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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ

PRÁTICA 3 – CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA PREPARATIVA: PIGMENTOS


DE FOLHAS VERDES

Relatório elaborado como requisito da disciplina


Cromatografia e Espectrometria (CQ040) da
Subárea de Química Orgânica do Departamento
de Química do Setor de Ciências Exatas para o
curso de graduação em Farmácia no período
2014.2 da Universidade Federal do Paraná.

Professora: María Eugenia Balbi

CURITIBA
2014
Sumário

1 INTRODUÇÃO................................................................................................1
1.1 CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA............................................1
1.2 PIGMENTOS.................................................................................................2
2 METODOLOGIA............................................................................................3
3 RESULTADOS................................................................................................5
4 DISCUSSÃO....................................................................................................7
5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..............................................................8
1. Introdução

Entre os métodos modernos de análise, a cromatografia ocupa um lugar de destaque devido à


facilidade com que efetua a separação, identificação e quantificação das espécies químicas, por si
mesma ou em conjunto com outras técnicas instrumentais de análise, como a espectrofotometria ou a
espectrometria de massas.
A cromatografia é um método físico-químico de separação dos componentes de uma mistura,
realizada através da distribuição desses componentes em duas fases, que estão em contato íntimo. Uma
das fases permanece estacionária, enquanto a outra se move através dela. Durante a passagem da fase
móvel sobre a fase estacionária, os componentes da mistura são distribuídos pelas duas fases de tal
forma que cada um deles é seletivamente retido pela fase estacionária, o que resulta em migrações
diferenciais desses componentes.
Há cinco principais procedimentos cromatográficos: a cromatografia em coluna, em papel, em
camada delgada, em fase gasosa e em fase líquida.
O foco deste relatório é a Cromatografia em Camada Delgada, mais especificamente, Preparativa. Por
isso, é essencial introduzir alguns conceitos e informações sobre ela.

1.1. Cromatografia em Camada Delgada

A cromatografia em camada delgada é uma técnica cromatográfica muito parecida com a realizada
em papel, porém que demanda menor tempo para sua execução, e que conduz a resultados muito mais
eficientes e perfeitos de separação.
Consiste em cobrir uma placa de vidro, alumínio ou plástico, com um adsorvente (Sílica gel,
Alumina, Terra Diatomácea Celulose, Poliamida, dentre outros) adequado e com uma granulometria
específica. A espessura da camada varia de 0,15 a 2,0mm e deve ser a mais uniforme possível. O
adsorvente é misturado ou não com um aglutinante em quantidades acima de 20% (No caso, sulfato de
cálcio calcinado (CaSO4.½H2O). Porém, poderia ser álcool polivinílico, amido ou algum outro),
suspenso em água ou em outro solvente adequado e depositado uniformemente sobre a placa
(Manualmente ou por intermédio de aplicadores apropriados). Ao secar, permanece aderido à placa
que, em geral, deve ser ativada por aquecimento em estufa. A revelação e identificação das substâncias
é feita da mesma maneira que na cromatografia em papel. Possui a vantagem, no entanto, de poder
utilizar reveladores mais agressivos, já que seu suporte é mais resistente que o papel.
O grande desenvolvimento dessa técnica é consequência natural das múltiplas vantagens que ela
oferece, tais como fácil compreensão e execução, separações em breve espaço de tempo, versatilidade,
grande repetitividade e baixo custo. A cromatografia em camada delgada é utilizada habitualmente em
análise qualitativa e quantitativa devido à sua grande sensibilidade e precisão. Pode ser utilizada,
também, em escala preparativa para amostras de até 250mg. Para quantidades maiores, a
cromatografia em coluna é preferível.
Em alguns aspectos, ela perde para a cromatografia gasosa e para a cromatografia líquida de alta
eficiência. Essas últimas, todavia, são muito menos acessíveis e mais dispendiosas e não podem ser
encontradas em qualquer laboratório ou indústria.
Um dos aspectos mais importantes da cromatografia é o de que em um determinado sistema
cromatográfico, o movimento relativo de um composto em relação à distância percorrida pelo solvente
é uma propriedade característica e reprodutível. Nas cromatografias em papel e em camada delgada,
esse movimento é expresso como um valor de "Rf" (Fator de Retardamento). Sendo esse definido
como, a razão entre a distância percorrida pela mancha e a distância percorrida pelo solvente.

Rf = distância percorrida pela mancha (da) / distância percorrida pelo solvente (ds)

Esses valores possuem reprodutibilidade em condições idênticas de trabalho (Temperatura, solvente


e umidade constantes) e servem para caracterizar e identificar as substâncias. A medida é feita desde a
linha (imaginária) de aplicação (ponto onde foi aplicada a amostra) até o centro
da mancha em estudo. O valor obtido é comparado aos tabelados na literatura especializada podendo
servir para identificar a substância em questão.
1.2 Pigmentos

É de suma importância conhecer um pouco sobre os pigmentos que serão visualizados nessa prática:

O Beta-caroteno constitui um pigmento natural e o mais abundante do grupo de carotenoides,


presentes nos alimentos. É encontrado, especialmente, em vegetais e frutas de cor amarelo-alaranjada
e em vegetais folhosos de cor verde-escura. Nestes, a cor natural do carotenoide é mascarada pela
clorofila, presente nos cloroplastos (MANGELS et al., 1993; RODRIGUEZ-AMAYA, 1997).
Enquanto que as Xantofilas são os carotenoides oxigenados (GOODWIN, 1965). Possuem um grupo
hidroxila (OH − ) ligado aos anéis ionona da cadeia. Abrangem as verdadeiras xantofilas, como a beta-
criptoxantina (3-hidroxi-β-caroteno), encontrada em frutas e no milho amarelo; a zeaxantina (3,3’-
diidroxi-β-caroteno), também encontrada no milho amarelo e a xantofila propriamente dita, também
chamada de luteína (3,3’-diidroxi-α-caroteno), que se encontra nas folhas verdes, nas flores, nos
frutos, no corpo lúteo e na gema do ovo. Transmitem a cor amarela pela absorção do respectivo
comprimento de onda.
Há também os que possuem grupos carbonila ligados aos anéis ionona (Cetonas carotênicas); os que
apresentam oxigênio entre carbonos, formando ciclos (Epóxidos carotênicos); os que apresentam
oxigênio entre carbonos (Éteres carotênicos); os que possuem grupos carboxila ligados na extremidade
da cadeia carbônica, pois não contam com anéis iononas (Ácidos carotênicos) e os que apresentam o
grupo carboxil entre carbonos (Ésteres carotênicos).
Já as Feofitinas (A e B) são o produto resultante da ação da enzima Mg-dequelatase sobre as
clorofilas cujo processo supõe-se que seja extremamente rápido, considerando as propriedades
fotodinâmicas da molécula e a catálise enzimática. Apresentam uma cor verde tendendo ao marrom,
deduzindo-se que a remoção do átomo de Mg (Magnésio) é fundamental para a mudança de cor
(Langmeier et al., 1993). Podem ser vistos como de coloração cinza.
E as Clorofilas são moléculas formadas por complexos derivados da porfirina, tendo como átomo
central o Mg (Magnésio). Enquadram-se como os pigmentos naturais mais abundantes presentes nas
plantas e ocorrem nos cloroplastos das folhas e em outros tecidos vegetais. Estudos em uma grande
variedade de plantas caracterizaram que os pigmentos clorofilianos são os mesmos. As diferenças
aparentes na cor do vegetal são devidas à presença e distribuição variável de outros pigmentos
associados, como os carotenóides, os quais sempre acompanham as clorofilas (VON ELBE, 2000).
A clorofila a (Apresenta coloração azul-esverdeada), ou Chl a, é o pigmento utilizado para realizar a
fotoquímica (o primeiro estágio do processo fotossintético), enquanto que os demais pigmentos
auxiliam na absorção de luz e na transferência da energia radiante para os centros de reação, sendo
assim chamados de pigmentos acessórios. E a clorofila b (Apresenta coloração verde), ou Chl b, está
presente em vegetais superiores, algas verdes e em algumas bactérias (TAIZ & ZIEGER, 2004).
2. Metodologia

Primeiramente, em um momento anterior ao experimento, foi preparada a fase estacionária, já que a


sílica (Silanol ou Siloxila) ao ser posta em posição vertical, escorreria para fora da placa,
inviabilizando a análise. Para tal, foi preparada uma suspensão 2:1 com sulfato de cálcio (gesso) com
granulometria entre 70 e 230 mesh (63 – 200 µm), isto é, Sílica Gel G60.
Dispondo de placas de vidro limpas e após agitar bem a suspensão por cerca de 1 (um) minuto, foi
utilizado um espalhador para distribuir uma camada de Sílica Gel G60, possuindo especificados 0,3
mm de espessura para as placas de vidro de 7,5 x 2,5 cm e 0,5 mm para as de 20 x 5 cm, sobre a
superfície. Depois, foi mantida em repouso por uns 15 minutos.
Logo após, deve ser levada à estufa (Forno) a 110ºC por 2 horas, assim perdendo a água livre, já que a
água ligada necessita de uma temperatura bem mais elevada para tal, sendo removida entre 450ºC
(Início do processo) e 1100ºC (Fim do processo). Dessa maneira, as cromatoplacas estão ativas e
prontas para uso.
Aqui se inicia o experimento. Se a cromatoplaca de 20 x 5 cm não estiver sobre a bancada, deve ser
prontamente levada até ela. Primeiramente, o excesso lateral deve ser retirado. Então, a partir do lado
em que a borda (Superior ou inferior) da placa contenha a menor distância para atingir a região com
sílica, a linha de aplicação deve ser traçada 2,5 cm acima dessa base.
É importante atentar onde terá início a região com sílica, para prevenir que, ao colocar uma quantidade
adequada de fase móvel na cubeta, o eluente não alcance a fase estacionária, não permitindo que
ocorra a subida por capilaridade, a corrida cromatográfica e as observações futuras provenientes disso.
Cerca de 0,5 cm abaixo da borda superior, foi estabelecida a frente de progressão. Dessa forma, a área
disponível para a separação dos componentes da amostra, os pigmentos, é melhor explorada.
A amostra utilizada trata-se de um extrato da folha de beterraba, que possui os pigmentos abordados
anteriormente em sua constituição. E o solvente empregado para a extração foi o diclorometano.
Em posse de um capilar, de preferência, de maior calibre, aplique sucessivas vezes na região da linha
de aplicação, formando uma faixa de amostra concentrada. Ao atingir a coloração verde-escura, está
pronta para ir à cuba cromatográfica, onde permanecerá por, aproximadamente, 30 minutos. Tempo
necessário para que a fase móvel, ciclohexano: acetato de etila, 2:1 (v/v), percorra a fase estacionária,
chegando à frente de progressão, promovendo uma boa separação dos componentes do extrato.
Durante este intervalo em que a fase móvel percorre o adsorvente na placa de 20 x 5 cm, é possível
realizar um teste da concentração da amostra em uma placa de 7,5 x 2,5 cm.
Para tal, deve-se estabelecer a frente de progressão 0,5 cm abaixo da borda superior, e a linha de
aplicação, 5 (Cinco) cm abaixo da frente. Dois pontos de aplicação equidistantes entre si e
equidistantes entre as paredes da placa deverão ser realizadas sobre a linha de aplicação, sendo
usualmente, uma aplicação no da esquerda e três, no da direita. Após a inserção na câmara saturada, e
passado o tempo da migração cromatográfica, retira-se a cromatoplaca e verifica-se se a separação foi
considerável. Caso não tenha sido, para o próximo procedimento, serão empregados dois pontos de
aplicação equidistantes entre si e equidistantes entre as paredes da placa sobre a linha de aplicação,
sendo duas aplicações no da esquerda e seis, no da direita.
Depois daqueles 30 minutos da corrida cromatográfica da cromatoplaca de 20 x 5 cm, deve-se retirar
a placa da cuba e pô-la para secar em ambiente arejado, dando preferência à capela de exaustão.
Logo após, registre as distâncias percorridas pela amostra, para efetuar as migrações relativas, que
servirão para uma futura análise.
A última etapa consiste em um comparativo entre a separação de uma banda específica
(Correspondente a um pigmento) pelo extrato e dessa mesma banda, em uma amostra isolada.
Para isso, é necessário remover da superfície da placa um determinado componente, raspando-o com
uma espátula, e passando-o a um béquer de 50 mL.
Feito isso, deve-se adicionar até 5 mL de uma mistura de ciclohexano: acetato de etila, 2:1 (v/v), que é
razoavelmente polar, interagindo, e, assim, removendo qualquer um que seja o pigmento da sílica,
deixando em contato por alguns minutos sob constante agitação. Após isso, com um papel de filtro
acomodado em um funil, que repousa sobre um béquer, deve-se filtrar a suspensão e levar o béquer
para aquecer, até que o solvente tenha evaporado, permanecendo somente o componente.
Para as duas bandas que percorreram mais no adsorvente, que foram as que correspondem aos
pigmentos Beta-caroteno (Amarelo-alaranjado) seguido do pigmento Feofitina A e B (Cinza), o
diclorometano é suficiente. Para as demais (Clorofila a [Azul-esverdeado] e b [Verde] e as Xantofilas
[Amarelo]), é necessário um solvente mais polar. No caso, acetato de etila.
Deve-se adicionar 2 mL do solvente adequado e misturar. Uma cromatoplaca de 7,5 x 2,5 cm deve
estar preparada conforme os procedimentos descritos anteriormente.
Uma alíquota, então, deve ser retirada da amostra isolada com um capilar, e, sendo o ponto de
aplicação da direita, passa por três aplicações consecutivas, enquanto que o ponto de aplicação da
esquerda trata-se do extrato.
Feita a migração cromatográfica e posta para secar a placa, as migrações relativas (R f ) podem ser
obtidas, e, assim, proceder com a comparação entre a distância percorrida pelo pigmento na amostra
isolada e no extrato.
3. Resultados

da
Sendo R f = ds
, os respectivos valores foram elucidados para cada componente na Cromatografia em

Camada Delgada Preparativa (Placa de 20 x 5 cm) e na Cromatografia em Camada Delgada final


(Placa de 7,5 x 2,5 cm).

CCDP: 4 – Azul-esverdeado
ds = 11,50 cm 4,00 cm
R f = 11,50 cm = 0,348 x 100 = 34,8
1 – Amarelo-Esverdeado
5 – Azul-Esverdeado
0,30 cm
R f = 11,50 cm = 0,026 x 100 = 2,6 5,20 cm
R f = 11,50 cm = 0,452 x 100 = 45,2
2 - Amarelo
6 – Cinza
1,00 cm
Rf = = 0,087 x 100 = 8,7 7,30 cm
11,50 cm Rf = = 0,635 x 100 = 63,5
11,50 cm
3 - Verde
7 – Amarelo-alaranjado
2,50 cm
Rf = = 0,217 x 100 = 21,7 10,50 cm
11,50 cm R f = 11,50 cm = 0,913 x 100 = 91,3

CCD: 3 – Azul-esverdeado
ds = 5,00 cm 3,10 cm
Rf = = 0,62 x 100 = 62
5,00 cm
1 – Amarelo
4 – Cinza
1,30 cm
R f = 5,00 cm = 0,26 x 100 = 26 4,40 cm
R f = 5,00 cm = 0,88 x 100 = 88
2 - Verde
5 – Amarelo-alaranjado
2,20 cm
Rf = = 0,44 x 100 = 44 5,00 cm
5,00 cm R f = 5,00 cm = 1,00 x 100 = 100

Amostra isolada – Beta-caroteno (Amarelo-alaranjado):


5,00 cm
R f = 5,00 cm = 1,00 x 100 = 100
Tabela 1. Resultados obtidos na separação cromatográfica em CCD dos pigmentos extraídos em
diclorometano da folha de beterraba.
Cor da banda Pigmento da (cm) ds (cm) R f (x100)
Amarelo Xantofila 1,30 5,00 26
Verde Clorofila b 2,20 5,00 44
Azul-esverdeado Clorofila a 3,10 5,00 62
Cinza Feofitinas A e B 4,40 5,00 88
Amarelo-alaranjado Beta-caroteno 5,00 5,00 100

Tabela 2. Resultados obtidos na separação cromatográfica em CCDP dos pigmentos extraídos em


diclorometano da folha de beterraba.
Cor da banda Pigmento da (cm) ds (cm) R f (x100)
Amarelo-Esverdeado Xantofila e Clorofila b 0,30 11,50 2,6
Amarelo Xantofila 1,00 11,50 8,7
Verde Clorofila b 2,50 11,50 21,7
Azul-esverdeado Clorofila a 4,00 11,50 34,8
Azul-Esverdeado Clorofila a 5,20 11,50 45,2
Cinza Feofitinas A e B 7,30 11,50 63,5
Amarelo-alaranjado Beta-caroteno 10,50 11,50 91,3
4. Discussão

Os procedimentos foram seguidos, por isso na Cromatografia em Camada Delgada Preparativa, as


bandas apresentaram-se homogêneas.
Contudo, na etapa em que tinha de agitar o que fora raspado em 5 mL de ciclohexano: acetato de etila,
2:1 (v/v), agitou-se bem, no entanto fez-se uso do bastão de vidro para melhor misturar a sílica com o
componente adsorvido. Quando a suspensão, oriunda da remoção do pigmento da sílica gel, passou
pelo papel filtro acomodado no funil que repousava sobre o béquer de 50 mL, foi evidenciado que
pequeno fora o volume que atravessara o filtro. Deveríamos ter posto mais solvente direto no funil,
assim forçando a passagem.
Houve problemas decorrentes do ínfimo volume em etapas posteriores. Por exemplo, ao adicionar o
diclorometano, além de não ser possível inserir muito, evaporava rapidamente, tendo, então, de repetir
o procedimento.
Sobre a escolha do solvente, entre diclorometano e acetato de etila, após a etapa de aquecimento,
deve-se levar em conta a relação entre a polaridade do pigmento e a do solvente, possibilitando que
haja interação entre eles. Para o Beta-caroteno e as Feofitinas A e B, que são bem pouco polares, o
diclorometano, pouco polar, basta. Todavia, para as Clorofilas a e b e as Xantofilas, mais polares, é
necessário um solvente mais polar, o acetato de etila.
A etapa de aquecimento faz-se necessária, pois aquele solvente, se presente, poderia acarretar na
difusão radial da mancha e em sua deformação.
A respeito da distância percorrida entre a linha de aplicação e o centro da mancha, foi igual para a
amostra isolada de Beta-caroteno e a sua respectiva, no extrato, sugerindo que a concentração utilizada
foi correta, tanto na aplicação, como depois com a adição de diclorometano à amostra isolada seca.
Pôde-se notar nessa prática, que o comprimento da placa cromatográfica resulta em uma diferença
considerável na separação dos componentes, tanto que o Beta-caroteno que conseguiu acompanhar a
frente de progressão na CCD, não conseguiu na CCDP.
5. Referências Bibliográficas

1) COLLINS, C. H.; BRAGA, G. L.; BONATO, P. S. (Coord.). Fundamentos de Cromatografia.


Campinas, UNICAMP, 2006.
2) RAMOS, L. P. Material de apoio às aulas práticas das disciplinas de Cromatografia
(CQ019). Curitiba, UFPR, 2014.

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