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PROTOCOLOS DE COLETAS, ANÁLISES,

IDENTIFICAÇÃO E ARMAZENAMENTO DE
FUNGOS AMBIENTAIS

Prof. Dr. Jorge Luiz Fortuna


Docente Adjunto com Dedicação Exclusiva da área de Microbiologia do curso de
Ciências Biológicas do Campus X da Universidade do Estado da Bahia (UNEB).
Responsável pelos Laboratórios de Microbiologia e de Biologia dos Fungos.
E-mail: jfortuna@uneb.br

Fungus Extremus
Teixeira de Freitas-BA
2020
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SUMÁRIO

1. CLASSIFICAÇÃO DOS FUNGOS, p. 4


INTRODUÇÃO, p. 4
NOMENCLATURA, p. 4
CLASSIFICAÇÃO, p. 5
2. COLETA DE ESPÉCIMES EM CAMPO, p. 7
INTRODUÇÃO, p. 7
EQUIPAMENTOS PARA A COLETA, p. 7
3. MACROFUNGOS, p. 9
APRESENTAÇÃO, p. 9
4. PRINCIPAIS ESTRUTURAS DOS MACROFUNGOS, p. 10
ESTRUTURAS DOS MACROFUNGOS, p. 10
5. COLETA E IDENTIFICAÇÃO DE MACROFUNGOS, p. 11
PROCEDIMENTOS EM CAMPO, p. 11
MATERIAIS E EQUIPAMENTOS NECESSÁRIOS PARA ANÁLISES
LABORATORIAIS, p. 11
PROCEDIMENTOS NO LABORATÓRIO, p. 12
6. MICROFUNGOS, p. 14
APRESENTAÇÃO, p. 14
FUNGOS INGOLDIANOS, p. 14
FUNGOS AERO-AQUÁTICOS, p. 15
FUNGOS AQUÁTICO-TERRESTRES, p. 15
FUNGOS AQUÁTICO-FACULTATIVOS, p. 15
7. PRINCIPAIS ESTRUTURAS DOS MICROFUNGOS, p. 16
APRESENTAÇÃO, p. 16
TIPOS DE COLORAÇÃO MICROSCÓPICA, p. 16
ESTRUTURAS DO MICÉLIO, p. 16
TIPOS DE CONIDIÓFOROS, p. 17
CLASSIFICAÇÃO DO CONIDIÓFORO QUANTO AO CRESCIMENTO, p. 17
CLASSIFICAÇÃO DO CONIDIÓFORO QUANTO AO EIXO, p. 17
CLASSIFICAÇÃO DA CÉLULA CONIDIOGÊNICA, p. 17
CLASSIFICAÇÃO QUANTO A ONTOGENIA DOS CONÍDIOS, p. 18
CLASSIFICAÇÃO QUANTO A PROLIFERAÇÃO DOS CONÍDIOS, p. 18
CLASSIFICAÇÃO QUANTO A ABERTURA DA CÉLULA CONIDIOGÊNICA, p. 18

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CLASSIFICAÇÃO QUANTO A LIBERAÇÃO (SENESCÊNCIA) DOS CONÍDIOS, p. 19


CLASSIFICAÇÃO QUANTO A SEQUÊNCIA DE PRODUÇÃO DOS CONÍDIOS, p. 19
8. COLETA E IDENTIFICAÇÃO DE MICROFUNGOS, p. 20
PROCEDIMENTOS EM CAMPO, p. 20
MATERIAIS E EQUIPAMENTOS NECESSÁRIOS PARA ANÁLISES
LABORATORIAIS, p. 20
PROCEDIMENTOS NO LABORATÓRIO, p. 21
9. FUNGOS ENDOFÍTICOS E EPIFÍTICOS, p. 23
APRESENTAÇÃO, p. 23
PROCEDIMENTOS EM CAMPO, p. 23
MATERIAIS E EQUIPAMENTOS NECESSÁRIOS PARA ANÁLISES
LABORATORIAIS, p. 23
PROCEDIMENTOS NO LABORATÓRIO, p. 24
10. MICROCULTIVO, p. 26
MONTAGEM DA CÂMARA ÚMIDA, p. 26
PREPARAÇÃO DO MEIO DE CULTURA, p. 26
MICROCULTIVO E PREPARAÇÃO DAS LÂMINAS, p. 26
11. ARMAZENAMENTO DE ESPÉCIMES, p. 27
SECAGEM EM ESTUFA, p. 27
CAIXA COM ESPÉCIME SECA, p. 27
MÉTODO CASTELLANI, p. 27
TUBO COM ÓLEO MINERAL ESTERILIZADO, p. 27
12. MEIOS DE CULTURA, p. 28
ÁGAR BATATA DEXTROSE (ABD), p. 28
ÁGAR CENOURA MILHO (ACM), p. 28
13. RESINAS, CORANTES E REAGENTES, p. 29
RESINA PVLG (ÁLCOOL POLIVINÍLICO + ÁCIDO LÁTICO + GLICERINA), p. 29
RESINA PVL (ÁLCOOL POLIVINÍLICO + ÁCIDO LÁTICO + FENOL), p. 29
AZUL DE ALGODÃO, p. 30
LACTOFENOL DE AMANN, p. 30
AZUL DE METILENO, p. 31
VERMELHO CONGO A 1%, p. 31
KOH (HIDRÓXIDO DE POTÁSSIO) A 5%, p. 31
FLOXINA B 1%, p. 31
REAGENTE DE MELZER, p. 32
14. REFERÊNCIAS USADAS E CONSULTADAS, p. 33

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1. CLASSIFICAÇÃO DOS FUNGOS


INTRODUÇÃO
Provavelmente os fungos atuais se originaram a partir de seres unicelulares denominados de
nucleariidas (nucleariids), que são organismos ameboides heterotróficos com pseudópodos
filamentosos. Estes seres fazem parte do clado Opisthokonta (Opisthokonts), onde são agrupados
os organismos eucariontes que formam um clado estritamente monofilético que inclui os fungos
e os animais.
A partir do clado Opisthokonta são originados dois outros clados irmãos: o Holomycota, onde se
encontram os fungos; e o Holozoa, onde se encontram os animais.
Existem três tipos básicos de agrupar e classificar os seres vivos:
a) Monofilético: formado por grupos naturais que incluem o ancestral comum mais recente
do grupo e todos os descendentes desse ancestral.
b) Polifilético: formado por grupos que não incluem o ancestral comum de todos os
indivíduos, agrupando táxons semelhantes que não foram herdados por um antepassado
comum.
c) Parafilético: formado por grupos que inclui o ancestral comum mais recente do grupo,
mas não todos os descendentes desse ancestral.
Nas últimas décadas do Séc. XX houve a divisão em subgrupos à medida que o conhecimento
sobre a Biologia dos Fungos foi se aprofundando. Dividiu-se o reino em dois subgrupos não
taxonômicos: Eumycetes (fungos sensu stricto), que apresentam uma organização tipicamente
miceliana e uma parede celular contendo quitina; e Pseudomycetes (pseudofungos), que
apresentam parede celular contendo celulose em vez de quitina.
A partir do avanço da Biologia Molecular, a classificação atual dos fungos tende a ser
monofilética, podendo ser dividida em três grupos principais: Zoospóricos, que são fungos que
apresentam flagelos em alguma fase da vida; Zigospóricos, que são fungos que formam
zigosporângios; e os Dicarióticos, que também são conhecidos como fungos superiores, cuja
principal característica é possuir hifas dicarióticas que se apresentam com dois núcleos
independentes.

NOMENCLATURA
As regras de nomenclatura para os fungos segue o Código Internacional de Nomenclatura. Com
algumas exceções a nomenclatura dos táxons hierárquicos para os fungos segue o seguinte
padrão:
REINO Fungi
SUB-REINO ...myceta
FILO ...mycota
SUB-FILO ...mycotina
CLASSE ...mycetes
ORDEM ...ales
FAMÍLIA ...mycetidae

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CLASSIFICAÇÃO
Até o início do séc. XXI o reino Fungi era dividido basicamente em nove filos (Chytridiomycota;
Neocallimastigomycota; Cryptomycota; Entomophthoromycota Blastocladiomycota;
Zygomycota; Glomeromycota; Ascomycota e Basidiomycota), além de um grupo artificial (não
taxonômico) de fungos que só se conhece a forma da sua reprodução assexuada. Este grupo é
denominado de anamórfico ou mitospórico ou imperfeito ou conidial, podendo também ser
conhecido como deuteromiceto (Deuteromycota). Este grupo não possui valor taxonômico,
sendo seus membros relacionados aos filos Ascomycota e Basidiomycota assim que se conhece
como ocorre sua reprodução sexuada (HIBBETT et al, 2007; MORAES et al, 2009;
BLACKWELL, 2011; JONES et al, 2011; HUMBER, 2012).
Desses nove filos somente são macrofungos os Eumycetes ou Dicarióticos que pertence aos filos
Ascomycota e Basidiomycota, que são capazes de produzir estruturas facilmente visíveis.
Marques (2012) determinou que os Pseudomycetes também podem formar esporóforos
macroscópicos, apesar de pequenos, porém, os mesmos pertencem ao filo Myxomycota, que são
estudados na área de Micologia, mas na realidade são bactérias.
Apesar de esta classificação, descrita anteriormente, ser atual, três trabalhos recentes
(TEDERSOO et al, 2018; WIJAYAWARDENE et al, 2018; NARANJO-ORTIZ;
GABALDÓN, 2019) reorganizaram os grupos taxonômicos do reino Fungi a partir de estudos
utilizando ferramentas de Biologia Molecular, agrupando-os de forma monofilética.
De acordo com Tedersoo et al (2018) o reino Fungi pode ser subdividido em nove sub-reinos e
18 filos descritos abaixo:
GRUPO SUB-REINOS FILOS
Aphelidiomyceta Aphelidiomycota
Rozellomyceta Rozellomycota
Monoblepharomycota
Zoospórico Chytridiomyceta Crytridiomycota
Neocallimastigomycota
Blastocladiomyceta Blastocladiomycota
Olpidiomyceta Olpidiomycota
GRUPO SUB-REINOS FILOS
Basidiobolomyceta Basidiobolomycota
Entomophthoromycota
Zoopagomyceta Kickxellomycota
Zoopagomycota
Zigospórico
Mortierellomycota
Calcarisporiellomycota
Mucoromyceta
Glomeromycota
Mucoromycota
GRUPO SUB-REINO FILOS
Entorrhizomycota
Dicariótico Dikarya Ascomycota
Basidiomycota
Ainda segundo Tedersoo et al (2018), o filo Ascomycota subdivide-se em três sub-filos
(Taphrinomycotina; Saccharomycotina e Pezizomycotina), mesmo número de sub-filos do filo
Basidiomycota (Pucciniomycotina; Ustilaginomycotina e Agaricomycotina).

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Apesar desta atual classificação, em um recente trabalho de Naranjo-Ortiz e Gabaldón (2019),


estes descreveram uma nova forma de classificar o reino Fungi.
O novo formato proposto por Naranjo-Ortiz e Gabaldón (2019) apresenta um super-filo
(Opisthoporidia), que é formado por um clado composto por três principais linhagens:
Aphelidea; Rozellidea e Microsporidia, que também é conhecido como clado-ARM.
Além deste super-filo a recente classificação proposta conta com oito filos: Chytridiomycota;
Neocallimastigomycota; Blastocladiomycota; Zoopagomycota; Glomeromycota; Mucoromycota;
Ascomycota e Basidiomycota.
GRUPO FILOS SUB-FILOS CLASSES
Crytridiomycetes
Crytridiomycota Crytridiomycotina Monoblepharidomycetes
Hyaloraphidiomycetes
Zoospórico
Neocallimastigomycota Neocallimastigomycotina Neocallimastigomycetes
Blastocladiomycetes
Blastocladiomycota Blastocladiomycotina
Physodermatomyces
GRUPO FILOS SUB-FILOS CLASSES
Entomophthoromycetes
Entomophthoromycotina Basidiobolomycetes
Neozygitomycetes
Kickxellomycetes
Asellariomycetes
Zoopagomycota
Barbatosporomycetes
Kickxellomycotina
Dimargaritomycetes
Harpellomycetes
Zigospórico
Ramicandelaberomycetes
Zoopagomycotina Zoopagomycetes
Glomeromycetes
Glomeromycota Glomeromycotina Archaeosporomycetes
Paraglomeromycetes
Mucoromycetes
Mucoromycota Mucoromycotina Endogonomycetes
Umbelopsidomycetes
O sub-reino Dikarya passa a ter apenas dois filos: o Ascomycota, que continua apresentando três
sub-filos (Taphrinomycotina; Saccharomycotina e Pezizomycotina); e o filo Basidiomycota, que
também continua com três sub-filos (Pucciniomycotina; Ustilaginomycotina e Agaricomycotina).
FILOS SUB-FILOS CLASSES
Archaeorhizomycetes; Neolectomycetes; Pneumocystidomycetes; Schizosaccharomycetes;
Taphrinomycotina Taphrinomycetes
Saccharomycotina Saccharomycetes
Ascomycota Arthoniomycetes; Candelariomycetes; Collemopsidiomycetes; Coniocybomycetes;
Dothideomycetes; Eurotiomycetes; Geoglossomycetes; Laboulbeniomycetes;
Pezizomycotina Lecanoromycetes; Leotiomycetes; Lichinomycetes; Orbiliomycetes; Pezizomycetes;
Sordariomycetes; Xylobotryomycetes; Xylonomycetes
Agaricostilbomycetes; Atractiellomycetes; Classiculomycetes; Cryptomycocolacomycetes;
Pucciniomycotina Cystobasidiomycetes; Microbotryomycetes; Mixiomycetes; Pucciniomycetes;
Spiculogloeomycetes; Tritirachiomycetes
Basidiomycota Ustilaginomycotina Exobasidiomycetes; Malasseziomycetes; Monilielliomycetes; Ustilaginomycetes
Agaricomycetes; Dacrymycetes; Geminibasidiomycetes; Tremellomycetes;
Agaricomycotina Wallemiomycetes

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2. COLETA DE ESPÉCIMES EM CAMPO


INTRODUÇÃO
Para a realização de coletas em campo é necessário seguir alguns procedimentos para chegar aos
resultados esperados de um estudo e/ou pesquisa da área micológica.
Inicialmente é preciso escolher um local, obter informações sobre a localização e características
do ambiente, ou seja, ter conhecimento da área onde se pretende realizar algum tipo de estudo
e/ou pesquisa. Após a definição do local é preciso delimitar a área escolhida para coletar os
espécimes durante todo o período do trabalho e/ou pesquisa. As coletas podem ocorrer de
forma aleatória, coletando os espécimes em qualquer local da área escolhida ou por meio de
parcelas que foram previamente demarcadas.
As coletas podem ser realizadas durante todas as estações do ano, porém em períodos de chuvas
intensas devem ser evitadas, pois as estruturas dos fungos podem se encontrar danificados devido
a exposição intensa à chuva. O período ideal para coletar fungos é durante a manhã e, pois o
restante do dia será para realizar os procedimentos laboratoriais que requerem um pouco mais de
tempo e atenção.

EQUIPAMENTOS PARA A COLETA


Seguindo os procedimentos de coleta, precisa-se de alguns equipamentos importantes para
utilização no campo durante as coletas. Os principais equipamentos que não podem faltar são:
a) Equipamentos de Proteção Individual (EPI): calça de tecido grosso; camisa de manga
comprida; chapéu ou boné; meia; botas de cano longo ou sapatos/tênis resistentes e fechados;
perneiras (imprescindíveis contra picadas e/ou mordidas de animais peçonhentos e/ou
venenosos); e protetor solar.
b) Máquina fotográfica: para fazer registros dos fungos no seu ambiente natural, fotografar
suas estruturas macroscópicas, pois após a coleta as características macroscópicas sofrem
alterações, principalmente nos cogumelos que são friáveis.
c) Faca, canivete ou uma pá pequena de jardinagem: para ajudar na remoção do fungo do
seu substrato (terra, troncos de árvores, etc.).
d) Saco de papel (de vários tamanhos) e/ou frasco: utilizado para acondicionar
individualmente os espécimes, devem ser colocados com muito cuidado para não danificar a
amostra e devem estar identificados com um número além dos dados da coleta
(dia/mês/ano).
e) Ficha de campo, lápis e borracha: cada espécime coletado deve ter todas suas informações
referentes à sua estrutura e características anotadas em uma ficha de campo (FIGURA 1).
f) GPS: para marcar a localização da área de estudo e do local da coleta de cada espécime.
g) Sacola ou caixa térmica: para transportar os espécimes já no interior dos sacos de papel.
h) Régua ou fita métrica: utilizada para fotografar ao lado do espécime para comparação das
medições da estrutura dos espécimes.
i) Termômetro ambiental: para medir a temperatura do ambiente da área de estudo e do local
da coleta de cada espécime. A medição sempre deve ser realizada à sombra.
j) Higrômetro: para medir a umidade relativa do ar da área de estudo e do local da coleta de
cada espécime. A medição sempre deve ser realizada à sombra.

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k) Facão: para facilitar a caminhada em áreas com vegetação mais fechada.

FIGURA 1. Ficha de campo para descrever as principais características dos fungos coletados.

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3. MACROFUNGOS
APRESENTAÇÃO
Os macrofungos são fungos que produzem estruturas reprodutoras macroscópicas, designadas
por estroma; carpóforo; esporocarpo; cogumelo; orelha-de-pau; basidioma (basidiocarpo) ou
ascoma (ascocarpo), sendo visíveis a olho nu, ou seja, com tamanho superior a 1,0 mm.
Os macrofungos compreendem um componente extremamente abundante e heterogêneo de
biodiversidade do ecossistema e executam funções vitais ao meio ambiente (LEONARD;
FECHNER, 2010).
Os principais representantes dos Macrofungos são os pertencentes aos filos Ascomycota e
Basidiomycota.
O filo Ascomycota compreende o maior grupo do reino Fungi, constituído de aproximadamente
75% de todos os fungos descritos. Seus representantes são considerados cosmopolitas e são
encontrados na natureza como saprófitos, parasitas (especialmente de plantas), ou em associação
mutualística (com algas unicelulares) formando os liquens. A principal característica deste grupo é
a presença de asco contendo ascosporos, geralmente oito, que representam a estrutura de
propagação do grupo. São produzidos por reprodução sexuada, mas a reprodução assexuada
também pode ser encontrada (MORAES et al, 2009).
Os representantes do filo Basidiomycota são considerados cosmopolitas e sapróbios. São
comumente denominados “cogumelos”. Têm como principal característica a presença de basídio
contendo basidiósporos, geralmente quatro, produzidos por reprodução sexuada, sendo que a
reprodução assexuada também pode ser encontrada (MORAES et al, 2009).
O surgimento do “corpo de frutificação” (aparecimento do esporocarpo) dos macrofungos pode
ocorrer diversas vezes no ano, dependendo de temperatura e umidade favoráveis, mas o
momento exato é muitas vezes espécie-específico. As variadas espécies de macrofungos requerem
diferentes condições ambientais para a formação do esporocarpo. A sobrevivência do
esporocarpo pode durar de algumas horas a vários anos, dependendo do habitat, fisiologia,
agentes destrutivos e ciclo de vida da espécie. Caracteristicamente, um "pico" máximo de
atividade ocorre nas épocas de surgimento do esporocarpo com diversidade e quantidade da
produção do esporocarpo evidente. Este clímax é precedido por alguns dias ou semanas de
rápida acumulação e posterior declínio na produtividade de fungos (LEONARD; FECHNER,
2010).

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4. PRINCIPAIS ESTRUTURAS DOS MACROFUNGOS


ESTRUTURAS DOS MACROFUNGOS
a) Micélio Reprodutivo ou Aéreo ou Estroma: corpo de frutificação do fungo, formado por
hifas aéreas ou reprodutivas que apresentam a função de formar e liberar os esporos.
 Basidioma ou Basidiocarpo: estrutura reprodutora complexa dos fungos Basidiomycota.
 Ascoma ou Ascocarpo: estrutura reprodutora complexa dos fungos Ascomycota.
b) Píleo: também chamado de chapéu, é a porção acima do estipe e que carrega o himenóforo.
c) Himênio ou Superfície Himenial: camada membranosa superficial do macrofungo onde
são produzidos os esporos (basidiósporos ou ascósporos). Também podem ser encontrados
estruturas estéreis como cistídios (basidiomicetos); paráfises (ascomicetos) e setas.
 Esporos:
 Basidiósporos: esporos sexuais formados externamente em células denominadas de
basídios, sendo exclusivos dos fungos Basidiomycota.
 Ascósporos: esporos sexuais que se formam dentro de células denominadas de asco,
sendo exclusivos dos fungos Ascomycota.
 Estruturas Estéreis:
 Cistídios: estruturas microscópicas estéreis, não ramificadas, geralmente clavadas a
cilíndricas, de paredes finas ou espessas, que geralmente são encontradas no himênio de
Basidiomycota.
 Paráfises (Paraphysis): estruturas estéreis formadas por células terminais das hifas
estéreis e filamentosas que geralmente apresentam um ápice globoso ou capitado ou
forma de baqueta que geralmente são encontradas em Ascomycota.
 Setas (Setae): estruturas estéreis formadas por hifas diferenciadas que apresentam
forma de cerda ou seta com parede espessa.
d) Himenóforo: parte do macrofungo que suporta o himênio. Pode se apresentar na forma de
lamelas; poros; tubos; acúleos; etc.
e) Estipe: também denominado de haste, pé ou pedúnculo, é a parte que sustenta o estroma
(micélio reprodutivo) do fungo.
f) Anel: estrutura circular presente no estipe da maioria dos cogumelos.
g) Volva: estrutura que envolve a base do estipe em alguns cogumelos.

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5. COLETA E IDENTIFICAÇÃO DE MACROFUNGOS


PROCEDIMENTOS EM CAMPO
1) Materiais importantes: canivete; facão; perneiras; GPS; termômetro; higrômetro; etc.
2) Fotografando o macrofungo: ao encontrar um magrofungo deve-se fotografá-lo em seu
habitat natural registrando as suas estruturas. O segundo registro deve ser realizado com o
auxílio de uma régua ou trena milimétrica para captar as medições gerais do corpo frutífero do
fungo ainda no seu ambiente natural.
3) Anotações: na ficha de campo (FIGURA 1) devem ser anotadas todas as informações sobre a
coleta e o fungo, tais como: data, local de coleta, coletores, clima, tipo de substrato que se
encontra o fungo, coloração das estruturas e presença ou ausência de odor.
4) Coleta do macrofungo: com uma faca ou canivete o macrofungo deve ser coletado junto
com uma parte do seu substrato, sempre atento para não danificar as estruturas principais do
fungo (píleo e haste).
5) Coleta para identificação molecular: retirar um ou mais fragmentos do fungo ainda fresco e
colocar em um ou mais microtubos de 2,0 mL (tipo eppendorf) e depois completar com sílica
gel.
6) Armazenamento: os macrofungos coletados devem ser armazenados em sacos de papel e/ou
frascos. No exterior dos sacos/frascos devem ser descritas as informações de identificação
conforme a ficha de campo.
7) Transporte: todo material coletado deve ser encaminhado para o laboratório no mesmo dia
para as etapas de triagem e análises para a identificação. O material deve ser transportado em
caixa isotérmica.

MATERIAIS E EQUIPAMENTOS NECESSÁRIOS PARA ANÁLISES


LABORATORIAIS
a) Autoclave: usado para esterilização de materiais e meios de cultura.
b) Estufa de esterilização (Pasteur): para esterilização de vidrarias em geral.
c) Microtubo: usar microtubo de 2,0 mL (tipo eppendorf) para colocar fragmentos do fungo
fresco para identificação molecular.
d) Sílica gel: para retirar umidade do fungo sem alterar o seu material genético.
e) Béquer: para colocar água e utilizar na esporada.
f) Placa de Petri: para meio de cultura e esporada.
g) Lâmina e lamínula: para visualização de esporos que foram depositados durante a esporada.
h) Resina PVLG (Álcool Polivinílico + Ácido Lático + Glicerina) ou resina PVL (Álcool
Polivinílico + Ácido Lático + Fenol): para fixação das lamínulas na lâmina.
i) Esmalte incolor: para vedação da lamínula.
j) Microscópio óptico: para visualização de esporos e estruturas microscópicas dos fungos.
k) Estereomicrócopio óptico (Lupa): para visualização de detalhes macroscópicos dos
Macrofungos (lamelas. Poros; himênio; etc.).

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l) Estufa de secagem com ventilação forçada: para secagem dos macrofungos para
armazenamento na Micoteca.
m) Lâmina de aço; pinça e agulha: usadas para manipulação e cortes de estruturas dos fungos.
n) Folha de papel branca e preta: usada como apoio das lamelas para obtenção dos esporos.
o) Água destilada: para hidratar as estruturas dos fungos durante as análises.
p) KOH (hidróxido de potássio) a 5%: hidratante para análise e medição das estruturas
microscópicas (coloração citoplasmática e separação das hifas). Quando os macrofungos
escurecem na presença do KOH significa que sofreu uma reação Xantocroica.
q) Reagente de Melzer: empregado nas análises das microestruturas do basidioma
(basidiósporos, basídios) e também para determinar as reações de amiloidia (amiloide ou
destrinoide ou inamiloide) de esporos, ascos, basídios e tecidos himeniais de ascomycota e
basidiomycota. Nas análises de estruturas hifais seu uso é indispensável.
 Reação Amiloide: caracterizada pela coloração azul.
 Reação Dextrinoide: coloração marrom ou avermelhada (IKI +).
 Reação Inamiloide: quando não houve nenhuma alteração na cor (IKI –).
r) Floxina 1%: corante para estruturas hialinas microscópicas dos fungos.
s) Azul de metileno: usado para corar estruturas hifais. Ao reagir coram-se de verde esmeralda
(grupo xantocroicos) e violeta claro ou azul arroxeado (grupo dos basidiocarpos corticosos).
Observação: o uso desse corante é importante, pois dependendo do tipo de reação, sua leitura
torna-se um item para identificação da espécie.
t) Azul de algodão: usado para observar a reação das microestruturas, sendo a reação chamada
de cianófila quando for positiva.

PROCEDIMENTOS NO LABORATÓRIO
1) Fotografia: todos os fungos devem ser fotografados novamente no laboratório ao lado de
uma régua ou escala sobre uma superfície clara para análise e registro de suas características
para comparar com as registradas em campo.
2) Descrição do macrofungo: com o auxílio de literaturas especializadas, cada estrutura
macroscópica do fungo deve ser caracterizada desde o tamanho (medir as estruturas); a forma;
a cor, descrevendo detalhadamente cada característica de cada parte do fungo (píleo; himênio;
himenóforo; estipe; anel; volva; etc.).
3) Anotação das características: todas as informações devem ser anotadas em uma ficha ou em
caderno próprio do responsável da pesquisa. São informações importantes de caráter de
identificação: medidas e formas de esporos; coloração; tipo de reação com reagentes; tipo de
hifas; etc.
4) Reações de amiloidia: gotas de reagente de Melzer devem ser adicionadas diretamente no
himênio de fungos do tipo orelha-de-pau para observação de reação.
5) Contagem dos poros: no caso de fungos com poros no himênio (himenóforo), estes devem
ser contados e anotados. A contagem dos poros é feita utilizando-se uma régua milimetrada e
estereomicroscópios (lupa). Contam-se quantos poros tem por milímetro. Devem ser
escolhidas pelo menos dez (10) regiões do fungo para fazer a contagem. Anota-se o menor
valor e o maior valor.

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6) Técnica de esporada: deve ser feita a técnica de esporada para obter os esporos dos fungos,
principalmente aqueles na forma de cogumelo, mas os fungos do tipo orelha-de-pau também
podem ter esporada.
a. Técnica de esporada de cogumelos: utiliza-se um pedaço de papel retangular (se
possível uma metade branca e outra preta) com um pequeno corte em forma de círculo
no meio para encaixe da haste (estipe). O cogumelo deve ficar encaixado com a
superfície do himênio (himenóforo) sobre o papel e a estipe dentro da água em um
béquer durante 24 horas em um local escuro para que os esporos possam cair das
lamelas e marcar o papel. No outro dia poderá ser observada a cor da esporada, além
disso, poderão ser coletados esporos para serem fixados em lâminas com a resina e
lamínula para observação em microscópio óptico.
b. Técnica de esporada para fungos tipo orelha-de-pau: a obtenção de esporos ocorre
com o himênio (himenóforo) voltado para baixo sobre uma lâmina de vidro colocada
em uma placa de Petri forrada com papel toalha que deverá ser umedecido com água
deionizada ou destilada. A placa deverá ser tampada e armazenada durante 24 horas em
ambiente escuro para obtenção dos esporos. No outro dia observa-se a lâmina para
confirmar ou não a presença de esporos. Caso se encontrem os esporos coloca-se a
resina e depois a lamínula para observação em microscópio óptico.
7) Cortes: as análises do basidioma (basidiocarpo) e do himênio (himenóforo) iniciam-se com
cortes destas estruturas utilizando-se lâminas de aço (tipo Gillette). Os cortes devem ser feitos
em diferentes partes do basidioma e himênio para visualização das hifas (para caracterização) e
outras microestruturas (cistídios, paráfises, setas, etc.).
8) Montagem das lâminas em cogumelos: cortes finos da lamela devem ser colocados sobre
uma lâmina e depois se colocam os reagentes e corantes. O uso dos corantes deve ser utilizado
separadamente em lâminas diferentes. Com a lamínula cobre-se a amostra e leva ao
microscópio para visualização em diferentes aumentos.
9) Montagem das lâminas em fungos porosos (orelha-de-pau): cortes finos devem ser feitos
em diferentes regiões do fungo sobre diferentes lâminas. Em uma lâmina adicionar uma gota
de KOH 5% e em outra adicionar KOH 5% e corante azul de metileno. Cobrir com lamínula
e observar em microscópio óptico para caracterizar as hifas. Quando as estruturas são hialinas
(transparentes), de difícil observação, acrescentar o corante floxina 1%.
10) Identificação: após todas as análises descritas acima e consequente registros das
características dos fungos utilizam-se chaves de identificação; bancos de dados de herbários e
literaturas especializadas para identificação do espécime.
11) Conservação do macrofungo: o espécime é seco em estufa de ventilação forçada a 45°C
por 12 h (fungos mais secos) e 24 h (fungos friáveis ou úmidos). Após a secagem cada fungo
é acondicionado em caixas de papel com suas respectivas informações e inserido na micoteca
para conservação e/ou futuros estudos.

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6. MICROFUNGOS
APRESENTAÇÃO
Os fungos anamórficos formam um grupo de fungos onde a reprodução assexuada é
predominante, com a formação de conídios como estrutura de propagação. A reprodução
sexuada é ausente, desconhecida ou teve a capacidade perdida. Esse grupo está relacionado aos
gêneros do filo Ascomycota e Basidiomycota por comparação de sequências gênicas. São
considerados como cosmopolitas, sapróbios e parasitas de animais e plantas. Os conídios são
formados por células conidiogênicas, presentes nos conidióforos, que são prolongamentos de
hifas modificadas, com função reprodutiva. Os conídios podem ter diferentes formas, tamanhos
e cores, podem possuir ou não a superfície texturizada, ornamento ou septo (MORAES et al,
2009).
Os microfungos são definidos como fungos com produção de estruturas microscópicas de
esporos (MUELLER et al, 2004). Estão distribuídos praticamente em todos os grupos
(Chytridiomycota, Zygomycota, Glomeromycota, Ascomycota e Basidiomycota) e possuem
estruturas reprodutivas microscópicas (MORAES et al, 2009).
Os fungos conidiais, também incluídos entre os microfungos, representam a fase anamórfica de
Ascomycota e Basidiomycota e tem aproximadamente 15.000 espécies descritas mundialmente
(KIRK et al, 2001). A estrutura reprodutiva mais comum em fungos são os conídios (reprodução
sexuada dominante), Moraes et al (2009) afirmam que os conídios são prolongamentos de hifas
modificadas, com função reprodutiva, formados por células conidiogênicas, presente nos
conidióforos.
Os fungos conidiais formam um grupo artificial, anteriormente conhecido como fungos
mitospóricos, fungos imperfeitos, fungos anamórficos ou Deuteromicetos e constituem a fase
assexuada dos filos Ascomycota e Basidiomycota, não apresentando forma sexuada de
reprodução. A maior parte destes fungos conidiais perdeu sua capacidade de reprodução sexuada
ou de se reproduzirem dessa forma em condições extremas ou desconhecidas (KIRK et al, 2001).
Os fungos conidiais podem estar presentes em quase todos os tipos de substratos possíveis de
serem utilizados em sua nutrição e podem ser encontrados tanto em ambientes terrestres,
associados às plantas, serrapilheira, solo e outros substratos, quanto em ambientes aquáticos
(água doce, salobra ou salgada), associados a partes de vegetais submersas e organismos aquáticos
(ALEXOPOULOS et al, 1996; MUELLER et al, 2004; SEIFERT et al, 2011).
As estruturas reprodutivas básicas que compõem este grupo são os conídios, os conidióforos e as
células conidiogênicas, sendo de grande importância para a taxonomia devido a grande
diversidade morfológica propiciada pela plasticidade fenotípica/genotípica do grupo
(ALEXOPOULOS et al, 1996).
Os fungos conidiais podem ser divididos em fungos ingoldianos; fungos aero-aquáticos; fungos
aquático-terrestres; e fungos aquático-facultativos (ALEXOPOULOS et al, 1996; GOH; HYDE,
1996; INGOLD, 1975; SILVA et al, 2014).

FUNGOS INGOLDIANOS
São dependentes exclusivamente do ambiente aquático para sua reprodução. Sua identificação é
baseada na morfologia dos conídios que apresentam formas hidrodinâmicas (tetra-radiados,
ramificados e sigmoides) que auxiliam na aderência ao substrato (DIX; WEBSTER, 1995; GOH,
1997). Estão presentes na natureza habitando, principalmente, ambientes lóticos com água limpa

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e clara. Porém, alguns já foram reportados em água poluída (SRIDHAR et al, 2000), lagos e no
ambiente terrestre (BANDONI,1972, SCHOENLEIN-CRUSIUS; MALOSSO 2006).

FUNGOS AERO-AQUÁTICOS
Não conseguem completar seu ciclo de vida em ambiente aquático, sobrevivem vegetativamente
à substratos submersos. Porém, só esporulam quando expostos ao ar. Geralmente colonizam
matéria em decomposição e habita ambientes lênticos. Sua dispersão ocorre na superfície da água
(GOH; HYDE, 1996; SHEARER et al, 2007).Vivem em ambientes lênticos como lagos e
riachos, colonizam matéria orgânica em decomposição, possui conídios com estruturas
multicelulares de formas distintas em sua maioria helicoidal ou clatróide, estas formas possui ar
que possibilita os conídios a flutuarem sendo dispersos na superfície da água (BARBOSA, 2011;
SILVA, 2013).

FUNGOS AQUÁTICO-TERRESTRES
Geralmente são encontrados em gotas de chuva ou orvalho, em plantas intactas, como a
superfície foliar ou mesmo no tronco, formando um filme d’água que funciona como um micro-
habitat aquático (ANDO, 1992).

FUNGOS AQUÁTICO-FACULTATIVOS
São fungos que podem ser encontrados tanto em ambiente terrestre quanto aquático (lóticos e
lênticos). São caracterizados como sapróbios, com conidióforos e conídios de parede
relativamente espessa, podendo se desenvolver sobre substratos vegetais submersos ou terrestres
(SILVA, 2013). Podem esporular e dispersar seus conídios nos ambientes terrestre e aquático Os
conídios neste grupo são ovoides, cilíndricos, obclavados, piriformes ou fusiformes, o que não
caracteriza adaptações distintas para o ambiente aquático (GOH; HYDE, 1996).

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7. PRINCIPAIS ESTRUTURAS DOS MICROFUNGOS


APRESENTAÇÃO
Fungos Hyphomycetes (Hifomicetos) ou Deuteromycetes (Deuteromicetos) ou Conidiais ou
Anamorfos (Anamórficos) ou Imperfeitos (Fungi imperfecti) são fungos que só é conhecida a
reprodução assexuada. Apresentam estruturas características, tais como: conidióforos, células
conidiogênicas e conídios (conidiósporos).
Os conídios têm como função a dispersão e a perpetuação das espécies sendo de grande
importância ecológica e taxonômica.
Quando se conhece a fase sexual destes fungos, na maioria das vezes, estes passam a se classificar
no filo Ascomycota ou no filo Basidiomycota.

TIPOS DE COLORAÇÃO MICROSCÓPICA


a) Fungos Demáceos ou Dematiáceos: fungos escuros ou negros.
b) Fungos Hialinos: fungos claros.

ESTRUTURAS DO MICÉLIO
h) Micélio Vegetativo ou de Absorção ou Assimilativo: formado por um conjunto de hifas
que estão submersas no substrato ou crescendo na superfície, sendo formado por hifas
septadas, que são filamentos celulares cilíndricos geralmente multinucleados, com parede
celular. As hifas geralmente apresentam ramificações entre o ápice e a base do micélio.
i) Micélio Reprodutivo ou Aéreo ou Estroma: corpo de frutificação do fungo, formado por
hifas aéreas ou reprodutivas que apresentam a função de formar e liberar os conídios
(esporos).
 Basidioma ou Basidiocarpo: estrutura reprodutora complexa dos fungos
Basidiomycota.
 Ascoma ou Ascocarpo: estrutura reprodutora complexa dos fungos Ascomycota
j) Esclerócito ou Escleroto: formado por hifas agregadas escuras com parede espessa e
firmemente entrelaçadas com função de resistência.
k) Rizomorfo ou Rizoide: aglomerado de hifas formando denso filamento semelhante a raízes.
l) Hifopódio (Hyphopodia): formado por hifas diferenciadas com função de se fixar ao
substrato. Também denominado de Apressório.
m) Estomatopódio (Stomatopodia): formado por hifas diferenciadas de fungos parasitas que
penetram no tecido do hospedeiro. Também conhecidas como Haustório.
n) Seta (Setae): estrutura formada por hifas diferenciadas que apresentam forma de cerda ou
seta com parede espessa.
o) Paráfise (Paraphysis): estrutura formada por células terminais das hifas estéreis e
filamentosas que geralmente apresentam um ápice globoso ou capitado ou forma de baqueta.
p) Conidióforo: é uma hifa diferenciada que dará origem aos conídios. Pode não estar presente.
q) Célula Conidiogênica: célula produtora de conídios. Sempre está presente.

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r) Métula: célula de um conidióforo que transporta (carrega / sustenta) as fiálides.


s) Fiálide: célula conidiogênica que produz conídios blásticos de maneira basípeta.

TIPOS DE CONIDIÓFOROS
a) Conidióforo Micronematoso: conidióforo com mesma espessura/tamanho que a hifa
principal.
b) Conidióforo Macronematoso: conidióforo com espessura/tamanho maior que a hifa
principal.
c) Conidióforo Isolado: formado apenas por uma hifa diferenciada.
d) Conidióforo Agrupado: formado por agrupamento de diversas hifas. Pode ser classificado
em Protegido e Desprotegido.
 Conidióforo Agrupado Protegido:
 Acérvulo: corpo de frutificação (estroma) em forma de almofada, fechado tendo
apenas uma abertura, composto por hifas impactadas que originam os
conidióforos.
 Picnídio: corpo de frutificação assexual, geralmente em forma piriforme,
revestido por conidióforos.
 Conidióforo Agrupado Desprotegido:
 Sinema: corpo de frutificação formado por diversos conidióforos em paralelo.
 Esporodóquio: corpo de frutificação em forma de almofada ou prato recoberto
por conidióforos.

CLASSIFICAÇÃO DO CONIDIÓFORO QUANTO AO CRESCIMENTO


a) Basáuxico: o crescimento do conidióforo ocorre na base.
b) Acroáuxico: o crescimento do conidióforo ocorre no ápice.

CLASSIFICAÇÃO DO CONIDIÓFORO QUANTO AO EIXO


a. Simpódico ou Simpodial: quando o eixo principal para de crescer e o crescimento continua
na ramificação lateral, repetindo o mesmo processo.
b. Monopódico ou Monopodial: quando o eixo principal sempre cresce mais que os ramos
(ramificações) laterais.
c. Acropetálica: quando uma cadeia de hifas é formada ocorrendo ramificação (bifurcação) e
formação dos conídios ocorre no topo das bifurcações.

CLASSIFICAÇÃO DA CÉLULA CONIDIOGÊNICA


a. Integrada: quando a célula conidiogênica está incorporada no eixo principal ou em ramos do
conidióforo onde os conídios são terminais ou intercalares. Os conídios são produzidos no
conidióforo.
b. Discreta ou Distinta: quando a célula conidiogênica apresenta um formato distinto
(ampuliforme, esférica, etc.). Os conídios são produzidos numa estrutura fora do conidióforo.

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CLASSIFICAÇÃO QUANTO A ONTOGENIA DOS CONÍDIOS


a) TÁLICO: conídio origina-se da subdivisão de células ou hifas pré-existentes sem a produção
de uma nova parede celular. Divide-se em Holotálico e Enterotálico.
 Holotálico: quando os conídios não se encontram em cadeia e são formados a partir do
surgimento de septos. Divide-se em Tálico-ártrico e Tálico-solitário.
 Tálico-ártrico ou Artrotálica: quando a hifa pré-existente sofre apenas septação.
 Tálico-solitário: quando o ápice da hifa recebe um acúmulo de citoplasma originando
o conídio.
 Enterotálico ou Enteroártrico: quando os conídios se apresentam em cadeia e
separados por compartimentos (células) que sofrem lise.
b) BLÁSTICO: conídio origina-se a partir do crescimento da parede celular de uma célula pré-
existente. Divide-se em Holoblástico e Enteroblástico.
 Holoblástico: quando a parede externa da célula conidiogênica é contínua com a parede
do novo conídio. Divide-se em Monoblástico e Poliblástico.
 Monoblástico: ambas as paredes (internas e externas) da célula conidiogênica
contribuem para a formação dos conídios.
 Poliblástico: conídio emerge da parede interna da célula conidiogênica, sendo exposto
pelo rompimento da parede externa.
 Enteroblástico: quando a parede externa da célula conidiogênica é descontínua com a do
conídio. A parede do conídio é derivada da superfície interior da célula. Divide-se em
Trético e Fialídico.
 Trético: células conidiogênicas estão integradas no conidióforo e apresentam poros.
Divide-se em Monotrético e Politrético.
 Fialídico: apresenta células conidiogênicas evidentes, diferenciadas do conidióforo,
podendo apresentar colarete ou não. Divide-se em Monofialídico e Polifialídico.

CLASSIFICAÇÃO QUANTO A PROLIFERAÇÃO DOS CONÍDIOS


a) Determinado: ocorre apenas um evento de conidiogênese saindo apenas um conídio.
b) Percorrente ou Anélide: ocorre uma proliferação de mais de um conídio, geralmente em fila.
Como consequência o resíduo de secessão forma anéis no conidióforo.
c) Simpodial: ocorre uma proliferação mudando de direção no crescimento fazendo com que o
conidióforo mude o eixo (geniculação).
d) Fialídico: ocorre rápida sucessão de conídios a partir de células conidiogênicas denominadas
fiálides.

CLASSIFICAÇÃO QUANTO A ABERTURA DA CÉLULA CONIDIOGÊNICA


a) Ausência: quando não há abertura visível na célula conidiogênica.
b) Presença: quando apresenta abertura visível na célula conidiogênica. Pode ser Denticulado ou
Cicatrizado.
 Denticulado: dentado de maneira pouco profunda.
 Cicatrizado: célula conidiogênica apresenta uma cicatriz deixada pelo conídio.

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CLASSIFICAÇÃO QUANTO A LIBERAÇÃO (SENESCÊNCIA) DOS CONÍDIOS


a) Esquizolítico ou Esquizólisis: o conídio é liberado a partir da ruptura da hifa. Geralmente
são formadas cicatrizes circulares.
b) Rexolítico ou Rexólisis: o conídio é liberado a partir da lise ou fratura da célula basal.

CLASSIFICAÇÃO QUANTO A SEQUÊNCIA DE PRODUÇÃO DOS CONÍDIOS


a) Basípeta ou Basi-axial: conídio mais novo está no início (base) da cadeia.
b) Acrópeta: conídio mais novo está no ápice da cadeia.

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8. COLETA E IDENTIFICAÇÃO DE MICROFUNGOS


PROCEDIMENTOS EM CAMPO
1) Materiais importantes: canivete, facão, perneiras, GPS, termômetro, higrômetro; etc.
2) Coleta de material em campo: seguir o protocolo específico de cada coleta.
3) Armazenamento das amostras: em sacos de papel e/ou frascos;
4) Transporte para o laboratório: em caixas isotérmicas.

MATERIAIS E EQUIPAMENTOS NECESSÁRIOS PARA ANÁLISES


LABORATORIAIS
a) Autoclave: usado para esterilização de materiais e meios de cultura.
b) Estufa: utilizado para crescimento dos microfungos.
c) Estufa de esterilização (Pasteur): para esterilização de vidrarias em geral.
d) Vasilha de plástico: para lavagem dos substratos em água corrente.
e) Placa de Petri:
 Para fazer um micro ecossistema (mini estufa) onde serão colocados os substratos para
crescimento dos microfungos;
 Para repique dos microfungos em Ágar Batata e/ou Ágar Cenoura Milho;
 Para fazer o microcultivo.
f) Caixa isotérmica: para colocar as placas de Petri contendo os substratos. A caixa isotérmica
deve ser forrada com papel toalha úmido e fechada.
g) Folha de papel toalha: usada para a secagem dos substratos e também para forrar as placas
de Petri (micro ecossistema) e a caixa isotérmica.
h) Estereomicrócopio óptico (Lupa): para visualização dos microfungos crescendo nos
substratos.
i) Microscópio óptico: para visualização das estruturas microscópicas dos microfungos.
j) Seringa com agulha de insulina: para manipulação dos microfungos no substrato e
transferência para as lâminas de vidro para visualização das estruturas dos microfungos no
microscópio óptico.
k) Lâmina e lamínula: para visualização do microfungo retirado do substrato e para fazer
microcultivo.
l) Resina PVLG (Álcool Polivinílico + Ácido Lático + Glicerina) ou resina PVL (Álcool
Polivinílico + Ácido Lático + Fenol): para fixação das lamínulas na lâmina.
m) Esmalte incolor: para vedação da lamínula.
n) Estufa de secagem com ventilação forçada: para secagem dos substratos para
armazenamento na Micoteca.
o) Lâmina de aço ou bisturi: usados para cortar o Ágar Batata ou Ágar Cenoura Milho para
fazer o microcultivo. Também serão utilizados para cortar o Ágar Batata ou Ágar Cenoura
Milho, com o microfungo, para ser armazenado no método Castelanni (1939).

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p) KOH (hidróxido de potássio) a 5%: pode ser utilizado no caso de microfungos escuros
(demáceos). Usados para clarear microfungos demáceos.
q) Floxina B 1%: corante para estruturas hialinas (claras) microscópicas dos fungos.
r) Corantes: usados na microscopia óptica. O ideal é fazer uma lâmina SEM CORANTE e
outra COM CORANTE. Os principais corantes utilizados são:
 Azul de metileno.
 Azul de algodão.
 Lactofenol de Amann.
 Vermelho Congo.

PROCEDIMENTOS NO LABORATÓRIO
1) Higienização das amostras coletadas: lavagem do material em água corrente intermitente
durante 30 min.
2) Secagem do material: sobre papel toalha durante 15 min em temperatura ambiente.
3) Cultivo em micro ecossistema: colocar as amostras dos substratos coletados (para ser
cultivado) em placas de Petri contendo papel toalha (esterilizados) e depois umedecer o
papel com água também esterilizada.
4) Armazenamento: colocar as placas com os substratos em temperatura ambiente, dentro de
caixa isotérmica, contendo papel toalha umedecido no fundo da caixa e tampar a caixa.
5) Visualização: após uma semana, começar a visualização dos substratos nas placas de Petri
utilizando lupa (estereomicroscópio) para observação de crescimento de microfungos.
6) Registrar: assim que um microfungo for encontrado deve-se fotografá-lo ainda nos
substratos, diretamente da ocular da lupa.
7) Preparação da lâmina direta: com o auxílio de agulhas de insulina deve-se retirar o
microfungo do substrato e transferi-lo para uma lâmina de vidro contendo resina PVLG
(Álcool Polivinílico + Ácido Lático + Glicerina) ou resina PVL (Álcool Polivinílico + Ácido
Lático + Fenol).
8) Desmembramento do microfungo: ainda na lâmina, e com o auxílio das agulhas, o
microfungo deve ser desmembrado para facilitar a visualização de suas estruturas tais como
os esporos e células conidiogêncas.
9) Visualização e registro: tendo uma boa visualização das estruturas fúngicas pode-se
colocar a lamínula sobre a lâmina e fotografar as estruturas do microfungo diretamente da
ocular do microscópio.
10) Selar as lâminas: após a confecção das lâminas estas devem ser seladas passando esmalte
incolor nas bordas das lamínulas e deixando secar por 24 h antes de usá-las novamente.
11) Cultivo em meio de cultura: deve ser realizado cultivo em meio Ágar Cenoura Milho
(ACM) e Ágar Batata Dextrose (ABD) com 0,5% de cloranfenicol (ver protocolo de
produção) dos microfungos encontrados nos substratos, utilizando as técnicas de uma estria
e/ou três picadas. Após os repiques as placas devem permanecer incubadas de 3 a 7 dias
(dependendo da taxa de crescimento de cada espécime).
12) Registro das placas: as placas com crescimento dos microfungos devem ser fotografadas,
tanto a face superior (micélio aéreo) quanto a face inferior (micélio vegetativo). Suas
características devem ser anotadas.

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13) Microcultivo: após o crescimento dos microfungos nos meios de cultura, realizar o
microcultivo (ver protocolo de microcultivo).
14) Visualização do microcultivo: as lâminas produzidas no microcultivo devem ser
visualizadas em microscópio óptico para caracterizar e medir (com auxílio da escala
micrométrica da ocular) as estruturas dos microfungos que serão importantes para a
identificação destes. Anote tudo em seu caderno de pesquisa.
15) Registrar: as estruturas visualizadas nas lâminas devem ser fotografadas e o aumento da
imagem deve ser anotado.
16) Armazenamento em tubos de ensaio: a partir das placas de Petri com ACM e ABD com
crescimento dos microfungos deve-se fazer repiques para tubos de ensaio contendo o meio
de cultura ACM inclinado e após o crescimento dos microfungos, no meio de cultura,
adicionar óleo mineral esterilizado até cobrir a amostra.
17) Armazenamento em água: a partir das placas de Petri, com ACM e ABD com crescimento
dos microfungos, deve-se fazer cortes cúbicos do ágar, com o auxílio de um bisturi,
formando fragmentos do ágar contendo o microfungo. Estes fragmentos devem ser
colocados em frascos de vidro contendo água deionizada ou destilada, ambos esterilizados
(ver protocolo do método de Castellani).
18) Armazenamento do substrato e das lâminas: os substratos, dos quais foram retirados os
microfungos, devem ser secos em estufa com ventilação forçada a 45°C/24 h e depois
armazenados em caixas junto com suas respectivas lâminas. Tudo deve ser identificado e
registrado na Micoteca.

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9. FUNGOS ENDOFÍTICOS E EPIFÍTICOS


APRESENTAÇÃO
Fungos endofíticos são microfungos que habitam o interior de tecidos e órgãos vegetais sem
causar prejuízos ao seu hospedeiro.
Fungos epifíticos são microfungos que habitam as superfícies de partes estruturais dos vegetais.

PROCEDIMENTOS EM CAMPO
1) Materiais importantes: canivete, facão, perneiras, GPS, termômetro, higrômetro; etc.
2) Coleta de material em campo: retirar a estrutura da planta com tesoura, canivete ou estilete.
3) Armazenamento das amostras: em sacos de papel e/ou frascos;
4) Transporte para o laboratório: em caixas isotérmicas.

MATERIAIS E EQUIPAMENTOS NECESSÁRIOS PARA ANÁLISES


LABORATORIAIS
a) Vasilhas de plástico: para lavagem e higienização das estruturas das plantas.
b) Álcool Etílico a 70%: para a higienização das estruturas das plantas.
c) Hipoclorito de sódio: para a higienização das estruturas das plantas.
d) Água deionizada ou destilada esterilizada: para a higienização das estruturas das plantas.
e) Capela de exaustão ou fluxo laminar: local para higienização das estruturas dos das plantas.
f) Autoclave: usado para esterilização de materiais e meios de cultura.
g) Estufa: utilizado para crescimento dos microfungos.
h) Estufa de esterilização (Pasteur): para esterilização de vidrarias em geral.
i) Placa de Petri:
 Para repique dos microfungos em Ágar Batata e/ou Ágar Cenoura Milho;
 Para fazer o microcultivo.
j) Folha de papel toalha: para forrar as placas de Petri (microcultivo).
k) Estereomicrócopio óptico (Lupa): para visualização dos microfungos crescendo nos
substratos.
l) Microscópio óptico: para visualização das estruturas microscópicas dos microfungos.
m) Seringa com agulha de insulina: para manipulação dos microfungos no substrato e
transferência para as lâminas de vidro para visualização das estruturas dos microfungos no
microscópio óptico.
n) Lâmina e lamínula: para visualização do microfungo e para fazer microcultivo.
o) Resina PVLG (Álcool Polivinílico + Ácido Lático + Glicerina) ou resina PVL (Álcool
Polivinílico + Ácido Lático + Fenol): para fixação das lamínulas na lâmina.
p) Esmalte incolor: para vedação da lamínula.

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q) Lâmina de aço ou bisturi: usados para cortar o Ágar Batata ou Ágar Cenoura Milho para
fazer o microcultivo. Também serão utilizados para cortar o Ágar Batata ou Ágar Cenoura
Milho, com o microfungo, para ser armazenado no método Castelanni (1939).
r) KOH (hidróxido de potássio) a 5%: pode ser utilizado no caso de microfungos escuros
(demáceos). Usados para clarear microfungos demáceos.
s) Floxina B 1%: corante para estruturas hialinas (claras) microscópicas dos fungos.
t) Corantes: usados na microscopia óptica. O ideal é fazer uma lâmina SEM CORANTE e
outra COM CORANTE. Os principais corantes utilizados são:
 Azul de metileno.
 Azul de algodão.
 Lactofenol de Amann.
 Vermelho Congo.

PROCEDIMENTOS NO LABORATÓRIO
1) Higienização dos substratos: higienizar as estruturas das plantas coletadas (no interior de
uma capela de exaustão ou fluxo laminar), utilizando recipientes previamente higienizados
com solução de hipoclorito (3%), de acordo com o tipo de microfungo (epifítico ou
endofítico) que se pretende isolar.

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2) Colocando fragmentos nas placas: após a higienização deve-se cortar (utilizando lâmina
de aço ou bisturi ou tesoura previamente esterilizada ou flambada) pequenos discos ou
fragmentos (6-7 mm) das estruturas das plantas e colocar (usando uma pinça esterilizada ou
flambada) na placa de Petri contendo Ágar Batata Dextrose (ABD). Para cada placa de Petri
é possível colocar de três a cinco fragmentos.
3) Incubação das placas: incubar em estufa úmida e manter em temperatura ambiente,
analisar o crescimento que pode variar de três a seis dias, dependendo da estação.
4) Repique dos fungos: repicar os variados fungos que cresceram a partir dos fragmentos das
plantas para outra placa de Petri contendo ABD, sendo um fungo para cada nova placa de
Petri.
5) Microcultivo: realizar o método de microcultivo em lâminas dos fungos que cresceram nos
fragmentos (ver protocolo de microcultivo);
6) Visualização das lâminas do microcultivo: com o microscópio óptico fazer varredura na
lâmina e medir as estruturas dos microfungos conforme o protocolo de identificação. Anotar
as medidas realizadas.
7) Registro: fotografar as estruturas e anotar o aumento da objetiva.
8) Cultivo: cultivar os microfungos em placas de Petri e em tubos de ensaio inclinados com
Ágar Cenoura Milho (ACM) com 0,5% de cloranfenicol. A incubação deve ser realizada a
temperatura ambiente de 3 a 7 dias.
9) Registro das placas: as placas com crescimento dos microfungos devem ser fotografadas,
tanto a face superior (micélio aéreo) quanto da face inferior (micélio vegetativo). Suas
características devem ser anotadas.
10) Armazenamento em água: após o crescimento dos microfungos nas placas de Petri, retirar
pequenos discos ou quadrados (utilizando bisturi esterilizado ou flambado) e colocá-los em
frascos de vidro contendo água deionizada ou destilada esterilizada (ver protocolo para
armazenamento a partir do método Castellani).
11) Armazenamento em tubos de ensaio: após o crescimento dos microfungos nos tubos de
ensaio, esterilizar óleo mineral e colocar dentro dos tubos até a total cobertura dos
microfungos.

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10. MICROCULTIVO
MONTAGEM DA CÂMARA ÚMIDA
Montar uma placa de Petri com o fundo coberto com papel de filtro e colocar sobre este um
bastão em forma de “U” ou “V”, uma lâmina e três lamínulas.
Caso não tenha um bastão para a lâmina ficar em cima use outra lâmina como base, colocando a
lâmina de cima perpendicular à lâmina de baixo.
Esterilizar todas as placas de Petri montadas em estufa de esterilização (Pasteur) a 180°C/3 horas.

PREPARAÇÃO DO MEIO DE CULTURA


Vazar, em placa de Petri esterilizada, uma camada fina do meio de cultura Ágar Batata Dextrose
(ABD) ou Ágar Cenoura Milho (ACM), esterilizados.
Após a solidificação do meio, com o auxílio de um bisturi (esterilizado ou flambado) ou canudo
de plástico ou metal (previamente esterilizado), cortar pequenos fragmentos do Ágar.

MICROCULTIVO E PREPARAÇÃO DAS LÂMINAS


Transferir, com o auxílio de um bisturi, um ou dois fragmentos do Ágar para a lâmina que está na
placa de Petri do microcultivo (todo o procedimento deverá ser realizado próximo à chama do
bico de Bunsen).
Com uma agulha ou alça em “L” (previamente esterilizadas ou flambadas) transferir partes do
micélio do fungo para o fragmento de Ágar que foi colocado sobre a lâmina.
Colocar as lamínulas sobre os fragmentos do Ágar.
Molhar o papel de filtro com água deionizada ou destilada esterilizada formando uma câmara
úmida.
Tampar a placa de Petri e deixar em temperatura ambiente, por aproximadamente uma semana
ou mais dependendo do fungo estudado.
Após esse período, inativar a esporulação, adicionando 1,0 mL de formol ao papel e vedando a
placa com fita adesiva durante 24 h-48 h. O vapor de formol, além de inativar o fungo, irá auxiliar
na fixação das estruturas microscópicas.
Depois da inativação do fungo montar lâminas e lamínulas com corantes e/ou resinas.
Retirar a lamínula com auxílio de uma pinça, cuidadosamente, uma vez que nela deverão estar
aderidas as hifas e esporos do fungo. Pingar uma gota de corante e/ou resina e montar sobre uma
lâmina.
Desprezar o cubo de Ágar que ficou na lâmina e em seu lugar pingar uma gota de corante e/ou
resina e recobrir com lamínula, para visualizar esporos e hifas também aderidos à lâmina.
Observar em microscópio óptico.
As lâminas podem ser vedadas utilizando esmalte incolor e esperando secar por 24 horas.

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11. ARMAZENAMENTO DE ESPÉCIMES


SECAGEM EM ESTUFA
Tanto os substratos, dos quais foram retirados os microfungos, quanto também os macrofungos,
devem ser secos em estufa com ventilação forçada e depois armazenados em caixas junto com
suas respectivas lâminas de suas estruturas (para os microfungos) e lâminas dos esporos (para os
macrofungos). Tudo deve ser identificado e registrado na Micoteca.
A secagem dos substratos dos microfungos deve ser realizada a 45°C/24 h.
A secagem dos macrofungos deve ser realizada a 45°C por 12 h (fungos mais secos) e 24 h
(fungos friáveis ou úmidos).

CAIXA COM ESPÉCIME SECA


As caixas com espécimes dos microfungos devem conter identificação completa; substrato seco e
lâminas com as estruturas do microfungo.
As caixas com espécimes dos macrofungos devem conter identificação completa; espécime seca e
lâminas com os respectivos esporos do macrofungo.

MÉTODO CASTELLANI
Realizar todo o procedimento próximo ao bico de Bunsen.
A partir das placas de Petri contendo ACM e ABD, com crescimento dos microfungos, devem-se
fazer cortes cúbicos do ágar, com o auxílio de um bisturi (esterilizado ou flambado), formando
pequenos fragmentos do ágar contendo o microfungo.
Os fragmentos devem ser transferidos para frascos de vidro contendo água deionizada ou
destilada, ambos esterilizados, e depois tampados.
Armazenar os frascos em temperatura ambiente ou refrigerador.

TUBO COM ÓLEO MINERAL ESTERILIZADO


Realizar todo o procedimento próximo ao bico de Bunsen.
A partir das placas de Petri contendo ACM e ABD, com crescimento dos microfungos, devem-se
fazer repiques para tubos de ensaio contendo o meio de cultura ACM inclinado e incubar de 3 a 7
dias em temperatura ambiente.
Após o crescimento dos microfungos, no meio de cultura dos tubos de ensaio, deve-se adicionar
óleo mineral esterilizado até cobrir os microfungos.
Armazenar os tubos de ensaio em temperatura ambiente ou refrigerador.

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12. MEIOS DE CULTURA


ÁGAR BATATA DEXTROSE (ABD)
FÓRMULA:
Infusão de Batata por 200 g 4,0 g/L*
Dextrose 20,0 g/L
Ágar 15,0 g/L
*4,0 g de extrato de batata são equivalentes a 200 g de infusão de batata.
pH final: 5,6 ± 0,2 a 25°C

PREPARO:
Suspender de 39,0 a 42,0 g (depende da marca) do pó em um litro (1.000 mL) de água destilada
ou deionizada (verificar e seguir as instruções no rótulo do frasco do meio de cultura).
Aquecer até dissolver completamente, sem ferver.
Esterilizar em autoclave a 121°C por 15-20 minutos.
Resfriar em temperatura ambiente.

ÁGAR CENOURA MILHO (ACM)


FÓRMULA:
Cenoura madura ralada 30,0 g/500 mL
Fubá de milho (tipo flocão) 30,0 g/500 mL
Ágar bacteriológico 16 g/L

PREPARO:
Ralar a cenoura madura e pesar 30,0 g e colocar em um erlenmeyer com 500 mL de água
deionizada ou destilada (Solução 1).
Pesar 30,0 g de fubá de milho (tipo flocão) e colocar em um erlenmeyer com 500 mL de água
deionizada ou destilada (Solução 2).
Cozinhar por 15 minutos no fogão (não deixar ferver) as duas soluções em recipientes separados.
Após cozidas as soluções 1 e 2 devem ser coadas separadamente (use coador de pano) e
utilizando uma proveta coloque a mesma quantidade da Solução 1 e da Solução 2 em um único
recipiente com tampa (geralmente a Solução 2 fica com menor volume).
Após juntar as duas soluções acrescente o Ágar Bacteriológico, lembrando que a quantidade pode
variar dependendo do volume final das duas soluções, para cada 1 L (1.000 mL) da solução final
de cenoura e milho são acrescentados 16,0 g de Ágar (para outras quantidades use regra de três).
Esterilizar em autoclave a 121°C por 20 minutos.
Resfriar em temperatura ambiente.

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13. RESINAS, CORANTES E REAGENTES


RESINA PVLG (ÁLCOOL POLIVINÍLICO + ÁCIDO LÁTICO + GLICERINA)
FÓRMULA:
PVA (Álcool Polivinílico Branco Granulado) 16,6 g
Água deionizada ou destilada 100,0 mL
Ácido lático 100,0 mL
Glicerina 10,0 mL

PREPARO:
Em um erlenmeyer coloque 16,6 g de PVA em 100,0 mL de água deionizada ou destilada.
Tampe com rolha de algodão hidrófobo e por cima da rolha coloque papel alumínio (faça
pequenos furos no papel alumínio).
Homogeneizar e autoclavar a 121°C/20 min.
Depois de frio misturar com 100,0 mL de ácido lático e 10,0 mL de glicerina.
Guardar em frasco âmbar ou coberto com papel alumínio ao abrigo da luz.
Usar somente depois de 48 horas.
Parte da resina pode ficar estocada no frasco maior (em refrigerador).
A resina que vai ser usada pode ser colocada em frascos menores (âmbar ou coberto com papel
alumínio), com conta-gotas.
Identifique todos os frascos.

RESINA PVL (ÁLCOOL POLIVINÍLICO + ÁCIDO LÁTICO + FENOL)


FÓRMULA:
PVA (Álcool Polivinílico Branco Granulado) 15,0 g
Água deionizada ou destilada 100,0 mL
Ácido lático 22,0 mL
Fenol líquido 22,0 mL

PREPARO:
Modo de fazer a solução estoque:
Em um erlenmeyer coloque 15,0 g de PVA em 100,0 mL de água deionizada ou destilada.
Tampe com rolha de algodão hidrófobo e por cima da rolha coloque papel alumínio (faça
pequenos furos no papel alumínio).
Homogeneizar e autoclavar a 121°C/20 min.
A solução estoque deve ser acondicionada em refrigerador depois de pronta e ao abrigo da luz
(frasco âmbar ou coberto com papel alumínio).
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Modo de fazer a solução de uso:


Misturar 56,0 mL da solução estoque com 22,0 mL de ácido lático e 22,0 mL de fenol líquido.
Guardar em frasco âmbar ou coberto com papel alumínio ao abrigo da luz.
Usar somente depois de 48 horas.
Parte da resina pode ficar estocada em refrigerador.
A resina que vai ser usada pode ser colocada em frascos menores (âmbar ou coberto com papel
alumínio), com conta-gotas.
Identifique todos os frascos.

AZUL DE ALGODÃO
FÓRMULA:
Ácido lático 20,0 g 100,0 g
Cristais de fenol 20,0 g 100,0 g
Glicerina 20,0 g 100,0 g
Azul algodão 0,05 g 0,25 g
Água destilada ou deionizada 20,0 mL 100,0 mL

PREPARO:
Fundir os cristais de fenol em banho-maria e depois misturar com os outros ingredientes.
Esperar 24 horas e filtrar.
Armazenar em pote de vidro âmbar ou coberto por papel alumínio.

LACTOFENOL DE AMANN
FÓRMULA:
Ácido fênico 20,0 g 100,0 g
Ácido lático 20,0 g 100,0 g
Glicerina 40,0 g 200,0 g
Água destilada ou deionizada 20,0 mL 100,0 mL
Azul de Poirrierblau 0,05 g 0,25 g

PREPARO:
Misturar todos os componentes e dissolver pelo calor.
Depois adicionar 0,05g de azul de Poirrierblau.
Esperar 24 horas e filtrar.
Armazenar em pote de vidro âmbar ou coberto por papel alumínio.

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AZUL DE METILENO
FÓRMULA:
Azul de metileno 1,0 g
Água destilada ou deionizada 100,0 mL

PREPARO:
Dissolver os dois ingredientes até a total dissolução dos componentes.
Armazenar em pote de vidro âmbar ou coberto por papel alumínio.

VERMELHO CONGO A 1%
FÓRMULA:
Vermelho congo 1,0 g
Água destilada ou deionizada 100,0 mL

PREPARO:
Dissolver os dois ingredientes até a total dissolução dos componentes.
Armazenar em pote de vidro âmbar ou coberto por papel alumínio.

KOH (HIDRÓXIDO DE POTÁSSIO) A 5%


FÓRMULA:
Hidróxido de potássio 5,0 g
Água destilada ou deionizada 100,0 mL

PREPARO:
Dissolver os dois ingredientes até a total dissolução dos componentes.
Armazenar em pote de vidro âmbar ou coberto por papel alumínio.

FLOXINA B 1%
FÓRMULA:
Floxina B 10,0 g
Glicerina 75,0 mL
Água destilada ou deionizada 175,0 mL

PREPARO:
Misturar todos os componentes e dissolver pelo calor.
Armazenar em pote de vidro âmbar ou coberto por papel alumínio.

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REAGENTE DE MELZER
FÓRMULA:
Iodo 0,5 g 2,5 g
Potássio iodado 1,5 g 7,5 g
Hidrato de cloro 20,0 g 100,0 g
Água destilada ou deionizada 20,0 mL 100,0 mL

PREPARO:
Dissolver os ingredientes e agitar.
Armazenar em pote de vidro âmbar ou coberto por papel alumínio.

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14. REFERÊNCIAS USADAS E CONSULTADAS

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Projeto Fungus Extremus – UNEB – Campus X – Ciências Biológicas – Prof. Dr. Jorge Luiz Fortuna

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