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UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESTADO DO PARÁ

INSTITUTO TECNOLÓGICO
FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA

Valéria Cristina Pinheiro Máximo

ESTUDO DO DESENVOLVIMENTO DE MICRO-ORGANISMOS EM


TUBULAÇÕES METÁLICAS PARA O CONTROLE DA CORROSÃO NAS
UNIDADES GERADORAS DA UHE TUCURUÍ

Belém-PA
2018
Valéria Cristina Pinheiro Máximo

ESTUDO DO DESENVOLVIMENTO DE MICRO-ORGANISMOS EM


TUBULAÇÕES METÁLICAS PARA O CONTROLE DA CORROSÃO NAS
UNIDADES GERADORAS DA UHE TUCURUÍ

Trabalho de conclusão de curso de graduação


apresentado a Faculdade de Engenharia Química da
Universidade Federal do Pará como requisito parcial
para a obtenção do título de Bacharel(a) em
Engenharia Química.

Área de habilitação: Corrosão

Orientador: Prof. Dr. José Carlos Cardoso Filho

Belém-PA
2018
RESUMO

O acúmulo de matéria orgânica sobre superfícies, conhecido como biofouling, pode


contribuir para a formação de biofilmes, os quais podem iniciar um processo de corrosão
influenciada por microorganismos, ou biocorrosão. As consequências da formação de
biofilmes podem ser prejudiciais para o funcionamento adequado de equipamentos em usinas
hidrelétricas, devido ao risco de rompimento de superfícies e obstrução ou redução de
passagens de água. Logo, é perceptível a necessidade de encontrar meios para evitar ou
reduzir o desenvolvimento de biofilmes em usinas hidrelétricas. Para isso, deve-se
inicialmente identificar quais micro-organismos fazem parte do biofilme em questão. A
identificação das bactérias (um dos tipos de organismos presentes no biofilme) em uma
amostra pode ser feita, após o isolamento de cada espécie, por técnicas convencionais que
envolvem a avaliação de características morfológicas, testes bioquímicos e análises por
marcadores moleculares. Entretanto, tais métodos demandam um período de tempo
considerável e recursos elevados para serem realizados. Este trabalho possui como objetivo a
avaliação dos biofilmes formados em superfícies metálicas de corpos de prova (CP’s)
expostos em estações de avaliação de corrosão na Usina Hidrelétrica de Tucuruí, através do
isolamento e caracterização morfológica e molecular dos micro-organismos encontrados nas
amostras CP’s, visando à identificação dos grupos presentes. Também foram avaliados os
processos que ocorrem durante a etapa de adesão dos micro-organismos sobre a superfície
metálica através de espectroscopia de impedância eletroquímica. Foram caracterizados os
CP’s coletados periodicamente e através de cultivos microbiológicos e utilização de
ferramentas de biologia molecular, foi possível detectar e identificar os micro-organismos
normalmente envolvidos na corrosão influenciada por micro-organismos. Também foi
confirmada a presença de Bactérias Redutoras de Sulfato e Bactérias Oxidantes do Ferro e
Pseudomonas Aeruginosas.

Palavras – chave: corrosão, biofilme, corrosão microbiológica, biocorrosão, UHE-Tucuruí.


DEDICATÓRIA

Dedico a Deus, a base de tudo, por nunca me abandonar e não me


deixar desistir, sempre mostrando os melhores caminhos; aos meus familiares, em especial ao
meu marido Raid,a meus pais Sérgio e Kátia, por segurarem a barra esses anos todos, me
incentivando a continuar, e meus filhos Victória, Maria Clara e Miguel, por serem a luz da
minha vida, minha razão de seguir meus sonhos, meu tudo.
AGRADECIMENTOS

Agradeço ao meu orientador Prof. José Carlos Cardoso Filho, pela sua dedicação e paciência,
por sua contribuição na minha formação e por ter me acolhido, sempre me incentivando a continuar.

Ao Leonardo H.L.S. Oliveira, por ter cedido suas pesquisas para o desenvolvimento deste
trabalho.

À minha família por todo o suporte durante os anos da minha graduação.

Aos meus amigos da Engenharia Química, que de alguma forma deram sua contribuição e
apoio nessa longa jornada.
Valéria Cristina Pinheiro Máximo

ESTUDO DO DESENVOLVIMENTO DE MICRO-ORGANISMOS EM


TUBULAÇÕES METÁLICAS PARA O CONTROLE DA CORROSÃO NAS
UNIDADES GERADORAS DA UHE TUCURUÍ

Trabalho de conclusão de curso de graduação apresentado a Faculdade de Engenharia


Química da Universidade Federal do Pará como requisito parcial para a obtenção do título de
Bacharel(a) em Engenharia Química.

Aprovado em: ____ de _______ de _____.

BANCA EXAMINADORA

__________________________________________
Prof. Msc. Fábio de Andrade Pontes – FEQ/ UFPA

__________________________________________
Msc. Letícia Maria Martins Siqueira – FEQ/ UFPA

__________________________________________
Prof. Dr. José Carlos Cardoso Filho – FEQ/ UFPA (orientador)
LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Técnicas utilizadas .................................................................................................................18

Figura 2 -Isolado AC13 08 I (aumento 100 x).......................................................................................26

Figura 3 -Isolado AX21 08 I (aumento 1000 x).....................................................................................26

Figura 4 -Isolado AX46 04 I (aumento 1000 x).....................................................................................27

Figura 5 – Contagem microbiológica de Bactérias totais, Bactérias Gram-negativas e Fungos. Valores


expressos em UFC/m2 de superfície metálica exposta às águas do reservatório da UHE-Tucuruí.......28

Figura 6 – Isolados microbianos (Coleta 1). Bacilos gram-positivos com formação de esporos
subterminais (A), Bacilos gram-positivos com formação de esporos centrais (B), Leveduras (C),
Bactérias em morfologia de estafilococos (D)........................................................................................29

Figura 7 – Isolados microbianos (coleta 2). Bactérias filamentosas gram-positivas (A, B e E), Bacilos
grampositivos (C e D), Bacilo gram-negativo (F)..................................................................................30

Figura 8: Bactéria gram-negativa com característica filamentosa..........................................................31

Figura 9 – Micromorfologia dos fungos isolados dos CP’s coleta 1 – UHE-Tucuruí. Penicillium sp (A,
B, D e E) 400x, Aspergillus sp (C) 400x, Paecilomyces sp (F) 400x....................................................32

Figura 10 - Micromorfologia dos fungos isolados dos CP’s coleta 2 – UHE-Tucuruí. Aspergillus sp
(A, B e C) 400x, Penicillium sp (D) 400x, Cladosporium sp (E) 1000x, Acremonium sp (F) 400x,
Paecilomyces sp (G) 400x, Phoma sp (H) 400x.....................................................................................33

Figura 11. Espectros de impedância eletroquímica do sistema Pt | Pt | Ag/AgCl em meio de cultivo M9


em função do tempo. Temperatura 37 ºC. Sem presença de bactéria.....................................................35

Figura 12. Espectros de impedância eletroquímica do sistema Pt | Pt | Ag/AgCl em meio de cultivo M9


em função do tempo (t=0 a t = 2 h) na presença de bactéria Pseudomona Aeruginosa. Temperatura

37ºC.........................................................................................................................................................35

Figura 13. Espectros de impedância eletroquímica do sistema Pt | Pt | Ag/AgCl em meio de cultivo M9


em função do tempo (t=2 a t = 26 h) na presença de bactéria Pseudomona Aeruginosa. Temperatura 37
ºC.............................................................................................................................................................36

Figura 14. Fotografia da superfície da platina após ficar imersa por 24 horas numa solução contendo o
meio de cultivo M9 e bactérias Pseudomona Aeruginosa......................................................................36

Figura 15. Fotografia da superfície da platina após ficar imersa por 24 horas numa solução contendo o
meio de cultivo M9 sem a presença de bactérias no meio......................................................................36

Figura 16 - gráfico da contagem de unidades formadoras de colônia / m2, amostras coletadas das
estações de corrosão instaladas na UHE-Tucuruí..................................................................................37

Figura 17 - Bactérias Aeróbias/Anaeróbias Facultativas.....................................................37

Figura 18 - Fungos...............................................................................................................38

Figura 19 - Bactérias Redutoras de Sulfato (BRS)...............................................................38

Figura 20 - Bactérias Oxidantes do Ferro.............................................................................39


SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 9

1.1 JUSTIFICATIVA ........................................................................................................ 11

1.2 OBJETIVOS ............................................................................................................... 12

1.2.1 Objetivo geral ............................................................................................................ 12

1.2.2 Objetivos específicos .................................................................................................. 12

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA.................................................................................. 13

2.1 CORROSÃO ............................................................................................................... 13

2.2 CORROSÃO INFLUENCIADA POR MICROORGANISMOS (CIM) ....................... 13

2.3 BIOFILMES ................................................................................................................ 14

2.4 ETAPAS DE FORMAÇÃO DO BIOFILME MICROBIANO ...................................... 15

2.5 MICROORGANISMOS ENVOLVIDOS COM A CIM .............................................. 16

2.5.1 Bactérias Oxidantes de Ferro ................................................................................... 16

2.5.2 Bactérias Redutoras de Sulfato ................................................................................. 16

2.5.2 Pseudomonas Aeruginosas ......................................................................................... 17

2.5.2 Fungos ........................................................................................................................ 17

2.6 TÉCNICAS EMPREGADAS ...................................................................................... 17

3 MATERIAIS E MÉTODO ....................................................................................... 17

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................ 25

5 CONCLUSÃO ............................................................................................................. 39

6 REFERÊNCIAS .......................................................................................................... 40
9

1 INTRODUÇÃO

A corrosão é um processo espontâneo de deterioração, que ocorre em superfícies de


materiais metálicos, por meio de reações químicas ou eletroquímicas, influenciada por vários
fatores físicos, químicos e biológicos, dentre os fatores biológicos, destacam-se os produtos
do metabolismo microbiano e a formação de biofilme, capazes de modificar a interface
substrato/solução, facilitando, iniciando, acelerando ou inibindo as reações de corrosão, sem
alterar sua natureza eletroquímica (GENTIL,2003).

A corrosão microbiológica, ou biocorrosão, é o processo eletroquímico de dissolução


metálica iniciada ou acelerada por micro-organismos. Denomina-se genericamente fouling, ou
acumulação, a formação de depósitos sobre a superfície de equipamentos ou instalações
industriais. Esses depósitos têm como efeito negativo uma importante diminuição da
eficiência da vida útil do equipamento. A palavra biofouling (bioincrustação) refere-se ao
acúmulo indesejável de depósitos biológicos sobre uma superfície (HEITZ et al., 1996). Esse
depósito pode conter microrganismos (microfouling) a macrorganismos (macrofouling).

Em geral, o biofouling resulta do acúmulo de biofilmes. Um biofilme é constituído por


células imobilizadas sobre um substrato, incluídas em uma matriz orgânica de polímeros
extracelulares produzidos pelos microrganismos, genericamente denominado material
polimérico extracelular (MPE), que representa um dos principais componentes do biofilme.
Bactérias do gênero pseudomonas SP estão entre os micro-organismos mais comumente
envolvidos na formação de biofilmes, especificamente a Pseudomonas Aeruginosa (VIDELA,
2003).

A região norte do Brasil apresenta, sob o ponto de vista climatológico, condições


altamente favoráveis ao desenvolvimento de biofilmes sobre as superfícies de materiais
imersos em águas naturais, não necessariamente de origem marinha. Estes biofilmes podem
originar as condições necessárias para o desenvolvimento de microrganismos capazes de
produzir substâncias que causam corrosão nos metais e degradação das estruturas de concreto
e madeira. A forma de corrosão gerada é, geralmente, do tipo localizada, forma altamente
perigosa, já que sua detecção é difícil e muitas vezes só acontece quando ocorre a falha
mecânica da estrutura (MARANGONI, 2010).

Nas centrais hidrelétricas, a matéria prima utilizada é a água das bacias hidrográficas
de rios, sendo acumuladas em reservatórios. Por ser uma água sem tratamento (água bruta)
10

abrigam micro-organismos, substâncias em suspensão e matéria orgânica que causam


entupimentos, prejudicam as trocas térmicas favorecendo a ação corrosiva nos metais dos
equipamentos (OLIVEIRA, 2010).

Os estudos referentes a esse processo fornecem suporte para que soluções eficazes
possam ser elaboradas para se obter um controle efetivo em razão dos micro-organismos,
podendo-se evitar problemas futuros decorrentes da formação desses biofilmes em superfícies
metálicas.

O presente trabalho, portanto, teve como objetivo principal a investigação da formação


de biofilmes sobre superfícies metálicas instaladas na Usina Hidrelétrica de Tucuruí, Pará. Os
estudos levaram à análise dos seus efeitos sobre os metais (corrosão influenciada por micro-
organismos) e, os micro-organismos isolados destes biofilmes foram identificados por meio
de metodologias clássicas e moleculares, além da utilização de técnicas eletroquímicas e de
cultivo microbiológico para identificação dos fenômenos envolvidos na formação do biofilme
fornecendo subsídios para minimizar os danos causados pela bioincrustação e biocorrosão em
diferentes materiais.
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1.1 JUSTIFICATIVA

Segundo dados da ANEEL (2014), 67,91 % da produção de energia brasileira são


procedentes de hidrelétricas, com apenas 1091 Unidades Geradoras, do total de 3040 Centrais
Geradoras Elétricas já instaladas.

A presença de micro-organismos nas instalações do reservatório dessas usinas pode


trazer danos de elevada gravidade na eficiência de produção de energia elétrica e na vida útil
de equipamentos, pois micro-organismos podem desencadear vários processos, tais como, a
corrosão influenciada, entupimentos e incrustações devido à formação do biofilme,
principalmente em superfícies de peças fabricadas com aço carbono.

A justificativa econômica do projeto deve ser analisada sobre este ponto de vista de
que, danos causados pelos problemas de corrosão levam a parada das máquinas não
programadas, além de que as programadas podem ser reduzidas pela diminuição dos
processos que levam ao entupimento do sistema de resfriamento. A busca pela solução desses
problemas é de extrema importância, já que esse sistema é o responsável por uma importante
parcela de toda a energia elétrica produzida no Brasil.

Neste sentido, o estudo acerca desses processos aplicado em tubulações e


equipamentos de distribuição hídrica da usina hidrelétrica de Tucuruí é fundamental para
auxiliar a conservação de tais estruturas, o que assegura maior qualidade nos serviços. Além
disso, possibilita a economia com gastos em manutenção e substituição de ferramentas.
12

1.2 OBJETIVOS

1.2.1 Objetivo geral

O presente trabalho tem como objetivo estudar o desenvolvimento de biofilmes sobre


superfície metálica (aço carbono e aço inox) por meio da espectroscopia de impedância
eletroquímica (EIE).

1.2.2 Objetivos específicos

Este trabalho possui como objetivo a avaliação dos biofilmes formados em superfícies
metálicas de corpos de prova (CP’s) expostos em estações de avaliação de corrosão na Usina
Hidrelétrica de Tucuruí, através do isolamento e caracterização morfológica e molecular dos
micro-organismos encontrados nas amostras CP’s, visando à identificação dos grupos
presentes. Também foram avaliados os processos que ocorrem durante a etapa de adesão dos
micro-organismos sobre a superfície metálica através de espectroscopia de impedância
eletroquímica. Foram caracterizados os CP’s coletados periodicamente e através de cultivos
microbiológicos e utilização de ferramentas de biologia molecular, foi possível detectar e
identificar os micro-organismos normalmente envolvidos na corrosão influenciada por micro-
organismos.
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2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

Neste capítulo serão abordados aspectos importantes do processo da corrosão, bem


como a definição da corrosão influenciada por micro-organismos e como ocorre a formação
dos biofilmes microbianos e por consequência a degradação do material exposto ao meio
corrosivo. Além de expor os tipos de microorganismos comumente envolvidos na formação
dos biofilmes e as técnicas utilizadas para caracterização do mesmo.

2.1 Corrosão

De acordo com Gentil (2003) é de pleno conhecimento que materiais metálicos são
suscetíveis ao fenômeno da corrosão pelo fato desta ser um processo absolutamente natural e
espontâneo. O processo corrosivo é considerado uma reação química heterogênea ou uma
reação eletroquímica que ocorre na interface de contato entre o metal e o meio corrosivo.

Analogamente para Venzlaff (2013), a interação dos materiais utilizados na construção de


equipamentos com o ambiente a que estão expostos em serviço provoca, com frequência, sua
degradação, a qual pode tornar-se ainda mais severa quando houver associação do meio
corrosivo com micro-organismos e regiões mecanicamente fragilizadas, o que pode modificar
as propriedades mecânicas dos materiais metálicos e alterar a durabilidade e desempenho dos
mesmos.

Conforme Carvalho (2016), cientificamente, o termo corrosão é empregado a fim de


designar o processo de destruição total, parcial, superficial ou estrutural dos materiais por um
ataque eletroquímico, químico ou eletrolítico. Com base nesta definição, pode- se classificar a
corrosão em: eletroquímica, química e eletrolítica.

2.2 Corrosão influenciada por micro-organismos (CIM)

A corrosão microbiologicamente induzida ou biocorrosão envolve três componentes


fundamentais: metal, solução e micro-organismos. Ou seja, refere-se a capacidade dos micro-
organismos em iniciar, acelerar ou facilitar as reações de corrosão no meio através de seus
metabolitos ativos (JAVAHERDASHTI, 2008).
14

Segundo Silva (2015), a biocorrosão em sistemas industriais ocorre principalmente


quando a superfície do metal está imersa em água. A elucidação dos mecanismos de
biocorrosão atuantes deve considerar a investigação de quatro aspectos básicos como a
presença de gases (oxigênio, hidrogênio, sulfeto de hidrogênio); as características físico-
químicas e biológicas do líquido; depósitos de biofouling (biofilme + produtos de corrosão) e
o substrato metálico (equipamento) (COETSER et al,2005 apud SILVA, L. J. 2015).

Dentre os grupos de bactérias envolvidas no processo sobressaem às bactérias


precipitantes do ferro, produtoras de ácidos, produtoras de exopolissacarídeos (pseudomas
aeruginosa) e as bactérias redutoras de sulfatos (BRS). (OLIVEIRA, 2010)

Segundo Videla (1992), as quatro características anatômicas e fisiológicas dos micro-


organismos mais relevantes aos estudos de biocorrosão, biofouling e biodeterioração são a
grande velocidade de reprodução; alta relação superfície/volume, alta atividade e flexibilidade
metabólica de troca com o meio e distribuição uniforme no ambiente.

2.3 Biofilme

A adesão de bactérias a superfícies metálicas pode dar inicio a formação de biofilmes


dentro dos quais os processos metabólicos afetam significativamente a corrosão da superfície.
A formação de biofilmes microbianos é uma resposta a estímulos externos do meio
ambiente, onde estes micro-organismos estão inseridos, através de várias estratégias:
aglomeração, lípase bacteriana, virulência, formação de biofilme, entre outras. Uma resposta
atualmente bastante estudada é o Quorum Sensing (QS) que pode influenciar todos os
fenótipos citados anteriormente (MARANGONI, 2014).
As formações de biofilme têm uma ordem distinta de eventos e estágios de
desenvolvimento. Uma única bactéria é capaz de condicionar a superfície. Normalmente,
dentro de segundos da inoculação começa a excreção de película viscosa que cobre a
superfície; e logo a espécie colonizadora fica permanentemente ligada à superfície. Mais
microorganismos tornam-se embutidos na superfície viscosa; E após vários dias, é formado
um aglomerado de substância composta por várias espécies de microorganismos referidos a
biofilme. Com o tempo, à medida que o biofilme cresce, pequenas porções se rompem e são
transportadas para outra área pela água que flui para começar a colonizar novas superfícies.
Os principais fatores que afetam a formação do biofilme nas superfícies são
propriedades eletroquímicas da superfície, disponibilidade de nutrientes e fluxo de água. A
modificação química das superfícies afeta a taxa e a extensão da fixação microbiana.
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Anexando-se a uma superfície, as células aumentam a quantidade de nutrientes disponíveis e,


assim, aumentam suas chances de crescimento e sobrevivência (WINTERMUTE, SILVER,
2010).

2.4 Etapas de formação do biofilme microbiano

A formação de biofilmes inicia-se com a adsorção de moléculas orgânicas ou


inorgânicas à superfície, formando o filme condicionante. Esse filme altera as características
físico-químicas da superfície do metal contribuindo para que haja a colonização primária dos
micro-organismos sobre a superfície sólida condicionada. (FLETCHER, 1992)
A fixação de células livres provenientes do meio líquido a superfícies sólidas
compreende a etapa inicial de desenvolvimento do biofilme e ocorre poucos minutos após o
transporte e a adsorção de substancias orgânicas dissolvidas no meio aquoso (MACHADO,
2005).
A aderência à superfície ocorre em dois estágios: Adesão reversível, seguida por adesão
irreversível (MITTELMAN, 1998).
A adesão reversível se dá pela interação inicial fraca da bactéria com o substrato. Isso
envolve forças de atração de Van der Waals, forças eletrostáticas e forças de interações
hidrofóbicas. Durante a adesão reversível, bactérias exibem movimentos brownianos e são
facilmente removidas pela aplicação de forças mínimas. A adesão irreversível resulta do
ancoramento de apêndices (pili, flagelo, proteínas adesina) e ou da produção de substancias
poliméricas extracelulares, fazendo com que as ligações entre as células e a superfície se
fortaleçam (CHARACKLIS, 1990). Nesta fase há também a colonização por
microorganismos secundários, uma vez que os colonizadores primários contribuem para a
modificação da superfície sólida por meio de uma produção significativa de SPE
condicionando a adesão de outras espécies de microorganismos, originando em um biofilme
jovem de multiespécies. E tem-se a SPE como principal força de ligação entre a célula e a
superfície metálica, tendo ainda nesta etapa a mobilidade celular minimizada, e os genes
envolvidos na comunicação celular e produção de SPE em máxima atividade (CHENG et al.,
2007).
A formação do biofilme maduro ocorre de 3 a 6 dias após a adesão inicial, podendo
chegar a 10 dias. A maturidade acontece, principalmente, por meio do aumento da densidade
populacional e também pela pronunciada produção e deposição de polímeros extracelulares,
aumentando a espessura do biolfilme (CHENG et al., 2007). Na maturação acontece um
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rearranjo estrutural do biofilme, à redistribuição das bactérias bem como o aparecimento de


canais e poros onde há difusão de nutrientes (STOODLEY et al., 2002).

2.5 Micro-organismos envolvidos com a Corrosão Influenciada por Microorganismos


Os micro-organismos encontrados nos biofilmes depositados sobre os metais, podem
atuar de diferentes maneiras na CIM. São as enterobactérias, bactérias dos gêneros
Pseudomonas e Bacillus, bactérias redutoras de sulfato (BRS), bactérias oxidantes do ferro e
bactérias oxidantes do enxofre, e fungos filamentosos. A detecção de micro-organismos
associados à corrosão normalmente está condicionada ao seu isolamento, culturas puras e
identificação. Porém, em alguns casos são necessárias condições especiais para seu
isolamento, dificultando sua identificação. As BRS são um exemplo claro desta limitação, já
que são anaeróbicas estritas e exigem ausência total de oxigênio (MARANGONI et al., 2010).

2.5.1 Bactérias Oxidantes de Ferro


Bactérias que oxidam o ferro são relacionadas com a biocorrosão, elas são autótrofos e
capazes de oxidar o ferro ferroso a férrico e assim obtendo energia necessária para o seu
crescimento. (MACUL, 2013)
Além da influência sobre a corrosão através dos metabólitos gerados, são capazes de
produzir flóculos e depósitos de fouling inorgânico e biológico nos sistemas de águas
industriais, contribuindo para falha mecânica em diversos equipamentos industriais
(COETSER; CLOETE, 2005).

2.5.2 Bactérias Redutoras de Sulfato


As bactérias redutoras de sulfato (BRS) são relatadas, pela literatura, como os principais
microrganismos associados a processos de degradação de materiais metálicos em serviço.
Elas estão amplamente distribuídas na natureza, podendo ser encontradas em zonas anóxicas
de diferentes ambientes como solo, águas doces e salgadas, sedimentos, fontes hidrotermais,
lamas vulcânicas, ambientes geotérmicos, águas de reservatórios, rizosfera de plantas, assim
como na boca e intestino de muitos animais, incluindo o homem (VASCONCELOS et al,
2014).
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2.5.3 Pseudomonas Aeruginosa


A Pseudomonas aeruginosa é uma bactéria de caráter oportunista que possui grande
facilidade para formar biofilmes e não apresenta muitas exigências nutricionais, visto que
dentro de 96 horas, cresce em grande quantidade na superfície de lâminas de aço inoxidável.
O aço inoxidável tem uma alta resistência e suas características físico-químicas
proporcionam muitas vantagens, porém é um material susceptível a adesão e formação de
biofilmes, principalmente quando apresenta superfícies com rugosidades, o que pode ser
observado pela maior capacidade de adesão da Pseudomonas.(VEIGA, 2016).

2.5.4 Fungos
Os fungos são micro-organismos eucariotos, capazes de crescer sobre todos os
substratos e ambientes, desde rochas, superfícies metálicas, e até sobre e no interior de
diversas espécies de plantas. Muitos são capazes de metabolizar compostos orgânicos como
madeira, tinta, papel e polímeros de borracha (GÖRS et al., 2007 apud MARANGONI, 2014),
produzindo solventes orgânicos como ácidos e álcoois que favorecem a biocorrosão.
O fungo Hormoconis resinae é um exemplo de fungo que provoca a biocorrosão, ele
provoca a corrosão de tanques de combustível de aeronaves. O fungo é contaminante do
combustível, e ao entrar no tanque encontram condições ideias para se proliferar, no seu
processo de crescimento produz ácidos orgânicos, que desloca o pH para faixa ácida do meio
e provocam a corrosão sobre as ligas de alumínio. (MACUL, 2013)

TÉCNICAS EMPREGADAS:
As técnicas utilizadas neste trabalho para a caracterização e inspeção das superfícies dos
corpos de prova, são especificadas como:

Figura 1: Técnicas utilizadas


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3 MATERIAIS E MÉTODO

Foram instalados corpos de prova (CP’s) em estações de avaliação de corrosão em que


circula constantemente água do reservatório da UHE-Tucuruí, que é alimentado pelo rio
Tocantins.

Amostragem

Os corpos de Prova metálicos (AÇO CARBONO – identificados como “AC” e AÇO


INOX – identificados como “AX”) são coletados para avaliação microbiológica: bactérias
aeróbias, anaeróbias estritas e facultativas. Também foi avaliada a qualidade da água sob os
aspectos físico-químicos e bacteriológicos, sendo que o último será utilizado para detecção do
nível de contaminação do rio que alimenta o reservatório por material orgânico.

Delineamento experimental

Foram coletados periodicamente num total de seis coletas (ciclos de 2 meses) amostras
de corpos de prova que foram instalados nas estações de corrosão. Estas estações são
compostas basicamente por caixas acrílicas onde circula continuamente água do reservatório
da usina, que é alimentado pelo rio Tocantins, mesma água que se utiliza para movimentar as
turbinas e que está em contato direto com as superfícies metálicas de tubulações e
equipamentos.

Meios de cultivo, Soluções e Reagentes

Os meios de cultivo e soluções foram esterilizados: em autoclave, 121ºC a 1atm por 20


min, ou através de filtros Millipore 20µm (meios de cultura, soluções e reagentes sensíveis ao
calor). Vidrarias foram autoclavadas por 40 min, frascos, ponteiras e tubos tipo Eppendorf
autoclavados à pressão de 1atm, por 15 min. Todo material contaminado foi esterilizado antes
do descarte.

Meios de Cultivo

Meios de cultivo comerciais

Foi utilizado o meio de cultura comercial TripticSoy Case , marca Acumedia, para o
isolamento de bactérias anaeróbias facultativas e aeróbias; para o isolamento de fungos foi
utilizado o meio Ágar Batata Dextrose, marca Acumedia.
19

Meio seletivo LeathenMcintyre-Braley

O meio de cultivo Leathen-Mcintyre-Braley foi preparado com: Sulfato de amônio


0,15 g/L, Nitrato de Cálcio 0,01 g/L, Fosfato de Potássio dibásico 0,05 g/L, Sulfato de
Magnésio 0,5 g/L, Cloreto de Potássio 0,05 g/L, Água destilada qsp 1000 mL(APHA;
AWWA; WPCF, 1999).

Após a esterilização adicionou-se 10 mL da solução de sulfato ferroso 10%


esterilizada em filtro millipore. O pH deve ser ajustado a 3,5 com NaOH (2N) e alíquotas de
10 mL do meio são distribuídas em tubos de ensaio esterilizados com tampa rosqueável.

Meio seletivo para Bactérias Redutoras de Sulfato (BRS)

Segundo formulação sugerida pelo Standard Methods for Examination of Water and
Wastewater (APHA; AWWA; WPCF, 1999) , foram utilizados: Glicose 0,15 g/L, Lactato de
sódio 3,5 g/L, Extrato de carne 1,0 g/L, Peptona 2,0 g/L, Sulfato de Sódio 1,5 g/L, Fosfato de
potássio dibásico 0,5 g/L, Sulfato de magnésio 2,0 g/L, Cloreto de Cálcio 0,1 g/L, Água
destilada qsp 1000 mL.

Segundo metodologia preparou-se duas soluções separadamente para que sejam


adicionadas após esterilização do meio seletivo para BRS. Solução 1 (Ascorbato de sódio 1 g/
100 mL) e solução 2 (Sulfato ferroso amoniacal 3,92 g/ 100 mL).

O pH deve estar em 7,5 ± 0,3 após a esterilização. Portanto deve-se preparar o meio
sem as soluções “1” e “2”, que são dispensados em tubos com tampa rosqueável e
esterilizados. Para se inocular, os tubos devem estar completamente cheios, então o meio
extra esterilizado é reservado para preencher o volume total dos tubos de ensaio. No momento
em que são inoculadas as amostras neste material, prepararam-se as soluções “1” e “2”, que
foram esterilizadas por filtração (membrana 0,45 micrometros) e adiciona-se 1 mL de cada
solução para 100 mL do meio principal.

Soluções e Reagentes

Solução Salina

Solução 0,85% (p/v) de NaCl (8,5 g/L de NaCl dissolvidos em Água destilada).
20

DNA Polimerase (Marca Invitrogen)

Utilizou-se a Taq DNA polimerase da marca Invitrogen nas reações de amplificação


por PCR, na concentração de 5 U/ µL.

dNTP (Marca Invitrogen)

Os quatro desoxirribonucleotídeos: dATP, dTTP, dGTP, dCTP (concentração estoques


100 mM), foram diluídos em água ultrapura a 2,5mM (solução única). Nas reações de
amplificação, a concentração final utilizada será de 0,2 mM.

EDTA 0,5M

Para o preparo desta solução foram utilizados: EDTA 372,2 g/L e Água destilada qsp
1000 mL. O EDTA foi pesado e acrescentado uma parte de água ultrapura autoclavada
(aproximadamente 80% - 800mL). O pH deve ser corrigido inicialmente com NaOH em pellet
(aproximadamente 20 g) e o ajuste final (pH 8,0) com NaOH (4N). Para obtenção de EDTA
50mM, dilui-se esta solução dez vezes. A solução deve ser autoclavada e mantida a 4ºC.

Gel de Agarose (0,8% p/v)

Utiliza-se para o preparo do Gel: Agarose 8 g/L em Tampão TBE 1X.

Gel de Agarose (1,6% p/v)

Utiliza-se para o preparo do Gel: Agarose 16 g/L em Tampão TBE 1X.

Oligonucleotídeos iniciadores (Primers)

Os primers foram diluídos em tampão TE (solução 4mM), usando o peso molecular do


primer individual fornecido pelo fabricante. Os primers diluídos devem ser mantidos a -20ºC.

Tampão da Amostra para eletroforese

O Tampão foi preparado com: Sacarose 400 g/L, Azul de bromofenol 2,5 g/L e Água
destilada. Os reagentes foram solubilizados e mantidos a 4ºC.

Tampão CTAB

Utiliza-se: Tris-base 30,25 g/L, Na-EDTA 9,25 g/L, CTAB 25 g/L, Cloreto de sódio
102,5 g/L e Água ultra pura qsp 100 mL. O pH final será ajustado para 7,5. A solução deve
21

ser aquecida para que o Na-EDTA e o CTAB sejam dissolvidos e o volume completado para
100 mL com água Ultra pura autoclavada.

Tampão de Corrida para Gel de Agarose (TBE 10X – pH 8,0)

Para o preparo do Tampão foram utilizados: Tris-base 108 g/L, Ácido Bórico 55 g/L,
EDTA (0,5M) 40 mL/L e Água ultra pura qsp 1000 mL.

Tampão Tris-EDTA (TE)

Tris-HCL (pH: 8,0) 20mM EDTA 20mM

Solução de Brometo de Etídio

Dissolveu-se 1,0% (p/v) de brometo de etídio em água ultrapura, agitando-se por


várias horas. A solução deve ser estocada à temperatura de 8ºC longe de fontes luminosas.
Para revelação, Foram diluídos 3 µL/L de brometo em de água ultra pura.

Metodologia de análise dos corpos de prova

Preparou-se o inóculo através da adição de tubérculo de corrosão (área de 25cm2 de


metal exposto em estação e corrosão) de cada corpo de prova (CP’s de aço carbono e aço
inox) em 200 mL de solução salina (NaCl 0,85% p/v) esterilizada. Para a obtenção deste
material raspam-se os CP’s com lâminas esterilizadas (cada um dos corpos de prova é tratado
separadamente). Foram realizadas as diluições necessárias e com estas será possível realizar
os inóculos para: isolamento de bactérias aeróbicas e anaeróbicas facultativas, isolamento de
fungos, presença/ausência de Bactérias oxidantes do ferro e presença/ausência de Bactérias
redutoras de sulfato.

Isolamento de bactérias aeróbicas e anaeróbicas facultativas.

Realizou-se a homogeneização das amostras (inóculos já diluídos) em um agitador de


tubos e inoculou-se 100 µL das amostras em placas de Petri com meio caldo de soja
(Tripticsoycase – Acumedia). O inóculo foi homogeneizado sobre o meio de cultivo com o
auxílio de uma alça de Drigalski. As placas foram incubadas à temperatura de 25ºC em BOD,
por 2-3 dias.
22

Presença / Ausência de bactéria oxidante de ferro

Foi inoculado 5 mL da solução de inóculo em tubos de ensaio com Meio seletivo


Leathen Mcintyre-Braley (20mL) e incubado a 30ºC por 15-20 dias.

Lâminas de Gram foram confeccionadas conforme Konemam et. al (2001) e


comparadas com fotos existentes no Standard Methods for the Examination of Water and
Wastewater (1999). Adicionou-se 2 gotas da solução de Ferrocianeto de Potássio 1% em cada
tubo teste. A coloração azul intenso (Azul da Prússia) indica a presença de Fe 2+ insolúvel e,
somada ao resultado da coloração de Gram, confirma a presença de Bactéria oxidante de
ferro.

Presença / Ausência de bactérias redutoras de sulfato

As amostras foram inoculadas em um meio específico para bactérias sulfato-redutoras


(APHA; AWWA; WPCF, 1999). É necessário utilizar uma metodologia específica para
produção de tubos com o meio de cultura e ausência de oxigênio. Estes serão esterilizados e
haverá uma atmosfera interna reduzida de oxigênio. Este meio será transferido aos tubos de
ensaio que possuem tampa rosqueável de baquelite e rolha de borracha, que asseguram a
vedação do sistema, garantindo o isolamento e, assim, manutenção do meio isento de
oxigênio, característica necessária para o isolamento das Bactérias Sulfato Redutoras (BRS),
que são anaeróbicas estritas. Para a confecção destes tubos foi realizado o seguinte
procedimento:

Autoclavar o tubo de ensaio com o meio de cultura e separadamente as rolhas de


borracha e agulhas metálicas. A esterilização foi realizada durante 15 min, 121ºC a 1atm em
autoclave vertical.

Adicionou-se ao tubo com meio de cultivo autoclavado o inóculo e foi preenchido até
a capacidade máxima do tubo com o mesmo meio de cultura, que foi autoclavado previamente
e separado para este propósito. Para completa vedação deste sistema, utiliza-se a rolha de
borracha que foi inserida no tubo onde se deve tomar o cuidado para que não fique nenhuma
bolha de ar no interior do tubo. A agulha de metal autoclavada auxilia este processo de
inserção da rolha, adaptado de Rodríguez Cavallini e Cruz, 1999.
23

A presença de Bactérias redutoras de sulfato é assinalada pela formação de depósito de


sulfeto ferroso, de coloração preta, após 20-30 dias de incubação em estufa de anaerobiose
com recirculação de gás carbono a temperatura de 30ºC.

Isolamento de Fungos

Utilizando-se o mesmo inóculo, obtido dos corpos de prova, inoculou-se 100 µL em


placa de Petri com meio de cultura (BDA – Acumedia). O inóculo foi distribuído com alça de
Drigalski pela placa de petri com Agar (técnica de semeadura). As placas foram incubadas a
temperatura de 25ºC em BOD, por 4-7 dias.

Identificação de micro-organismos

Biofilme

Para a caracterização do biofilme formado sobre os corpos de prova realizou-se


microscopia eletrônica de varredura – MEV (BOZZOLA; RUSSELL, 1999). Foram utilizados
os equipamentos CPD030 Critical Point Dryer para o ponto critico e SCD030 – Balzers Union
FL 9496 Balzers para metalização (Centro de Microscopia Eletrônica da UFPR) e para a
observação o microscópio eletrônico de varredura marca PHILLIPS modelo XL30
(Departamento de Tecnologia de Materiais – LACTEC).

Bactérias aeróbicas e anaeróbicas facultativas

Para a classificação das bactérias Gram-positivas e negativas foi realizada a técnica de


coloração de Gram (KONEMAN et al., 2001). Para bactérias Gram-positivas utiliza-se provas
bioquímicas e características morfológicas para a classificação taxonômica do gênero Bacillus
sp. Os grupos taxonômicos Pseudomonas sp e Enterobactérias (Gram-negativas) foram
determinados através de bioquimismo e características morfológicas, segundo Koneman et al.,
(2001).

Fungos

A identificação dos fungos foi realizada por meio da observação de estruturas de


reprodução, utilizando a técnica do microcultivo, com lâminas de 7 a 14 dias de cada
morfogrupo. As lâminas foram fixadas, coradas em lactofenol com 0,05% de azul de algodão
e lactofenol de Amann, após processo de confecção foram analisadas ao microscópio óptico
(aumento 400X).
24

Além disso, para confirmação de espécie, foi utilizada microscopia eletrônica de


varredura – MEV (BOZZOLA; RUSSELL, 1999). Utilizou-se os equipamentos CPD-030
Critical Point Dryer para o ponto crítico e SCD030 – Balzers Union FL 9496 Balzers para
metalização (Centro de Microscopia Eletrônica da UFPR) e para a observação ao microscópio
eletrônico de varredura marca PHILLIPS modelo XL30 (Departamento de Tecnologia de
Materiais – LACTEC).
25

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Bactérias aeróbias e anaeróbias facultativas (COLETA 1)

Na primeira coleta realizada foram isolados 39 micro-organismos, dentre os quais 36


são bactérias e 3 leveduras.

As figuras 2, 3 e 4 ilustram os micro-organismos isolados (Técnica da coloração de


Gram) observados a microscopia ótica.

Figura 2 -Isolado AC13 08 I (aumento 100 x)

Figura 3 -Isolado AX21 08 I(aumento 1000 x).


26

Figura 4 -Isolado AX46 04 I (aumento 1000 x).

Bactérias oxidantes do ferro (COLETA 1)

Foram inoculadas as 4 amostras coletadas e todas apresentaram resultado negativo para


a Presença/Ausência de Bactérias Oxidantes do Ferro através de cultivo microbiológico.

Resultado inconclusivo devido ao baixo período de exposição do metal a ação da água


do reservatório (1 semana de exposição). O biofilme formado sobre o metal era ainda pouco
expressivo para o aço carbono (AC) e principalmente para o aço inox (AX).

Bactérias Redutoras de Sulfato (BRS) (COLETA 1)

Foram inoculadas as 4 amostras coletadas e todas apresentaram resultado negativo para


a Presença/Ausência de Bactérias Redutoras de Sulfato através de cultivo microbiológico.

O resultado também foi inconclusivo devido ao baixo período de exposição do metal a


ação da água do reservatório (1 semana de exposição). O biofilme formado sobre o metal era
ainda pouco expressivo para o aço carbono (AC) e principalmente para o aço inox (AX).

Fungos (COLETA 1)

Foram isolados um total de 20 tipos diferentes de fungos no total das 4 amostras


inoculadas.
27

Isolamento de bactérias aeróbicas e anaeróbicas facultativas Totais

Na primeira coleta, referente a aproximadamente 1 semana de exposição dos corpos-


de-prova à água do Rio Tocantins, houve um crescimento maior na liga correspondente ao aço
inox (AX 21). Tal fato mostrou-se distinto dos demais observados em trabalhos anteriores, em
que os maiores números encontravam-se em ligas de aço carbono. Foram isoladas 42 colônias
bacterianas que apresentavam características morfológicas diferentes entre si.

Figura 5 – Contagem microbiológica de Bactérias totais, Bactérias Gram-negativas e Fungos. Valores expressos
em UFC/m2 de superfície metálica exposta às águas do reservatório da UHE-Tucuruí

Na coleta 2, foram realizadas duas contagens, sendo uma para bactérias totais em meio
de cultivo TSA, e outra em meio de cultivo Agar MacConkey, o qual possui compostos
inibitórios ao crescimento de bactérias Gram positivas. Dessa forma, é possível comparar os
resultados obtidos em termos de grupos bacterianos, conforme o gráfico (FIGURA 5). .

Nessa coleta, observou-se claramente a maior incidência bacteriana em ligas de aço


carbono, denominados AC 45, AC 15 e AC 48. No corpo-de-prova de aço inox, AX 44, a
contagem de micro-organismos totais foi inferior aos demais, ao passo que não houve
desenvolvimento de bactérias Gram negativas. Já nas ligas de Aço carbono houve
crescimento.

Foram isolados 116 colônias bacterianas que apresentavam características morfológicas


diferentes entre si.
28

Verificou-se, em ambas as coletas, a presença de bacilos Gram-positivos, bacilos Gram


negativos, cocobacilos Gram-negativos, cocos Gram-positivos, bactérias filamentosas Gram-
positivas e Gram-negativas. Através da Figura 6 e Figura 7, respectivas às coleta 1 e 2, é
possível visualizar a grande variabilidade e diversidade morfológica dos micro-organismos
isolados (158 isolados até a coleta 2).

Figura 6 – Isolados microbianos (Coleta 1). Bacilos gram-positivos com formação de esporos subterminais (A),
Bacilos gram-positivos com formação de esporos centrais (B), Leveduras (C), Bactérias em morfologia de
estafilococos (D). Aumentos 1000X

Figura 7 – Isolados microbianos (coleta 2). Bactérias filamentosas gram-positivas (A, B e E), Bacilos
grampositivos (C e D), Bacilo gram-negativo (F). Aumentos de 1000x.
29

Isolamento de bactérias Gram-negativas

Foi utilizado o meio MaConkey para o isolamento seletivo de bactérias gram-negativas


e isolamento de Enterobactérias e Pseudomonas sp.

Identificação de Pseudomonas sp por amplificação com oligonucleotídeos específicos

Para as reações de identificação de Pseudomonas sp, foi amplificado o sinal,


correspondendo ao DNA total extraído do corpo-de-prova AC45, referente à presença da
bactéria Pseudomonas sp na segunda coleta. Indicando a presença deste micro-organismo.

Presença / Ausência de bactéria oxidante de ferro

Após o período de incubação das bactérias oxidantes de ferro, lâminas foram preparadas
a partir do material contido nos tubos de cultivo. Esperava-se a observação de uma maior
turbidez no meio, o que indicaria a presença de maior desenvolvimento bacteriano no meio.

Os gêneros das ferrobactérias mais comuns que causam problemas quando presentes na
água são:

Sphaerotillus, Leptothris, Crenothrix e Gallionella . Os três primeiros gêneros


caracterizam-se pelo arranjo filamentoso de suas células, que são envolvidas por uma bainha,
daí receberem também a denominação de bactérias com bainha. As bactérias do gênero
Gallionella são unicelulares, retiformes ou encurvadas e segregam um filamento longo (tipo
de apêndice), em forma de fitas entrelaçadas, a partir do hidróxido férrico depositado na
célula. (VIDELA 2003).

Com posse das lâminas, utilizou-se a técnica de coloração de Gram, e posteriormente


observou-se ao microscópio indicando a presença de bactérias filamentosas Gram negativas
(FIGURA 8). Essa observação pode indicar a presença das bactérias oxidantes de ferro. No
entanto, após a adição da solução de ferrocianeto de potássio 1%, não houve aparecimento da
coloração azul intenso, o que comprovaria a presença desse grupo.
30

Figura 8: Bactéria gram-negativa com característica filamentosa. Aumento 1000x.

Presença / Ausência de bactérias redutoras de sulfato

Após o período de crescimento das bactérias em meio anaeróbico, a coloração


escurecida dos tubos comprovaria o crescimento das bactérias redutoras de sulfato nas
amostras. Os resultados apresentaram-se negativos para as coletas 1 e 2, não havendo a
mudança de cor em nenhum dos tubos.

Foi possível observar a amplificação, resultados positivos, para as bactérias


correspondentes aos gêneros Desulfobulbus sp, Desulfovibrio sp, Desulfosarcina sp,
Desulfococcus sp, Desulfonema sp e Desulfovibrio sp.

Isolamento de Fungos

Foram obtidos um total de 41 isolados fúngicos até a coleta 2

Na “Coleta 1” 20 (vinte) isolados fúngicos diferentes foram obtidos e identificados ao


nível de gênero por macro e micromorfologia, dentre eles, 15 Penicillium sp. , 2 Paecilomyces
sp., 1 Aspergillus sp., 1 Acremonium sp. e 1 Blastomyces sp. Na Figura 14 segue imagem de
alguns dos isolados fúngicos desta coleta.

Na “Coleta 2” foram isolados 21 (vinte e um) diferentes fungos e, a partir da macro e


micromorfologia, identificados 6 Aspegilllus sp., 5 Penicillium sp., 1 Acremonium sp., 2
Paecilomyces sp ., 1 Cladosporium sp., 1 Phoma sp. Na Figura 9 segue imagem de alguns dos
isolados fúngicos desta coleta.
31

Figura 9 – Micromorfologia dos fungos isolados dos CP’s coleta 1 – UHE-Tucuruí. Penicillium sp (A, B, D e E)
400x, Aspergillus sp (C) 400x, Paecilomyces sp (F) 400x.

Figura 10 - Micromorfologia dos fungos isolados dos CP’s coleta 2 – UHE-Tucuruí. Aspergillus sp (A, B e C)
400x, Penicillium sp (D) 400x, Cladosporium sp (E) 1000x, Acremonium sp (F) 400x, Paecilomyces sp (G)
400x, Phoma sp (H) 400x.

Foram realizadas análises das medidas de espectroscopia de impedância eletroquímica


realizadas em corpos de prova na UHE-Tucuruí. Também foram realizados estudos iniciais da
adesão de bactéria Pseudomona Aeruginosa sobre superfície de platina para compreensão do
32

fenômeno, correlacionando os dados eletroquímicos com as imagens obtidas por microscópio


ótico e pela contagem das bactérias por espectrometria de ultra violeta.

Preparação do eletrodo

Para os estudos, o metal servindo como substrato metálico foi um disco de platina
comercial de 2 mm de diâmetro e isolado com teflon. O eletrodo foi previamente polido com
lixa de carbeto de silício, alumina e pasta de diamante. Na sequência o eletrodo foi lavado
com água ultrapura. A esterilização foi feita com lâmpada ultravioleta (254 nm) por 15
minutos e pelo uso de etanol a 70 %.

A preparação do meio de cultivo e da bactéria Pseudomona aeruginosa tipo PA14 foi


crescida previamente no laboratório de microbiologia por 18 h. Para a adesão da bactéria no
eletrodo de platina e a formação do biofilme, a célula foi colhida por centrifugação e lavada
duas vezes com o meio de cultivo M9. A densidade das células foi ajustada para
aproximadamente 106 CFU/ml usando espectrofotômetro UV/Visível.

Adesão da bactéria e formação do biofilme

Uma célula eletroquímica convencional de três eletrodos com um volume aproximado


de 120 ml foi utilizada nos experimentos, chamado neste ensaio como reator para formação de
biofilme. Os três eletrodos utilizados foram: um eletrodo de disco platina (2 mm de diâmetro)
como sendo o eletrodo de trabalho, um eletrodo de platina chapa com ~ 2 cm 2 de área foi
utilizado como contra eletrodo, para permitir um bom fluxo de corrente, e um eletrodo de
referência de prata/cloreto de prata em solução saturada de cloreto de potássio. Para a adesão
da bactéria no eletrodo de trabalho, o reator foi completado com uma suspensão de 106
CFU/ml no meio M9.

Medidas de Espectroscopia de Impedância Eletroquímica (EIE)

Uma vez que todo o sistema de medidas estava esterilizado foi introduzido no reator o
meio M9 e imediatamente foi realizada uma medida de EIE, utilizando um
potenciostato/galvanostato PARSTAT 2273 (Princeton Applied Research, USA) com
amplitude do sinal de perturbação de 10 mV na faixa de frequência entre 100 mHz – 100 kHz.

Nas Figuras 11 a 13 estão apresentados os espectros de EIE obtidos em diferentes


tempos de medida. Na Figura 11 as medidas foram realizadas apenas no meio de cultivo, ou
33

seja, sem a presença de bactéria. Nas Figuras 12 e 13 as medidas de EIE foram realizadas em
presença de bactéria Pseudomona Aeruginosa.

Os resultados foram interpretados utilizando a análise de circuito equivalente e um


software livre da Scribner Associates, Inc., chamado de ZView®. Na Figura 14 está
apresentada uma fotografia da superfície da platina após 24 horas em contato com o meio M9
contendo bactéria Pseudomona Aeruginosa. Pode ser observado a presença de bactérias
aderidas na superfície metálica.

Figura 11. Espectros de impedância eletroquímica do sistema Pt | Pt | Ag/AgCl em meio de cultivo M9 em


função do tempo. Temperatura 37 ºC. Sem presença de bactéria.
34

Figura 12. Espectros de impedância eletroquímica do sistema Pt | Pt | Ag/AgCl em meio de cultivo M9 em


função do tempo (t=0 a t = 2 h) na presença de bactéria Pseudomona Aeruginosa. Temperatura 37 ºC.

Figura 13. Espectros de impedância eletroquímica do sistema Pt | Pt | Ag/AgCl em meio de cultivo M9 em


função do tempo (t=2 a t = 26 h) na presença de bactéria Pseudomona Aeruginosa. Temperatura 37 ºC
35

Figura 14. Fotografia da superfície da platina após ficar imersa por 24 horas numa solução contendo o meio de
cultivo M9 e bactérias Pseudomona Aeruginosa.

Figura 15. Fotografia da superfície da platina após ficar imersa por 24 horas numa solução contendo o meio de
cultivo M9 sem a presença de bactérias no meio.

Resultados para contagem de Unidades Formadoras de Colônias / m2 (UFC/m2)

Foram realizadas contagens de Unidades Formadoras de colônias por m2 (UFC/m2) de


micro-organismos envolvidos no processo de adesão e colonização de superfícies (Figura 16).
Os dados obtidos para as coletas 1 a 4 são apresentados no Gráfico abaixo e com estes dados
foi possível determinar qual a concentração de micro-organismos (aproximadamente 107
UFC/m2) será utilizada nos experimentos de controle da formação e desagregação de biofilme
através do sistema de cultivo e monitoramento da formação de biofilme.
36

Figura 16 - gráfico da contagem de unidades formadoras de colônia / m2, amostras coletadas das estações de
corrosão instaladas na UHE-Tucuruí.

Resultados para isolamento e identificação de Bactérias Aerobias/Anaerobias


facultativas

Foram isoladas e identificadas as bactérias aeróbias/anaeróbias facultativas (Figura 17)


dos corpos de prova (CP’s) coletados e estes micro-organismos estão envolvidos na adesão e
colonização de superfícies, importante etapa na formação de biofilmes.

Figura 17 - Bactérias Aeróbias/Anaeróbias Facultativas

Resultados para isolamento e identificação de Fungos

Foram isolados e identificados os Fungos (Figura 18) dos corpos de prova (CP’s)
coletados e estes micro-organismos estão envolvidos na adesão e colonização de superfícies,
importante etapa na formação de biofilmes.
37

Figura 18 - Fungos

Resultados para Detecção da Presença/Ausência de Bactérias Redutoras de Sulfato

Foi detectada a Presença de Bactérias Redutoras de Sulfato (BRS), micro-organismos


envolvidos na maturação de Biofilmes e alteração de superfícies colonizadas (Figura 19), nos
corpos de prova (CP’s) coletados.

Figura 19 - Bactérias Redutoras de Sulfato (BRS)

Resultados para Detecção da Presença/Ausência de Bactérias Oxidantes do Ferro

Foi detectada a Presença de Bactérias Oxidantes do Ferro, micro-organismos envolvidos


na maturação de Biofilmes e alteração de superfícies colonizadas (Figura 20), nos corpos de
prova (CP’s) coletados.
38

Figura 20 - Bactérias Oxidantes do Ferro


39

5 CONCLUSÃO
De acordo com os dados obtidos para as coletas de 1 a 4 foram isoladas e identificadas
as bactérias aeróbias/anaeróbias facultativas e os fungos que estão envolvidos na adesão e
colonização da superfície dos corpos de prova, importante etapa na adesão dos biofilmes.

Também foi detectada a presença de bactérias redutoras de sulfato e oxidantes de ferro


envolvidas na maturação dos biofilmes e alteração de superfícies colonizadas nos corpos de
prova.

O grau de recobrimento da superfície de platina pela Pseudomonas Aeruginosa foi


monitorado por microscopia ótica.

Foi observado após resultados de espectroscopia de impedância eletroquímica que a


superfície é totalmente recoberta com um biofilme após 24 h de contato entre a platina e o
meio de cultivo com a presença da bactéria Pseudomonas Aeruginosa.
40

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