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INSTITUTO FEDERAL DE EDUCAÇÃO, CIÊNCIA E TECNOLOGIA DE MATO GROSSO

MÉTODOS ÓTICOS DE ANÁLISE


CAMPUS CUIABÁ – BELA VISTA
CURSO – ENGENHARIA DE ALIMENTOS
DISCIPLINA: ANÁLISE INSTRUMENTAL

MÉTODOS Os métodos óticos ou


fotométricos, como diz o
ESPECTROFOTOMÉTRICOS nome, usa a luz
(foto), para medir
algo (métrico),
geralmente a
concentração de uma
substância que tem
capacidade de interagir
Profª Dra. Elaine de Arruda Oliveira Coringa com a luz.

MÉTODOS ÓTICOS DE ANÁLISE Espectro eletromagnético

•Espectrofotometria = técnicas baseadas na


interação da matéria com a radiação
eletromagnética, na forma de emissão e absorção.

• tipos: espectrofotometria no ultravioleta


(UV) e visível (VIS), infravermelho (IR).

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MÉTODOS ÓTICOS DE ANÁLISE
•Radiação eletromagnética = luz, forma de
energia que tem o comportamento de uma onda e
de uma partícula de energia:

• difração, refração = propriedade


ondulatória

• absorção/emissão = propriedade
corpuscular

MÉTODOS ÓTICOS DE ANÁLISE MÉTODOS ÓTICOS DE ANÁLISE


•Espectrofotometria UV,Vis e de fluorescência •Espectrofotometria de Infravermelho (IR)
medem a radiação absorvida.
•Uso em alimentos:
•Uso em alimentos: • grupos funcionais moleculares absorvem luz
• análise de componentes do alimento que em  do IR  identificação positiva (proteínas,
absorvem na região UV ou Vis (corantes, ácidos graxos, umidade)
nutrientes inorgânicos, vitaminas);
• análise de moléculas orgânicas por • Análise quantitativa (FTIR = infrared transform
fluorescência (detecção de contaminantes como Fourier)
bactérias e alguns resíduos de pesticidas).

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ESPECTROFOTOMETRIA UV / VIS

Espectrofotometria de
Absorção no UV/Vis
SÃO MÉTODOS ÓTICOS QUANTITATIVOS
BASEADOS NA ABSORÇÃO DE LUZ
VISÍVEL (380 A 760 nm) E
ULTRAVIOLETA (200 a 380 nm) POR UMA
AMOSTRA MATERIAL

EMPREGO EM ANÁLISE DE Interação da luz com a matéria


ALIMENTOS

• determinação de aditivos conservantes


(nitrito, nitrato, sorbatos)

• determinação de corantes artificiais

• análise de metais, fluoreto, fósforo

• determinação da cafeína, carotenóides,


vitaminas (A, B, C).

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 Quando a amostra é estimulada pela aplicação de uma
O processo de absorção da luz: fonte de radiação eletromagnética externa, muitos
processos são possíveis de ocorrer:
1. A radiação pode ser espalhada ou refletida.
2. Uma parte da radiação incidente pode ser absorvida e
promover algumas das espécies do analito para um
estado excitado, como pode ser visto na Figura 24-5b
3. Na espectroscopia de absorção, medimos a
quantidade de luz absorvida em função do comprimento
de onda.
 Cada espécie molecular é capaz de absorver suas próprias
frequências características da radiação eletromagnética, e
esse processo resulta em um decréscimo da
intensidade da radiação eletromagnética incidente.
Dessa forma, a absorção da radiação atenua o feixe de
luz incidente.

PARÂMETROS DE ANÁLISE: Qual a importância do


comprimento de onda?
• amostras líquidas e límpidas • Cada substância química presente na amostra
interage com a luz de determinados comprimentos
• coloridas: absorção visível de onda  parâmetro de análise instrumental
• incolores: absorção no ultravioleta
•Absorção ou emissão de luz  ocorre em maior
• comprimento de onda de absorção: intensidade no comprimento de onda da substância
em análise  precisão e exatidão do método
• Visível  380 – 760 nm
• Usado no ESPECTROFOTÔMETRO e COLORÍMETRO
• Ultravioleta  200 – 380 nm

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Comprimento de onda x elemento Teste de chama – emissão de luz de
químico comprimento de onda característico:
Elemento Comprimento de onda (em nm)
Na 589
Li 671
Ca 616
Sr 707
Ba 624
Cor Intervalo de comprimentos de onda (nm)
vermelha 780 – 622
alaranjada 622 – 597
amarela 597 – 577
verde 577 – 492
azul 492 – 455
violeta 455 – 380

ESPECTROFOTOMETRIA

MÉTODOS ÓTICOS DE ABSORÇÃO DE LUZ FONTE DE LUZ

ABSORÇÃO X CONCENTRAÇÃO

LEI DE BEER-LAMBERT
Quando a luz é absorvida pela substância (AMOSTRA) a
intensidade do feixe de luz diminui. Essa diminuição é DETECTOR DE LUZ
proporcional à Concentração da solução.
AMOSTRA
ABSORVENTE

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LEI DE BEER-LAMBERT LEI DE BEER-LAMBERT
SOLUÇÃO  A Figura mostra a atenuação de um feixe
Luz Luz
incidente
AMOSTRA
emergente
paralelo de radiação monocromática quando
C (mol/L) este passa por uma solução absorvente de
I0 I1
espessura de l cm e de concentração igual a c
mols por litro.
 Em virtude das interações entre os fótons e as
partículas absorventes, a potência radiante do
feixe decresce de Io a I1.
 I1 = luz transmitida = TRANSMITÂNCIA
 Inverso da Transmitância = ABSORBÂNCIA
(luz absorvida pela amostra)

Lei de Beer-Lambert LEI DE BEER-LAMBERT

• TRANSMITÂNCIA = qtde. de luz que passou


pela amostra (%T) – escala porcentual (0-100%)
C C
• ABSORBÂNCIA = qtde. de luz absorvida pela A A
amostra (A) – escala logarítmica (0 – 2) T T
A = - log (T/100) LEI DE BEER: padrões de Fe+2 para análise espectrofotométrica, com
concentrações variando de 1 mg/L (esquerda) a 10 mg/L (direita). A
absorbância da solução é evidenciada pela intensidade da cor, que é
proporcional à concentração do ferro em solução.

Proporcionalidade Cor x Concentração

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Importância da Transmitância: como Por que uma Solução Vermelha é Vermelha?
percebemos a cor de uma solução  Porque transmite a radiação vermelha:

 Em geral, a radiação empregada em uma análise


colorimétrica deve ser a cor complementar da
solução do analito

Limitações da Lei de Beer:


Desvios da Lei de Beer:
Desvios químicos:

 A lei de Beer descreve o comportamento da


absorção somente para soluções diluídas (até 0,01
mol/L);

 desvios da lei de Beer aparecem quando a espécie


absorvente sofre associação, dissociação ou reação
com o solvente para gerar produtos que absorvem
de forma diferente do analito.

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Limitações da Lei de Beer:
INSTRUMENTAÇÃO
Desvios instrumentais:

 Radiação policromática: A lei de Beer se aplica


estritamente somente quando as medidas forem
feitas com a radiação monocromática.
 Correção: instrumentos com maior precisão na
seleção do comprimento de onda.

Espectrofotômetro de Absorção
LEITURA INSTRUMENTAL UV/Vis:
• ESPECTROFOTÔMETRO / COLORÍMETRO: Muitos instrumentos espectroscópicos para uso nas regiões
do UV/visível e IV apresentam cinco componentes:
Aparelho usado para medir absorção de luz por uma
solução na região do Visível e Ultravioleta; 1. uma fonte estável de energia radiante;
2. um seletor de comprimento de onda que isola uma região
ESCALAS DE LEITURA: limitada do espectro para a medida;
3. um ou mais recipientes para a amostra;
•% Transmitância (T) - 0 a 100% 4. um detector de radiação, o qual converte a energia
radiante para um sinal elétrico mensurável;
•Absorbância (A) - 0 a 2 (adimensional) 5. uma unidade de processamento e de leitura do sinal,
geralmente constituída por um circuito eletrônico e, nos
instrumentos modernos, por um computador.

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Detector

Mono-
cromador

cubeta lâmpada

Espectrofotômetro de Absorção
UV/Vis:

MODO DE OPERAÇÃO:

“A luz vinda de uma fonte contínua passa por um


monocromador que seleciona uma estreita faixa
de comprimento de onda, passa pela amostra
contida na cubeta de comprimento b e a
intensidade de luz transmitida é medida num
detector.”

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1. Fonte de radiação – lâmpadas:
Fontes são lâmpadas que emitem feixes de luz na
região do espectro visível, ultravioleta e
infravermelho.

Tipos:

Fonte de radiação UV: lâmpada de H2 – D2 – Xe2.


Emitem radiação na faixa de 180 a 350 nm.

Fonte de radiação VIS: lâmpada de W. Emitem


radiação na faixa de 350 a 2.500 nm.

1. Fonte de radiação – lâmpadas:

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2. Seletor de comprimento de
onda – monocromador:

Monocromador: Selecionam bandas mais


estreitas de comprimentos onda através da
dispersão da luz por um elemento de dispersão da
luz:

prisma ótico
rede (grade) de difração.

2. Seletor de comprimento de
onda – monocromador:

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3. Recipiente para amostras:
• CUBETA DE ABSORÇÃO:
•Recipientes para conter a amostra, os quais são geralmente
denominados células ou cubetas, devem ter janelas que
sejam transparentes na região espectral de interesse

•Tipos:
De vidro  para operar nos comprimentos de
onda de 340 a 1.000 nm (visível);
De quartzo  para operar em comprimentos de
onda mais baixos (até 185 nm, UV)

b = caminho ótico

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4. Detector:

 Para a obtenção da informação


espectroscópica, a potência radiante
transmitida, fluorescente ou emitida deve
ser detectada de alguma forma e
convertida em uma quantidade
mensurável.

 Um detector é um dispositivo que indica


a existência de algum fenômeno físico e o
transforma em um sinal elétrico (leitura).

CALIBRAÇÃO

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CALIBRAÇÃO Operação do instrumento:
• ABSORÇÃO COM O “BRANCO”  1ª CALIBRAÇÃO
- Com água destilada:

leitura em A = zero
leitura em %T = 100

• CURVA DE CALIBRAÇÃO da substância 2ª CALIBRAÇÃO


- Com no mínimo 5 soluções padrão da substância
-Construção da curva de calibração no EXCEL o obtenção da
equação da reta
-Uso da equação da reta para determinação da Ca (x)

INTERFERENTES NA ANÁLISE
ESPECTROFOTOMÉTRICA
Operação do instrumento:

Quanto ao método:
• Proporcionalidade entre COR e CONCENTRAÇÃO
(visível)
• Estabilidade da cor
• Limpidez da solução
• Diluição adequada (amostra = padrão)  fator de
diluição (f = Vsolvente/Vsolução)

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INTERFERENTES NA ANÁLISE DETERMINAÇÃO DA
ESPECTROFOTOMÉTRICA CONCENTRAÇÃO DA AMOSTRA
Quanto ao instrumento:
1. Comparação com uma solução padrão,
• Vida útil da fonte de luz usando a equação (Fator de Calibração):
• Comprimento de onda ajustado
• Calibração correta (1º - solução “branco” e 2º -
Ca = Aa . Cp
“padrão”) Ap
• Curva de calibração pré-preparada para cada tipo - Ca = concentração da amostra (?)
de análise - Aa = absorbância da amostra
• Cubetas impecáveis - Cp = concentração da solução padrão
- Ap = absorbância da solução padrão

2. Pela Curva de Calibração: mínimo 5


Exemplo – Fator de calibração:
soluções padrão  uso da EQUAÇÃO DA
RETA obtida pelo EXCEL (y = ax+b)
 Determine a concentração de uma substância
na amostra (Aamostra = 0,90) através do uso de
uma solução padrão, cujos dados foram:

Apadrão = 0,73
Cpadrão = 0,00046 mol/L

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Exemplo – Curva de calibração:
Espectrofotometria de
Absorção no IR

Absorção no IR: Absorção no IR:


 A porção do espectro percebida pelo olho humano (região
visível) está compreendida entre comprimentos de onda de
380 nm e 780 nm e, acima desse limite, até cerca de
50.000 nm (faixa entre as regiões do visível e das
microondas), a radiação é chamada infravermelha (IV).

 É dividida em infravermelho próximo (1-25mm),


infravermelho médio (25-50mm) e infravermelho afastado
(> 25mm).

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Absorção no IR:
Absorção no IR:
 O objetivo da espectroscopia de absorção no IV é a
determinação dos grupos funcionais de um dado  A absorção no IR varia com o comprimento de
material. Cada grupo absorve em frequência onda selecionado, e é geralmente apresentada
característica de radiação na região do IV.
na forma de um ESPECTRO DE ABSORÇÃO.

 Assim, um gráfico de intensidade de radiação versus


frequência, o espectrograma de IV, permite caracterizar
os grupos funcionais de um padrão ou de um material
desconhecido.

 A posição de absorção de uma banda no espectro pode


ser expressa em número de onda (cm-1) = 1/

Absorção no IR x Absorção UV/Vis Absorção no IR em alimentos:


 Absorção no IR resulta de transições energéticas  O Infravermelho próximo (FT-NIR) e o médio (FT-IR) aliado
vibracionais enquanto que a absorção no UV/Vis à utilização da análise multivariada, foram usados para
são transições eletrônicas; determinar a autenticidade de alimentos e mostraram ser
úteis para detectar problemas de adulterações em puré de
framboesa, fiambre, azeite, óleos vegetais, presença de
 IR analisa gases e substâncias sólidas, além de gordura de porco em mistura de gorduras animais, outras
soluções; UV/Vis só soluções. gorduras vegetais em manteiga de cacau, café, mel, sumo
de laranja, leite, carne, e outros produtos.
 IR não usa cubetas, mas sim células amostradoras
de líquidos, de comprimento ótico muito pequeno  Com um Espectrômetro de Infravermelho Próximo,
(mm), fabricadas com sais inorgânicos cristalinos; conhecido como NIR (Near Infrared Reflectance), é possível
saber em apenas seis segundos, o nível de proteína, fibra,
gordura, matéria seca e matéria mineral, elementos que
conferem qualidade aos grãos como soja, milho e trigo.

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Espectrofotômetros IR: Espectrofotômetros IR:
 Os componentes dos instrumentos IV diferem
significativamente daqueles dos instrumentos
UV/visível.

 As fontes de IV são constituídas por sólidos


aquecidos e os detectores IV respondem ao
calor em vez de fótons.

 Os componentes ópticos dos instrumentos IV


são construídos de cristais polidos de sais, tais
como o cloreto de sódio e o brometo de
potássio.

Componentes do espectrofotômetro IR:


Esquema do espectrofotômetro IR:
 a) Fonte de radiação: a radiação IV é produzida
por uma fonte aquecida eletricamente, que emitem
radiação na região do IR: Fonte de Nernst (400–
20.000 nm); Fio de níquel-crômio (750–20.000
nm); Globar (1.200–40.000 nm)

 b) Área de amostras: composta por uma


variedade de acessórios para a medida de gases,
líquidos e sólidos.

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Esquema do espectrofotômetro IR:
 c) Monocromador: dispersa a luz proveniente da
fonte por um elemento de dispersão, que pode ser
um prisma ou uma rede de difração;

 d) Detector: utiliza o efeito térmico da radiação


para quantificá-la. Um detector térmico apresenta
uma superfície pequena enegrecida que absorve
radiação infravermelha, aumentando a sua
temperatura. O aumento de temperatura é
convertido em um sinal elétrico que é amplificado e
medido. Os dois tipos comuns de detectores não
seletivos são o termopar e o bolômetro.

Aplicações na Espectrofotometria IR
 A espectroscopia no infravermelho tem sido usada nas
análises de açúcares em alimentos nas últimas décadas.
Esta técnica só não é mais utilizada na análise de alimentos
e seus produtos pelas seguintes razões:
a. Os espectros no infravermelho são complexos. Cada grupo
funcional contribui para o espectro e isto resulta em
sobreposição das bandas de absorção dificultando a
interpretação.

b. A água, que é a principal constituinte de produtos


biológicos, tem forte absorção no infravermelho.

c. A radiação no infravermelho penetra fracamente nas


amostras e, dessa maneira, somente a superfície da
amostra pode ser estudada.

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Aplicações na Espectrofotometria IR Aplicações na Espectrofotometria IR
 a técnica de espectroscopia no infravermelho médio vem
sendo cada vez mais empregada para a análise qualitativa e
 Caracterização físico-química de queijo prato por
quantitativa de alimentos; espectroscopia no infravermelho
 Análise de leite, carne, óleos, gorduras, manteiga,
margarina, leite condensado e frutas, avaliando tanto
aspectos quantitativos quanto qualitativos, como a
certificação da qualidade.
 O emprego das técnicas multivariadas para discriminar
ingredientes alimentares por meio de dados de
espectroscopia por reflexão difusa no infravermelho com
transformada de Fourier (DRIFTS).
 Evita-se o emprego de reagentes agressivos ou a geração
de resíduos danosos ao ambiente, pois requer pouco ou
nenhum tratamento das amostras.

Aplicações na Espectrofotometria IR Aplicações na Espectrofotometria IR


 Análise exploratória de adoçantes de mesa via  Espectroscopia no infravermelho médio e análise
espectroscopia no infravermelho (FTIR) sensorial aplicada à detecção de adulteração de
café torrado por adição de cascas de café

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Material de referência
 Apostila Instrumental cap. 4
 Fundamentos de Química Analítica – SKOOG
 Cap. 24: Introdução aos Métodos Espectroquímicos
Guia de Estudos 03
 Cap. 25: Instrumentos para a Espectrometria Óptica
 Análise Instrumental – SKOOG: Espectrofotometrias de
 Cap. 6: Introdução aos métodos espectrométricos
 Cap. 7: Componentes dos instrumentos óticos
Absorção UV/Vis/IR
 Cap. 13: Espectrometria de Absorção molecular UV/vis
 Cap. 16: Introdução à espectrometria no IV
 Análise Instrumental – CIENTIFUEGOS E VAITSMAN:
 Cap. 1: Introdução ao UV e Vis.
Entrega: 08/10/12
 Cap. 2: Infravermelho

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