Sistemas baseados em quitosano

modificado para a entrega de DNA

minicircular às células cancerígenas do
colo do útero

Ana Sofia Mota Martins Serra, nº 35634

Orientadora: Mestre Ana Margarida Almeida

Coorientadora: Doutora Ângela Sousa
Covilhã, 23 de Maio de 2017
Trabalho apresentado no âmbito da unidade curricular de Projeto em Biotecnologia.
 O conteúdo do presente trabalho é da exclusiva responsabilidade do autor (a):

_______________________________________________________________________

(Ana Sofia Mota Martins Serra)

RESUMO

O cancro do colo do útero afeta milhões de mulheres em todo o mundo, sendo o vírus do
Papiloma Humano (HPV) o principal fator de risco. Nos últimos anos, muitas investigações têm
sido realizadas no sentido de alcançar um tratamento eficaz, embora se tenham revelado, até
ao momento, infrutíferas. Na verdade, ainda não existem tratamentos devidamente
direcionados para este tipo de cancro. Sabe-se que o p53 funciona como um supressor de
tumor e que a sua sobreexpressão tem uma ação direta nas oncoproteínas do HPV, revelando
assim capacidade de inibir o desenvolvimento e progressão do cancro do colo do útero.

No presente projeto é proposto o desenvolvimento de um sistema para a entrega de mcDNA,

codificante para a proteína supressora de tumor p53, direcionada a células do cancro do colo
do útero A funcionalização do quitosano será realizada com os ligandos que reconheçam e
tenham a capacidade de se ligar a receptores específicos e exclusivos de células
cancerígenas. São equacionados o ácido fólico e um aptâmero de DNA , utilizados
individualmente e em simultâneo. O polímero de quitosano será ainda acoplado à
polietilenoimina (PEI) com vista a obtenção de melhores resultados.

O vetor será construído, produzido e purificado, com o objetivo de ser utilizado

posteriormente em estudos in vitro. Os métodos utilizados nos estudos in vitro englobam o
Western Blot, o ensaio MTT e a citometria de fluxo. Pretende-se, com estes métodos,
comparar o efeito das nanopartículas nas células cancerígenas e nas células saudáveis,
determinar a viabilidade das células após transfecção com cada grupo de nanopartículas,
aferir a indução da apoptose das células infetadas pelo HPV e verificar a expressão da
proteína p53 nos diferentes grupos de transfecção, para que se possa determinar a estratégia
que se revela mais eficaz na entrega do vector às células cancerígenas.

Palavras-chave: cancro do colo do útero, DNA mini-circular, quitosano, ácido fólico, aptâmero
ÍNDICE
ESTADO DA ARTE

O cancro do colo do útero é o quarto cancro mais comum na população feminina em todo o
mundo [1]. Apesar das inúmeras pesquisas em desenvolvimento e dos avanços médicos na
prevenção, diagnóstico e tratamento desta doença, a mortalidade permanece elevada em
países em desenvolvimento [2]. Geralmente, a taxa de sobrevivência é de 90% quando a
doença é diagnosticada em estágios iniciais, baixando para cerca de 15% quando
diagnosticada tardiamente [3].

O vírus do Papiloma Humano (HPV) é um dos principais fatores de risco para o

desenvolvimento do cancro do colo do útero. O genoma viral do HPV é constituído por uma
dupla cadeia de DNA circular, contendo 6000 a 8000 pares de bases, o que constitui 8 genes
no total. Estes genes são classificados como precoces (E) ou tardios (L), de acordo com seus
padrões de expressão. Existem seis genes E (E1, E2, E4, E5, E6 e E7) e dois genes L (L1 e L2)
[4]. Existem mais de 200 genótipos do HPV que podem ser classificados de alto e baixo risco,
em função das doenças que causam e do seu potencial oncogénico [5]. Nos tipos de HPV de
alto risco incluem-se os tipos 16 e 18, identificados em mais de 90% dos casos cancro do colo
do útero [6].

Após a infecção pelo vírus do Papiloma Humano, as oncoproteínas E6 e E7 são expressas

consistentemente. A proteína p53 desempenha um papel importante no controlo do ciclo
celular, na reparação do DNA e na indução da apoptose [7]. As proteínas E6 e E7 formam
complexos com a p53 e retinoblastoma (Rb), respetivamente, inibindo a atividade destas
proteínas na regulação do ciclo celular [8].

Embora já existam vacinas preventivas direcionadas ao cancro do colo do útero, contendo

partículas virais da cápsula do HPV16 e HPV18, estas apenas reduzem a incidência de novas
infecções por HPV, uma vez que são ineficazes nos pacientes já infectados. O cancro do colo
do útero em fase tardia é normalmente removido por cirurgia e tratado com agentes de
quimioterapia, imunoterapia e radioterapia. No entanto, estas abordagens terapêuticas não
têm alcançado resultados satisfatórios, apesar do rápido progresso na compreensão da
biologia dos HPVs e das células do cancro do colo do útero. Há ainda a considerar os efeitos
colaterais da maioria das terapias utilizadas e o facto de não existirem atualmente
tratamentos devidamente direcionados para este tipo de cancro [9].

Atualmente, estão disponíveis diferentes classes de vetores para promover a entrega e

expressão de transgenes terapêuticos em células eucarióticas. Entre estes, o DNA plasmídico
(pDNA) continua a ser o escolhido pela relativa segurança do pDNA em comparação com
vetores baseados em vírus, porque existe um risco quase nulo de integração de material
genético no genoma do hospedeiro [10].

Os biofármacos baseados em ácidos nucléicos têm demonstrado algum potencial para o

tratamento de doenças debilitantes, ou potencialmente fatais, que atualmente permanecem
incuráveis. Esta área promissora da investigação prevê a criação de vacinas de DNA de última
geração, células pluripotentes ou terapias baseadas em genes. Para atingir esse objetivo, o
DNA mini-circular (mcDNA) tem vindo a evidenciar-se e constitui, do ponto de vista atual,
uma ferramenta eficiente, segura e sem efeitos citotóxicos, para desenvolver
biomedicamentos inovadores. Trata-se de um vetor desprovido de sequências de origem
bacteriana e de tamanho reduzido que apresenta uma expressão de genes persistente, pelo
que evidencia uma eficácia terapêutica melhorada em comparação com vetores não virais
convencionais [10].

No entanto, a degradação do DNA terapêutico pelas nucleases séricas tem sido um obstáculo
para a entrega funcional às células-alvo. Nesse sentido, será necessário desenvolver um
transportador de entrega de genes, capaz de proteger o DNA até atingir o seu alvo, sem
qualquer toxicidade ou respostas imunes [11]. O quitosano, um polissacarídeo catiónico
natural, aparece como um bom candidato, tendo em conta a sua eficiência de transfecção,
combinada com o reduzido nível de citotoxicidade. O quitosano rapidamente forma
complexos, microesferas ou nanopartículas com ácidos nucleicos, após a interação
eletrostática, e possui excelentes propriedades físico-químicas que parecem favoráveis à
entrega de ácidos nucleicos. A relação carga / carga entre o quitosano e o DNA é um fator
preponderante para o sucesso da ligação eletrostática do DNA ao quitosano. A relação entre
nitrogénio e fosfato (N / P), isto é, a relação entre o nitrogénio carregado positivamente do
grupo amino da molécula de quitosano para fosfatos negativamente carregados em ácidos
nucleicos, influencia potencialmente a eficiência do polímero de quitosano para condensar e
proteger o DNA [12].

Ainda assim, o peso molecular e o grau de acetilação são propriedades do quitosano que
afectam a sua solubilidade e hidrofobicidade aquosas, alterando assim a sua eficiência como
veículo de entrega de genes. Um dos fatores limitantes à sua ação é o pH, uma vez que o seu
desempenho é potenciado a pH neutro ou ligeiramente alcalino. Este polímero é solúvel em
soluções aquosas ácidas e insolúveis em soluções básicas ou neutras, sendo que a solubilidade
do quitosano está diretamente relacionada com a protonação dos seus grupos amina [13].

O quitosano é o mais proeminente dos transportadores não-virais estudados devido às suas

propriedades de biodegradabilidade, biocompatibilidade e baixa toxicidade. Acresce o facto
de poder ser modificado para aumentar a eficiência de transfecção e direcionar a entrega de
genes. [11] Tendo em consideração que a eficiência de transfecção das nanopartículas de
DNA-quitosano ainda é muito baixa em comparação com os vetores virais, vários ligandos têm
sido propostos para melhorar a eficiência de transfecção. A integração de ligandos em
sistemas à base de quitosano tem evidenciado boa capacidade de direcionamento às células
cancerígenas [14].

Neste sentido, será interessante contruir um vector de mcDNA que expresse o gene da
proteína p53 e desenvolver nanopartículas modificadas de quitosano para o direcionamento
do cancro do colo do útero.
OBJETIVOS

O cancro é um problema de saúde pública que representa uma das principais causas de morte
a nível mundial. Neste sentido, qualquer progresso científico que permita melhorar o
diagnóstico e tratamento do cancro constitui uma prioridade global. A procura incansável do
Homem por uma melhor qualidade e uma maior esperança média de vida, tem despoletado a
necessidade de encontrar alternativas para o seu tratamento.

O presente projeto tem como objetivo desenvolver um sistema para a entrega de mcDNA,
codificante para a proteína supressora de tumor p53, direcionada a células do cancro do colo
do útero. Este direcionamento pode ser alcançado pela funcionalização do quitosano com
determinados ligandos que reconheçam e tenham a capacidade de se ligar a receptores
específicos e exclusivos de células cancerígenas. Serão equacionados o ácido fólico e um
aptâmero como ligandos, utilizados individualmente e em simultâneo. O polímero de
quitosano será ainda acoplado à polietilenoimina (PEI) com vista a obtenção de melhores
resultados.

Esta abordagem pretende avaliar posteriormente, em estudos in vitro, qual a estratégia que
se revela mais eficaz na entrega do vector às células cancerígenas.
PLANO E MÉTODOS

O presente trabalho propõe o estudo de uma nova terapia que consiste no desenvolvimento
de um sistema para a entrega de mcDNA, codificante para a proteína supressora de tumor
p53, direcionada a células do cancro do colo do útero. Este sistema é baseado em
nanopartículas de quitosano, cuja funcionalização será realizada com os ligandos ácido fólico
e aptâmero, utilizados individualmente e em simultâneo. O polímero será ainda acoplado à
polietilenoimina (PEI).

Os vectores de entrega poliméricos geralmente envolvem o uso de polímeros catiónicos, uma

vez que estes são capazes de complexar o DNA carregado negativamente por intermédio de
interações electrostáticas entre as cargas positivas presentes no polímero e os grupos fosfato
presentes na estrutura das moléculas de DNA (2). O PEI apresenta um enorme potencial
catiónico, que se traduz em elevadas eficiências de transfecção. Contudo, a sua elevada
toxicidade faz com que seja necessário desenvolver estratégias de modo a amenizar esta
característica (3).

Uma das estratégias adotadas é a utilização do polímero natural quitosano devido à sua baixa
imunogenicidade, toxicidade mínima, biocompatibilidade e biodegradabilidade. A natureza
catiónica do quitosano proporciona uma forte interação eletrostática com o DNA carregado
negativamente, protegendo-o da degradação da nuclease nos fluidos biológicos (4). Sabe-se
que o ácido fólico é um ligando atraente devido à sobreexpressão de receptores de folato no
número de células cancerígenas humanas. Acresce o facto de haver evidência de que as
nanopartículas de quitosano, compreendendo ácido fólico, mostram uma absorção
intracelular melhorada do vetor.

O aptâmero de DNA foi escolhido devido ao seu uso como um ligando de direcionamento de
cancro, com capacidade de inibir a proliferação de células cancerígenas. Além disso, os
aptâmeros são ligandos eficazes, na medida em que combinam fragmentos de biopolímeros de
alta afinidade (6).

Pretende-se implementar um processo biotecnológico para construir, produzir e purificar um

vetor de DNA mini-circular (mcDNA), a ser utilizado posteriormente em estudos in vitro com
linhas celulares humanas infetadas com o HPV 16 e 18. As vantagens do mcDNA residem no
facto de não possuir uma origem de replicação bacteriana, sequências codificantes de
resistência a antibióticos e conter um gene terapêutico controlado por um promotor
eucariótico (16). O seu tamanho relativamente reduzido propicia uma maior difusão quando
administrado em linhas celulares, aumentando assim a eficácia terapêutica. (14)

No processo de purificação é proposto utilizar a cromatografia de troca aniónica, em que é

usada uma coluna monolítica de troca aniónica da isoforma superenrolada do mcDNA. Esta
metodologia tem demonstrado eficácia, uma vez que os suportes monolíticos proporcionam
acessibilidade de superfície e capacidades de ligação muito elevadas, permitindo separações
rápidas em larga escala, sem que a resolução seja afetada.

Relativamente aos estudos in vitro irei avaliar o potencial das nanopartículas desenvolvidas,
no direcionamento da entrega de DNA mini-circular a células cancerígenas do cancro do colo
do útero.

Após a cultura e transfecção das linhas celulares, as metodologias utilizadas serão o Western
Blot, o ensaio MTT e citometria de fluxo para avaliar a apoptose celular.

O método Western Blot irá ser usado para extrair e quantificar as proteínas de cada grupo de
transfecção. Para separar as proteínas de uma amostra homogénea, tendo em conta o seu
peso molecular, a técnica utilizada é a eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE).

Para determinar a viabilidade celular, após transfecção com cada grupo de nanopartículas,
será utilizado o ensaio MTT. Após redução, o MTT forma cristais de formazano, de cor azul,
que ao serem dissolvidos absorvem na região do visível, podendo desta forma ser
quantificados por espectrofotometria. A redução do MTT é feita através de desidrogenases
celulares, podendo-se avaliar a capacidade redutora da célula.

A morte das células por apoptose será avaliada utilizando a técnica de citometria de fluxo,
pela medição da intensidade de fluorescência após as células cancerígenas serem tratadas
com os reagentes anexina V e iodeto de propídio (PI).
TAREFAS

1.Construção/Produção dos vetores de expressão

1.1 Construção do DNA mini-circular (mcDNA)

O mcDNA é construído através do plasmídeo parental (PP), no qual se irá incluir a sequência
nucleotídica do p53. Deve-se proceder, em seguida, à transformação por choque térmico de
células competentes de E. coli ZYCY10P3S2T [15].

Posteriormente, será necessário realizar uma reação de PCR com primers para o gene de
interesse, tendo como objetivo confirmar a transformação das colónias recombinantes. Após a
seleção das colónias positivas, deve promover-se o seu crescimento para posterior extração e
sequenciação do vetor, a fim de confirmar o sucesso da construção do mesmo.

1.2 Produção do DNA mini-circular

A molécula PP-p53 será amplificada, por fermentação de E. coli ZYCY10P3S2T transformadas,

em meio líquido Terrific Broth (TB), contendo triptona (20 g/litro), extrato de levedura (24
g/litro), glicerol (4 mL/litro), 0,017M de KH2PO4, 0,072M de K2HPO4 a pH 7,0, com agitação
constante a 250 rpm e condições variáveis de temperatura (37ºC e 42ºC) [16].

A produção de mcDNA será induzida pela adição de uma solução estéril de L-arabinose
(0,01%). Após esta indução, o plasmídeo parental (PP) é convertido em mcDNA e mini
plasmídeo (mP), pela ação da integrase ΦC31, que reconhece sequências específicas. Estes
dois vetores são distintos pois contêm sequências genéticas diferentes, nomeadamente os
genes terapêuticos de interesse (mcDNA) e as sequências de origem bacteriana (mP).
Concomitantemente, a expressão endonuclease da I-Scel será também induzida com a adição
de L-arabinose, degradando os resíduos de mP e PP, através do reconhecimento de locais
específicos [10].

No entanto, alguns contaminantes do mP e PP não são totalmente removidos, pelo que será
necessário proceder-se a um processo de purificação para isolar o mcDNA e, torná-lo, dessa
forma, adequado para fins terapêuticos.

2.Purificação do DNA mini-circular (mcDNA)

Tendo em conta a diversidade de espécies presentes na estirpe de E.coli ZYCY10P3S2T e a
semelhança entre o mcDNA, PP, mP e outras impurezas do hospedeiro, nomeadamente, RNA e
DNA genómico, apenas os métodos cromatográficos revelam-se adequados e eficazes para
obter essa biomolécula [16].
Neste projeto é proposto utilizar a cromatografia de troca aniónica, em que a ordem de
eluição depende da carga, do tamanho e da conformação das biomoléculas. Será usada uma
coluna monolítica de troca aniónica para a purificação da isoforma superenrolada do mcDNA,
uma vez que os suportes monolíticos proporcionam acessibilidade de superfície e capacidades
de ligação muito elevadas, permitindo separações rápidas em larga escala, sem que a
resolução seja afetada [16].

Esta tarefa irá permitir isolar o vetor de DNA mini-circular com o grau de pureza
recomendável para posteriormente ser utilizado nos estudos in vitro.

3.Caracterização
Tendo em conta o objectivo deste projeto, foram constituídos os seguintes grupos de
nanopartículas: 1) PEI-C-FA; 2) PEI-C -APT; 3) PEI-C-FA-APT; 4) amostra controlo.

A utilização de copolímeros é uma das estratégias exploradas para obter novos e melhores
sistemas de entrega de material genético, visto que a combinação de polímeros permite
juntar as características e vantagens das diferentes estruturas químicas numa só molécula
[17].

A combinação de quitosano-ácido fólico-DNA é preparada por adição da solução de DNA ao

complexo de ácido fólico-quitosano em Tris-HCl 10 mM a pH 7,2 com agitação ocasional para
assegurar a formação de uma solução homogénea (4). Para determinar a eficácia de
transfecção de DNA e o efeito da complexação ácido fólico-quitosano na morfologia do DNA,
as nanopartículas devem ter duas propriedades: uma carga superficial apropriada ou potencial
Zeta e um tamanho apropriado. Uma carga de superfície positiva permite uma interação
eletrostática entre as membranas celulares negativamente carregadas e as nanopartículas
carregadas positivamente. Um potencial Zeta positivo leva a uma melhor interação na
superfície da membrana celular e permite uma absorção mais eficiente das nanopartículas
pelas células (5).

Para ligar os aptâmeros de DNA ao polímero de quitosano, estes são amplificados com primers
reversos marcados com NH2 e com fosfato, sendo posteriormente tratados com exonuclease,
adicionados gota a gota ao polímero de quitosano e incubados durante 6 horas sob agitação
(7). É de referir que a complexação do ácido fólico e do aptâmero ao polímero de quitosano
acima é efectuada de forma sequencial.

Para determinar a eficiência de encapsulação (EE) dos diferentes polímeros, a concentração

de pDNA livre no sobrenadante resultante da centrifugação de partículas é quantificada.. É
sabido que níveis elevados de proteção e condensação do DNA podem reduzir a atividade de
transfeção das nanopartículas de base polimérica, já que as interações electroestáticas são
tão fortes que impedem a correta entrega do plasmídeo (8).
Os polímeros propostos no presente trabalho serão realizados em várias rácios e
caracterizados quanto ao tamanho, forma, potencial zeta, capacidade de proteção do DNA e
citotoxicidade, uma vez que existe uma elevada dependência entre estes e a atividade de
transfecção dos complexos. O objetivo é verificar se existe efeito sinérgico entre os polímeros
e determinar o rácio que apresentou as melhores características para posterior utilização nos
estudos in vitro.

É esperado que concentrações mais elevadas de copolímero/DNA estejam associadas a

complexos menores e mais compactos, apresentando simultaneamente maior densidade de
carga superficial catiónica. As nanopartículas com tamanhos reduzidos e com carga superficial
positiva serão capazes de interagir com as células alvo, entregar o DNA e, consequentemente,
promover a expressão do transgene (8). Relativamente à citotoxicidade, espera-se que rácios
N/P mais elevados correspondam a uma maior quantidade de polímero, o que causa maior
toxicidade, provavelmente devido a uma maior interação com as membranas celulares, já que
as interações electroestáticas são mais fortes (9).

Para determinar a eficiência de encapsulação (EE) dos diferentes polímeros, a concentração

de pDNA livre no sobrenadante resultante da centrifugação de partículas é quantificada.. É
sabido que níveis elevados de proteção e condensação do DNA podem reduzir a atividade de
transfeção das nanopartículas de base polimérica, já que as interações electroestáticas são
tão fortes que impedem a correta entrega do plasmídeo (8).
4. Estudos in vitro

Os estudos in vitro têm como objectivo avaliar o potencial das nanopartículas desenvolvidas,
no direcionamento da entrega de mini-circular a células cancerígenas do cancro do colo do
útero.

Neste projeto serão usadas duas linhas celulares humanas: SiHa e HeLa, sendo que SiHa é uma
linha celular humana de carcinoma cervical infetado com o HPV 16, enquanto a linha celular
HeLa se encontra infetada com o HPV 18.

4.1 Cultura de células e transfecção

As linhas celulares SiHa e HeLa serão cultivadas em meio DMEM, suplementado com soro
bovino fetal 10% (v / v), a 37ºC numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO2. Estas
linhas serão transfectadas com o vetor de expressão e partículas baseadas em quitosano (C),
PEI, ácido fólico (FA) e aptâmero (APT). Serão constituídos quatro grupos de transfecção, a
saber: (1) Células transfectadas com mcDNA, PEI, C e FA; (2) Células transfectadas com
mcDNA, PEI, C e APT; (3) Células transfectadas com mcDNA, PEI, C, FA e APT; (4) Células não
transfectadas (controlo).

A eficiência de transfecção é avaliada por espectrofluorimetria, com um espectrofluorômetro

de leitor de placa. Todas as experiências de transfecção são realizadas no meio DMEM-F12/
FBS a 10% para simular condições fisiológicas. A proteína fluorescente verde (GFP) é utilizada
como gene repórter, uma vez que cobre todo o espectro visível. Quando inserida por
transfecção nas células, a sua distribuição intracelular pode ser analisada. As células são
transfectadas com uma concentração de mcDNA (1 µg/cm2) e a intensidade da fluorescência
da GFP é normalmente quantificada 48 horas após a transfecção.

4.2 Análise por Western Blot

Na análise por Western Blot, é necessário realizar, em primeiro lugar, a extração e a

quantificação de proteínas das células de cada grupo de transfecção. Em seguida, dever-se-á
proceder-se à separação das proteínas, tendo em conta o seu peso molecular. Para separar as
proteínas de uma amostra homogénea, a técnica mais utilizada é a eletroforese em gel de
SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) [18].

As proteínas serão transferidas para uma membrana e incubadas com anticorpos específicos
para a proteína de interesse e com um anticorpo secundário, conjugado com a Peroxidase
Horseradish (HRP), que serão detetados posteriormente pela presença de reagentes
quimiluminescentes no meio. As bandas da membrana serão visualizadas em câmaras de
imagem com um sistema de dispositivo de carga acoplada (CCD), num ambiente escuro. A
absorvância das bandas positivas é quantificada por densitometria ou por espectrofotometria,
de modo a quantificar a quantidade de proteínas de interesse presente [18].

Com este procedimento, pretende-se verificar se a expressão da p53 nos diferentes grupos de
transfecção a fim de determinar as melhores estratégias de nanopartículas, na medida em
que a maior expressão da proteína indicia mais eficiência de transfecção. Em principio, a
amostra de controla terá menor expressão da proteína em questão.

4.3 Ensaios de viabilidade celular e apoptose

Este ensaio tem como objetivo determinar a viabilidade celular após transfecção com cada
grupo de nanopartículas, incluindo o de controlo, que corresponde à linha celular saudável.
Pretende-se comparar o efeito das nanopartículas nas células cancerígenas e nas células
saudáveis para identificar as que não são tóxicas em células saudáveis.

Neste ensaio, a atividade metabólica das células é quantificada através da redução do MTT
(brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5 difeniltetrazólio) por desidrogenases associadas ao
NADPH e ao NADH, resultando na produção de cristais de formazano, intensamente coloridos,
no interior das células [20].

Será de suma importância aferir a indução da apoptose das células infetadas pelo HPV, dado
que o facto de haver menor viabilidade celular não é condição sine qua non de morte
programada. Esta poderá ter a ver apenas com a formulação de nanopartículas ser tóxicas
para as células. A apoptose mediada por p53 em células transfectadas será avaliada através
da técnica de citometria de fluxo, pela medição da intensidade de fluorescência após as
células cancerígenas serem tratadas com os reagentes anexina V e iodeto de propídio (PI). As
células marcadas com anexina V encontram-se em apoptose e o PI marca os ácidos nucleicos,
significando que a membrana plasmática não se encontra viável. As células não transfectadas
são também usadas como controlo [21].

As células transfectadas deverão demonstrar um nível significativo de apoptose em relação ao

grupo de controlo, uma vez que a sobreexpressão do p53 mantém a expressão regular dos
genes supressores de tumor nas células epiteliais, inibindo o desenvolvimento e progressão
das células infetadas pelo HPV, ou induzindo a morte das células cancerígenas.
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