prematuro de la célula
prevendría la replicación viral. Esta decisión altruista impediría o retrasaría la
propagación de la infección en el tejido al tiempo que se pone en marcha la respuesta

115
inmune. Por ejemplo, cuando células infectadas con el virus de la influenza sobrellevan
apoptosis, los restos celulares portando antígenos virales son ingeridos por células
dendríticas las cuales presentan el antígeno a las células T. Pero la mayoría de los virus se
las ingenian para replicarse y propagarse en los tejidos.
El descubrimiento de que muchos virus codifican proteinas con capacidad de
modular el programa apoptótico introdujo el concepto de que tal modulación es
importante para la efectiva replicación y propagación viral. Estos productos virales son
análogos a proteinas celulares de reconocida función en la apoptosis como Bcl-2 o
inhibidores de las caspasas. Por ejemplo, la proteina E1B 19 K de adenovirus inhibe la
apoptosis al unirse a la proteina pro-apoptótica Bax impidiendo o retrasando la activación
de caspasas. El virus de la peste porcina africana codifica una proteina con homología a
Bcl-2, una proteina celular antiapoptótica. El efecto neto de este y otros mecanismos es
retrasar el suicidio de la célula hasta tanto la progenie viral sea liberada.
Muchas veces, la relación entre infección viral y apoptosis no es tan clara.
Algunos virus producen tanto proteinas pro-apoptóticas como antiapoptóticas. Un
ejemplo conocido está dado por los adenovirus. Los adenovirus codifican para las
proteinas E1A, E3 11K y la ya mencionada E1B 19K, las dos primeras inducen apoptosis
mientras que la tercera la bloquea. Mutantes de adenovirus que no producen E1B 19K
producen diez veces menos progenie que el virus salvaje porque las células infectadas
mueren prematuramente. Mutantes defectivos en E3 11K también producen menos
progenie, pero esta vez se debe a que, al no lisarse la célula, la progenie no es liberada.
¿Qué rol cumple la apoptosis en el desarrollo de las enfermedades causadas por
virus? En algunas infecciones la relación es clara. Por ejemplo, el virus Sindbis (RNA,
Togaviridae) infecta neuronas e induce apoptosis neuronal. Existe una alta correlación
entre la tasa de apoptosis neuronal inducida por la infección y la mortalidad. En otras
palabras, las cepas neurovilurentas inducen abundante apoptosis neuronal en
contraposición a las cepas menos virulentas. Ambas cepas replican eficientemente en
cultivos de tejidos. Cuando se construyó un virus Simdbis neurovirulento que portaba el
gen celular Bcl-2, el virus produjo una mortalidad significativamente menor que el virus
salvaje. En su lugar, se instauró una infección persistente en el sistema nervioso central,
característica de las cepas menos virulentas.

116
 Virulencia
El término virulencia se refiere a la capacidad de un virus de causar enfermedad,
lesiones patológicas o muerte. Es un término relativo para comparar aislamientos,
variantes o tipos de una misma especie de virus. Por ejemplo, la cepa A es menos o más
virulenta que la cepa B, el mutante X es más o menos virulento que el virus salvaje. La
virulencia está sujeta a variaciones naturales y a veces distintos aislamientos difieren
significativamente en su virulencia. ¿Qué es lo que hace que un aislamiento sea más
virulento que otro? La respuesta está en los genes virales y en la actualidad se presta gran
interés a los genes que determinan la virulencia. Los motivos son esencialmente dos: 1)
dichos genes son importantes determinantes de enfermedad y conocer su funcionamiento
permite comprender cómo los virus enferman a los animales, 2) la identificación de los
genes de virulencia permite utilizar las técnicas de DNA recombinante para promover la
atenuación programada de virus a los fines de producir vacunas.

¿Cómo se estudia la virulencia?

Si se entiende la virulencia como una cualidad del virus, es de interés mapear los
determinantes genéticos de esa propiedad. Sorprendentemente, no siempre los
determinantes de virulencia recaen sobre regiones codificantes de los genes. Existen
ejemplos que demuestran que secuencias no codificantes pueden tener un rol importante
en la virulencia.
Otros investigadores se concentran en examinar las diferencias entre las
infecciones por variantes de un virus. Estas diferencias pueden ser cuantitativas (por ej.
las cepas virulentas del virus Sindbis producen más apoptosis neuronal que las no
virulentas) o cualitativas (una variante puede presentar diferente tropismo, o diferente
capacidad de diseminación).

¿Cómo se mide la virulencia?

En primer lugar es necesario señalar que la virulencia no es una propiedad

absoluta de un virus., esto es, independiente de la dosis, vía de inoculación, etc. Para
comparar la virulencia entre un mutante y el virus salvaje debe homogenizar los
parámetros de la infección. De nada serviría comparar la virulencia de los dos virus si
para ello infecto ratones por vía intramuscular con un virus, y por vía intranasal con el
otro, o si inoculo 108 TCID50 del mutante en un grupo de animales y 105 TCID50 del
salvaje en otro grupo, o si uso ratones para testear un virus y ratas para el otro.
La manera convencional de medir virulencia es a través de la producción de
enfermedad o de muerte. En el segundo caso, una forma corriente de expresar virulencia
es mediante el cociente cantidad de virus/mortalidad en la forma de TCID50 o PFU/LD50.
En el primer caso, pueden emplearse distintas medidas según el virus. Para poliovirus,
por ejemplo, la medida empleada es la parálisis, mientras que para poxvirus se mide la
severidad de las lesiones cutáneas. Cuando de virus inductores de tumores se trata (e.g
retrovirus), un parámetro común es el periodo de latencia desde la infección hasta la
aparición del tumor. En la figura 34 se compara la virulencia entre poliovirus salvaje y la

117
cepa OPV, vacunal (Sabin), a través de la capacidad de inducir parálisis en el huésped
natural.

Virus Periodo Casos de parálisis por Virulencia

millón de infecciones relativa
primarias
Salvaje 1931-1954 7000 10.000

OPV 1961-1978 0.62 1

Figura 34: Virulencia de dos variantes del virus de la polio. Los valores correspondientes al virus salvaje
corresponden a estudios de brotes donde la infección se determinó serológicamente.

Cuando se realizan pruebas de virulencia en el laboratorio, la dosis es un factor de

consideración. En la figura 35 se muestra un estudio de inoculación con un flavivirus
administrado a distintas dosis. Nótese que el efecto de la dosis no se refleja en la tasa de
mortalidad pero sí en el tiempo de supervivencia.

Dosis Mortalidad Tiempo

(log10 LD50) (%) medio de
supervivencia
(días)
7.6 100 2.4
6.6 100 2.4
5.6 100 3.3
4.6 100 2.7
3.6 100 4.6
2.6 100 5.2
1.6 100 5.6
0.6 100 5.8
-0.4 10 7.0

Figura 35. Efecto de la dosis en el tiempo de supervivencia

Manipulación experimental de la virulencia

Casi sin excepción, los procedimientos utilizados en el laboratorio de Virología,

tal como el pasaje en cultivo de tejidos o en animales, seleccionan variantes atenuadas de
virulencia reducida. En general, el pasaje de un virus por una especie de laboratorio por
una vía definida, aumenta la virulencia del virus para esa especie pero suele disminuirla
para otras, incluida el huésped natural. Aunque el pasaje de virus en cultivos de tejidos
frecuentemente lleva a la atenuación, no siempre es el caso. Por ejemplo, cuando
diferentes cepas atenuadas del virus de la rabia se pasaron en líneas celulares de
neuroblastoma murinas o humanas (pero no en otras líneas celulares), se observó una
clara selección de virus de mayor virulencia. Esto sugiere que las células de

118
neuroblastoma ejercen las mismas presiones selectivas que el pasaje intracerebral en
animales.
Hemos visto que una estrategia clásica en la generación de mutantes es la
mutagénesis seguida de selección de variantes sensibles a la temperatura (mutantes ts)
(ver Genética de virus). Muchos mutantes ts exhiben virulencia reducida en animales. La
reducción en la virulencia no es necesariamente una consecuencia directa de la
sensibilidad a la temperatura ya que la temperatura corporal del huésped está en el rango
de la temperatura permisiva. Es más probable que los mutantes ts tengan también una
restricción en el rango de huésped, e.g. en el tipo celular que infectan.
No siempre es sencillo explicar la reducción de la virulencia en mutantes ts ya que
pueden existir otras mutaciones que son “silenciosas” en cultivos de tejidos pero que
ejercen influencia en el fenotipo in vivo.
En clases pasadas vimos como pueden diseñarse mutaciones en genes virales, ya
sean puntuales, deleciones o inserciones. Esta tecnología ha sido empleada en diversos
sistemas. Por ejemplo, se han utilizado virus quiméricos para mapear el gen responsable
del tropismo por los macrófagos que presentan ciertas sepas del HIV-1. Estos estudios
demostraron que el gen env del HIV es responsable de dictar el tropismo.
Cuando se seleccionan variantes de reducida virulencia hay que recordar que las
mutaciones de mayor interés son las que selectivamente afectan la virulencia in vivo, sin
afectar la capacidad del virus de replicar en cultivos celulares. Es de esperar que
cualquier mutación que disminuya la replicación in vitro, también va a reducir la
virulencia.
Hemos visto que la base de la atenuación o de la virulencia es genética. Ahora
bien, ¿cómo se manifiestan las mismas en la patogénesis? Por ejemplo, un virus puede
mostrarse atenuado si la viremia que ocasiona es menor que la causada por otra variante,
o si se replica menos en los tejidos periféricos. Para un virus neurotrópico, la atenuación
de una variante puede deberse a: 1) menor capacidad para invadir el sistema nervioso
(menor “neuroinvasividad”), 2) menor capacidad para replicarse en el sistema nervioso, o
3) ambas cosas a la vez. Otras veces, las diferencias en virulencia responden a diferencias
en el tropismo de las variantes. La mayoría de las cepas del HIV-1 pueden clasificarse
como linfotrópicas (LT) o macrófagotrópicas (MT). Solo estas últimas pueden replicarse
bien en cultivos de macrófagos o monocitos. Las variantes MT dominan en los estadios
iniciales de la infección mientras que las variantes LT son las aisladas comúnmente en la
etapa del SIDA clínico. Suele considerarse a las variantes LT más virulentas debido a la
mayor rapidez con que se replican en células de la sangre y a su mayor capacidad de
inducir sincitios.

¿Qué tipos de genes están involucrados en la virulencia?

Los estudios de virulencia en diversos sistemas virales han establecido los

siguientes principios generales: 1) no existe un gen “maestro” que controla la virulencia.
La atenuación puede resultar de mutaciones en cualquier gen estructural o no estructural
de los virus, incluyendo regiones genómicas no codificantes, 2) el fenotipo de virulencia
puede alterarse por cambios muy discretos del genoma si los mismos afectan sitios
críticos, 3) la reversión del estado atenuado al virulento es menos probable cuando la
atenuación se debe a varias mutaciones y no a una sola, 4) las mutaciones atenuantes son

119
muchas veces mutaciones que afectan el rango de huésped, esto es, que afectan la
replicación viral en ciertos tipos celulares pero no en otros, 5) la reversión al fenotipo
virulento puede deberse a reversiones verdaderas o a supresiones intra o extragénicas, 6)
la mutación de genes virales derivados de la célula huésped (grandes virus DNA) lleva
generalmente a la atenuación.

Virus atenuados como vacunas

El aspecto práctico más importante de la atenuación es la producción de vacunas.

Muchas de las vacunas más efectivas son a virus vivo atenuado. Existen tres
requerimientos básicos para que un virus atenuado sirva como vacuna:
1- El virus debe estar lo suficientemente atenuado como para no inducir enfermedad
clínica.
2- El virus atenuado debe ser lo suficientemente infeccioso como para estimular la
respuesta inmune.
3- La cepa vacunal debe ser genéticamente uniforme y estable como para que no haya
peligro de reversión.

120
 Los virus pueden activar la vía del complemento por medio de anticuerpos anti-
virus, pero incluso algunos no requieren anticuerpos mediadores ( fig 43). El virus de la
enfermedad de Newcastle y los retrovirus activan directamente la vía clásica o la
alternativa. Los factores del complemento cumplen un rol importante en los inicios de la
respuesta inflamatoria ante la infección viral mediante sus efectos opsonizantes y
quimiotácticos.

Los macrófagos

Los macrófagos representan una población muy heterogenea de células con

capacidad de fagocitar material particulado. Representantes de esta población se encuentran
en casi todos los órganos y tejidos: macrófagos alveolares en el pulmón, células de Kupffer
en el hígado, los histiocitos en el tejido conectivo, la microglía en el tejido nervioso, etc.
Además, cada subpoblación se presenta en distintos estadios de diferenciación y activación.

Figura 43. Vías del complemento activadas por los virus

Durante las infecciones agudas, los macrófagos son congregados y se vuelven el

tipo celular predominante hacia las 24 hpi. Citokinas como el IFN y el TNF liberadas e
la infección son importantes para la activación de los macrófagos. Muchos virus poseen
tropismo por los macrófagos. Los que no lo poseen, pueden acceder al macrófago mediante
fagocitosis de viriones opsonizados ya que estas células presentan receptores para C3 del
complemento y para la porción Fc de las Ig. Esta última vía de entrada es esencialmente
degradativa y resulta en la presentación antigénica vía MHC clase II.
Los macrófagos no suelen ser permisivos para la infección viral y esta característica
se denomina resistencia intrínseca de los macrófagos para diferenciarla de la actividad

121
antiviral ejercida por las citokinas que libera (resistencia extrínseca). Cuando se infectan
macrófagos peritoneales con el HSV-1 (virus del herpes simplex tipo 1), el 15% de las
células son infectadas restrictivamente,con expresión de algunos genes precoces del virus.
El resto de los macrófagos no son permisivos en absoluto y no expresan ningún gen viral.
La adición de factores activantes de los macrófagos (TNF, MCP) puede estimular o inhibir
la replicación viral. Se ha demostrado que la resistencia de algunas especies a la infección
con ciertos virus se correlaciona con la resistencia intrínseca de los macrófagos a esos
virus. Unos pocos virus, como el de la peste porcina africana (DNA, familia sin designar),
infectan y replican activamente en macrófagos.
La resistencia intrínseca de los macrófagos parece depender de los altos niveles
endógenos de IFN y IFN . Cuando se cultivan macrófagos frescos y se infectan con virus,
las células se muestran no permisivas, pero la permisividad aumenta a medida que los
cultivos envejecen. Esto se correlaciona con la expresión cada vez menor de IFN en los
cultivos.
Como mencionaramos, los macrófagos juegan un rol central en la inflamación en
los sitios de replicación viral. Los macrófagos liberan: 1) IFN y IFN los cuales
promueven resistencia a la infección viral en las células vecinas y activan a las células NK,
2) TNF el cual resulta tóxico para células infectadas, 3) proteinas pro-inflamatorias
(MIPs) que atraen linfocitos al sitio de infección, 4) IL-12, que colabora en la activación de
células NK al estimular la síntesis de IFN Estas capacidades múltiples de los macrófagos
se resumen en la figura 44.

IL-x: interleukina
CR: receptordelcomplemento
CRF: factorliberadordecorticotropìna
FcR: receptorFc
MCP:proteinacofactordemembrana
MIP:proteinasinflamatoriasdemacrófago
TNF: factordenecrosistumoral

Figura 44. Rol del macrófago en la respuesta temprana a la infección viral. (de Viral Pathogenesis.
Nathanson).

122
Granulocitos

Los neutrófilos son un componente mayor de los infiltrados leucocitarios durante las
primeras horas de infección viral. Las células infectadas, cuando reaccionan con
anticuerpos y complemento, liberan factores quimiotácticos para los neutrófilos. Como los
macrófagos, los neutrófilos expresan receptores para Fc y C3 y pueden fagocitar viriones
opsonizados, incluso lisar células infectadas con ciertos virus. Sin embargo, no sabemos
como inciden estas actividades en el curso de la enfermedad.
Los neutrófilos producen y liberan péptidos llamados defensinas, de unos 30
aminoácidos de largo, los cuales pueden permeabilizar células infectadas e incluso virus
envueltos (HSV, influenza, VSV, etc) neutralizando así la infectividad.
Los neutrófilos son generalmente ignorados como mediadores de la resistencia
antiviral natural porque en algunas infecciones parecen no reclutarse y porque la
neutropenia acompania muchas veces a la infección viral.

Células NK

Las células NK representan una respuesta natural temprana a las infeccones virales.
Las NK son linfocitos grandes que contienen gránulos con proteasas llamadas granzimas y
perforinas. Estas sustancias son citotóxicas cuando contactan la superficie de células
infectadas y generalmente promueven apoptosis.
Aunque las células NK contienen una serie de moléculas de adhesión, no contienen
TCR o BCR. A diferencia de las CTLs, las NK generalmente lisan células infectadas que
expresan bajos niveles de MHC clase I. Las células NK expresan proteinas receptoras
(NKR-P) en sus membranas que están codificadas por varios genes y sujetas a splicing
alternativo y, por lo tanto, introducen heterogeneidad en las NK. Las proteinas NKR
pueden unirse a los oligosacáridos de la superficie celular.
Muchas citokinas influyen la respuesta NK a la infección viral. Por ejemplo, el IFN
liberado por las células infectadas produce un aumento notable de la citotoxicidad,

Figura 45. Cinética de la producción de citokinas y activación de linfocitos citolíticos durante la infección con
el LCMV.

123
reclutamiento y proliferación de las NK (fig 45). La actividad NK disminuye a medida que
aumenta la respuesta CTL quizás como consecuencia de la disminución de los niveles de
IFN y del aumento de TGF el cual es un potente inhibidor de la proliferación NK
producido sobretodo por los macrófagos y las célula T CD8+.

La depleción de células NK en ratones mediante administración de anticuerpos anti-

NK mejora la propagación de ciertos virus pero no de todos. Aún no se tiene en claro cual
es el mecanismo por el cual las células NK controlan las infecciones virales in vivo pero se
piensa que la lisis de las células infectadas y la producción de citokinas antivirales pueden
explicar el efecto. Existe evidencia de que algunas glicoproteinas virales se unen a las NK y
que de esta manera las células infectadas interactuarían con las NK. Sin embargo, otros
trabajos señalan que la activación de las NK y no la unión es el factor más importante para
la lisis de células infectadas. Dicha lisis podría tener lugar en momentos específicos del
ciclo infeccioso. Un punto de susceptibilidad podría darse cuando disminuye la expresión
de MHC clase I en la superficie celular como producto de la infección con ciertos virus.
Recordemos que la infección viral, por otro lado, induce la síntesis de IFN el cual aumenta
notablemente la expresión de clase I en la célula. El resultado neto es que el IFN protege
paulatinamente a la célula infectada de la lisis por células NK a medida que aumenta la
expresión de clase I. Este aumento en clase I, a su vez, vuelve más sensible a la célula
target a la lisis por células T CD8+. Podríamos decir que hay un “switch” de sensibilidad a
la lisis en la célula target de NK hacia CD8+. Estos conceptos se muestran en la figura 46.

Figura 46. Susceptibilidad de las células target a la lisis.

Cuando hechamos un vistazo a los distintos mecanismos inespecíficos para

combatir las infecciones virales, podemos reconocer cierto grado de redundancia. Por
ejemplo, reiteradamente se ha demostrado que las células NK lisan targets infectados por

124
HSV-1 in vitro. Sin embargo, la depleción de NK en ratones no va acompañada de una
mayor replicación viral como podría esperarse. Ello depende de que el IFN y otros
mecanismos efectores pueden limitar la infección por sí solos. Por otro lado, animales
inmunodeprimidos con ciclofosfamida son protegidos de la infección si se transfieren
células NK. Sin dudas, los distintos mecanismos efectores se refuerzan mutuamente.

Interferones

La actividad antiviral de los IFNs es una de sus varias funciones biológicas y la que
más nos interesa aquí. Los IFNs son proteinas que no se sintetizan constitutivamente (e.g.
continuamente) en las células, deben ser inducidos. La infección viral es un potente
inductor. Una vez liberados, los IFNs se unen a receptores en células vecinas o distantes y
promueven la expresión de un set de genes: genes inducibles por IFN. Las proteinas
codificadas por estos genes llevan a cabo las funciones del IFN (fig 47).

Figura 47. Inducción y actividad de los IFNs

Existen muchos IFNs los cuales han sido clasificados de acuerdo a su origen y a sus
secuencias de aminoácidos. La figura 48 muestra los IFNs humanos.
Los IFNs tipo I son producidos por leucocitos y fibroblastos, son monoméricos,
están estructuralmente relacionados, y sus genes están en el cromosoma 9. El IFN tipo II es
producido por los linfocitos y células NK (IFN ), es un homodímero, y no se relaciona
estructuralmente con el tipo I.

125
 Tipo Clase Subtipo Cromosoma Aminoac. Receptor

I por lo menos
2 subunidades
1 9 166 idem

idem

idem

II 1 12 146 2 subunidades

Figura 48. Características de los IFNs humanos

Actividades biológicas de los IFNs: - inhibición de la replicación viral

- inhibición del crecimiento celular
- activación de macrófagos, NKs y CTLs
- inducción de MHC clase I y II, y RFc
- pirógeno
- antitumoral

Inducción de los genes para IFNs: el inductor más potente es el RNA de doble cadena, un
intermediario de la replicación de muchos virus, tanto RNA como DNA1. Varias citokinas
también inducen su síntesis: IL-2, IL-1, TNF. En todos los casos, la inducción es transitoria
y a nivel de la transcripción.

Transducción de señales por IFNs

Los IFNs tipo I y II se unen a receptores distintos que se expresan en todas las
células (fig 49). Sus colas intracitoplasmáticas están asociadas a proteinkinasas de tirosina

1
Tener en cuenta que los virus DNA producen RNA complementario como resultado de su alta densidad
génica en ambas cadenas de DNA.

126
 Figura 49. Señalización celular por IFN y IFN

denominadas JAKs. Cuando el IFN o el IFN se unen a sus receptores, las JAKs resultan
activadas y como consecuencia un grupo de proteinas denominadas STATS2 son
fosforiladas y traslocadas al núcleo donde se unen a los promotores de los genes inducidos
por IFNs. Los promotores de estos genes contienen secuencias (ISRE para IFN y GAS
para IFN ) específicas para STATs. La transcripción de estos genes comienza minutos
después de la unión de los IFNs a sus receptores y dura unas pocas horas. Como ambos
IFNs comparten proteinas transductoras puede darse la situación de sinergismo o de
represión antagonista.

Acción antiviral de las proteinas inducidas por IFNs

Se desconoce el número exacto de genes inducidos por los IFNs pero se estiman
entre 50 y 100. Las funciones de estas proteinas (IIPs: proteinas inducidas por IFN) son
muy diversas: factores de transcripción, enzimas, receptores, etc., muchas se desconocen.
En principio, no hay una proteina que por si sola pueda bloquear la replicación viral, más
bien es una suma de actividades mediadas por distintas proteinas que llevan a la célula a un
estado antiviral. Tampoco parece haber un paso único en el ciclo replicativo de los virus
que sirve de target a las IIPs. Ni una vía única de bloquear a todos los grupos virales
sensibles al IFN. Por ejemplo, el VSV y el virus de la influenza son bloqueados tanto a

2
STATS: Signal Transducers and Activators of Transcription

127
nivel de la transcripción como de la traducción virales. Los retrovirus son inhibidos
tempranamente durante la síntesis de DNA viral y más tarde durante el ensamblaje. Los
virus DNA son inhibidos en múltiples pasos del ciclo replicativo.
Dos vías inhibitorias han sido estudiadas en mayor detalle y ambas promueven
inhibición de la síntesis de proteinas: 1) vía de las 2-5(A) sintetasas, y 2) vía de la
proteinkinasa dependiente de RNA (ver Efectos de los virus sobre la función celular). Las
2-5(A) sintetasas son una familia de proteinas inducidas por IFNs que requieren RNA de
doble cadena como cofactor para su activación. Existen múltiples isoenzimas en distintos
compartimientos de la célula que tienen la capacidad de unirse y activar a otra enzima, la
Rnasa L. La Rnasa L es la responsable de inhibir la replicación de los picornavirus al
degradar el RNA viral (fig 50, abajo).

La síntesis de PKR también es inducida por el IFN y la enzima también requiere

RNA de doble cadena como cofactor. La activación va acompañada de autofosforilación.
Uno de los targets de la enzima es eIF-2 , la GTPasa que opera como factor de iniciación
en la síntesis de proteinas. La fosforilación de eIF-2 impide su reciclaje por eIF-2B y por
lo tanto la síntesis proteica queda bloqueada. En otras palabras, respecto de la PKR el IFN
actúa de la misma manera que algunos virus.
Otra familia de proteinas inducidas por los IFNs es la familia Mx las cuales inhiben
la replicación del virus de la influenza y VSV. Los IFNs también inducen MHC clase I y II,
proteinas del proteasoma y permeasas las cuales aunque no son antivirales a nivel de la
célula son extremadamente importantes en el reconocimiento de targets por las células del
sistema inmune.
Como la respuesta a los IFNs es de las mas comunes y potentes para contrarestar la
replicación viral, no sorprende que los virus hayan adoptado estrategias diversas para
combatirla. Algunas proteinas virales están dirigidas a bloquear la señalización por IFNs y
las inducción de IIPs. Otras se dirigen a bloquear IIPs específicas.

Se han producido animales en los cuales se eliminaron genes para IFN o para sus
receptores (ratones knock out). Por ejemplo, ratones knock out incapaces de producir el
receptor para IFN , resultaron altamente susceptibles a la infección por varios virus (VSV,
vaccinia, LCMV, etc). Ratones knock out para IFN , sin embargo, pudieron controlar la
infección por el virus de la influenza pero resultaron altamente susceptibles a la bacteria
intracelular Mycobacterium tuberculosis. Ratones que no producen el receptor para IFN
tienen mayor sensibilidad para la infección por vaccinia pero no por VSV.
En ciertos casos, la producción de IFN debida a una infección viral puede ser
contraproducente para el huésped. Desde hace tiempo se sabe que personas tratadas con
IFN pueden presentar nefrotoxicidad. Ratones lactantes infectados con una cepa del LCMV
presentan toxicidad renal y hepática. Dicho efecto puede prevenirse totalmente con la
administración de anticuerpos anti IFN

128
Figura 50. Vías antivirales inducidas por IFN

129
 Respuesta inmune específica e inespecífica a las infecciones virales
Aunque todas las infecciones virales movilizan los mecanismos del sistema inmune, no
es sencillo generalizar a partir de los pocos modelos, muchas veces dispares, en los que se ha
examinado con cierto detalle la respuesta específica a los virus. Tanto la respuesta celular como
humoral son importantes para contrarestar una infección, pero la contribución relativa de una u
otra, así como las modalidades en tiempo y espacio varían de virus a virus, así como para un
mismo virus en distintas circunstancias.
En una situación ideal, la respuesta inmune debe impedir la propagación de los virus en
los tejidos para minimizar el daño patológico y eliminar en lo posible todo rastro del virus
(incluido el genoma viral) del cuerpo. Durante el proceso, algunas células guardarán “memoria”
de lo sucedido y estarán disponibles para actuar con mayor rapidez y eficacia ante el eventual re-
encuentro con el virus. Como los virus han coevolucionado con el sistema inmune, han
desarrollado estrategias diversas para interceptar, retrasar o evadir la respuesta inmune, de tal
manera de tener chance de propagarse y poder ser transmitidos. Esta verdadera batalla por la
supervivencia puede tener distintas consecuencias para el huésped (y para el virus), desde la
infección clínicamente inaparente hasta la infección fatal, con todo un rango de posibilidades
intermedias que caen dentro de lo que llamamos enfermedad. La carga viral, la citopaticidad y la
virulencia por un lado, y el estado general y la historia previa de contactos con el agente, por el
otro, determinan el resultado de la infección. Mientras que los virus citopáticos son generalmente
bien controlados por la respuesta inmune, los no citopáticos suelen mantener equilibrios
diferentes con el sistema, y muchas veces el estado de enfermedad depende más de la
inmunopatología que de la capacidad destructora del virus per se.

Inmunidad celular y humoral

La inmunidad celular, mediada por los linfocitos T, depende del contacto directo de estas
células con los tejidos. Las células T reconocen al antígeno viral expresado en las células
infectadas (T CD8+), o en las células presentadoras o APCs ( T CD4+), gracias a la interacción
entre el receptor T (TCR) y péptidos derivados de las proteinas virales expresados en superficie
mediante asociación con las moléculas de histocompatibilidad (MHC) clase I y II. En su
continuo deambular por los tejidos, las células T ejercen una constante vigilancia en búsqueda de
péptidos foráneos.
La inmunidad humoral depende de las células B las cuales reconocen el antígeno
sobretodo en solución (e.g. no sobre la superficie de otra célula). La respuesta B requiere la
colaboración del subset CD4+ de linfocitos T para alcanzar una producción significativa de
anticuerpos.
El principal rol de las células T CD8+ (o CTLs, “cytotoxic T lymphocytes) es matar a las
células infectadas, mientras que a las células CD4+ les compete promover la multiplicación y
diferenciación de las células B específicas para el virus, mediante la secreción de linfokinas. Los
anticuerpos producidos por la célula B diferenciada (plasmocito), multiplica el poder efector de
las células B unas 100000 veces.
Respuesta primaria

Durante la infección de células permisivas, los productos virales son sintetizados a la par
que ocurre el shutoff de la síntesis celular. La síntesis y segregación de las proteinas virales
siguen en todo las reglas que se aplican a sus contrapartidas celulares. Como una proporción de
las proteinas virales (y celulares) que se sintetizan no logran alcanzar una conformación
funcional (incluso tras la asistencia por chaperonas), las mismas son decoradas por ubiquitina y
derivadas hacia los proteasomas del citosol donde son degradadas a péptidos. Estos péptidos son
translocados al lumen del retículo endoplásmico por medio de las proteinas TAP (figura 36).

CD8+

transportedelcomplejo
claseI-péptidoalasu-
perficie

vesícula

Golgi

TAP chaperona
cadena
ß-2-microglobulina

transportedepéptidos RE
alREpormediodeTAP
ensamblaje
asociaciónconTAP
yunióndelpéptido declaseI

proteólisis proteosoma

proteina síntesis
ubiquitinada proteina
viral

Figura 36. Presentación por MHC clase I. Esto ocurre en la gran mayoría de las células del cuerpo, incluidas las
APCs.

Las proteinas TAP descargan los péptidos en los complejos MHC clase I los cuales
resultan estabilizados. Los complejos clase I-péptido son luego transportados a la superficie
celular para el reconocimiento por el TCR de las células T CD8+. Si la célula CD8 es específica
para el péptido, se activará. Que el mecanismo descripto es esencial para la respuesta antiviral
viene también indicado por ciertos virus (e.g. adenovirus, herpesvirus1) que codifican productos
que interfieren con la presentación por clase I, ya sea uniendose con TAP o con la misma clase I.
El resultado global de tal interferencia sería la replicación viral antes que se monte una respuesta
citotóxica. La célula infectada, por otra parte, libera interferón (IFN) cuyo efecto es doble: 1) el
IFN induce a las células vecinas a expresar mayor cantidad de clase I y a movilizar mecanismos
intracelulares tendientes a bloquear la replicación viral, 2)el IFN es un potente activador de las
células NK (“natural killer cells”), linfocitos grandes capaces de lisar células infectadas. Lo
mencionado no hace más que enfatizar el rol fundamental de la presentación de antígenos virales
1
La proteina ICP47 del virus del herpes simplex promueve que las moléculas inmaduras de MHC se acumulen en
el retículo endoplásmico. La proteina E1A de adenovirus inhibe la transcripción de clase I, mientras que la proteina
E3 19 Kd forma complejos con la cadena de clase I que se retienen en el citoplasma.
por clase I. Clase I se expresa moderadamente en todas las células pero se observan altos niveles
en APCs y leucocitos.
Existe evidencia que indica que la mayor parte de la activación T no ocurre en el sitio
primario de infección sino en los linfonódulos (LN). De hecho, aquellos antígenos virales
expresados exclusivamente por células que no son presentadoras de antígeno (APC), son
virtualmente ignorados por las células T. Es probable que como consecuencia de la infección de
tejidos periféricos como las mucosas, parte de la progenie viral (y de las linfokinas producidas)
alcance los LN por vía linfática. Algunos virus que también son linfotrópicos pueden replicarse
activamente en los NL. Pero incluso virus que limitan su ciclo replicativo a los epitelios
superficiales , como los virus de la influenza y parainfluenza, pueden activar al NL mediante un
mecanismo APC-dependiente. El epitelio respiratorio, por ejemplo, posee una gran cantidad de
células dendríticas que no son infectadas productivamente por el virus de la influenza. Estas
células pueden presentar antígeno en conjunción con clase I pero también con clase II. El
mecanismo para este último caso es diferente e involucra a los lisosomas, como se ilustra en la
figura 37.

Presentación del complejo

a las células CD4.

proteina
CD4+
intacta

endocitosis
Fusión de vesícula con membrana;
expresión del complejo péptido-clase II
en la superficie
vesícula
endocítica

CIIV/MIIC
1- degradación de li y liberación
de CLIP. endosoma
2- unión del péptido a clase II.
generación de
vesícula péptidos
fusión de lisosoma

vesículas

Golgi

RE síntesis de clase II
ß li
APC

Figura 37. Presentación por MHC clase II

Las APC se traslocan vía linfática hasta los NL, donde tienen amplia oportunidad de
activar a las células T CD4+ vía MHC clase II-péptido y a las células T CD8+ vía clase I-péptido.
En condiciones de reposo, la frecuencia de células CD8+ específicos en los NL es muy
baja, del órden de 1 en un millón. Una semana después de la inoculación intranasal de virus
Sendai (parainfluenza murino), la proporción de células CD8+ aumenta a 1 en 1000 o 1 en 100.
Para el día 9 post-infección (pi), células CD8+ específicas para el virus ya se encuentran en el
tracto respiratorio. Estas células representan entre el 10 y el 20% del total de células CD8+
específicas de virus que se detectan en los NL regionales y en el bazo. La expansión clonal de
células CD8+ en los NL termina para el día 20 pi. La cinética de las células CD8+ durante la
infección aguda se muestra en la figura 38.

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Figura 38: cinética de linfocitos CD8+ en el bazo de ratones inoculados con LCMV (virus de la coriomeningitis
linfocitaria).

Cuando todas las células infectadas son eliminadas por las CTL virus-específicas, estas
mueren por apoptosis. La muerte de las CTLs es un mecanismo importante para resetear el
sistema una vez controlada la infección. Se piensa que tanto el ligando Fas como el TNF (Tumor
Necrosis Factor) están involucradas en la eliminación de células T. Un pool de células CD8+
específicas de virus escapa a este control y persiste en los órganos linfáticos (células de
memoria).
Una consecuencia importante de la presentación por células dendríticas y otras APCs en
los órganos linfáticos es la activación de células T CD4+ por vía TCR/clase II-
péptido. Las CD4+ son las mayores productoras de linfokinas en los NLs. La mayoría de los
virus inducen respuestas helper de tipo I (Th1) donde las células CD4+ producen IL-2
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Figura 39. Cinética de la producción de anticuerpos después de la infección viral aguda de ratones con el LCMV

(interleukina 2) e IFN . Estas linfokinas coestimulan las células B que han contactado con
antígeno viral y, como consecuencia, las células B proliferan, cambian de isotipo de
inmunoglobulina (Ig) y se diferencian en plasmocitos secretores de anticuerpos. La prevalencia
de células B en los NL y el bazo alcanza su pico al promediar la segunda semana pi y luego
declina en las 2 o 3 semanas subsiguientes (virus Sendai). Como se muestra en la figura 39, una
alta proporción de células B permanece en la médula ósea como células de memoria.

Los distintos virus difieren bastante en su capacidad de erigir una respuesta inmune. Los
virus que infectan APCs suelen inducir una fuerte respuesta CTL, mientras que los virus no
citopáticos que replican en neuronas o células mesenquimáticas inducen respuestas CTL pobres.
La importancia de la respuesta CTL para el control de la infección viral es ilustrada por ratones a
los cuales se ha inactivado el gen para la perforina, la proteina que forma los canales de
membrana en las células target. Cuando se infectan ratones knock out para la perforina con el
virus LCMV (RNA, Arenaviridae), las células T CD8+ no pueden lisar los targets y el virus
persiste en el organismo.

Respuesta secundaria

Las infecciones virales agudas inducen memoria celular en los linfocitos. La memoria B
se manifiesta por la secreción continua de Ig, incluso después de la resolución de la infección. La
memoria T se manifiesta por la persistencia de un pool de CTLs específicos de virus que se
encuentra en mayor número que las células naïve y que son capaces de responder con mayor
rapidez y eficacia ante la re-entrada del virus. La diferencia fundamental entre ambos tipos de
memoria es que mientras la producción de anticuerpos se mantiene activa, las células T de
memoria permanecen latentes hasta la re-entrada del virus. Esto es importante ya que de lo
contrario la secreción continua de linfokinas por células T activadas podría ser peligroso para el
huésped. Por ejemplo, el TNF induce en los macrófagos la producción de óxido nítrico que
puede ser tóxico para los tejidos (fig 40).

Figura 40. Inmunidad antiviral luego de la resolución de la infección viral aguda. Diferencia entre la memoria B y T.

La importancia de mantener un nivel de anticuerpos reside en que ante la reinfección, la

viremia puede ser mas facilmente controlada. Como consecuencia, el virus tendrá menos
oportunidades de diseminación a órganos y tejidos críticos. Para los virus que limitan la
infección a los tejidos periféricos, la clave es mantener una buena tasa de anticuerpos a nivel de
las mucosas. En general, los títulos de anticuerpos en las mucosas decaen rapidamente. Los
anticuerpos de las mucosas pueden originarse en plasmocitos residentes. La Ig A también puede
ser internalizada por los epitelios y, en principio, estaría en condiciones de neutralizar virus
intracelular.

Inmunopatologías e inmunosupresión asociadas a las infecciones virales

Muchos virus (quizás la mayoría) no son citopáticos y no causan enfermedad aguda.

Estos virus pueden ser eliminados rapidamente por la respuesta inmune, pero cuando la misma
no es adecuada el virus puede persistir en el organismo creando un conflicto entre la infección y
la inmunidad que se traduce en inmunopatología. El virus LCMV es un ejemplo.
En la figura 41 se observa que cuando se inoculan animales inmunocompetentes por vía
intracraneal (IC), el LCMV causa coriomeningitis letal. Si el virus se inocula por vía
endovenosa, resulta eliminado, a menos que la dosis sea muy alta en cuyo caso el virus persiste
en el animal. Si se inoculan ratones inmunosuprimidos por vía IC, no se desarrolla
coriomeningitis, el virus no es eliminado y el animal se transforma en un carrier. Estos
experimentos demuestran que el proceso inflamatorio que termina con la vida del animal es
causado por las células T efectoras y no por la replicación viral.

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Figura 41. Las diversas relaciones virus-huésped entre el LCMV y el ratón.

LCMV también puede causar inmunosupresión la cual se manifiesta por un déficit en la

respuesta humoral frente a otros agentes, como el virus de la estomatitis vesicular (VSV, RNA,
Rhabdoviridae). La figura 42 muestra que la inmunosupresión inducida por el LCMV depende
de la respuesta de células T ante la infección. En A se muestra la respuesta humoral en un ratón
frente al VSV. Ratones carrier para LCMV presentan la misma respuesta (B). Sin embargo, si se
infectan animales con LCMV y 10 días después con VSV, los anticuerpos anti VSV no aparecen
(C). Si a ratones infectados con LCMV se les remueven las células T CD8+, la respuesta frente al
VSV vuelve a ser normal (D). Estos experimentos demuestran que en este modelo, las CTLs son
responsables de la inmunosupresión. LCMV infecta APCs las cuales están involucradas en la
respuesta humoral frente al VSV. Las APCs infectadas son targets para las CTLs específicas de
LCMV y por lo tanto son destruidas. Esa podría ser la causa de la falta de respuesta

Figura 42. La inmunosupresión por el LCMV es causada por la respuesta CTL frente al virus.
humoral frente al VSV: la falta de APCs se traduce en un déficit de colaboración T para la
diferenciación de células B. En rigor, si la respuesta CD8+ anti-LCMV fuera lo suficientemente
rápida, la destrucción de las APCs también afectaría la respuesta de anticuerpos contra el LCMV.
Es probable que mecanismos similares operen durante la inmunosupresión ejercida por el HIV
en personas.
Muchas infecciones virales aumentan la susceptibilidad frente a otras infecciones, virales
o bacterianas. Aunque esto resulta más claro en infecciones crónicas por retrovirus como el HIV
y el virus de la inmunodeficiencia felina, también se observa con agentes como la influenza, el
virus del moquillo canino, el viruas de la diarrea viral bovina, etc.
Si durante un proceso infeccioso se desarrollan inmunocomplejos en exceso, puede
desarrollarse enfermedad inflamatoria. Esto sucede cuando en antígeno no es eficientemente
eliminado o cuando el virus persiste replicandose en el huésped. Usualmente, los
inmunocomplejos son eliminados por los macrófagos y otras células que epresan receptores para
la porción Fc de las Igs.
Otros desarreglos inmunológicos ocasionados por las infecciones virales son la pérdida
de la hipersensibilidad retardada y la disminución de la respuesta linfoproliferativa inducida por
antígenos.
¿Cuáles son los mecanismos responsables de la inmunosupresión de origen viral? Uno de
ellos es la replicación viral en células con roles críticos en la respuesta inmune. En la tabla
siguiente se enumeran algunos virus con esta capacidad.
Los virus también producen proteinas que directamente interfieren con la respuesta inmune.

Respuestas no específicas a las infecciones virales

La inmunidad natural está representada por las barreras ofrecidas por el huésped frente a
la infección antes de poner en marcha los mecanismos específicos discutidos en la sección
previa. Aunque esas barreras no suelen ser suficientes ara prevenir la infección, sí cumplen roles:
1) retrasando la relicación viral, 2) maximizando la efectividad de la respuesta específica. Entre
los elementos de la resistencia natural se encuentran los anticuerpos naturales, el complemento,
las colectinas, los macrófagos, las células NK, los granulocitos y las citokinas. Por su significado
especial durante las infecciones virales, sólo trataremos algunos de ellos.

Complemento
El sistema del complemento puede neutralizar la infectividad viral al menos de dos
formas: 1) mediante lisis directa de virus envueltos, 2) mediante opsonización de viriones
seguida de degradación en los macrófagos, los cuales tienen receptores para el factor C3.
 Tipos de interacción entre virus y células
En lo que va del curso hemos tratado con cierto detalle la que puede considerarse
la versión “más popular” de las posibles interacciones entre virus y células: la infección
aguda productiva seguida de la eliminación del virus del organismo. En esas
condiciones, el virus se replica a expensas de la maquinaria biosintética celular
promoviendo cambios profundos en la transcripción y traducción de la célula, en
estructuras membranosas, y en el control del balance supervivencia-apoptosis. La célula
muere como consecuencia de la actividad directa del virus o por acción de las células de
la inmunidad en colaboración con citokinas. Los virus enrolados en esta estrategia
sobreviven en la naturaleza ya sea infectando constantemente a los animales (e.g.
influenza), infectando huespedes alternativos (e.g. virus de la rabia, virus de las
encefalitis equina, etc), o simplemente valiendose de su resistencia para sobrevivir fuera
del organismo (e.g. poxvirus, rotavirus). Hemos sugerido varias veces que ciertos virus,
no citopáticos, establecen relaciones diferentes con el huésped en las cuales el virus
persiste y el huesped sobrevive con mayor o menor menoscabo en su fisiología. Estas
infecciones persistentes son tan o más comunes que las infecciones agudas y representan
una estrategia alternativa por la cual los virus logran replicarse y, sobretodo, transmitirse.
Son de especial interés en medicina poblacional ya que el huésped puede no manifestar
síntomas de infección y, sin embargo, ser una fuente continua de contagio. Sin duda, el
desarrollo de técnicas cada vez más sensibles de detección ha contribuido
significativamente a la identificación y análisis de las infecciones persistentes.
Existe un tipo de interacción que, por su características, será tratada por separado.
En este tipo de interacción, el control del crecimiento celular es desregulado y la
consecuencia es la transformación celular seguida de cáncer.

I) Persistencia viral

Existen tres requisitos importantes para que se establezca una infección

persistente: 1) el genoma viral debe persistir en los tejidos del huésped, 2) el virus no
debe ser citopático o su citopatogenicidad debe ser atenuada, 3) la infección viral debe
eludir de alguna manera la respuesta inmune. En general, los virus que causan
infecciones persistentes inicialmente pasan por un periodo de infección aguda. Durante la
persistencia viral, el virus puede replicarse continuamente (infección crónica), o bien
puede mantenerse sin replicar por periodos largos de tiempo ocasionalmente
interrumpidos por periodos de replicación (infección latente). Los priones causan
infecciones lentas, crónicas sin infección aguda previa.

Ia- Mecanismos de persistencia

Un virus solo puede persistir si no mata las células que infecta, por lo tanto los
virus menos citopáticos tienen mayor probabilidad de establecer infecciones crónicas.
Existen varias formas en que los virus pueden limitar su efecto lítico. Además, ciertos
virus son líticos para algunos tipos celulares pero no para otros, o resultan líticos para un
tipo celular solo en determinados periodos de la infección. Por ejemplo, los herpesvirus
neurotrópicos (HSV-1, BHV-1, PRV) son extremadamente citolíticos en células

139
epiteliales pero no en neuronas sensoriales (ver más adelante). El citomegalovirus
(CMV), otro herpesvirus, infecta monocitos de manera no productiva: la expresión de
genes virales es restringida y no hay producción de progenie. Sin embargo, cuando los
monocitos infectados se activan, se expresa toda la gama de genes virales y se libera
progenie.
Los genomas de ciertos virus pueden persistir por largo tiempo. Los genomas de
herpesvirus pueden persistir en el núcleo como episomas, con o sin replicación. Los
genomas de retrovirus y papilomavirus se insertan en los cromosomas del huésped, y
serán replicados cada vez que la célula se divida y replique su DNA. No existe un
mecanismo similar para virus RNA. Los genomas de estos virus solo pueden persistir si
se replican continuamente.
Existen diversas formas por las cuales los virus evaden al sistema inmune. En la
latencia por HSV-1, el virus persiste sin producir ninguna proteina y por lo tanto no hay
nada que el sistema inmune pueda detectar como extraño. Otros virus infectan los
denominados sitios o nichos inmunológicamente priviligiados. Uno de tales sitios es el
sistema nervioso. Las neuronas están aisladas por la barrera hemato-encefálica la cual
limita el tránsito de linfocitos por el tejido nervioso. Además, las neuronas no expresan ni
MHC clase I ni clase II por lo cual no pueden ser reconocidos directamente por los
linfocitos T. Por razones desconocidas, el riñón es frecuente asentamiento de infecciones
persistentes con continua eliminación de virus por la orina. Algunos poliomavirus
humanos y el CMV persisten de esa manera. Recientes estudios han demostrado que,
aunque no existen barreras en el riñón, los linfocitos T están impedidos de llegar al
epitelio renal. Otros sitios de privilegio lo constituyen las glándulas salivales (CMV,
virus de Epstein Barr), la epidermis (papilomavirus), etc.
La variación antigénica es una forma reconocida por la cual los virus evaden la
respuesta inmune. Los virus RNA que causan infecciones persistentes se valen de su alta
tasa de mutabilidad para generar variantes que eluden el reconocimiento por anticuerpos
y células T. El mejor ejemplo de variación durante la infección persistente de un animal
lo constituyen los lentivirus (RNA, Retroviridae), como el virus de la anemia infecciosa
equina (VAIE). Cuando se toman muestras de suero de caballos infectados con el VAIE
a distintos tiempos de la infección, se observa que un suero es capaz de neutralizar virus
aislado de episodios clínicos previos pero no de los subsecuentes. Este fenómeno se
correlaciona con variaciones en las glicoproteinas que son blanco de los anticuerpos
neutralizantes. Observaciones similares se realizaron con otros lentivirus como el HIV, el
virus de la artritis/encefalitis caprina, etc. En muchos casos, el virus “parental” (e.g. el
que inicia la infección) persiste junto con las nuevas variantes lo cual nos lleva a
interrogarnos ¿cuál es el significado de tal variación antigénica para el virus si el animal
es incapaz de eliminar el virus parental? Desde este punto de vista, parece que la
variación antigénica no es un requisito para que estos virus persistan.
Así como se producen variantes de escape a la neutralización por anticuerpos,
también se producen variantes de escape al reconocimiento por células T CD8+ . Esto
puede darse porque: 1) los péptidos virales dejan de ser reconocidos por las CD8+, 2) el
péptido variante es reconocido por el TCR pero en vez de constituir una señal activante
actúa como antagonista.
Ya hemos mencionado (ver Respuestas específicas…) que otro mecanismo para
eludir el reconocimiento por los linfocitos es la interferencia con la presentación de

140
péptidos. Esto puede lograrse por confiscación de MHC dentro de la célula, bloqueo de
las proteinas TAP, desregulación de moléculas de adhesión como LFA-3 y ICAM-1, etc.
por una o más proteinas virales. Aunque varios grupos de virus parecen entrar en esta
categoría, aún no se han realizado experimentos in vivo que comprueben que tales
interferencias son requeridas para que estos virus persistan.
Los virus también pueden interferir con las citokinas a través de productos virales
(sobretodo en grandes virus DNA) denominados virokinas. Un ejemplo conocido es la
proteina T2 de los poxvirus la cual presenta homología estructural con el receptor para el
TNF y es liberada a partir de las células infectadas. T2 se une al TNF fuera de las células
impidiendo que se una a su receptor natural, previniendo así el efecto tóxico del TNF
sobre las células inectadas. Otras virokinas han sido identificadas en poxvirus,
herpesvirus, virus de la peste porcina africana y adenovirus. Aunque es tentador pensar
que estas interferencias facilitarían el escape de la respuesta inmune y la persistencia, se
trata de trabajos in vitro que requieren confirmación experimental en el contexto del
animal.
Finalmente, quizás la mejor forma de eludir al sistema inmune y persistir es
mediante la tolerancia inmunológica. Ejemplos de este mecanismo son la hepatitis B en
personas y el virus de la diarrea viral en bovinos. En el primer caso, chicos que nacen de
madres infectadas se transforman en carriers del virus. La infección temprana promueve
deleción clonal en el timo o en la perisferia.

Un ejemplo de latencia viral: los herpesvirus neurotrópicos

Los virus del herpes simplex (HSV), de la rinotraqueitis infecciosa bovina (BHV-
1) y de la seudorabia (PRV), pertenecen a la subfamilia alpha de herpesvirus y presentan
un ciclo infeccioso muy similar en sus huéspedes naturales. El virus se replica
inicialmente en el tejido epitelial de alguna mucosa (generalmente la mucosa nasal,
labial, conjuntival o genital, según el virus). Las células epiteliales son permisivas a la
infección y producen progenie viral. Por lo tanto, en la periferia estos virus producen una
infeccón lítica productiva en la cual se expresan todas las clases temporales de genes:
precoces (genes IE), tempranos (genes E) y tardíos (genes L). La progenie viral
subsecuentemente penetra en las terminales nerviosas que se ubican entre las células
epiteliales. Estas terminales pertenecen a neuronas sensoriales cuyos somas se encuentran
en los ganglios nerviosos raquídeos y craneales.
Los viriones utilizan el flujo axonal retrógrado para llegar hasta el soma (figura
51) donde ocurre la denudación. En unas pocas neuronas ocurre una infección productiva
similar a la descripta para la periferia, se produce progenie viral pero esta no tiene
oportunidad de propagarse lateralmente. Este bloqueo parece depender de la no
permisividad de las células gliales satélites que rodean los somas pero también de la
rápida respuesta celular inflamatoria.
La mayoría de las neuronas infectadas, sin embargo, no son permisivas a la
infección. En estas células, una vez denudado, el genoma viral se instala en el núcleo
como un episoma (e.g. no se integra en los cromosomas). El virus no se replica en estas
condiciones, no se producen proteinas virales y la neurona mantiene su función. Decimos
que el virus permanece en estado latente y que las neuronas quedan latentemente
infectadas.

141
 Cuando se infectan animales con alguno de estos virus, puede recuperarse virus
infeccioso de los ganglios mediante la técnica de homogenato solo durante las primeras
dos semanas pi. Este periodo coresponde a la fase aguda de la infección en la que unas
pocas neuronas sostienen una infección productiva. Transcurrido este intervalo, ya no
puede aislarse virus infeccioso de los homogenatos de ganglio. Este periodo (fase latente)
puede durar meses o años hasta que algún estímulo promueva reactivación viral.

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Figura 51. Colonización ganglionar por los herpesvirus neurotrópicos.

En la reactivación se produce virus infeccioso, detectable por medio de

homogenatos. El virus es transportado por medio del flujo axonal anterógrado hacia la
perisferia. En el tejido periférico (usualmente el mismo sitio donde ocurrió la infección
primaria) se produce un un ciclo lítico de infección seguido de reinternalización y re-
infección del ganglio. Por lo tanto, se establece un ciclo de infección aguda periférica-
infección latente ganglionar-reactivación que perpetúa la infección de la persona o animal
sin tener que invocar una fuente exógena de virus. Es más, este ciclo se repite a pesar que
el animal o persona monta una respuesta inmune adecuada, tanto celular como humoral.
Recordemos que el tejido nervioso es considerado un nicho privilegiado. La única
instancia en la cual el sistema efector del sistema inmune tiene oportunidad de atacar al
virus es durante la replicación periférica ya que luego se encuentra oculto en el soma
neuronal o su axón, el cual no expresa antígenos de hisocompatibilidad clase I o II. Esto
se ve agravado por el hecho de que el virus latente no expresa ninguna proteina. La
infección latente por herpesvirus neurotrópicos es considerada como una de las formas
más acabadas de parasitismo.
La transcripción del genoma viral durante la fase latente se encuentra severamente
restringida. Solo una región discreta del genoma latente produce transcriptos. En el HSV-
1 los transcriptos reciben el nombre de LATs (Latency Associated Transcripts o
transcriptos asociados a la latencia). Aun no se ha comprobado si los LATs codifican
para una proteina o, en otras palabras, si los LATs son mRNAs. Al representar el único
producto de transcripción del virus latente, los LATs rapidamente llamaron la atención

142
por su posible rol en algún aspecto de la latencia, ya sea en el establecimiento, el
mantenimiento o la salida (reactivación) del estado latente. Para contestar esta pregunta,
se construyeron mutantes del HSV-1 que no producen LATs, utilizando las mismas
estrategias que vimos al tratar Genética viral. Cuando se infectaron ratones con estos
mutantes se reprodujo la infección latente de manera similar que con el virus salvaje. Sin
embargo, cuando se examinaron los ganglios de animales infectados con los mutantes, se
observó que una gran cantidad de neuronas entraba en apoptosis. La hipótesis actual es
que los LATs, mediante un mecanismo desconocido, previenen la muerte de las neuronas
inducida por la infección. En otras palabras, el virus prevendría la extinción de su propio
nicho de persistencia.
Se desconocen los mecanismos que subyacen a la reactivación. Probablemente,
los estímulos reactivantes promuevan un cambio en el status fisiológico de la neurona a
través de la activación de factores de transcripción o de kinasas. Estos factores a su vez
podrían activar la expresión de genes virales conduciendo a un ciclo lítico.
Aunque todos los miembros de la familia Herpesviridae tienen la propiedad de
establecer infecciones latentes, los sitios de latencia y sus modalidades de reactivación
varían entre los distintos virus. La latencia por herpesvirus ilustra un importante
principio. Un mismo virus puede establecer ciclos infecciosos en tipos celulares disímiles
adaptandose y sacando provecho de su particular fisiología. Genes virales que pueden ser
críticos para un tipo celular no lo son necesariamente para el otro, y viceversa. Por otra
parte, la latencia cumple con los requisitos básicos de las infecciones persistentes: 1)
efecto lítico restringido en neuronas, 2) persistencia del genoma, 3) evasión del sistema
inmune.

Infección persistente por el virus del sarampión

El virus del sarampión es un paramixovirus (RNA, polaridad -) que infecta a las

personas causando una enfermedad eruptiva. La infección, tipicamente aguda, puede
compremeter el sistema nervioso causando una encefalitis aguda post-infecciosa. Con
baja frecuencia, el virus causa una panencefalitis subaguda progresiva (SSPE) años
después de la resolución de la infección aguda, que es el resultado de la persistencia del
virus en el sistema nervioso.
El virus del sarampión inicia la infección en el epitelio respiratorio y luego invade
los linfonódulos regionales. El virus se replica en el linfonódulo y luego causa viremia
asociada a los leucocitos. La viremia disemina el virus a otros linfonódulos causando
hiperplasia linfoidea seguida de viremia secundaria. Como resultado de la viremia
secundaria, múltiples tejidos resultan infectados: tractos gastrointestinal y respiratorio,
piel (donde aparecen las típicas erupciones), conjuntiva, etc.
El sistema nervioso probablemente resulte infectado durante la viremia
secundaria. El virus persiste en el tejido nervioso bajo una marcada depresión de la
respuesta inmune a células T. Estudios in vitro demostraron que el virus del sarampión se
replica a muy bajos niveles en las neuronas con poca o ninguna eliminación de progenie
viral. En pacientes con SSPE se observa retención de nucleocápsides dentro de la célula y
expresión reducida de antígenos virales en las membranas.
En pacientes con SSPE se han demostrado variantes mutadas de la proteina M
(matriz) del virus. Estas variantes no alcanzarían una conformación funcional, se retienen

143
en el citosol y no son incorporadas en nucleocápsides. En estas condiciones, el virus no
puede salir de la célula infectada por los mecanismos normales, aunque sí existe
evidencia de que el virus defectuoso puede propagarse directamente entre células que
contactan entre sí. También se han aislado virus de pacientes con SSPE en los cuales la
proteina de fusión lleva una o más mutaciones. Probablemente, las mutaciones de los
genes virales junto a una respuesta inmune deficiente contribuyan a la persistencia viral.

II) Transformación celular por pequeños virus DNA

Tanto virus DNA como RNA pueden inducir tumores. Los virus DNA causantes
de tumores son virus pequeños como poliomavirus y papilomavirus. Los papilomavirus
han recibido gran atención por su rol en las displacias y carcinomas en humanos y
bovinos. Otro papilomavirus, el virus de Shope, causa papilomas cutaneos benignos en
conejos.
Uno de los conceptos surgidos del estudio de virus oncogénicos a DNA es que los
mismos codifican una o más proteinas (oncoproteinas virales) capaces de interactuar con
proteinas celulares que juegan roles críticos en el control del ciclo celular. En la mayoría
de los casos, las oncoproteinas se asocian a la proteina del retinoblastoma (pRb) o a p53,
o a ambas. Tanto pRb como p53 son proteinas celulares con función supresora de los
tumores. Por lo tanto, los genes que las codifican se conocen como antioncogenes. De lo
arriba expuesto se deduce que cualquier desregulación ocasionada sobre pRb y/o p53 por
las oncoproteinas virales va a derivar en una célula con menor probabilidad de controlar
su proliferación.

II-a) Rol de pRB y p53 en el ciclo celular

El ciclo celular consiste en una serie de fases (G1, S, G2 y M) que culmina con la
repartición de los cromosomas, organelos y compartimientos entre dos células hijas
(figura 52). La transición entre las fases está controlada por kinasas denominadas cdk’s (=
kinasas dependientes de ciclinas). Las ciclinas son proteinas cuya concentración oscila a
lo largo del ciclo celular y cuya función es activar en momentos precisos a las cdk’s.
Dicha activación requiere asociación directa entre ciclina y cdk. Existen ciclinas y cdk’s
específicas para cada fase del ciclo (fig. 53).
Uno de los eventos más importantes del ciclo celular es la transición de la fase G1
a la S, ya que una vez superada, la célula completará el ciclo irreversiblemente. El
objetivo de tal transición es la activación de todos los genes necesarios para la replicación
del DNA, el proceso bioquímico que caracteriza a la fase S. En las células en reposo
reproductivo, la transición G1-S está bloqueada por pRb. Esta proteina nuclear logra su
propósito de diversas maneras. Una de ellas es inhibiendo factores de transcripción que
funcionan activando genes de la fase S del ciclo (fig 54). Se piensa que la función de
freno del ciclo de pRb es central a su efecto antitumoral.
Las células son generalmente estimuladas a dividirse a través de la inducción
ejercida por factores de crecimiento o mitógenos. Uno de los efectos más importantes de
los factores de crecimiento es suprimir el bloqueo ejercido por pRb. La célula estimulada
por factores de crecimiento produce cdk’s y ciclinas específicas de fase G1. Las cdk4 y
cdk2, activadas respectivamente por las ciclinas D y E, fosforilan a pRb y así la inactivan.

144
Una vez fosforilada, pRb no puede ya inhibir a los factores responsables de la activación
de los genes de fase S (e.g. E2F, fig. 54). No es de extrañar que varias oncoproteinas de
virus inductores de tumores apunten a pRb con la misma consigna: suprimir el freno del
ciclo celular. Varios poliomavirus, papilomavirus y adenovirus1 codifican oncoproteinas
con capacidad de inactivar a pRb.

G
2 G
1

Figura 52. Fases del ciclo celular

p53 es un factor de transcripción celular que se encuentra mutado en muchos

tumores. Su rol más importante es impedir que las células propaguen ciertos defectos que
pueden ser lesivos para el organismo. La situación mas estudiada es cuando el DNA
celular se encuentra dañado. De una manera aún no aclarada, el daño en el DNA celular
estimula la expresión de p53 la cual, a su vez, activa la transcripción de varios genes. La
entrada a M

MPF
M
activación cdk
B (p34)
de targets
cdk4
D
cdk6
G2 G1
activación de targets
cdk2
E
R
entrada a S
S
cdk2
E
A
A

Figura 53. Ciclinas y cdk´s

consecuencia de tal activación es la apoptosis o la detención del ciclo celular, según el

estado de la célula.

1
Los adenovirus no causan tumores en sus huespedes naturales, pero sí en animales de laboratorio.

145
 La vía que interrumpe el ciclo es la mejor conocida. p53 activa la expresión de
p21, una proteina que se une a las cdk´s de la fase G1 impidiendo que pRb sea
desactivada (figura 55). Como consecuencia, la célula no avanza a la fase S. La hipótesis
actual es que la inactivación de p53 lleva a la inestabilidad genómica de la célula, una
característica del cáncer.

Figura 54. Efecto de las cdk´s/ciclinas sobre pRb.

146
 Figura 55. Inhibición de la entrada a S por p53.

II-b) Poliomavirus y Adenovirus

Los poliomavirus, son pequeños virus DNA cuyo genoma circular contiene unas
5000 bases. Miembros de esta familia son el SV40 (Simian Virus 40), y los virus
humanos JCV y BKV. El SV40 suele causar infecciones asintomáticas en monos, pero se
lo ha asociado con tumores cerebrales en chicos. El BKV también suele ser asintomático
pero ocasionalmente causa tumores en personas inmunocomprometidas.

Figura 56. Organización genómica del SV40. El virus contiene 5243 bases. La región E se
transcribe de derecha a izquierda a partir de “0”. La región L (VPs) , en sentido contrario. Las regiones
codificantes se muestran como flechas sombreadas. Notese que T y t poseen la misma secuencia en sus
extremos N.

147
 El genoma de poliomavirus contiene dos promotores, uno temprano y otro tardío.
La activación del promotor temprano ocurre antes de la replicación del genoma y resulta
en la producción de dos proteinas: T y t (también conocidas como antígenos T grande y
pequeño, respectivamente) obtenidas a partir de un transcripto primario por splicing
alternativo (fig. 56). La proteina T es multifuncional: es un factor de transcripción viral,
una ATPasa, una helicasa con participación en la replicación del genoma, y también una
oncoproteina. La simple introducción del gen T en muchos tipos celulares lleva a la
inmortalización. Cuando se crearon ratones transgénicos que expresaban la proteina T, la
gran mayoría desarrollaba tumores de distinta naturaleza.

La proteina T se une específicamente tanto a pRb como a p53 2. Como

consecuencia, pRb y p53, dos de los frenos más importantes para el avance del ciclo
celular, son inactivados. Estudios con mutaciones diseñadas intragénicas han demostrado
que la deleción de las regiones del antígeno T responsables de unir pRb o p53 eliminan el
poder transformante de T.
¿Es la formación de tumores un requisito para que los poliomavirus se propaguen
en el huésped? La baja frecuencia de tumores ocasionados por poliomavirus en sus
huéspedes naturales indica que no. Para una infección productiva exitosa, estos virus
necesitan crear un ambiente intracelular apropiado para la replicación de su genoma. En
otras palabras, necesitan de células en etapa S del ciclo celular. Sabemos que la gran
mayoría de las células de un organismo se encuentran en estado quiescente, fuera del
ciclo celular. Por lo tanto, la estrategia de virus como el SV40 consiste en cancelar el
estado quiescente movilizando la célula hacia la fase S, en la cual abundan enzimas
relacionadas con el metabolismo de los ácidos nucleicos y la duplicación del DNA. Por
ejemplo, los niveles de deoxinucleótidos en células quiescentes es muy bajo y los mismos
solo aumentan significativamente cuando la actividad de la enzima reductasa de
ribonucleótido aumenta como consecuencia de la entrada en fase S. Las oncoproteinas
como el antígeno T facilitan la transición G1/S al suprimir los efectos bloqueantes de pRb
y p53. La importancia de este hecho queda ilustrada por la existencia de oncoproteinas en
otros virus DNA pequeños que tienen requerimientos similares para replicar su genoma,
y que usan a pRb y/o p53 como targets.
La supresión funcional de pRb y/o p53 es necesaria pero no suficiente para
desencadenar la formación de un tumor, tal cual lo indica la baja frecuencia de tumores
inducida por poliomavirus. Esta observación está de acuerdo con el conocimiento actual
sobre el desarrollo del cáncer. Se piensa que la transformación celular es consecuencia de
al menos dos eventos mutacionales. La mutación de p53 (o de pRb) podría ser uno de
ellos tal cual lo atestigua la alta frecuencia de p53 mutada en tumores humanos. Por sí
solo, dificilmente la mutación de p53 justifique el crecimiento descontrolado de una
célula. Pero sí podría explicar la propagación de células con defectos en el DNA.
Recordemos que la inestabilidad genética es típica de la célula cancerosa. En tanto los
defectos en el DNA no sean detectados y suprimidos por p53, las posibilidades de que
surjan mutaciones en otros genes aumenta. Con cierta frecuencia, tales mutaciones
podrían recaer sobre otras proteinas que funcionan en el ciclo celular. Por ejemplo, si la
mutación recae sobre el gene ras (otra proteina que suele estar mutada en muchos
tumores) este podría mantenerse activo aún en ausencia de factores de crecimiento. En
2
En realidad, p53 fue descubierta por su cualidad de asociarse físicamente con el antígeno T.

148
conecuencia, el núcleo celular es continuamente estimulado para instruir un ciclo celular
tras otro. En este contexto, la supresión de p53 y/o pRb por los virus DNA tumorigénicos
garantizaría el primer paso hacia la transformación celular.
Uno de los mecanismos fundamentales para suprimir el crecimiento
descontrolado de los tejidos es la apoptosis. p53 (y también pRb) juega un rol importante
en la apoptosis en respuesta al daño genómico. Por lo tanto, su inactivación por
oncoproteinas virales también garantiza la supervivencia celular hasta tanto el virus haya
escapado de la célula.

Los adenovirus no son tumorigénicos en sus huéspedes naturales pero sí inducen

tumores en roedores. La actividad transformante de los adenovirus recae sobre dos genes
de expresión temprana, E1A y E1B. E1A produce dos proteinas por splicing alternativo
que son esenciales para la activación de la transcripción viral durante la infección lítica.
Estas proteinas también se unen (e inactivan) a pRb. La remoción de secuencias en las
proteinas E1A responsables de unirse a pRb disminuyen significativamente su capacidad
transformante. E1B también origina dos proteinas, una de las cuales (55 Kd) facilita el
transporte de los mRNAs virales al citoplasma. La proteina 55 Kd se une (e inactiva) a
p53. Nuevamente vemos como un virus DNA que requiere un “ambiente S” para su
replicación, destina dominios de dos importantes proteinas reguladoras para inactivar
pRb y p53. La transfección de células humanas con el gen E1A es suficiente para su
transformación pero más a menudo el resultado es la apoptosis. El efecto apoptótico de
E1A puede prevenirse si previamente las células son transfectadas con el gen E1B.

II-c Papilomavirus

Los papilomavirus (PV) causan tumores en animales y en humanos. La

imposibilidad de propagar PV en cultivo ha determinado que gran parte de nuestro
conocimiento dependa de estudios in vivo. La biología de los PVs es un excelente
ejemplo de la adaptación de un virus al tejido que infecta, los epitelios de revestimiento.
El BPV-1 (papilomavirus bovino 1) produce fibropapilomas en el ganado, aunque la
infección productiva solo ocurre en el epitelio esamoso diferenciado. El BPV-4 produce
hiperproliferación epitelial en el tracto gastrointestinal que puede progresar a cáncer en
animales que consumen ciertas plantas tóxicas. Más de 100 genotipos de PVs humanos
(HPV) han sido identificados a partir de distintas lesiones epiteliales. Algunos son
netamente cutaneos y se asocian con verrugas benignas, pero otros son mucosotrópicos y
pueden causar cáncer anogenital y otros tipos de cáncer. De acuerdo al riesgo de
progresar a neoplasia, los HPV se dividen en virus de alto (HPV-16, HPV-18) y bajo
riesgo. Los de alto riesgo producen lesiones genitales que pueden regresar o persistir, con
un bajo porcentaje evolucionando a carcinomas o adenocarcinomas in situ.
El genoma de los PVs es una molécula circular de DNA de doble cadena de unas
8000 bases de longitud. Todos sus regiones codificantes se localizan en una de las dos
cadenas de DNA. Un 10% del genoma, conocido como URR (Upstream Regulatory
Region) no codifica para ninguna proteina pero contiene importantes secuencias
regulatorias: uno o dos promotores y el origen de replicación del DNA. Gracias al
splicing alternativo, los PVs producen más proteinas que las deducidas a partir de sus
marcos de lectura (ORFs) (fig. 57). La región codificante del genoma se divide en dos

149
subregiones: E (temprana) y L (tardía). La subregión E codifica para las proteinas E1 a
E7, responsables de la regulación de la transcripción viral, la replicación del genoma y la
patogénesis. Los genes L son estructurales y codifican para las proteinas del virión.

Figura 57. Estructura genómica del HPV. Aunque el genoma es circular aquí se muestra la
versión linearizada. Los rectángulos arriba representan los ORFs. Los números sobre la línea horizontal
indican pares de bases. Debajo de la línea se muestran los mensajeros virales (a, b, c, etc) a la izquierda y
las proteinas por ellos codificadas, a la derecha.

El ciclo replicativo de los PVs está intimamente asociado a la fisiología de los

epitelios estratificados (EE). Los EE consisten de múltiples estratos de keratinocitos. Las
células basales apoyan sobre la membrana basal e incluyen stem cells que se dividen
periódicamente para renovar al estrato parabasal suprayacente. Las células parabasales
poseen aún cierta capacidad replicativa pero pronto quedan determinadas para
diferenciarse. Hacia apical se encuentran las células espinosas y las granulosas. Ambos
tipos celulares se hallan fuera del ciclo celular y representan distintos estadios de
diferenciación caracterizados por la síntesis de keratinas específicas (K1 y K10, en el
caso de la piel). Las células granulosas finalmente sufren apoptosis y todo lo que queda
de ellas son fibras de keratina entrecruzadas que forman las escamas del estrato córneo.
Todas las capas mencionadas están presentes en las verrugas causadas por PVs. La
dinámica de proliferación y diferenciación del epitelio está influenciada por el factor de
crecimiento epidérmico (EGF) y los factores de crecimiento tumoral (TGF) y
secretados por los keratinocitos y los fibroblastos de la dermis.

150
 Para que los PVs infecten un epitelio estratificado es necesaria una lesión. El virus
establece una infección persistente en el estrato basal. Es probable que, como
consecuencia de los procesos reparativos del epitelio, las stem cells proliferen
activamente generando una población de células infectadas. Cuando la reparación
termina, las células basales vuelven al estado de reposo pero cierto número de células
parabasales y sus productos de diferenciación contienen virus. El virus puede permanecer
en estado latente o bien replicar y generar progenie. Las lesiones pueden regresar,
persistir o progresar con el tiempo según el status del sistema inmune. Los PVs no causan
lisis celular como otros pequeños virus DNA, más bien extienden el intervalo entre la
diferenciación y la apoptosis de los keratinocitos.

Figura 58. Diferenciación del epitelio cutaneo normal y actividades virales en lesiones benignas
infectadas productivamente (Nathanson. Viral Pathogenesis, 1997)

En las lesiones benignas, puede detectarse DNA viral en el núcleo de las células
epiteliales. Aunque el genoma viral se mantiene como un episoma, en algunos
carcinomas se lo encuentra integrado a los cromosomas celulares. La amplificación del
genoma solo ocurre en keratinocitos que abandonaron el ciclo celular. Al igual que los
poliomavirus, los PVs inducen en estas células un estado de fase S necesario para la
replicación del genoma viral.
En algunas células no se observa transcripción viral (latencia) mientras que en
otras la transcripción es compatible con una infección productiva. Esto último suele
observarse en el estrato espinoso lo cual sugiere que los promotores virales son
especialmente activos en esta etapa de la diferenciación de los keratinocitos (fig 58). En
contraposición a las lesiones benignas, las células cancerosas expresan altos niveles de

151
los genes virales E6 y E7 y bajos niveles de E5. Esta observación sugirió que E6 y E7
podrían codificar para oncoproteinas. La introducción de los genes E6 y, sobretodo, E7
en células cultivadas lleva a su transformación. Como el antígeno T de poliomavirus y
E1A de adenovirus, la proteina E7 se une e inactica a pRb. Significativamente, las
proteinas E7 de HPVs de alto riesgo se unen a pRb con bastante mayor afinidad que las
E7 de virus de bajo riesgo. Por lo tanto, existe una correlación entre la capacidad de E7
para unirse a pRb y el riesgo de inducir cáncer tras la infección. La proteina E6 de HPVs
se une e inactiva a p53 y por lo tanto podría suprimir la apoptosis mediada por p53 en
respuesta a la inducción de la fase S promovida por E7. Nuevamente, E6 de virus de alto
riesgo son más eficientes en suprimir la función de p53 que las de bajo riesgo.
Simultaneamente, E6 impediría el bloqueo ejercido por p53 en el avance del cilo celular.
E6 podría operar como oncoproteina sin necesidad de interactuar con p53. Efectivamente,
la proteina E6 del BPV-1 también es una oncoproteina en ensayos in vitro, sin embargo
no parece asociarse a p53. Se desconoce su mecanismo de acción.
Como mencionaramos arriba, la interferencia con pRb y p53 por los PVs lleva a
la creación de un ambiente del tipo de fase S en células quiescentes como las del estrato
espinoso. Esta acción es vital para la replicación del virus pero no es suficiente para la
progresión de las lesionas hacia carcinomas. De acuerdo al modelo de múltiples pasos de
la oncogénesis, otras mutaciones en genoma celular deben acumularse para dar paso a la
malignidad.

Conclusiones: hemos visto que distintos virus DNA, no relacionados entre sí, codifican
proteinas que interfieren con la actvidad de reguladores del ciclo celular y la
supervivencia celular. Desde la perspectiva viral, tal interferencia es necesaria para la
infección productiva. Sin embargo, la inactivación de reguladores como pRb y p53
sensibilizan a las células a sufrir cambios genómicos que favorecen la proliferación
descontrolada de las células. Es notable que los virus DNA grandes no codifiquen
proteinas similares a pesar de presentar requerimientos parecidos para inducir una
infección productiva. Sin embargo, estos virus tienen tamaños de genoma que les
permiten codificar para un mayor número de proteinas. Entre ellas se encuentra la
reductasa de ribonucleótido, una típica enzima de fase S. Por lo tanto, los grandes virus
DNA podrían no necesitar movilizar a la célula quiescente hacia la fase S: pueden crear
su propio ambiente a partir de los genes virales.
Seguidamente abordaremos al otro gran grupo de virus oncogénicos, los
retrovirus. Primero daremos cuenta de las caracteristicas biológicas mas importantes de
este grupo de virus para luego detenernos en los mecanismos por los cuales inducen
transformación celular.

III- Transformación por virus RNA (retrovirus)

http://pathmicro.med.sc.edu/Spanish-Virology/spanish-chapter6.htm

152
153
 ANTIVIRALES

Los virus son parásitos intracelulares estrictos y pueden replicar sólo cuando
infectan células, apropiándose de su maquinaria metabólica para producir nuevas
partículas virales. Debido a que su ciclo replicativo está íntimamente relacionado
con el de la célula que infecta, es difícil afectar la replicación viral sin alterar las
funciones celulares. Por ello es necesario encontrar blancos vulnerables
particulares de la replicación viral que permitan un ataque selectivo.
Con frecuencia no se dispone de modelos animales adecuados para probar la
eficacia de nuevos antivirales de utilización en humanos debido al tropismo viral
específico a cada especie. Por otra parte, los resultados que se obtienen in vitro, no
necesariamente se reproducen in vivo.

Entonces, las limitantes en la obtención de antivirales de utilidad clínica son:

- Los virus son parásitos intracelulares estrictos

- Utilizan la maquinaria metabólica celular en el desarrollo de su ciclo replicativo
- Existen variadas dificultades en la evaluación de nuevas drogas ( extrapolación de
resultados desde estudios in vitro y con modelos animales a su utilización in vivo
sobre la especie destinada)

Los progresos en la quimioterapia antiviral han generado la necesidad de contar con

técnicas de diagnóstico rápidas y específicas que permitan instaurar un tratamiento
antiviral precoz y adecuado.

Las características que debe cumplir un antiviral para ser utilizado en clínica son:

- Alta especificidad
- Baja toxicidad
- Buena solubilidad
- Buena biodisponibilidad oral
- Sin acción mutagénica, teratogénica y carcinogénica
- De dosificación y costo convenientes

En forma general, el control de las infecciones virales puede realizarse por:

a) Sustancias inactivantes que actúan directamente sobre la partícula viral, en

forma previa a su ingreso al huésped susceptible( Ej. antisépticos y
desinfectantes).

b) Compuestos antivirales que interfieren con el ciclo replicativo, evitando la

formación de progenie viral.

c) Inmunomoduladores: compuestos que modifican la respuesta inmune del

huésped (Ej. Interferón).

154
 COMPUESTOS MÁS UTILIZADOS COMO DROGAS ANTIVIRALES

Dentro del grupo de compuestos utilizados como estrategias antivirales

encontramos:

1. Anticuerpos antivirales (impiden la adsorción viral)

2. Moléculas solubles (funcionan como el receptor celular neutralizando al
virus antes de infectar células Ej. Cd4).
3. Derivados de péptidos virales que impiden la adsorción o la penetración
del virus a la célula, interactuando o compitiendo con proteínas virales que
participan con receptores o co-receptores celulares.
4. Péptidos inhibidores de la fusión de membranas que impiden los cambios
conformacionales de las proteínas virales necesarios para este proceso y la
entrada viral (Ej. T-20).
5. Inhibidores de las enzimas virales pueden o no ser análogos de
nucleósidos o nucleótidos.
a. Análogos de nucleósidos: por su estructura química, impiden la
síntesis de la nueva hebra viral al ser incorporados a esta cadena (Ej.
Aciclovir).
b. Inhibidores enzimáticos no análogos: incluyen a los compuestos
que inhiben a la transcriptasa reversa y a las proteasas de HIV. Los
antivirales más utilizados en clínica son aquellos capaces de bloquear
enzimas virales en distintas etapas del ciclo replicativo. Las enzimas
virales susceptibles de ser inhibidas son: DNA y RNA polimerasas,
transcriptasa reversa (Ej. HIV), proteasas (HIV) y neuroaminidasa
(influenza).
Se encuentran en estudio los inhibidores de la integrasa (retrovirus) que
impedirían la integración del DNA viral al genoma del huésped.
6. Compuestos químicos que impiden la modificación de péptidos o
proteínas: Se trata de proteínas involucradas en el denudamiento viral (Ej.
Amantadina para el virus influenza).
7. Otros: Se encuentra en estudio la utilización de otras moléculas que
bloquean la síntesis de RNA, DNA o proteínas, como los RNA de
interferencia.

ETAPAS DEL CICLO DE REPLICACIÓN VIRAL QUE PUEDEN SER

AFECTADAS POR DROGAS ANTIVIRALES

Los avances en el conocimiento del ciclo replicativo de diferentes virus ha permitido

definir etapas específicas del ciclo de multiplicación viral, posibilitando el desarrollo
de inhibidores selectivos de estas etapas.
Un agente antiviral efectivo interrumpe la replicación viral en un sitio específico y
esencial del ciclo replicativo, sin afectar el metabolismo normal de la célula
huésped. Para identificar estos sitios es necesario conocer la estructura y los
mecanismos replicativos propios de cada familia de virus.

155
Los blancos de acción más adecuados son las etapas críticas de la replicación
(Figura 1).

Adsorción y penetración: Todos los virus ingresan a la célula por estos

mecanismos. Estos procesos implican la interacción de componentes virales con
receptores específicos a nivel de la membrana celular, siendo susceptibles a la
acción de agentes como los anticuerpos antivirales específicos, así como también
de moléculas receptoras solubles (CD4 soluble), bloqueantes de receptores (en
desarrollo para HIV) e inhibidores de fusión de los co-receptores (T-20 o Enfuvirtiva
en HIV) (Figura 2).

156
Denudamiento: En muchos casos algunas enzimas celulares participan junto a las
enzimas virales durante el proceso de denudamiento, por este motivo resulta difícil
interferir en esta etapa en forma específica sin alterar el metabolismo celular. En
infecciones por el virus de influenza se han utilizado, Amantadina y Rimantadina
(aminas primarias), que impiden el denudamiento viral.

Síntesis de macromoléculas virales: En esta parte del ciclo es importante

distinguir :

a) Síntesis de RNA mensajero. El proceso de síntesis de macromoléculas se

inicia con la formación de RNA mensajero (mRNA). Siendo la transcripción
un proceso universal, es difícil actuar sobre esta etapa sin interferir en la
transcripción de la célula huésped. Se podrían diseñar drogas que inhiban la
capacidad funcional del ácido nucleico viral que ingresa, o bien actuar sobre
las enzimas involucradas, o sobre el producto.

b) Replicación del genoma viral. Este proceso implica replicación de virus RNA
y DNA :

- Replicación de virus RNA.

Debido a que la célula normalmente sintetiza ribonucleótidos y RNA en forma

continua, interferir con la síntesis de RNA altera la función celular. Por lo tanto, los
blancos apropiados deben ser el RNA viral, la actividad de la RNA polimerasa y, o el
complejo replicativo. Los compuestos que actúan a este nivel son la Ribavirina
(análogo de guanosina) y moléculas de RNA de interferencia.

- Replicación de virus DNA.

Los blancos más vulnerables son la fuente de desoxirribonucleótidos y las enzimas

virales, sobre los que actúan los análogos de nucleósidos. Estas moléculas se

157
incorporan al genoma viral que está replicando y pueden: a) actuar como terminador
de cadena, inhibiendo la elongación de la hebra de DNA, b) inhibir irreversiblemente
a la polimerasa que participa en el proceso replicativo y c) actuar en ambos niveles.
En este grupo se encuentran los antivirales más eficaces en clínica: Aciclovir (ACV),
Zidovudina (AZT), etc (Figura 3). Existen también compuestos no análogos de
nucleósidos, capaces de inhibir la actividad de las polimerasas virales, pero no
actúan como terminadores de cadena. El Foscarnet es el más utilizado en clínica y
actúa sobre la DNA polimerasa de los herpesvirus, y del virus hepatitis B y la
transcriptasa reversa de HIV (Figura 3).

Figura 3: A y B Estructura química de análogos nucleósidos de guanosina (Acyclovir) y timidina

(Zidovudina). C Inhibidor de la polimerasa no análogo ( Foscarnet)

Síntesis de proteínas virales: El interferón interfiere con la replicación de virus

RNA y DNA, permitiendo la traducción de mensajeros celulares, pero no de
mensajeros virales. En la actualidad, esta sustancia natural también se sintetiza in
vitro para uso clínico.

Procesamiento de proteínas virales precursoras: Algunos virus requieren que

proteasas virales procesen poliproteínas en dos o más proteínas, para su
ensamblaje. Una alternativa del tratamiento anti HIV es la inhibición competitiva de
estas proteasas, por péptidos miméticos que al interactuar con estas enzimas,
impiden su acción sobre el polipéptido viral, Entre ellos se encuentran Saquinavir,
Ritonavir, Indinavir y Nelfinavir. Recientemente se han desarrollado nuevos
inhibidores de proteasa de segunda generación (Amprenavir). Esta nueva droga es
de menor peso molecular y su carácter no peptídico la hace menos vulnerable a la
digestión, mejorando su biodisponibilidad oral y reduciendo los efectos tóxicos.

Ensamblaje: La droga isatín-B-tiosemicarbazona resultó ser efectiva para el

tratamiento del virus de la viruela. Su mecanismo de acción más probable sería la
interferencia con el ensamblaje de las proteínas estructurales sintetizadas.

Liberación: Recientemente se dispone de drogas antivirales que intervienen en la

liberación de la partícula viral desde la célula infectada. Estos son compuestos
análogos al ácido siálico, que inhiben a la neuroaminidasa, impidiendo la liberación

158
de nuevas partículas de virus influenza desde células infectadas, evitando de esta
manera, la propagación del virus a células no infectadas (Zanamivir y Oseltamivir)

AGENTES ANTIVIRALES ACTUALMENTE MÁS UTILIZADOS

A continuación se presentan algunos agentes antivirales más comúnmente

utilizados considerando el blanco del ciclo replicativo en que intervienen o por su
alto interés en clínica.

INHIBIDORES DE VIRUS INFLUENZA

AMANTADINA Y RIMANTADINA. Son aminas policíclicas simétricas con

actividad primaria contra el virus influenza A. Estos compuestos inhiben el
denudamiento del virus, probablemente al bloquear la proteína de la matriz viral
M2. Esta proteína forma canales iónicos para el paso de protones, permitiendo los
cambios de pH que se producen durante el denudamiento viral.

ZANAMIVIR (Relenza®)Y OSELTAMIVIR(Tamiflu®). Son moléculas análogas al

ácido sialico (N-acetil-glucosamina), que inhiben a la neuroaminidasa de los virus
influenza. Actúan en el proceso de liberación de nuevas partículas virales evitando
la propagación de nuevos viriones a células vecinas. Estos compuestos se unen a
la neuroaminidasa, impidiendo que la enzima rompa la interacción entre el ácido
siálico de la membrana celular y la hemaglutinina de las partículas virales, durante
la salida del virión. La unión de estos inhibidores a la neuroaminidasa es más
estable que el substrato natural, por poseer más sitios de unión.

INHIBIDORES DE HERPESVIRUS

ACICLOVIR. El aciclovir (ACV) es un análogo de la guanosina y posee una

cadena acíclica. Su espectro antiviral está limitado a algunos herpesvirus. Este es
el primer antiviral desarrollado que se activa mediante una enzima propia de estos
virus, lo que le confiere alta especificidad, siendo metabolizado selectivamente en
las células infectadas por herpes simples (HSV). Para inhibir la síntesis de DNA
viral, debe ser fosforilado primero a aciclovir monofosfato (ACV-MP) por la timidina
quinasa viral. Posteriormente, el ACV-MP es fosforilado a aciclovir difosfato (ACV-
DP), y luego a aciclovir trifosfato (ACV-TP) por quinasas celulares. Debido a este
mecanismo de acción, la cantidad de ACV-TP formado en las células infectadas
es mucho mayor que en las no infectadas.

FOSCARNET (Fosfonoformato) (Foscavir®). Es un compuesto no nucleósido,

una sal trisódica de ácido fosfonofórmico, análogo no competitivo de pirofosfato
que inhibe selectivamente las DNA polimerasas de los herpesvirus y virus de la
hepatitis B, como también sobre la enzima transcriptasa reversa de HIV-1.

159
ANTIRETROVIRALES
INHIBIDORES DE TRANSCRIPTASA REVERSA, ANÁLOGOS
DE NUCLEÓSIDOS.

ZIDOVUDINA. La zidovudina, AZT (Retrovir®), es un análogo sintético de la

timidina, que requiere ser fosforilado por quinasasa celulares. Esta, la primera
droga antiretroviral eficaz, es capaz de inhibir la replicación de diversos retrovirus
animales y humanos, incluyendo HTLV-I, HIV-1 y HIV-2. Para esto, en forma
selectiva e incluso en bajos niveles, el AZT-TP interactúa con la transcriptasa
reversa viral, impidiendo la síntesis del DNA del virus a partir del RNA viral. Al
igual que el aciclovir, funciona como terminador de la cadena por carecer de un
grupo -OH en el extremo 3' (posee un grupo azida en vez de un grupo hidroxilo).

OTROS ANTIVIRALES DE USO CLÍNICO

RIBAVIRINA (Virazole®). Es un derivado sintético similar a la guanina. Tiene un

amplio espectro de acción in vitro contra virus DNA y RNA, incluyendo virus
respiratorio sincicial (VRS), sarampión, influenza A y B, hepatitis A, HIV y otros. La
ribavirina es trifosforilada por enzimas celulares. El mecanismo de acción depende
del virus sobre el cual actúa, entre los cuales se ha propuesto la inhibición de
diversas enzimas celulares, por lo que es altamente tóxica.

Extraído y resumido de la siguiente página web:

http://www.med.uchile.cl/apuntes/archivos/2004/medicina/antivirales.pdf

160
161
.

162
 Evolución de las enfermedades virales
Continuamente se informa sobre la aparición de nuevas enfermedades o sobre la
re-emergencia de viejas enfermedades de origen viral. La emergencia de una enfermedad
de origen viral puede ser el resultado de un cambio evolutivo (mutación seguida de
adaptación) en el agente causal. Sin embargo, las causas más frecuentes de tales
emergencias son factores externos al virus. Los 4 factores más importantes que
determinan la emergencia son: 1) reconocimiento de una enfermedad nueva que
previamente pasó desapercibida, 2) aumento del cociente casos:infecciones, 3) aumento
en el número de infecciones, 4) aumento en la transmisión.

1- Reconocimiento inicial

En algunos casos, la presencia de una infección viral (y del mismo virus causal)
no es reconocida como una entidad nosológica específica hasta que emerge como una
enfermedad nueva. Un ejemplo es la encefalitis de California causada por un bunyavirus,
el virus La Crosse. El virus se aisló por primera vez en 1960 a partir del cerebro de un
chico que murió a raiz de una encefalitis. Ese aislamiento permitió producir antígeno y
realizar pruebas serológicas retrospectivas sobre casos clasificados como “encefalitis de
etiología desconocida”. Así se determinó que un buen número de encefalitis del alto
Mississippi en USA había sido causada por el virus de La Crosse. A partir de entonces se
diagnostica un promedio de 75 casos anuales en el medio oeste norteamericano. Estas
observaciones sugieren que el virus La Crosse estuvo presente bastante tiempo antes que
se reconociera la enfermedad.
Algo similar ocurrió con el síndrome pulmonar causado por Hantavirus. Cuando
las condiciones ambientales promovieron un incremento en la población de Peromyscus
(el ratón que sirve de reservorio al virus) se detectó un brote de enfermedad pulmonar
aguda en personas de la región (USA, 1993, Argentina, 1995). Cuando se testearon
autopsias por medio de RT-PCR se demostró que nuevas variantes de Hantavirus eran las
responsables. Antes de la ocurrencia de estos brotes, el síndrome pulmonar era una
entidad esporádica también clasificada como de etiología desconocida.
Los casos mencionados ilustran el concepto de que enfermedades virales aún no
reconocidas conviven con las poblaciones humana y animal. Las mismas no serán
reconocidas hasta que algún aspecto de su epidemiología, o la simple casualidad, atraigan
nuestra atención.

2-Aumento del cociente casos:infección

El aumento de casos por arriba de cierto nivel de expectativa, aún cuando el

número de infecciones es el mismo, llama la atención de las autoridades sanitarias. El
aumento del número de casos puede deberse a: 1) un cambio en la resistencia en la
población susceptible, 2) un aumento en la virulencia del virus. La primera situación
viene ejemplificada por la poliomielitis. Durante gran parte del siglo XX, la poliomielitis
infecciosa se presentaba en forma de epidemias anuales en gran parte del planeta. Las
epidemias no eran debidas a cambios en la virulencia del virus sino a un aumento en el

163
riesgo de contraer la enfermedad clínica. Paradójicamente, las mejoras en salud pública e
higiene personal llevaron a una reducción en la transmisión del virus y, por lo tanto, a un
retraso en la ocurrencia de la infección primaria, que normalmente ocurría en los
primeros 3 años de vida. Como resultado, los chicos tenían su primer encuentro con el
virus cuando los anticuerpos pasivamente transferidos por la madre habían desaparecido.
En otras palabras, la resistencia de la población susceptible había cambiado como
consecuencia de cambios en a conducta social.
Nosotros ya hemos visto como cambios genéticos en los virus pueden conducir a
cambios en la virulencia. Un ejemplo clásico de esta situación es el virus de la influenza.
La introducción en poblaciones inmunológicamente naïve de reasortantes con nuevos
genes para la hemaglutinina o la neuraminidasa, promueve la aparición de epidemias. En
octubre de 1983, una epidemia de influenza desvastó la industria avícola en
Pennsylvania. Quince millones de animales perecieron como producto de la enfermedad
y de las medidas contol. El virus aislado presentó una virulencia mucho mayor que los
aislamientos realizados tres meses antes. El incremento en la virulencia se debió a una
única mutación puntual en el segmento que codifica para la hemaglutinina lo cual se
tradujo en un incremento en la clivabilidad de la proteina1.

3- Aumento en el número de infecciones

Este parámetro puede reflejar una epidemia de una enfermedad ya conocida o la

emergencia de una entidad aún no reconocida. El aumento en el número de infecciones
puede obedecer a la invasión viral de una población aislada. Islandia representa una de
tales poblaciones. El moquillo canino generalmente está ausente en la isla y, por lo tanto,
no se vacuna. Sin embargo, en el siglo XX el virus fue introducido en tres oportunidades
a través de perros que no cumplieron apropiadamente con la cuarentena. En cada caso, se
observaron epidemias desvastadoras con pérdidas que superaron el 90% de los animales
infectados, y que solo pudieron controlarse mediante la eliminación de los perros.
Otra razón para el aumento del número de infecciones es el salto en las barreras
de especie. En este caso, el virus se convierte en un nuevo agente para la especie. Desde
el punto de vista epidemiológico, pueden darse tres situaciones: 1) el salto no va seguido
de transmisión entre individuos de la especie, en cuyo caso la nueva especie huésped
representa un punto muerto. Muchos arbovirus ejemplifican esta situación. Como
veremos más adelante en el curso, las infecciones por priones como el BSE (Encefalitis
Espongiforme Bovina) también entran en esta categoría. 2) el salto va seguido de
transmisión limitada en la nueva especie. El virus Ebola (Filovirus) en humanos y el
morbillivirus equino (Paramixovirus) entran en esta categoría. En ambos casos el virus se
transmite solo unas pocas generaciones. 3) invasión de una nueva especie huésped
seguida de propagación ilimitada en la misma. Dos ejemplos ya tratados en el curso
ilustran esta situación: el parvovirus canino y el HIV.

1
Recordar que el clivaje del precursor HA en HA1 y HA2 es crítico para la infecciosidad del virus. La
mutación permitió que HA sea clivada en tejidos que normalmente no lo hacen. Como consecuencia, el
rango de huésped y los títulos virales aumentaron.

164
4-Aumento en la transmisión

La transmisibilidad de un virus puede cambiar dramáticamente en diferentes

subpoblaciones y constituye un factor contribuyente en la emergencia de enfermedades
virales. Estudios serológicos indicaron que la infección por el HIV estuvo presente una o
dos décadas antes de que el SIDA emergiera en Africa. Hasta entonces, el SIDA era una
enfermedad esporádica en ciertas villas africanas, que se transmitía pobremente bajo las
condiciones rurales imperantes. Cuando la infección se desplazó hacia las ciudades
acompañando los procesos de urbanización, encontró condiciones nuevas para la
transmisión (crecimiento de la población, sexo abierto, prostitución) que llevaron a una
diseminación masiva de la infección.

Desaparición de enfermedades virales

La desaparición de enfermedades virales suele reflejar la intervención humana a

través de la inmunización, mejora en las normas de higiene, control de vectores, etc. La
poliomielitis ha desaparecido en el hemisferio occidental como consecuencia de la
inmunización programada. La vacunación contra el sarampión ha reducido la incidencia
de la enfermedad entre 100 y 1000 veces. La fiebre amarilla fue erradicada de Cuba en
1902 como consecuencia de la erradicación del Aedes aegypti.

Mecanismos en la evolución de las enfermedades virales

Las propiedades más importantes de los virus que favorecen su supervivencia en

la naturaleza son: 1) capacidad para replicar rapidamente, 2) capacidad de alcanzar altos
títulos, 3) capacidad de replicar en ciertos tejidos clave, 4) capacidad de ser eliminado
rapidamente o por largos periodos, 5) capacidad de eludir las defensas del huésped, 6)
capacidad de sobrevivir fuera del huésped. Los virus más exitosos utilizan una o varias de
estas estrategias.
El huésped es otro factor que influencia la evolución de las enfermedades virales,
a través de la presencia de genes específicos de resistencia (recordar la distribución del
gen para el co-receptor CCR5 en la población humana), la capacidad de generar
respuestas inespecíficas y específicas contra la infección, y factores fisiológicos tales
como el estado nutricional.
Existen parámetros poblacionales que inciden en la evolución de una enfermedad
viral. Ejemplos de ello los constituyen la distribución etaria de la población, distribución
de géneros, niveles económico y educativo, densidad de la población, exposición a
vectores, etc. La mayoría de las infecciones virales se transmiten de animal a animal, o de
persona a persona. La densidad de huespedes susceptibles es igual a la densidad de la
población multiplicado por la proporción susceptible de la población. Si la densidad está
por debajo de cierto umbral, el virus no puede ser propagado serialmente. Por ejemplo, en
poblaciones menores de 500.000 personas el virus del sarampión desaparece
espontaneamente.
La mixomatosis del conejo ilustra la coevolución de virus y huésped conducente a
la aparición de una enfermedad con características nuevas. Esta enfermedad es producida

165
por un poxvirus y se caracteriza por la aparición de tumores en la piel. Afecta a conejos
de Sudamérica y California y es transmitida mecánicamente por insectos durante la
picadura. En conejos europeos, sin embargo, el virus se asocia con una infección letal.
Por este motivo, el virus fue introducido en Australia para eliminar a la población de
conejos europeos que diezmaba la agricultura. La introducción del virus en 1950 fue
acompañada inicialmente por mortalidades superiores al 99%. El virus, altamente
virulento, era rapidamente transmitido por los mosquitos. Se creia entonces que la severa
reducción en la población de conejos iría acompañada de la desaparición del virus. Sin
embargo, pronto comenzaron a surgir mutantes de menor virulencia los cuales se
constituyeron en la fracción predominante del virus tres años más tarde. Simultaneamente
se empezaron a seleccionar animales resistentes a la infección. La aparición temprana de
variantes con virulencia reducida permitió que un 10% de la población de conejos se
recuperara. Esto permitió un aumento en el número de conejos geneticamente resistentes.
Actualmente se ha llegado a un equilibrio dinámico en el cual la población de conejos es
mucho menor a la inicial aunque demasiado numerosa para las expectativas de
agricultores y conservacionistas. El virus, por su parte, aún causa enfermedad severa y
mortalidad significativa.

166
 ESTERILIDAD Y DESINFECCIÓN. BIOSEGURIDAD EN EL
LABORATORIO DE VIROLOGÍA.
ESTERILIDAD Y DESINFECCIÓN

Introducción

En el trabajo con microorganismos es fundamental asegurarnos que los materiales a

utilizar no contengan otros gérmenes que puedan interferir con los que nosotros usaremos;
también, una vez concluido el trabajo es importante eliminar toda posible contaminación del
medioambiente y las personas. La eliminación de los microorganismos puede conseguirse por
medios físicos y químicos. Nos referimos a esterilización como el empleo de medios físicos o
químicos para eliminar la totalidad de los microorganismos viables en un material
determinado, mientras que con desinfección nos referimos al empleo de agentes químicos
germicidas con la finalidad de destruir la infectividad potencial de un material determinado (lo
que no implica necesariamente la eliminación de todos los microorganismos viables).
Hablamos de asepsia al referirnos a todas aquellas maniobras tendientes a evitar la llegada de
microorganismos (limpieza de mesadas, uso de guantes y barbijo, guardapolvo, etc...); y nos
referimos a antisepsia como al conjunto de procedimientos que tienen por objeto destruir o
eliminar los agentes contaminantes. Las sustancias que destruyen gérmenes se denominan
germicidas, y dentro de estas, las que destruyen virus son viricidas. En algunos medios de
cultivo celulares se utilizan antibióticos para evitar la proliferación de bacterias.

Preparación del material a esterilizar

El material a esterilizar debe ser acondicionado adecuadamente para no obstaculizar el

procedimiento y evitar la posterior contaminación.
Los elementos a esterilizar deben estar perfectamente lavados, enjuagados (20
enjuagues con agua corriente, 10 con agua destilada y 5 con agua bidestilada) y secos.
Las prendas de vestir se podrán envolver en doble papel madera o acondicionar en
tambores de acero inoxidable para autoclave. Las botellas, vacías o con soluciones, llevarán
sus tapas desenroscadas a medias para permitir el ingreso del vapor en su interior; a los
frascos sin tapa y las probetas se les obturará la boca con papel aluminio y luego con papel
madera. Las pipetas podrán envolverse en forma individual con papel madera o ubicarse en
pipeteros de aluminio. Los tubos de centrífuga y las pipetas pasteur se disponen en
paquetes de papel madera. Los filtros para medios de cultivo se esterilizan ya armados, con
sus bocas cubiertas con papel de aluminio y envueltos en doble papel madera.
Todos los materiales deben llevar escrita la fecha de esterilización en el envoltorio.
Métodos de esterilización

Como mencionamos anteriormente los métodos de esterilización se pueden dividir en

físicos y químicos, aunque estos últimos suelen clasificarse como desinfectantes.

Métodos Físicos.
Calor.
Este es el método de elección para esterilizar todos los materiales que no son
afectados por él. La mayoría de las bacterias patógenas son destruidas en pocos minutos a 50-
70ºC y muchas de las esporas lo son a 100ºC, pero para la esterilización es necesaria una
temperatura mayor, que puede alcanzarse por dos métodos: calor seco en estufas de
esterilización, o calor húmedo en autoclave. El autoclave actúa como una gran olla a presión
que alcanza, en su interior una presión de 1 atmósfera por encima de la atmosférica, llegando

167
la temperatura a 121ºC, si se mantiene durante 15 a 20 minutos se produce la destrucción de
todos los microorganismos y sus formas vegetativas. La estufa de esterilización, en cambio,
debe mantener una temperatura de 160ºC por 2 horas para tener el mismo resultado, y es más
perjudicial para el material a esterilizar. El vapor de agua a 121ºC tiene un poder de
penetración mayor que el aire caliente a 160ºC. Otros métodos que utilizan el calor son: la
pasteurización, la ebullición y la incineración. El mecanismo de acción del calor como agente
de esterilización se basa en la desnaturalización de proteínas, que se incrementa con el vapor
de agua ya que los puentes de hidrógeno de ellas son destruidos con mas facilidad si pueden
ser reemplazados con moléculas de agua.
Frío.
La congelación se puede utilizar para destruir algunos microorganismos,
sobretodo si se realiza en forma repetida, pero la mayoría de los virus son resistentes. El frío
suele utilizarse como método de conservación de virus y bacterias en freezer (-20 ó –80º) o en
nitrógeno líquido (-180ºC).
Radiación.
Las radiaciones de longitud de onda corta son eficaces para la esterilización de
materiales que no soportan el calor extremo. La luz UV de 270 nm es ampliamente utilizada
para esterilizar superficies y ambientes, fundamentalmente. También se utilizan otras
radiaciones como rayos X y rayos gamma en menor proporción. La acción de las
radiaciones ionizantes se basa en las lesiones que producen en el ADN de los
microorganismos, que impiden su replicación.
Filtración.
Este método se utiliza para esterilizar soluciones que no toleran altas
temperaturas (Ej: medios de cultivo). Para ello se utilizan filtros de diferentes materiales
(porcelana, cristal conglomerado, nitrocelulosa), y diámetro de poro variable. Para medios de
cultivo, el uso de filtros de diámetro de poro de 0.2 m es el más usado para excluir las
bacterias.

Desinfectantes

Los desinfectantes son sustancias que tienen una rápida acción germicida a baja
concentración. La potencia de desinfección depende de la concentración y la temperatura,
además del pH. Se agrupan aquí los agentes químicos más comunmente utilizados para
desinfección.

Métodos Químicos.
Halógenos.
El yodo se une las proteínas en forma irreversible y actúa como agente
oxidante. La tintura de yodo es una solución alcohólica, bactericida de acción rápida. Al
combinarse con detergentes forma los llamados yodóforos útiles para el lavado y desinfección
de superficies cutáneas. El cloro se utiliza fundamentalmente en forma de hipoclorito de
sodio (agua lavandina) para la limpieza de superficies, pisos, etc.... Se inactiva en presencia
de materia orgánica, y por ello las superficies a tratar deben estar limpias.
Agentes alquilantes.
Estos agentes actúan sobre proteínas y ácidos nucleicos. El formaldehído o
formol puede utilizarse en solución acuosa al 4% o en forma de gas. Las reacciones químicas
que produce son parcialmente reversibles. El óxido de etileno es un gas que constituye el
método mas adecuado para la desinfección gaseosa de superficies secas. Tiene como
desventaja su toxicidad para el hombre. Se utiliza para la esterilización de objetos sensibles al
calor. Las reacciones químicas que produce son irreversibles.

168
Agentes tensioactivos.
También llamados detergentes sintéticos, producen alteraciones en la
membrana celular de los gérmenes y las envolturas virales, dando lugar a la liberación de
metabolitos y a un aumento de la susceptibilidad al medio externo. Los más activos son los
detergentes catiónicos y, dentro de estos, los amonios cuaternarios (cloruro de benzalconio,
cloruro de lapirio). Estos compuestos son ampliamente utilizados para la antisepsia cutánea.
 Alcoholes
El más utilizado es el etanol por su capacidad de desnaturalizar las proteínas de la membrana
bacteriana. La concentración a la cual su actividad germicida es máxima, es al 70% en agua.

Tabla 1: Datos de interés para algunos desinfectantes usuales.

Agente Tiempo de contacto Corrosivo Inactivado por Irritante de las Tóxicos

para virus lipídicos materia orgánica mucosas
Amonios 10 minutos Sí Sí Sí
cuaternarios
Hipocloritos 10 minutos Sí Sí Sí
Yodóforos 10 minutos Sí Sí Sí Sí
Alcohol 10 minutos Sí Sí Sí Sí
etílico
Formol 10 minutos Sí Sí

Inactivación de virus

a) Definición.
Cuando hablamos de virus no podemos emplear el término muerte ya que las partículas
virales son incapaces de autoabastecerse energéticamente. Por ello utilizamos el término
inactivación que equivale a la muerte en los organismos vivos, y se refiere a la pérdida
permanente de infectividad.

b) Usos.
La inactivación puede realizarse para esterilizar un material o para otros procesos en los
cuales sea necesario preservar determinados componentes virales (antígenos para la
realización de vacunas, etc...) Por ello es importante determinar el grado de inactivación a
obtener y sus consecuencias sobre los distintos componentes del virión. La capacidad de
inactivación de un agente físico o químico está en relación con la dosis (tiempo X
concentración o intensidad), y las condiciones en que es usado (temperatura, pH, tiempo,
etc..).

c) Agentes.
Los agentes inactivantes pueden clasificarse de acuerdo a su mecanismo de acción en:
nucleotrópicos, proteotrópicos, lipotrópicos y universales.
Nucleotrópicos: actúan sobre los ácidos nucleicos. Ej: luz UV de 260 nm de longitud de
onda, formol, ácido nitroso, hidroxilamina, elementos radiactivos incorporados al ácido
nucleico (P32, H3 ).
Proteotrópicos: actúan sobre las proteínas. Ej: luz UV de 235 nm de long. de onda, calor,
enzimas proteolíticas, pH ligeramente ácido, detergentes.

169
Lipotrópicos: actúan sobre los lípidos, principalmente en virus con envoltura: Ej:
enzimas lipolíticas, detergentes.
Universales: son agentes no selectivos. Ej: rayos X, sustancias alquilantes, acción
fotodinámica.

Propiedades de algunos agentes inactivantes.

Calor. Su acción se produce, fundamentalmente por desnaturalización de las proteínas de
la cápside. La sensibilidad de los virus al calor es variable.
Luz UV (260 nm). La acción principal es sobre los ácidos nucleicos, induciendo
mutaciones. Estas lesiones pueden ser reparadas por mecanismos enzimáticos celulares.
Además, los rayos UV son absorbidos por muchas sustancias biológicas pero no
atraviesan medios opacos. Todo ello les resta utilidad, salvo en el caso de superficies
libres.
Formol. Actúa reaccionando con los grupos amino de las proteínas y con los ácidos
nucleicos de simple cadena, cuando es utilizado al 0.3%.
Óxido de etileno. Es un agente alquilante, como el ácido nitroso y la hidroxilamina.
Ejerce su acción sobre cualquier tipo de virus, actuando sobre los ácidos nucleicos y
también sobre las proteínas.
Éter. Disuelve los lípidos y, por lo tanto actúa sobre los virus envueltos, a una
concentración del 3 al 10%. No tiene efecto sobre virus no envueltos.
Enzimas. Proteasas (tripsina, pronasa) y/o lipasas (fosfolipasa A, C). Algunos virus
resistentes a las proteasas se hacen sensibles luego de la exposición a lipasas. Ciertos
enterovirus son resistentes a la acción de las enzimas.
Radiaciones ionizantes. Rayos X, rayos gamma, etc.. ejercen su acción sobre los ácidos
nucleicos.

BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE VIROLOGÍA

Introducción

La Bioseguridad comprende todas aquellas normas, metodologías y

procedimientos tendientes a evitar la adquisición de infecciones, en el laboratorio, por parte
de los seres humanos que allí trabajan; o en la comunidad donde éste se encuentra. Este tema
suele ser pasado por alto en muchos casos y es allí cuando el error humano, las prácticas
incorrectas de laboratorio y el empleo inapropiado del material, provocan la mayor parte de
los accidentes infecciosos que se producen en el laboratorio.
Por ello es fundamental que un servicio de laboratorio aplique un plan de
seguridad, y que todo el personal este informado de su existencia y conozca las razones por
las que debe proceder de la manera indicada. Tan importante como lograr su efectiva
implementación es conseguir la continuidad en su utilización.

Vías de contagio

Trabajar con virus patógenos para el ser humano conlleva el riesgo de adquirir
infecciones de laboratorio. Numerosas situaciones vividas por el personal de salud lo exponen
al contagio de distintos agentes patógenos. Enumeraremos a continuación, algunas de las vías
de contagio mas frecuentes que pueden ocurrir en el laboratorio:
Autoinoculación accidental debida a punción o cortes con agujas, pipetas, bisturíes u otros
elementos punzantes.

170
 Exposición de la piel o mucosas a fluidos biológicos contaminados; especialmente cuando
la permeabilidad de las mismas se encuentra alterada por heridas, escoriaciones, eczemas,
herpes, conjuntivitis o quemaduras.
Inhalación de aerosoles producidos al agitar muestras, al destapar tubos, al expulsar la
última gota de una pipeta, durante la centrifugación, especialmente cuando se usan tubos
abiertos o con mayor volumen del aconsejado por el fabricante en una centrífuga de
ángulo fijo o cuando ésta es frenada abruptamente para ganar tiempo.
Salpicaduras en los ojos.
Aspiración bucal por falta de protección al “pipetear” muestras infecciosas.

Grupos de riesgo

Tanto los virus como otros agentes infecciosos pueden clasificarse en cuatro
grupos dependiendo del peligro que significan para los trabajadores del laboratorio. De
acuerdo al peligro que entrañan los microorganismos infectantes se clasifican en grupos de
riesgo o nivel de contaminación I, II, III y IV.
Grupo de riesgo o Nivel de contaminación I (escaso o nulo riesgo individual y
comunitario)
Microorganismos que difícilmente provoquen enfermedades a humanos o animales.
Ej: Virus que afectan vegetales, bacteriófagos, etc
Grupo de riesgo o Nivel de contaminación II (riesgo individual moderado, riesgo
comunitario bajo)
Agente patógeno que puede provocar enfermedades a humanos o animales, pero que tiene
pocas probabilidades de entrañar un riesgo grave para el personal de laboratorio, la
comunidad, el ganado o el medio ambiente. La exposición dentro del laboratorio puede
provocar una infección grave, pero se dispone de medidas adecuadas para el tratamiento y la
prevención, por ello el riesgo de propagación es limitado.
Ej: Adenovirus, Coronavirus, Hepatitis A-G, Influenza A-C, Rabia, Rotavirus, etc..
Grupo de riesgo o Nivel de contaminación III (riesgo individual elevado, riesgo
comunitario bajo)
Agente patógeno que puede provocar enfermedades graves a humanos o animales, pero que
habitualmente no se propaga entre individuos (baja contagiosidad). Se dispone de medidas
eficaces de tratamiento y de prevención.
Ej: Hantavirus, Virus Junin, Encef. Eq. Venezolana, Fiebre Amarilla, Louping Ill, etc..
Grupo de riesgo o Nivel de contaminación IV (elevado riesgo individual y comunitario)
Agente patógeno que suele provocar enfermedades graves en las personas o en los animales y
que puede propagarse fácilmente entre individuos, directa o indirectamente (alta
contagiosidad). No suele disponerse de medidas eficaces de tratamiento y de prevención.
Ej: virus Ébola, HIV, virus de la peste porcina, etc.

Tipos de laboratorio

Los laboratorios pueden dividirse según sus características de diseño,

construcción y medios de contención, en tres tipos:
Laboratorio básico: comprende laboratorios que trabajan con agentes de los niveles de
contaminación I y II.
Laboratorio de contención: está instalado para trabajar con agentes del nivel III.
Laboratorio de contención máxima: está concebido para trabajar con agentes
infecciosos del nivel IV.

171
 Los laboratorios de contención máxima tienen un mantenimiento muy costoso
y existen solo en algunos países.
Para patógenos transmitidos por vía sanguínea, las precauciones de laboratorio
debieron ser dirigidas al cuidado de la salud bajo el término “Precauciones Universales”, y
estas deben ser observadas para todos los trabajos que se relacionan con el contacto de sangre
y fluidos corporales potencialmente infecciosos, sumado a esto el nivel de bioseguridad
apropiado del laboratorio.
Un aspecto a tener en cuenta es que los riesgos atribuibles a ciertos agentes
biológicos varían según los países, que cualquier medida de seguridad propuesta debe
adaptarse a los recursos disponibles y que las necesidades del personal de laboratorio varían
según la formación de ese personal y el trabajo al que esté asignado.

Sistemas de seguridad

CABINAS DE SEGURIDAD BIOLÓGICA.

Uno de los equipos de seguridad más importante que posee un laboratorio de
virología, es la cabina de seguridad biológica (CSB); este equipo permite el trabajo con
agentes infecciosos impidiendo que escapen al medioambiente y también evitando su
contaminación con agentes ambientales. De esta manera protege al material de investigación,
al operador y al ambiente. También se denominan cabinas de flujo laminar, este puede ser
horizontal o vertical. Podemos clasificar a las CSB en Clase I, II y III.
CSB Clase I: Estos equipos proveen protección al operador ya que el flujo de aire penetra por
el frente y es filtrado antes de salir al exterior. Poseen frente abierto, ventilación por presión
negativa y aire filtrado por filtro HEPA (High Efficiency Particulated Air). Este filtro detiene
el paso del 99,97% de las partículas mayores a 0,3 um. El inconveniente es que no provee
protección al producto, que puede contaminarse con agentes del medioambiente.
CSB Clase II: Estos equipos proveen protección al operador y al producto, ya que el aire que
entra por el frente es filtrado antes de ingresar al área de trabajo. Este diseño también provee
protección contra contaminación cruzada dentro de la cabina cuando se trabaja con varias
muestras. Poseen un dispositivo de flujo laminar vertical, con aire recirculado y filtrado por
filtro HEPA. Algunas poseen alarmas ópticas y acústicas. Permiten el trabajo con agentes de
los grupos de riesgo de nivel 1, 2 y 3.
CSB Clase III: Estos equipos proveen la máxima seguridad para el trabajo con agentes
infecciosos. Poseen un cierre hermético y la manipulación de las muestras se realiza mediante
la utilización de brazos de goma donde el operador introduce los suyos. Se puede utilizar para
tabajar con agentes del grupo de riesgo de nivel 4, o también de nivel 3 cuando la muestra se
presenta en un aerosol con alto riesgo de dispersión.
Estos equipos deben poseer superficies de fácil limpieza y resistentes a los
desinfectantes, es conveniente también que posean una fuente de luz UV para esterilizar su
superficie cuando no están en uso.

Tabla 2. Sumario de niveles de seguridad recomendados para agentes infecciosos.

Nivel de Tipo de Laboratorio Prácticas Equipo

Contam. Recomendadas de seguridad
(Barreras Primarias)
Laboratorio Básico PME No
1 (Ej: enseñanza básica) requerido (autoclave
es recomendable)

172
 Laboratorio Básico c/ CSB y PME con uso de CSB y
2 DPP (Ej: hospital primario) DPP. Acceso limitado.
Manual de bioseguridad.
Laboratorio de Contención Acceso
3 (Ej: Diagnóstico especial) limitado. Descontam. de
desechos. Descontam. de
ropa.
Laboratorio de -además: Cambio de
4 Contención máxima (Ej: ropa y ducha en la
Unidades patógenas entrada. Salida para la
peligrosas) eliminación especial de
residuos.
CSB, DPP, uso de
guantes y antiparras si
es necesario.
-además
Máscaras con filtro de
aire si es necesario.
-además
Trajes con presión
positiva.
Filtros de aire.

PME: Prácticas Microbiológicas Estándar

CSB: Cabina de Seguridad Biológica.
DPP: Dispositivos de Protección Personal.
(Extraído de “Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories” Richmond, JW.)

173
Áreas de trabajo

La diversidad de actividades desarrolladas en un laboratorio, hace necesario

delimitar áreas de trabajo con distinto nivel de riesgo de infección. Estas se adecuarán al tipo
de material con que se trabaje, las técnicas que se realicen y las muestras que se procesen.
1. Áreas de bajo riesgo: Serían aquellas en las que el personal no está mayormente
expuesto. Ej: administración, archivo, etc..
2. Áreas de mediano riesgo: Representadas por la zona de recepción de muestras, lavado de
material, atención de pacientes, etc..
3. Áreas de alto riesgo: Dentro de este grupo estarían las zonas de extracción de muestras,
procesamiento y control.
Estas áreas serán determinadas por el inspector de bioseguridad y el comité, de
acuerdo al espacio disponible y la conveniencia de lugar en cada caso.

Seguridad en la toma y remisión de muestras

Normas de seguridad a tener en cuenta para la toma de muestras infecciosas:

El operador que obtiene la muestra debe tener las manos lavadas, protegidas con guantes,
cabellos recogidos y usar ropa protectora si es necesario.
Las agujas, lancetas y jeringas serán descartables y se desecharán en recipientes adecuados.
Recordar que el mayor número de accidentes por punciones se produce al querer retirar las
agujas de las jeringas o al intentar taparlas con su capuchón plástico.
Para la obtención de las muestras se debe contar con recipientes adecuados. Los tubos o
frascos de vidrio deben ser de pared gruesa, con cierre hermético a rosca o tapón de goma.
Se deben encintar los tapones para transportar a distancia.
Todo material de obtención debe ser rotulado ANTES de la extracción o recolección de las
muestras.
El operador se deberá lavar las manos luego de quitarse los guantes al finalizar la toma de
muestras y proceder a desinfectar las superficies de trabajo y el recipiente de obtención (en
caso de que haya habido derrames) con agua lavandina al 5%.

Normas de seguridad a tener en cuenta para la remisión de muestras infecciosas:

Todas las muestras serán rotuladas con los datos de origen (paciente, laboratorio, hospital,
etc..), tipo de muestra (suero, líquidos de punción, tejidos, cultivos, cadáver, etc..), medio
de conservación (para virología: glicerina, frío), diagnóstico presuntivo y destino.
Toda persona que efectúe el transporte de materiales biológicos dentro o fuera de la
institución deberá conocer deberá conocer los riesgos que ello implica.
En caso de derivar muestras fuera de la institución se deberán tomar los recaudos
necesarios para proteger a la comunidad: La muestra herméticamente cerrada se colocará
en bolsa de nylon con suficiente algodón como para absorber todo el líquido en caso de
rotura y derrame. Esta se introducirá en un recipiente rígido e impermeable (se pueden
utilizar saché de suero vacíos). Y se agregará un saché refrigerante en caso de que la
muestra así lo requiera.
Si la muestra debe ser enviada por correo o por transporte contratado, se deberá cumplir
con las normas internacionales existentes para tal efecto.

174
Bibliografía

ESTERILIDAD Y DESINFECCIÓN:

Balows, A. et al: Manual of Clinical Microbiology. 5th American Society for Microbiology.
Washington DC. 1993.
Carter, GR.: Fundamentos de Bacteriología y Micología Veterinaria. Ed. Acribia. Zaragoza.
1989
Davis, BD et al: Tratado de Microbiología. 2a Ed. Editorial Salvat. Barcelona. 1978.
Joklik, WK. et al: Microbiología de Zinsser. 20º Ed. Ed. Panamiericana. Buenos Aires. 1994.
Mahy, BWJ & Kangro, HO: Virology Methods Manual. 1st Ed. Academic Press. London.
1996.

BIOSEGURIDAD:

Balows, A. et al: Manual of Clinical Microbiology. 5th American Society for Microbiology.
Washington DC. 1993.
Collins, CH. & Lyne, PM.: Métodos Microbiológicos. 5º Ed. Ed. Acribia. Zaragoza. 1989
Mahy, BWJ & Kangro, HO: Virology Methods Manual. 1st Ed. Academic Press. London.
1996.

175
 Cultivo de tejidos
Desde su introducción en 1949, los cultivos de tejidos (CT) imprimieron un avance sin
precedentes en el conocimiento de la biología de los virus animales. Desde el punto de vista
práctico, los CT solucionaron el problema de la propagación y cuantificación de virus,
haciendolo independiente de la inoculación de animales. Actualmente, pueden ser cultivadas
células de animales, plantas e insectos, a escalas domésticas o industriales, permitiendo el
crecimiento de distintos tipos de virus, ya sea para investigación básica, diagnóstico o
producción de vacunas. De hecho, las técnicas de CT se han erigido en un campo de
especialidad de desarrollo independiente, con aplicaciones en diversas areas de la Biología.
Muchos tipos celulares que no era posible cultivar en el pasado hoy son cultivados
rutinariamente, permitiendo examinar nuevas relaciones virus-célula. Estos avances se
debieron en gran parte al desarrollo paralelo de sofisticados medios de cultivo y al
descubrimiento y purificación de factores de crecimiento específicos de tipo celular. Así
mismo, se avanzó en la preservación por congelamiento de las células, abaratando el costo de
su producción y manutención.
Se deduce de lo arriba expuesto que todo laboratorio de Virología debe contar con una
sección de cultivo de tejidos. La coordinación entre esta sección y aquella donde se manipula
virus debe ser celosamente controlada para evitar la infección accidental de los cultivos lo
cual estropearía cualquier interpretación de los resultados.
Todo laboratorio de CT debe contar minimamente con: 1) fuente de agua de primera
calidad para la preparación de medios de cultivo y el lavado del material de vidrio.
Idealmente, se debe contar con un deionizador capaz de producir agua con una conductividad
no menor a 18 M cm. 2) fuente de frío para la preservación de stock de células (tanque de N
líquido) y de suero (freezer de –80C y –20C), 3) estufa de CO2 para el crecimiento celular,
independiente de aquellas empleadas para propagar virus 4) flujo laminar exclusivo para
mantenimiento y pasaje de células, 5) autoclave para esterilizar el material de vidrio, 6) sala
de lavado de material, 7) filtros para la esterilización de medios de cultivo, 8) dispositivos de
seguridad para el descarte de medios, material descartable, células y tejidos. El buen
funcionamiento de un laboratorio de Virología depende directamente del manejo de la sección
dedicada a CT.

Medios de cultivo

Desarrollados inicialmente de forma empírica, los medios de cultivo (MC) actuales

tienen una composición definida que permite crecer las células con alta repetibilidad. Se
dispone actualmente de catálogos comerciales con una vasta lista de medios que difieren en su
composición de acuerdo al tipo celular empleado. Básicamente, los MC deben proveer de
todos los nutrientes necesarios para el mantenimiento y crecimiento celular. Aunque la
diversidad de medios es grande, todos deben incluir: 1) fuente de C para la síntesis
macromolecular y metabolismo (aminoácidos esenciales, azúcares, etc), vitaminas y trazas
minerales, 2) un buffer capaz de controlar el pH del medio, 3) un indicador de pH,
generalmente una sustancia cuyo color cambia de acuerdo al pH, 4) una formulación tal que
respete la osmolaridad fisiológica de las células, sobretodo a través de la composición iónica,
5) una fuente de factores de crecimiento (generalmente suero sanguíneo). De todos los
elementos mencionados, el suero es el menos predecible en cuanto a su composición, por lo
que muchos laboratorios lo reemplazan por factores de crecimiento y/o diferenciación cuando
el trabajo requiere la definición completa del medio.

176
 Los medios definidos generalmente vienen en polvo y se reconstituyen con agua de
primera calidad. Como varios de sus componentes son inactivados por las altas temperaturas,
los medios se esterilizan mediante filtración con membranas de 0.2 m de diámetro de poro.
El suero se mantiene congelado, y se adiciona antes de agregar medio a los CT. Conviene
asegurarse de la esterilidad del medio sembrando medios para bacterias con el medio filtrado.
Una vez que las células toman contacto con el medio de cultivo, lo comienzan a
modificar. En muchos casos, dicha modificación es favorable para el metabolismo celular.
Como los nutrientes invariablemente se agotan, el medio debe reemplazarse periodicamente
con medio fresco.

Muchos tipos celulares requieren medios especiales. La variación es tal que un medio
que promueve la división en un tipo celular, puede promover la diferenciación (e incluso la
apoptosis) en otro. Por todo ello, es recomendable conocer las características de cada tipo
celular. Cuando se adquieren líneas celulares comerciales (ver abajo) es imperioso seguir las
instrucciones para su mantenimiento (tipo de medio, forma de pasaje, etc). Si no se respetan
estas instrucciones, las células comienzan a ser seleccionadas por las condiciones impuestas
por el operador. Los cambios acumulados luego de un número de pasajes pueden ser lo
suficientemente significativos como para modificar la línea original, haciendo cierto tipo de
experimentos irrepetibles.

Suero

Practicamente a todos los medios se les adiciona un porcentaje de suero (entre el 5 y

10%). Generalmente se emplea suero fetal bovino o suero equino. La calidad del suero es uno
de los factores más importantes en el éxito de los CT. Los proveedores de sueros deben
certificar la ausencia de endotoxinas y la sanidad de los animales dadores (para garantizar la
ausencia de virus). Los distintos lotes de suero pueden variar significativamente en su
capacidad para sostener el crecimiento celular, por lo cual se aconseja probar distintos lotes
hasta encontrar el más apto para el sistema celular empleado.
Algunos laboratorios producen su propio suero cuando disponen de animales sanos.
En estos casos suelen usarse novillos de un año de edad a los cuales se les extrae sangre
mensualmente. La sangre se colecta en frascos Mariotte, se espera que coagule y se centrifuga
a 4C para separar el suero. Este suero es luego tratado con polietilenglicol y filtrado para su
esterilización.

Recipientes para el crecimiento celular

La mayoría de las células utilizadas para CT son células adherentes: requieren una
superficie tal que les permita adherirse con relativa firmeza. La adhesión para estas células es
un requerimiento para subsistir, aquellas que fallan en adherirse, mueren. El vidrio o el
plástico especialmente tratado son generalmente aptos para las células adherentes. Los de
plástico son descartables, solo admiten un uso. Existe una gran variedad de formatos de
recipientes para crecer células: botellas, rollers, “flasks”, cápsulas de Petri, placas de pocillos
(o “wells”), portaobjetos con cámara, etc (fig. 1). La elección de cada tipo depende de la
naturaleza del trabajo: rollers para la producción masiva, flasks para trabajo rutinario, placas
para cuantificación de la infecciosidad, etc.
Algunos tipos celulares no se adhieren bien a las superficies convencionales y
requieren superficies más elaboradas. Por ejemplo, las neuronas y otras células altamente
diferenciadas requieren que el recipiente esté cubierto por algún sustrato que aumente la

177
adhesividad. El colágeno, la laminina, la polilisina, etc son algunos de los sustratos que
aumentan la adhesividad.
Finalmente, existen células no adhesivas que crecen naturalmente en suspensión,
como el caso de los linfocitos y ciertas líneas transformadas.

roller
cápsulas de petri
Flasks

porta-objeto con
cámaras

placa multiwell

medio de
cultivo
monocapa confluyente de células

sustrato plástico

Figura 1: Recipientes utilizados en CT.

Mantenimiento de los CT

La gran mayoría de los CT se incuban en estufas gaseadas con CO2. El porcentaje de

CO2 en la atmósfera de la estufa es usualmente del 5%. Con ese porcentaje el pH del medio se
mantiene dentro de los rangos fisiológicos (~ 7.2). La temperatura se mantiene a 37 C, aunque
CT derivados de especies cuya temperatura fisiológica es mayor (e.g. aves) requieren mayor
temperatura.

Tipos de cultivos celulares

Los cultivos más populares utilizados en Virología son: 1) cultivos primarios, 2)

cultivos de línea.

Los cultivos primarios (CP) se obtienen de tejidos de animales sanos. Por ejemplo, el
herpesvirus bovino 1 se propaga bien en cultivos de células provenientes de riñón fetal
bovino. Las técnicas para la producción de CP depende del tejido u órgano a partir del cual se
obtienen las células, pero en general se siguen los siguientes pasos (todo el material empleado
debe ser estéril!): 1) obtención quirúrgica aséptica del órgano o tejido, 2) desmenuzado con
tijera en pequeños trozos, 3) incubación de los trocitos con una enzima que digiera el cemento
intercelular (tripsina, colagenasa, pronasa, etc), 4) inactivación de la enzima por lavado o por
agregado de inhibidores, 5) disgregación mecánica de los fragmentos tisulares para la
liberación de las células individuales. Las células son resuspendidas con medio de cultivo con
suero y contadas en una cámara cuenta-glóbulos. Finalmente se siembra un volumen
apropiado de la suspensión en el recipiente adecuado, se agrega un volumen de medio, y se
coloca el recipiente en la estufa gaseada.
Cuando se siembra un recipiente, las células se adhieren a la superficie del recipiente y
comienzan a dividirse, con una periodicidad (tiempo generacional) que depende del tipo
celular. A medida que las células se dividen, más y más superficie es ocupada por células,

178
hasta que eventualmente toda la superficie del sustrato está cubierta. En este momento,
decimos que las células alcanzaron confluencia (fig. 2). Las células confluyentes contactan
unas con otras. El contacto intercelular funciona como un inhibidor del ciclo celular
(inhibición por contacto) y, por lo tanto, las células dejan de dividirse. En estas condiciones
las células pueden mantenerse por días o meses si se reemplaza el medio por uno fresco
periodicamente. Lo usual es que cuando las células confluyen, el operario realiza un pasaje.
El pasaje consiste en despegar las células (generalmente con una solución de tripsina),
resuspenderlas en medio de cultivo y sembrarlas en nuevos recipientes. Dependiendo del tipo
de células, el contenido celular de un recipiente se pasa a 3 o 4 recipientes donde se volverán
a repetir los eventos descriptos anteriormente (adhesión, división y confluencia). Cuando se
trata de CP, el número de pasajes es limitado ya que la frecuencia de división es cada vez
menor. Eventualmente, todas las células dejan de dividirse y entran en un estado quiescente
seguido de muerte celular (crisis). El número de pasajes admitidos antes de entrar en crisis
depende de la especie animal, del periodo de desarrollo del tejido primario (fetal o adulto), y
del tipo de tejido, pero como referencia digamos que oscila entre 5 a 20. La entrada en
quiescencia es inevitable en CP ya que está genéticamente determinada, y ninguna
manipulación del medio podrá evitarla. Por lo tanto, la utilidad de los CP viene limitada por
este fenómeno.
A pesar de este inconveniente práctico, los CP tienen sus ventajas para trabajar con
virus. Las células primarias derivan directamente de los tejidos del animal y por lo tanto no
han acumulado lesiones genéticas. Para cierto tipo de trabajos (genética de virus), esta
diferencia es fundamental. Por otro lado, muchos virus (como el herpes mencionado en
cultivos de riñón) crecen a títulos más altos en CP que en líneas celulares.
Algunos trabajos en Virología requieren poblaciones homogéneas de células, en lo
posible con un solo tipo celular. Los CP raramente ofrecen esta característica ya que por
definición son poblaciones heterogéneas de células.

Los cultivos de línea derivan de CP. Con una baja frecuencia, unas pocas células del
CP sufren lesiones genéticas que les otorgan una ventaja de crecimiento sobre el resto de la
población. Estas células comienzan entonces a predominar en el cultivo. Cuando estas
lesiones bloquean o eluden los mecanismos naturales que llevan a las células a volverse
quiescentes, decimos que la célula se ha inmortalizado. La inmortalización es una
característica de las células de línea que les permite tolerar innumerables pasajes antes de
sucumbir. Las células inmortales se diferencian de las células transformadas en que las
primeras aun son sensibles a la inhibición por contacto (fig 2B) mientras que las segundas,
indiferentes a este control, siguen dividiéndose y creciendo en forma estratificada (fig. 2C).
Se piensa que la inmortalización es un prerrequisito para la transformación. Las células
transformadas además guardan otras características: no requieren suero en el medio, dependen
menos de la adhesión al sustrato y originan tumores cuando se inoculan en animales.
Como en el caso de los CP, las líneas celulares tienen ventajas y desventajas. Por un
lado, al ser células inmortales, permiten pasajes innumerables, sin la necesidad de tener que
realizar cultivos primarios a partir del animal. Por el otro, la inmortalización implica cambios
genómicos que afectan el crecimiento celular. Dado que los virus mantienen una relación
estrecha con las funciones celulares, aquellas modificaciones pueden también repercutir en la
replicación viral. Mientras que las células primarias mantienen características propias del
tejido del cual provienen, las células de línea tienden a perderlas. Para muchos virus, las
características de diferenciación de sus células target son imprescindibles para cumplir su
ciclo replicativo.

179
 No todos los virus crecen en CT. Para estos casos, la inoculación de animales de
laboratorio o del huésped natural es el único recurso para su propagación.

Fig 2. Tipos de cultivo. A: cultivo primario de células fibroblasticas de escroto. B: línea estable ( inmortalizada
diploide) de fibroblastos de ratón (3T3). C: línea continua (transformada) de celulas epiteliales humanas
(HELA).

Aislamiento Primario Viral

Ante una enfermedad de la cual se sospecha una etiología viral, existen varios caminos
posibles para llegar a un diagnóstico, de los cuales el procedimiento más confiable es el
aislamiento viral. El mismo se lleva a cabo a partir de muestras obtenidas del individuo o
animal enfermo. Si son varios los animales infectados, conviene muestrear
representativamente. Es ideal que la toma de muestras tenga lugar dentro de los dos días de la
aparición de los síntomas porque la mayoría de los virus son diseminados sólo en los estadíos
iniciales de la enfermedad.
¿Qué muestra tomar y cómo? Depende de numerosos factores, pero no deben
exceptuarse los órganos que presentan lesiones, los humores (sangre, suero, LCR), ni los
órganos filtro (riñón, pulmón, bazo, linfonódulos). En enfermedades respiratorias se toman
hisopados nasales o faríngeos; en enfermedades de la piel se obtienen raspajes o líquidos de
punción, etc. Si se trata de un examen postmortem, se realiza la necropsia y se procede de
igual manera. Deben observarse todas las normas tendientes a evitar tanto la contaminación
de la muestra, en la medida que las condiciones lo permitan, así como la infección del
operador ante eventuales agentes zoonóticos. Los distintos especímenes (tejido, sangre, suero,
líquidos de punción, hisopados, etc) presentan técnicas de recolección y formas de
acondicionamiento propias, pero siempre es conveniente remitir las muestras refrigeradas e
inmersas en medio de transporte. Se recomienda el uso de hielo común, o hielo seco en caso
de que la muestra demore más de 5 días en arribar al laboratorio.
Como los distintos virus varían mucho en su composición, estructura y estabilidad, es
importante seleccionar el medio de transporte adecuado que garantice la supervivencia tanto
de las células como de las partículas virales que ellas portan. Afortunadamente el mercado
ofrece una gran variedad de medios, pero no hay uno universal, por lo cual la elección del
mismo debe ser cuidadosa.
El procesamiento estándar para el aislamiento viral, implica que las muestras sean

180
tratadas con antibióticos, homogeneizadas vigorosamente, clarificadas (para remover restos
celulares y bacterias) y luego inoculadas en cultivos celulares o animales apropiados.
Usualmente se incuba 0.5 ml de suspensión por tubo o flask durante una hora a temperatura
ambiente, luego se adiciona medio de mantenimiento celular y se incuba durante tiempo
variable bajo condiciones apropiadas de temperatura, humedad y CO2, realizando subpasajes
si fuera necesario. El crecimiento viral se observa como efecto citopático (CPE, del inglés
“cytopathic effect”) en la monocapa (ver más adelante) o bajo otros indicadores (en caso de
virus que no producen CPE).

Aislamiento de virus en cultivos celulares

Un buen laboratorio de diagnóstico viral debe contar con un amplio stock de distintas
líneas celulares, ya que las mismas juegan a veces un papel fundamental en la etapa de
aislamiento.
Se mencionan a continuación algunos ejemplos de tipos celulares utilizados en el
aislamiento de virus pertenecientes a distintas familias:
Herpesviridae: BHV-1 y PRV crecen fácilmente en células MDBK.
Adenoviridae: la mayoría de sus serotipos crecen bien en HEK y Hep2.
Papovaviridae: de esta familia sólo los pertenecientes al género Polyoma pueden ser aislados
en cultivos celulares, usándose HEK, NCI-H292, o células gliales fetales humanas.
Poxviridae: vaccinia y otros poxvirus pueden ser aislados en Vero, MK, fibroblastos diploides
y NCI-H292.
Reoviridae: Los reovirus 1, 2, y 3 son frecuentemente aislados a partir de muestras de
garganta y recto, tras 15 días de incubación en MK, HeLa, y NCI-H292.
Paramyxoviridae: Algunos virus de esta familia pueden desarrollar CPE entre los 4 y 7 días
de incubación, pero en general los cultivos deben ser pasados a ciegas por una semana más
para asegurar el crecimiento viral.
Orthomyxoviridae: Influenza A, B, y C se recuperan fácilmente a partir de cultivos de MK y
MDCK.
Picornaviridae: Esta familia incluye los géneros Enterovirus y Rhinovirus, los cuales
producen CPE en NCI-H292, y otros tipos celulares, pero algunos virus Cocksackie A sólo
crecen en cerebro de ratón lactante.
Togaviridae, Flaviviridae, Rhabdoviridae, Bunyaviridae, Filoviridae y Arenaviridae son
familias difíciles de aislar, por lo cual requieren medios y sistemas especiales.

Muchos virus producen CPE en los cultivos infectados. El CPE puede examinarse
utilizando un microscopio invertido el cual permite ubicar una placa o botella de cultivo entre
la platina y el objetivo. El CPE es el resultado de complejas interacciones entre el virus y la
célula susceptible que resulta en alteraciones de la morfología celular (fig. 3). Los
citomegalovirus (Flia. Herpesviridae) inducen aumento del volumen celular, mientras que
otros miembros de la misma familia (HSV-1, BHV-1, PRV) inducen redondeamiento de las
células. Por lo tanto, virus cercanos entre si pueden producir CPEs diferentes. Un caso
diferente es el de los reovirus, que promueven una degeneración celular con acumulación de
granulaciones intracitoplasmáticas, o por citar otro ejemplo, el virus respiratorio sincitial
bovino que induce fusión entre las células.

181
Figura 3. CPE producido por infección de una monocapa con poliovirus tipo 1. A) antes de la infección, B) las
células comienzan a redondearse a las 5 hs post infección (pi), C) la mayoría de las células se han redondeado (8
hs pi), D) a las 24 hs pi las células se han despegado del sustrato y forman acúmulos.

Algunos virus producen CPE en algunas células y no en otras. El tiempo que tarda en
manifestarse el CPE depende del tipo de virus, la dosis infecciosa y la línea celular empleada
pero, en general, oscila entre horas y días. Otros virus presentan variantes citopáticas y no
citopáticas, siendo un ejemplo el virus de la diarrea viral bovina.

Aislamiento de virus en huevos embrionados

En algunos virus (influenza, o aquellos cuyo huésped susceptible son las aves) se

182
recurre al huevo embrionado para su aislamiento. Este sistema es un receptáculo ideal para
crecer virus, por ser estéril y poseer un rango variado de tejidos y cavidades que toleran tanto
la replicación como la concentración viral.
Se utilizan huevos fecundados de gallina, que se incuban a 37 C, en una atmósfera de
62 % de humedad, con ventilación forzada. Algunos sistemas poseen un mecanisno para rotar
los huevos a intervalos regulares. El huevo embrionado puede ser inoculado en lugares
específicos y a distintos momentos de desarrollo. Por ejemplo, el virus de Newcastle se
inocula en el saco alantoideo a los 9-11 días de desarrollo (Fig. 4), mientras que el virus de la
Bronquitis infecciosa debe inocularse en saco vitelino de huevos de 5-6 días de edad.
Así como en las monocapas celulares se observa generalmente CPE, en huevos
embrionados inoculados suele visualizarse la presencia de pústulas (pocks) que se presentan
como áreas de respuesta inflamatoria. Si se realizan diluciones de una suspensión viral,
pueden inocularse varios huevos con cada dilución, contar el número de pústulas y luego
calcular el título viral de la misma manera que en el caso de cultivos celulares.

Figura 4. Crecimiento de virus en huevos embrionados ( de Principles of Virology, Flint, S.J. et al, 2000)

Detección de Virus en cultivos celulares en ausencia de CPE

Una vez infectada la monocapa celular, la presencia de CPE tras un determinado

período de incubación es indicativo de la presencia de partículas virales infecciosas; pero la
ausencia de CPE no supone en absoluto lo contrario, ya que muchos virus no producen CPE.
En estos casos se utilizan otros tests que se enumerarán a continuación. Vale aclarar que estas
pruebas también se usan para caracterizar virus que producen CPE, ya que la aparición de éste
no es patognomónica de ningún virus y conviene confirmar mediante otras técnicas.
Las pruebas de hemoadsorción constituyen un método rápido para la detección de
orthomyxovrus y algunos paramyxovirus, en casos donde el CPE es mínimo, o en aquellos
donde es evidente pero se busca discriminar rápidamente de otros virus que producen el
mismo efecto.
Las pruebas de interferencia viral son de suma utilidad cuando se intenta caracterizar
el virus de la rubeola (RNA, Togaviridae), ya que el mismo impide que otros virus infecten

183
las células en donde se encuentra. Una vez infectada la monocapa con dicho virus, se adiciona
una cantidad conocida de algún enterovirus (por ej: virus cocksackie), se reincuba por tres
días y se observa en los mismos la ausencia de CPE, mientras que en los controles infectados
solo con enterovirus se observa CPE.
Los coronavirus productores de enfermedad respiratoria humana no desarrollan CPE
en sus fases replicativas en fibroblastos diploides. Una vez que completó su fase replicativa y
alcanzó su pico de crecimiento comienzan a aparecer los cambios en la monocapa, que
consisten en una degeneración pareja de la monocapa en los días subsiguientes. El efecto
citopático es concomitante con la autólisis de los viriones recién formados. Al tiempo que el
CPE es completo, hay muy poco virus infeccioso en el cultivo.
Hay pruebas standard como la hemaglutinación (HA) y la inhibición de la
hemaglutinación (HI), la Fijación del Complemento, etc, para ciertos grupos de virus. Por
ejemplo, los orthomyxovirus y paramyxovirus (entre otros) contienen glicoproteinas en sus
membranas capaces de aglutinar los glóbulos rojos. Dicha aglutinación es proporcional a la
cantidad de virus (fig 5).
A pesar de que el tipo de CPE puede ser indicativo de un virus particular, siempre es
conveniente la confirmación por otra técnica más específica. Por ejemplo, los herpesvirus
bovino 1, 5 (BHV-1, BHV-5) y PRV (virus de la seudorabia) pueden infectar al ganado. Los
tres virus producen el mismo CPE. En estos casos conviene discriminar por medio de
inmunofluorescencia (IF) con anticuerpos específicos de virus. En el caso de BHV-1 y BHV-
5, ambos virus son lo suficientemente parecidos como para no ser diferenciados por sueros
policlonales y se requiere de anticuerpos monoclonales, específicos de epitopes. Para la IF se
inoculan células crecidas sobre portaobjetos y luego se incuban con anticuerpos anti virus
marcados con fluoresceína. Luego de un extensivo lavado, las células se observan en el
microscopio de fluorescencia (técnica directa) (fig 6). Para mayor sensibilidad puede
emplearse la técnica indirecta en la cual los células inoculadas son incubadas sucesivamente
con el anticuerpo anti virus (anticuerpo primario) y un anticuerpo secundario dirigido al
anticuerpo primario, marcado con fluoresceína. La técnica es rápida y sensible pero requiere
experiencia.

184
Fig 5. Muestras diluidas de diferentes cepas del virus de la influenza se mezclaron con
glóbulos rojos de pollo y se incubaron 30 minutos a 4C

Fig 6. Bases de la deteccion de antigenos virales con anticuerpos marcados.

B: Celulas infectadas con herpesvirus humano 1 teñidas con un anticuerpo contra una de sus
proteina estructurales.

185
 Cuantificación de virus
Cualquiera que quiera llevar a cabo un trabajo en Virolgía debe conocer la
concentración de partículas virales infecciosas de las suspensiones virales que utilizará en sus
experimentos. Si por ejemplo el experimento al llevar a cabo requiere que una monocapa de
células sea infectada con una multiplicidad de infección de 10 (esto es, 10 partículas
infecciosas por célula presente en el cultivo), es menester saber por un lado el número de
células a infectar, y por otro la concentración o título de la suspensión viral a utilizar. Esta no
es la única situación donde se requiere titular una suspensión viral. Puede que en una etapa
posterior del trabajo que iniciamos infectando células pasemos a la inoculación de animales, y
que distintas dosis de nuestro virus produzcan diferentes efectos, por lo cual estaremos
obligados a conocer el título del inóculo para producir entonces el efecto deseado.
Actualmente, los virus animales son cuantificados tanto por medio de ensayos de
infectividad (TCID50; EID50; LD50), como por otros ensayos químicos/biológicos
(hemoadsorción, hemoaglutinación, proteína total) o por conteo total de partículas virales
utilizando el microscopio electrónico.
La mayor parte de los virólogos consideran al ensayo de infectividad en placa como el
método de titulación más sencillo, apropiado, y sensitivo a la hora de cuantificar infectividad.
Sin embargo algunos virus como Influenza presentan poca eficiencia de plaqueo, por lo cual
son necesarios otros métodos, como la hemoaglutinación.
En esta sección se delinearán las técnicas básicas de titulación de virus, atendiendo
con especial detalles aquella/s que se llevarán a cabo en los trabajos prácticos. Para detalles
específicos sobre virus individuales, el lector deberá dirigirse a la literatura publicada.

Ensayos de Infectividad

Los ensayos de infectividad están diseñados para calcular el título viral, es decir el
número de unidades infecciosas por volumen, (ej: unidades formadoras de placa por mililitro).
Hablamos de unidades infecciosas para resaltar el hecho de que cualquier suspensión viral
consiste en una mezcla de viriones, algunos de los cuales son capaces de infectar mientras que
otros (por ejemplo, partículas defectuosas o DI) no lo son. A nosotros nos interesan las
primeras.
Las unidades infecciosas son consideradas como la menor cantidad de virus que
produce un efecto biológico detectable en el ensayo. Tal efecto es consecuencia del ciclo
replicativo que cumple un virus en la célula que infecta, y está dado por cambios bioquímicos
y morfológicos dentro del huésped que en general culminan con la muerte celular. Como
mencionaramos anteriormente, estos cambios morfológicos son denominados Efecto
Citopático (CPE), y, al microscopio óptico pueden adoptar distintas formas: redondeamiento
celular, fusión (formación de sincicios), o lisis total. Algunos virus no producen CPE ni matan
a sus células huésped, sino que las transforman en focos de crecimiento tumoral, y de esta
forma pueden visualizarse en una monocapa infectada.
Los ensayos de infectividad pueden ser cuantales o focales. Los ensayos cuantales
detectan la presencia de virus infeccioso desde un enfoque de “todo o nada” planteando las
siguientes preguntas: ¿presenta CPE la monocapa celular? ¿está infectado el huevo?, ¿ha
muerto un animal?. En cambio, los ensayos focales se basan en el conteo de focos
inflamatorios (pock) , o de focos con CPE, lo cual permite una determinación cuantitativa a
diferencia de los primeros que aportan datos cualitativos. En la práctica, se considera que un
foco pock o de CPE es originado por una o unas pocas partículas infecciosas, aunque puede
que ello no sea así en todos los casos. Este grado de incertidumbre se refleja en el uso del
término “unidad infecciosa” en vez del de “partícula infecciosa”.

186
Dilución de virus

La forma de determinar título viral es realizando diluciones seriadas de las

suspensiones virales, utilizando como diluyente medio de mantenimiento celular. Las mismas
se hacen 1:10 o 1:2.5 (a menor factor, título más preciso). En general, el factor utilizado es 1
en 10.

TCID50

Estas siglas provienen del inglés “Tissue Culture Infective Dose 50” (Dosis infectiva
de cultivos celulares 50), y se define como la dilución viral necesaria para infectar el 50 % de
una serie determinada de cultivos celulares inoculados. Este test se basa en la presencia y
detección de partículas virales capaces de producir CPE. Las células huésped son cultivadas
hasta formar monocapas cuasi-confluentes en placas de cultivo de 96 pocillos, a las que se les
agrega una dosis de las diluciones virales. Se realizan 10 repeticiones de cada dilución como
rutina. Una vez inoculadas las células, se incuban en estufa para permitir que el virus replique
y el CPE tenga lugar. Luego se observan las placas con el microscopio invertido y se cuentan
el número de pocillos con CPE y el número de pocillos sin CPE. Por lo tanto es un ensayo
cualitativo ya que sólo nos dice si hay o no CPE.
Los datos obtenidos se usan para calcular la TCID50 , lo cual puede hacerse tanto por
el método de Reed y Muench como por el de Spearman y Kärber. El resultado de este cálculo
no nos dice cuántas unidades infecciosas hay sino qué dilución de nuestra suspensión viral
original producirá CPE en el 50 % de las células inoculadas.

Ensayo de Placa

El ensayo de placa es un ensayo de infectividad que cuantifica el número de unidades

infecciosas en una suspensión viral dada. Se denominan placas a focos de infección discretos
localizados, los cuales se presentan como zonas de lisis celular o efecto citopático dentro de
una monocapa celular. Cada placa se origina de una única partícula infecciosa, lo cual permite
un cálculo muy preciso del título viral.
Existen dos tipos de ensayos de placa: en suspensión y en monocapa, y en esta guía
sólo se presentará el último. A una monocapa confluente de células se le agrega una pequeño
volumen de virus diluido, y luego de un breve tiempo de incubación (para que la adsorción
tenga lugar) se agrega una sobrecapa de medio semisólido. Dicha sobrecapa está compuesta
por una solución de agar/agarosa o metilcelulosa, que por su solidez relativa evita la
formación de placas secundarias a distancia y obliga a las partículas virales a invadir sólo
células vecinas a las primoinfectadas.
Una vez inoculados los pocillos y adicionada la sobrecapa, se deja incubar hasta que
las placas o focos con CPE sean discernibles, momento en el cual las células se fijan con una
solución salina con formol y luego se tiñen con cristal violeta. Las placas se observan a ojo
desnudo o, mejor, con ayuda de una lupa (fig. 7).
El título obtenido se expresa como Número de unidades formadoras de placa por ml
(PFU ml-1, PFU= Plaque Forming Units) .

Vale la pena remarcar que antes de realizar un ensayo de placa hay que determinar el
sistema virus/célula más sensible y apropiado para llevarlo a cabo, y para ello hay que tener
en cuenta algunos factores como la sensibilidad del tipo celular utilizado a la infección;
tiempo requerido para la adsorción; tipo de agar utilizado (puede inhibir la replicación viral);

187
tiempo de incubación; capacidad del virus de producir CPE en cultivos celulares; etc.

Figura 7

A. Figura aumentada de un foco de lisis. A la derecha se observa el mismo foco, expuesto a un substrato
que modificado se torna azul . El virus lleva un gen que expresa una enzima que actua sobre el
substrato.
B.C. .Focos de lisis en un ensayo de titulación. Las pequeñas áreas blancas representan focos de lisis
mientras que el fondo oscuro corresponde a la monocapa intacta.

Ensayos en huevos embrionados

Se ha desarrollado un método cuantitativo de titulación de virus en embrión de pollo

(pock assay1), el cual ha caído en desuso debido a las reformas legales que restringen el uso
del huevo embrionado en los ensayos de laboratorio. Básicamente consiste en la creación de
un falso saco de aire en el huevo, dentro del cual se inocula el virus diluido. Luego de incubar
por un lapso de tiempo, se cuentan las áreas de inflamación (“pocks”) resultantes de la
replicación del virus en las células epiteliales de la membrana corioalantoidea. Cada área o
pock es producida por una partícula infecciosa, lo cual hace que este método sea cuantitativo.

Hemoaglutinación

La capacidad de algunos virus de producir agregados de eritrocitos de distintas

especies se conoce como hemoaglutinación, la cual se produce por la interacción entre
glicoproteínas virales y receptores de membrana de las células sanguíneas. No todos los virus
hemoaglutinan, y algunos lo hacen sólo frente a eritrocitos de especies determinadas y bajo
estrictas condiciones de pH y fuerza iónica.
Para que la reacción ocurra, debe haber una concentración de virus capaz de establecer
puentes cruzados entre eritrocitos, causando así su aglutinación. Si se colocan los mismos en
un pocillo de fondo cóncavo, al no haber aglutinación formarán un pellet en el fondo. Al
producirse la hemoaglutinación se forma una estructura que tapiza las paredes del pocillo, lo
cual es bien diferente al pellet, de forma tal que ambas reacciones se distinguen a ojo
desnudo.

188
 La hemoaglutinación no mide infectividad, ya que no hay replicación viral en este tipo
de ensayo, sólo indica el número de partículas virales capaces de producir hemoaglutinación,
por lo que no es un método muy sensible, ya que se necesita una gran cantidad de partículas
para que se produzca el efecto.

Conteo de partículas

Existe un método de titulación en exceso dificultoso, que se vale del microscopio

electrónico para contar partículas virales. Muy sucintamente, el método se basa en el uso de
partículas de referencia de una concentración conocida, las cuales se mezclan con virus, y por
visualización en el microscopio electrónico se determina la relación virus/partículas, y con
este número se calcula la cantidad de virus total.

BASES PARA EL DIAGNÓSTICO VIROLÓGICO POR MICROSCOPÍA

ELECTRÓNICA

Fundamento

El microscopio óptico ha sido utilizado como instrumento de investigación en los

pasados tres siglos. La contribución a la ciencia que ha aportado su uso, incluye la
identificación de agentes causales de numerosas enfermedades, anatomía microscópica y
teoría celular. Hoy, como en el pasado, el microscopio óptico es un importante instrumento de
laboratorio. Esta utilidad, sin embargo, está restringida por su limitada habilidad para formar
imágenes definidas por debajo de los 2 µm de diámetro. Por ello no puede ser utilizado para
observar objetos de menor tamaño, como bacterias o virus.
Para obtener imágenes de objetos mas pequeños, incluyendo virus y macromoléculas,
se requiere un instrumento con mayor poder de resolución. El microscopio electrónico es ese
instrumento. Desarrollado entre los años 1928 y 1934, tiene la habilidad de producir imágenes
bien definidas de objetos mas pequeños a los que pueden verse con el microscopio óptico. El
potencial del uso del microscopio electrónico en virología fue rápidamente reconocido con la
publicación de la primera electrón-micrografía de un virus en 1939. Hasta ese momento, los
virus sólo habían podido ser detectados por las lesiones que producían en células y tejidos.
El gran valor de la microscopía electrónica se encuentra en la observación de objetos
cuyo tamaño se encuentra entre 5 y 250 nm, rango no cubierto por el microscopio óptico y en
el cual se encuentran prácticamente todos los virus conocidos. La microscopía electrónica
ofrece la posibilidad de obtener micrografías de partículas virales individuales y, de ese modo,
establecer su forma y tamaño con adecuada precisión.

El Microscopio Electrónico

El poder de resolución de un microscopio es la capacidad que tiene el mismo de

discernir entre dos objetos cercanos. Esta capacidad está dada, entre otras características, por
la longitud de onda de la radiación utilizada (luz visible, luz UV, etc.). La longitud de onda
de los electrones es unas 10.000 veces más pequeña que la de la luz visible, y disminuye con
la aceleración del voltaje aplicado, es por eso que la resolución es mayor en un microscopio

189
de 200 Kilovoltios (Kv) que en uno de 120 Kv. Es por ello que la resolución del microscopio
electrónico es mucho mayor que la del microscopio óptico, pudiendo resolver partículas de
hasta 2 nm de diámetro con perfecta definición.
El microscopio electrónico trabaja mediante el calentamiento de un filamento (cátodo)
de tungsteno o de exaboruro de lantano por aplicación de una corriente de alto voltaje pero
bajo amperaje, que emite electrones. Estos electrones son acelerados mediante un ánodo que
posee un pequeño orificio que pueden atravesar formando un haz de electrones. El haz
progresa a través del tubo del microscopio o cañón, donde una serie de bobinas
electromagnéticas lo concentran y corrigen aberraciones de forma similar a las lentes del
microscopio óptico. Como el haz puede desviarse o sufrir distorsiones al chocar con
moléculas del aire, dentro del cañón se debe mantener alto vacío, y es por esta razón que no
se pueden observar organismos vivos. La muestra se coloca de manera que se interponga en el
haz de electrones provocando una interferencia en las zonas de mayor contraste del objeto, el
cual es resaltado por exposición a sales de metales pesados, proceso denominado
contrastado. El haz sigue su viaje hasta llegar a una placa fluorescente que es excitada por
los electrones formando una imagen visible que reproducirá la interferencia producida por el
preparado. El haz también puede impresionar un placa fotográfica sensible, obteniéndose de
este modo una electrón-microfotografía del material observado. Para que el haz pueda
atravesar la muestra esta debe ser dividida en secciones ultrafinas mediante un aparato
llamado ultramicrótomo, el mismo, mediante cuchillas especiales divide las muestras en
secciones que no superan los 60 nm de espesor. Luego de esto los cortes son montados en
grillas de cobre de 3 mm de diámetro y se realiza el contrastado con sales de uranilo y plomo.
De esta forma la muestra ya está lista para ser observada.
Existen dos tipos de microscopios electrónicos: el microscopio electrónico de
transmisión (MET) y el microscopio electrónico de barrido o scanning (MEB ó MES).
Del primero ya hemos visto las bases de su operación. El funcionamiento del MEB, en
cambio, se basa en la emisión secundaria de electrones. Para ello se cubre la muestra con una
película compuesta por oro y carbón. El haz que llega hasta ella “rebota” y esa emisión
secundaria es transformada en una señal eléctrica, que luego de ser amplificada y procesada se
reconstruye en un monitor de televisión. Por ello con el MEB solo pueden verse superficies, y
no es necesario realizar cortes ultrafinos de la muestra. Es poco utilizado en virología.

Toma y procesamiento de las muestras

Los virus pueden ser aislados de un gran número de muestras clínicas incluyendo
materia fecal, orina, secreción nasal, traqueal, líquido vesicular, huevo embrionado, células y
sobrenadantes de cultivos de tejidos y, en general, de cualquier tejido o secreción animal.
Estas muestras deben ser preparadas para su observación al ME. La preparación variará si las
muestras son líquidas o sólidas.
1. Procesamiento de muestras líquidas: Las muestras líquidas deben ser centrifugadas
para que las impurezas sedimenten y no dificulten la observación de las partículas
virales, dicho procedimiento se denomina clarificación y se realiza a baja velocidad
(5.000G) durante 15 minutos, se extrae el sobrenadante y se vuelve a centrifugar, pero
esta vez a 100.000G durante 60 minutos, utilizando el sedimento. Si la muestra
consiste en una suspensión celular que queremos conservar intacta, se debe
centrifugar a menor velocidad para no producir citólisis (300G) y lograr un sedimento
donde las células se concentren. A partir de allí las muestras pueden seguir dos
caminos: se puede utilizar el sedimento de la segunda centrifugación para observar
mediante tinción negativa en fresco, o se puede incluir el sedimento celular, de la
primera centrifugación, en agar al 1% formando un “taco”,que se procesará como una

190
 muestra sólida (para ello las células deben estar fijadas previamente, en
glutaraldehído al 2%). Las muestras de materia fecal deben ser primero diluidas al
10% en agua desionizada (diH2O) y luego seguir el procesamiento anterior.
2. Procesamiento de muestras sólidas: Las muestras sólidas deben ser fijadas, como
primer paso, en glutaraldehído al 2% durante 2 a 12 horas a 4º C; debido a que este
fijador posee poco poder de penetración, el tamaño de la muestra no debe superar los
2 mm de lado. Luego se realiza una posfijación con tetróxido de osmio al 1% que
mejora la conservación de la muestra, sobre todo de los lípidos, y deposita sales sobre
diferentes estructuras aumentando el contraste. De allí se pasa al lavado y posterior
deshidratación en alcoholes de creciente graduación. Antes de la inclusión se debe
pasar por un intermediario miscible en alcohol y resina que es el óxido de propileno,
para terminar con la inclusión en resina, esta puede ser Epon 812, Maraglass, Spurr,
Araldita.
Una vez que las muestras han sido procesadas, deben ser preparadas para su observación.
La observación en fresco se realiza mediante tinción negativa, mientras que las incluidas en
resina deben ser cortadas en secciones ultradelgadas y contrastadas con sales de uranilo y
plomo para su observación. El fundamento en ambas, es similar: enfrentar las muestras con
sales de metales pesados que se distribuirán a través de las diferentes estructuras biológicas
según su afinidad, dando un contraste que pueda ser evidenciado mediante el microscopio
electrónico.

Técnicas de diagnóstico

a) Tinción negativa:

Esta es una técnica rápida y sencilla que puede proveer un diagnóstico viral en pocos
minutos, en base a la afinidad de las sales por diferentes estructuras virales y al retardo en la
transmisión de los electrones que producen (Fig. 8). El inconveniente es que se necesitan altos
títulos virales de, por lo menos, 106/ml. La metodología consiste en los siguientes pasos:
1. Preparación de grillas recubiertas con una membrana de Colodión o Formvar, sobre las
que se realiza una cobertura de carbón por evaporación (coating) que le proveerá de
mayor resistencia mecánica a la membrana.
2. Dentro de una placa de Petri con papel de filtro embebido en NaOH 0.1 M que hará las
veces de cámara húmeda, se colocan dos planchas de vidrio sobre las que se aplica una
pieza de Parafilm. El NaOH tiene como función crear un ambiente alcalino para disminuir
la formación de precipitados en la solución de contraste.
3. Sobre el Parafilm se deposita una gota de la suspensión viral por cada grilla que se
preparará y una gota de la solución de contraste: acetato de uranilo al 1% o ácido
fosfotúngstico al 1% (PTA). En general, siempre conviene tener grillas contrastadas con
uranilo y otras con PTA, ya que ambos tienen afinidades distintas por diferentes partes de
la partícula viral, dependiendo del virus; y, en algunos virus, el PTA puede afectar la
integridad de la partícula.
4. Con una pinza de punta muy fina se coloca la grilla debajo de la gota de suspensión
viral, con la cara que posee la membrana hacia arriba y se deja que el virus se adhiera
durante 5 minutos.
5. Se retira la grilla de la suspensión viral, se seca el exceso de líquido tocando uno de los
bordes con papel de filtro, y se coloca sobre la gota de solución de contraste, con la cara
que posee la membrana hacia abajo, para que el precipitado que pueda contener esta
solución no se deposite sobre la grilla impidiendo una correcta visualización. Se deja
actuar la solución por otros 5 minutos.

191
 6. Se retira la grilla de la solución de contraste, se seca el exceso de la misma forma que
antes, y se deposita en otra placa de Petri, con la cara que posee la membrana hacia
arriba, sobre papel de filtro para que termine de secarse (aproximadamente 15 minutos).
7. La grilla ya está lista para su observación al microscopio electrónico. Se debe tener
sumo cuidado en la manipulación de las grillas luego de la tinción, ya que muchos virus
no son inactivados por la fijación y siguen manteniendo su infectividad.

FIGURA 8: tinción negativa, coronavirus (izquierda), rhabdovirus (derecha).

Nota: Esta técnica puede sufrir modificaciones:

- se pueden enfrentar iguales cantidades de suspensión viral y solución de contraste en un tubo
eppendorf, y con la mezcla así obtenida realizar las grillas;
- otra técnica consiste en ubicar las gotas con la mezcla suspensión viral/solución de contraste
sobre agar al 1% el cual absorbe las sales y disminuye la formación de precipitado;
- también se puede hacer la membrana sobre la suspensión viral con lo cual las partículas
quedarán firmemente adheridas a la misma aumentando la cantidad de virus disponible para
su observación

b) Cortes ultrafinos:

Los cortes ultrafinos se obtienen mediante un aparato que se denomina

ultramicrótomo y que trabaja con dos tipo de cuchillas: de vidrio y de diamante, estas
últimas producen mejores resultados pero encarecen ostensiblemente la preparación. Las
cuchillas de vidrio son mas económicas y se preparan en el momento de su uso. Ambos tipos
de cuchillas poseen un pequeña “cubeta” llena de diH2O cerca de su superficie de corte, a la
cual van llegando los cortes, y de donde se retiran mediante un ansa o con la misma grilla.
Sobre los cortes también se realiza un contraste, pero esta vez se utilizan dos soluciones en la
misma grilla que son: el acetato de uranilo y el citrato de plomo. Los tiempos de contrastado
son más largos ya que las soluciones deben penetrar la resina en que están incluidas las
muestras.

c) Inmuno-electro-microscopía (IEM):

192
 Esta técnica provee un diagnóstico mucho mas preciso que las anteriores y puede
evidenciar partículas virales en muestras con menor título. Se utiliza tanto para virus en
suspensión como para cortes ultrafinos de tejidos infectados. Algunas de las metodologías que
emplean esta técnica se mencionan a continuación.
Clumping. Se enfrenta el virus con anticuerpos específicos sin marcar, de esta manera el
virus se concentra y aumenta la sensibilidad de la prueba. Se puede centrifugar para
concentrar los complejos atg-atc.
Decoración. Se enfrenta el virus con anticuerpos específicos sin marcar, estos pueden
verse al microscopio electrónico como un cúmulo de material amorfo alrededor de las
áreas reactivas. Se utiliza en virus de morfología compleja y puede servir para detectar el
sitio de unión al anticuerpo.
Pseudo-réplica. El anticuerpo se fija a la membrana de la grilla, con lo cual al recibir el
virus este queda firmemente unido a la grilla mejorando la sensibilidad de la técnica aún
con muestras poco concentradas.
Proteína A-oro. Luego de incubar la grilla con el virus, se agregan anticuerpos
específicos sin marcar (anticuerpo primario). Seguidamente se exponen las grillas a un
complejo formado por una proteína extraída de la pared del Staphylococcus aureus
llamada Proteína A, unida a oro coloidal. Esta proteína tiene la capacidad de unirse a la
fracción Fc de las Ig independientemente del tipo y la especie. De esta forma se une a la
fracción Fc del anticuerpo primario unido al virus, y el oro puede verse claramente como
esferas de diferente diámetro marcando la partícula viral. La desventaja de esta técnica es
que al ser la Proteína A inespecífica, también puede dar falsos positivos.
IgG-oro. El fundamento es similar al de la técnica anterior, pero en vez de Proteína A se
utiliza IgG específica contra el anticuerpo primario, unida también a oro coloidal (Fig. 9).
La IgG (anticuerpo secundario) se debe obtener de otra especie distinta a la que se usó
para obtener el anticuerpo primario. Esta metodología puede utilizarse tanto para
suspensiones como para cortes ultrafinos de muestras incluidas en resina, y puede servir
para la visualización de partículas virales completas o de productos virales individuales
(fig. 8). En caso de cortes ultrafinos, el desafío con los anticuerpos puede realizarse antes
de la inclusión (IEM pre-inclusión) o después de la misma, sobre los cortes (IEM pos-
inclusión). El procesamiento de la muestra para inclusión puede destruir los antígenos, lo
que hace mas conveniente la IEM pre-inclusión, aunque si los antígenos son intracelulares
(virus en citoplasma) solo pueden acceder a ellos los anticuerpos al realizar los cortes
ultrafinos (IEM pos-inclusión).
oro

atc secundario

atc primario

virión

grilla
Figura 9. Fundamento de la inmuno-electro microscopía

193
Ventajas y limitantes

Como toda metodología, el uso de la microscopía electrónica en el diagnóstico

virológico, posee ventajas y limitantes:
Ventajas:
1. Es una técnica rápida en comparación con otros métodos, como el desarrollo en cultivos
celulares.
2. No existen intermediarios, como reacciones serológicas o revelado de coloraciones. Se
pueden visualizar las partículas directamente y no sus efectos deletéreos.
3. La contaminación no es un problema tan grave como en el caso de los cultivos celulares.
Se requieren mínimos cuidados al respecto.

Limitantes:
1. Se requiere un alto título viral (mínimo 106/ml).
2. El equipo utilizado es muy costoso y pocas instituciones lo poseen.
3. El diagnóstico morfológico no es de certeza ya que muchos viriones poseen una
morfología y tamaño similar (con la IEM esto puede minimizarse).

Bibliografía

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Chichester, 1993.

194
 La reacción de la polimerasa en cadena (PCR)
Generalidades de la replicación del DNA

En las células, la replicación del DNA está a cargo de las polimerasas de DNA (DNA
Pol) las cuales sintetizan cada nueva cadena utilizando a la molécula original como templado.
Para que las cadenas templado sean accesibles para la polimerasa, la doble cadena o duplex de
DNA debe abrirse, esto es, los puentes H que normalmente mantienen las dos cadenas
pegadas tienen que desmantelarse transitoriamente. En las células, dicha apertura es ejecutada
por otras enzimas y factores que asisten la replicación.
Como todas las polimerasas de ácidos nucleicos, las DNA Pol adicionan uno a uno los
deoxinucleótido trifosfatos (dNTPs) en sentido 5’-3’ siguiendo las reglas de
complementariedad de bases (Fig. 10). Como las cadenas del DNA son antiparalelas, la
dirección de síntesis de una cadena es contraria a la dirección de la otra.

Figura 10. Síntesis de una cadena de DNA

Las DNA Pol no pueden iniciar la síntesis de una cadena de DNA de novo, esto es,
simplemente uniendose al templado y adicionando dNTPs. Para que la enzima trabaje, la
cadena templado debe estar unida a algún segmento de DNA (o RNA) que aporte un extremo
OH 3’. Este segmento recibe el nombre de primer. En estas condiciones, las polimerasas
adicionan el primer nucleótido y catalizan la unión entre el grupo fosfato 5’ del dNTP entrante
con el grupo OH 3’ del primer. De esta manera, una vez incorporado, el primer dNTP ofrece
un nuevo grupo OH 3’ para que la enzima puede adicionar el siguiente dNTP. Como
consecuencia, la nueva cadena de DNA va creciendo, ofreciendo
siempre un grupo OH 3’ en su extremo libre. Por esa razón decimos que la síntesis opera en
sentido 5’-3’.
Las DNA Pol de la célula suelen incorporar, a muy baja frecuencia, dNTPs
equivocados. Por ejemplo, donde existe una A en el templado, incorporan una C en la cadena

195
nueva. Las DNA Pol tienen la capacidad de detectar inmediatamente el error, escindir el
dNTP equivocado y adicionar el correcto. Esta actividad enzimática se denomina función
editora o proofreading.
La temperatura óptima de trabajo de las DNA Pol celulares es de aproximadamente 37
C. Ciertas bacterias que viven en condiciones extremas de temperatura, deben adaptar su
metabolismo a las condiciones reinantes. Una de tales bacterias es Thermus aquaticus. La
DNA Pol de T. aquaticus es capaz de sintetizar DNA a temperaturas superiores a 72 C,
valores a los cuales las polimerasas eucariotas son completamente inactivadas. El
descubrimiento de la DNA Pol de T. aquaticus, polimerasa Taq, fue central al desarrollo del
PCR.

El PCR
El PCR es una técnica en la cual una secuencia de DNA es replicada sistemáticamente
hasta obtener grandes cantidades de esa secuencia. Cuando decimos “grandes cantidades”
aludimos a que las mismas pueden detectarse con métodos relativamente sencillos. Dicha
secuencia puede estar presente en bajísimas concentraciones e incluso mezclada con otras
secuencias que no son de interés. De tal manera que la mayor ventaja del PCR es la capacidad
de amplificar secuencias específicas de DNA que se encuentran a bajas concentraciones. En
rigor, el PCR es tan efectivo en amplificar secuencias que uno puede analizar secuencias
provenientes de una única célula animal. El impacto de la técnica también llegó al
diagnóstico. En este sentido, fue importante advertir que en muchos casos no es necesario
purificar el DNA de la muestra con demasiado rigor.
De acuerdo a lo mencionado en la introducción, cualquier reacción de polimerización
de DNA debe incluir un templado de DNA, la polimerasa de DNA, dNTPs y primers. Se
necesitan dos primers, uno para cada cadena del templado y, por razones que aclararemos
después, los mismos deben estar en exceso. Para lograr que las cadenas del templado se
separen y la polimerasa pueda catalizar la reacción, en vez de utilizar los factores que emplea
la célula se usa la temperatura. Por arriba de cierto valor de temperatura, los puentes de H se
rompen y las cadenas del templado se separan (el DNA se desnaturaliza). Dicho valor
depende de la composición de bases del templado o, expresado de otra manera, del contenido
en G y C de la secuencia templado.1 La Taq polimerasa funciona mejor en un buffer
apropiado y en presencia de Mg++, por lo tanto ambos componentes deben estar presentes en
la mezcla de la reacción.
Una vez preparada la mezcla de reacción, se la incuba a unos 94 C un minuto para que
las cadenas del templado se separen. Este paso se denomina desnaturalización. Luego se
reduce la temperatura a, digamos, 60 C por un minuto de tal forma que los primers se unan
(hibridicen) a las cadenas templado separadas. Este paso se denomina hibridización o
annealing2. Luego se eleva la temperatura a un valor apropiado para máxima actividad de la
polimerasa Taq, unos 72 C, y se incuba por unos pocos minutos3. Con las dos cadenas del

1
Los organismos pueden diferir significativamente en su contenido en GC. Incluso la proporción en GC puede
cambiar de un segmento a otro del DNA. En general el contenido en GC es del orden del 50% pero en algunos
virus puede ser superior al 70%. Recordar que los pares GC del duplex de DNA se unen mediante 3 puentes de
H, mientras que los pares AT solo por dos. Por lo tanto, si queremos separar cadenas de un DNA con alto
contenido en GC deberemos emplear una temperatura superior a la empleada en una secuencia pobre en GC.
Como no siempre se conoce el contenido en GC del templado, generalmente se utiliza una temperatura lo
suficientemente alta como para separar cualquier tipo de DNA.
2
La temperatura y tiempo exactos dependen de la composición de bases, longitud y concentración de los
primers.
3
El tiempo depende de la longitud y concentración de la secuencia target, y de la temperatura.

196
templado “primadas”, la Taq Pol sintetiza las cadenas hijas. Este paso se denomina extensión
del primer o, simplemente, extensión. Aunque estos pasos pueden manejarse manualmente si
se disponen de varios baños de agua ajustados establemente a cada temperatura, la técnica se
simplifica y optimiza con el uso de termocicladores. Estos aparatos pueden ser programados
de tal manera que las reacciones automáticamente son llevadas de un paso a otro sin cambiar
los tubos de lugar.
La sucesión de los tres pasos mencionados, desnaturalización, annealing y extensión,
constituyen un ciclo de PCR (figura 11). La verdadera amplificación ocurre cuando las
reacciones se someten a varios ciclos, usualmente entre 30 y 40. El número de ciclos depende
de la concentración inicial del DNA target y se programa en el termociclador. En cada ciclo
ocurre exactamente lo mismo: el target se separa y los primers se pegan y extienden. Con cada
ciclo, la concentración de la secuencia target se duplica mientras que la concentración de
primers disminuye. Esa es una de las razones por las cuales los primers se colocan exceso.
Como en cada paso de desnaturalización la temperatura se acerca a la ebullición (con el
peligro de la evaporación y subsecuente concentración de las partes), una vez mezclados los
componentes en los tubos y antes de iniciar el termociclador, se agrega una gota de aceite
mineral la cual forma una película protectora en la fase superior.
Notese que en el annealing (60 C en el ejemplo) el templado se mantiene
desnaturalizado ya que su concentración es tan baja que difícilmente sus dos cadenas se
encuentren e hibridicen. Los primers, por otro lado, al estar en exceso hibridizan con sus
secuencias complementarias en el templado. Como la polimerasa Taq es capaz de catalizar a
alta temperatura, la renaturalización no es un problema.
Una vez concluido el último ciclo, los productos amplificados ya pueden evidenciarse
mediante electroforesis en geles de agarosa. La duración de una reacción de PCR depende del
número de ciclos programados pero, en general, oscila entre dos y tres horas.
Los primers
Queda claro que para llevar a cabo el PCR debe tenerse una información mínima
acerca de la secuencia a amplificar. Conociendo la secuencia pueden diseñarse los primers. El
diseño de los primers requiere ciertas consideraciones.
1) Longitud de los primers: usualmente se emplean primers de 18 a 30 nucleótidos. Cuanto
menor sea la longitud, más chance tenemos que una secuencia muy similar o idéntica se
encuentre en el DNA, en cuyo caso también se amplificaría una o más secuencias que no
nos interesan y que van a aparecer en el gel.

197
2) Composición de los primers: generalmente se seleccionan aquellos con un contenido GC
entre 50 y 60% cuando el organismo fuente de DNA lo permita. La composición de los

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 primers se relaciona con la temperatura de annealing4. Aumentando la temperatura de
annealing se mejora la discriminación frente a primers que hibridizan incorrectamente.
Por lo tanto, se logra mayor especificidad. En general, se utilizan primers de igual
longitud y tm4.
3) Estructura: si se encuentran zonas de complementariedad dentro de un primer, el mismo
presentará tendencia a autohibridizar, disminuyendo su efectividad. Igualmente, si existen
regiones de complementariedad entre los dos primers, los mismos tenderán a formar
duplex, con el mismo resultado negativo.
Actualmente existen softwares que permiten escoger los mejores primers posibles para la
secuencia target que se desea amplificar. Estos programas consideran los puntos
mencionados arriba y seleccionan el mejor par de primers “teóricos”.

Consideraciones
1) La longitud del producto amplificado: este parámetro usualmente depende del uso que se
hace del PCR. Si el producto va a emplearse para reacciones posteriores (e.g. clonado), es
muy importante que el mismo sea copia fiel de la secuencia target. A diferencia de la
polimerasa eucariota, la Taq no posee actividad proofreading. Por lo tanto, a mayor
longitud del producto, mayor chance de errores en la incorporación de nucleótidos. En
diagnóstico, este no suele ser un problema. En general, altas temperaturas de annealing y
extensión y bajas concentraciones de dNTPs resultan en máxima fidelidad.
2) Concentración de Mg++: este parámetro es importante ya que influye en el annealing de
los primers, la especificidad del producto, y la actividad y fidelidad de la enzima.
3) Número de ciclos: un error común es pensar que a mayor cantidad de ciclos mejores
resultados. Demasiados ciclos pueden aumentar la cantidad y complejidad de productos
amplificados inespecíficos.
De lo mencionado anteriormente se deduce que antes de utilizar sistemáticamente una
reacción de PCR se requiere de un tiempo de optimización. La obtención de buena
cantidad y calidad de producto específico amplificado requiere encontrar los primers
apropiados, la concentración óptima de Mg++, los parámetros de temperatura y tiempos
acordes al sistema, etc.

Electroforesis de los productos amplificados

Los productos amplificados son corridos en geles de agarosa al 0.5-1% durante
aproximadamente una hora. En paralelo se corren marcadores de peso molecular los
cuales permiten determinar si la banda correspondiente al producto amplificado es del
tamaño adecuado. Cuando se pone a punto una técnica de PCR para diagnóstico, es
importante confirmar que el producto amplificado corresponde realmente a la secuencia
target, sobretodo cuando se parte de genomas muy complejos donde no sería improbable
una amplificación inespecífica (aún con un tamaño del producto idéntico al esperado).
Una forma de comprobar la autenticidad del producto es mediante Southern blotting. Las
bandas del gel son transferidas a una membrana de nitrocelulosa la cual es luego
enfrentada a una sonda marcada radiactivamente. La sonda generalmente es

4
La composición de los primers es un determinante del valor Tm, o “melting temperature”, la temperatura a la
cual se separan las cadenas de un DNA. A mayor contenido en GC, mayor Tm. La temperatura de annealing para
el PCR generalmente es 5 C por debajo del Tm de los primers.

199
 complementaria a una región mas o menos central del producto amplificado. Después de
la hibridización, la membrana se lava y se pone en contacto con una película fotográfica
(radioautografía). Otra forma de constatar la autenticidad del producto es diseñar primers
de tal forma que la región amplificada incluya uno o dos sitios para enzimas de
restricción. Cuando los tubos salen del termociclador, una alicuota es tratada con la o las
enzimas de restricción y los productos de digestión son corridos en paralelo con el
producto amplificado no digerido. Si el tamaño de las bandas del digesto es el apropiado a
la posición de los sitios de restricción en el DNA target, la amplificación fue genuina.
Secuencias target de RNA
Ciertos organismos como los virus pueden tener genomas de RNA en vez de DNA.
Las polimerasas de DNA no pueden replicar RNA y no existe ninguna polimerasa de
RNA con las características de la Taq. La forma de solucionar este défict es mediante una
variante del PCR conocida como RT-PCR (Reverse Transcriptase-PCR). En estos casos el
RNA es convertido en DNA de doble cadena mediante incubación con la enzima
transcriptasa reversa (RT). La RT es una enzima codificada por los retrovirus que
actualmente se dispone comercialmente. Usando el RNA como templado, primers y
dNTPs, la RT sintetiza DNA de doble cadena a partir del RNA. Los protocolos actuales de
RT-PCR permiten poner todos los reactivos (RNA, RT, Taq, primers, etc) en el tubo
facilitando la reacción. La reacción de RT lleva aproximadamente una hora, tras lo cual
los tubos se pasan al termociclador.

Otras maneras de detectar ácidos nucleicos in situ: Hibridizacion in situ utilizando un probe
marcado con material no radioactivo ( nano-oro/plata , fig 12A) o radioactivo ( P32,fig 12B).
En el primer caso se trata de un condiloma producido por un papillomavirus observándose la
detección del DNA viral en el núcleo. En la fig 12B se ven varios cortes en donde se utilizo
un probe que detecta específicamente RNA viral del virus de hepatitis C (flechas)

200
A B

Existe una versión de la hibridizacion llamado dot/slot- blot que resulta conveniente cuando
se procesan numerosas muestras pudiéndose identificar los positivos rápidamente. Las
muestras se ponen sobre una membrana de celulosa o nylon y luego de fijarlas se incuban con
el probe específico que puede a su vez estar marcado radiactivamente o no. Un ejemplo se da
en la figura 13

Fig 13

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Estudio de otros componentes virales: proteínas
Como hemos visto, las proteínas virales, en particular las que conforman la partícula viral, son
altamente inmunogenicas y son las que usualmente son reconocidas en técnicas como IFA,
IHC, ELISA. Los diferentes componentes proteicos de los virus pueden estudiarse de varias
maneras. Una de ellas como se describe en la figura 14, consiste en la utilización de enzimas
que rompen la partícula luego que han sido marcadas durante su producción. Como las
proteínas celulares también se marcan se agregan granitos recubiertos con anticuerpos
específicos para ese virus con lo que se eliminan las proteínas no virales. La muestra se corre
en un gel de poliacrilamida que separa los componentes por peso molecular. Si la proteína no
esta marcada, la identificación puede hacerse mas tarde con un anticuerpo marcado, similar al
principio usado para IFA/IHC/ELISA.

Fig 14

Purificación de partículas virales

Luego de infectar células en cultivo se recupera el medio de cultivo conteniendo las partículas
virales. Luego de una breve clarificación para eliminar componentes groseros, el medio se
centrifuga a alta velocidad y el pellet, luego de resuspendido, se coloca sobre un gradiente de
densidad. Luego de la ultracentrifugacion, los diferentes componentes del pellet se separan de
acuerdo a su densidad, pudiéndose identificar la muestra que contiene virus debido a la lectura
por OD a 260. Fig 15.

202
Fig
15

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