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PCR em Tempo Real Dr Robson Francisco Carvalho rfcarvalho@ibb.unesp.br Departamento de Morfologia

PCR em Tempo Real

Dr Robson Francisco Carvalho

rfcarvalho@ibb.unesp.br

PCR em Tempo Real Dr Robson Francisco Carvalho rfcarvalho@ibb.unesp.br Departamento de Morfologia

Departamento de

Morfologia

PCR em Tempo Real

PCR em tempo real
PCR em tempo real

PCR em Tempo Real

O que há de errado com os géis de agarose?

* Pobre precisão

* Baixa sensitividade

* Curta extensão dinâmica (< 2 logs)

* Baixa resolução

* Não automatizado

* Baixa sensitividade * Curta extensão dinâmica (< 2 logs) * Baixa resolução * Não automatizado
PCR em tempo real
PCR em tempo real
* Baixa sensitividade * Curta extensão dinâmica (< 2 logs) * Baixa resolução * Não automatizado

PCR em Tempo Real

O que há de errado com os géis de agarose?

* Resultados não são expressos em números

* Colorações não são muito quantitativas

* Pós-processamento do produto da PCR

* Contaminação (brometo)

do produto da PCR * Contaminação (brometo) * Discriminação baseada apenas no tamanho do fragmento PCR

* Discriminação baseada apenas no tamanho do fragmento

PCR em tempo real
PCR em tempo real
do produto da PCR * Contaminação (brometo) * Discriminação baseada apenas no tamanho do fragmento PCR
PCR em Tempo Real PCR tradicional x PCR tempo real: Starting Template PCR Round 1
PCR em Tempo Real
PCR tradicional x PCR tempo real:
Starting
Template
PCR
Round 1
2X
Cycle
Template
PCR tradicional
Deteção do produto
PCR
no gel de agarose
Round 2
4X
Análise Real-time
Constante detecção e
monitoramento dos
produtos de amplificação
durante toda corrida
(emissão de fluorescência)
Template
30-40 ciclos
PCR em tempo real
Fluorescence

Sistemas de detecção

PCR em tempo real:

Sistema baseado na detecção e quantificação de um sinal fluorescente

PCR em tempo real: → Sistema baseado na detecção e quantificação de um sinal fluorescente PCR
PCR em tempo real: → Sistema baseado na detecção e quantificação de um sinal fluorescente PCR
PCR em tempo real
PCR em tempo real
PCR em tempo real: → Sistema baseado na detecção e quantificação de um sinal fluorescente PCR
PCR em Tempo Real Vantagens do PCR em tempo real: → Não é influenciado por
PCR em Tempo Real
Vantagens do PCR em tempo real:
→ Não é influenciado por amplificação não-específica (sondas)
→ Amplificação pode ser monitorada em tempo real
→ Ciclos mais rápidos
→ Detecção de alteração menor que 2x
5x
Gel de agarose
PCR em tempo real
PCR em Tempo Real Vantagens do PCR em tempo real: → Maior extensão dinâmica (de
PCR em Tempo Real
Vantagens do PCR em tempo real:
→ Maior extensão dinâmica (de até 10 10 x)
→ Requer 1000x menos DNA que demais ensaios
(3 picogramas = 1 genoma)
→ confirmação da amplificação específica (análise da curva de melting)
→ MAIS ESPECÍFICO, SENSÍVEL e REPRODUZÍVEL
→ Não é muito mais caro que a PCR convencional
(exceção: preço do equipamento)
PCR em tempo real
PCR em Tempo Real FASES DA PCR: → Exponencial: Dobro do produto é acumulado em
PCR em Tempo Real
FASES DA PCR:
→ Exponencial: Dobro do produto é acumulado em cada ciclo (eficiência da reação
~100%). Reação específica e precisa.
→ Linear: Alta variabilidade (consumo dos componentes da reação)
→ Platô: Detecção por gel para os métodos tradicionais. Produtos não são mais
produzidos e começam ser degradados
PCR em tempo real
PCR em Tempo Real FASES DA PCR: PCR em tempo real
PCR em Tempo Real
FASES DA PCR:
PCR em tempo real
PCR em Tempo Real Desvantagens do PCR em tempo real: → Não é ideal para
PCR em Tempo Real
Desvantagens do PCR em tempo real:
→ Não é ideal para multiplex
→ Utilização requer alta habilidade técnica e suporte
→ Alto custo do equipamento
PCR em tempo real
PCR em Tempo Real Sistema Tempo Real: → Sistema óptico → Termociclador → Hardware →
PCR em Tempo Real
Sistema Tempo Real:
→ Sistema óptico
→ Termociclador
→ Hardware
→ Software
PCR em tempo real
PCR em Tempo Real 1. Polimerase encontra o primer. 2. Laser excita a sonda fluorescente
PCR em Tempo Real
1. Polimerase encontra o primer.
2. Laser excita a
sonda fluorescente
do primer.
Q
F
3. Florescência
é absorvida
pela molécula
inibidora Q.
T
4. Detector registra “no reaction”.
PCR em Tempo Real 5. Primer estendido pela Polimerase. Q F …. … T
PCR em Tempo Real
5. Primer estendido pela Polimerase.
Q
F
….
T
PCR em Tempo Real 6. Extensão continua até a polimerase encontrar a molécula fluorescente. Q
PCR em Tempo Real
6. Extensão continua até a
polimerase encontrar a molécula
fluorescente.
Q
F
7. polimerase quebra o primer
marcado. A sonda fluorescente e a
molécula inibidora são liberadas.
….
T
PCR em Tempo Real F Q Q 8. O PCR continua, os primers F marcados
PCR em Tempo Real
F
Q
Q
8. O PCR continua, os primers
F
marcados são degradados e
moléculas fluorescentes “livres”
são acumuladas.
F
Q
T
9. O detector grava a fluorescência
como medida do progresso de
amplificação.
PCR em Tempo Real Análise - SNPs - Carga viral - Patógenos - Expressão gênica
PCR em Tempo Real
Análise
-
SNPs
-
Carga viral
-
Patógenos
-
Expressão gênica
-
Transgênicos
Endpoint
Tempo Real
PCR em tempo real
PCR em Tempo Real Análise Tempo Real Endpoint PCR em tempo real

PCR em Tempo Real

PCR em Tempo Real Análise Tempo Real Endpoint PCR em tempo real
Análise Tempo Real Endpoint PCR em tempo real
Análise
Tempo Real
Endpoint
PCR em tempo real
PCR em Tempo Real Montagem da reação: PCR em tempo real
PCR em Tempo Real
Montagem da reação:
PCR em tempo real
PCR em Tempo Real PCR em tempo real
PCR em Tempo Real
PCR em tempo real
PCR em Tempo Real Terminologia: → Baseline: fluorescência do amplicon = fluorescência do meio (ruído
PCR em Tempo Real
Terminologia:
→ Baseline: fluorescência do amplicon = fluorescência do meio
(ruído liberado pela reação-background)
- ciclo da PCR com poucas mudanças no sinal de fluorescência
PCR em tempo real
PCR em Tempo Real Terminologia: PCR em tempo real
PCR em Tempo Real
Terminologia:
PCR em tempo real
PCR em Tempo Real Terminologia: → Rn: sinal do alvo normalizado pelo sinal da referência
PCR em Tempo Real
Terminologia:
→ Rn: sinal do alvo normalizado pelo sinal da referência passiva (ex. ROX)
ROX: fluorescência presente no meio (correção do volume)
Normalização: fluorescência total- fluorescência ROX
PCR em tempo real
PCR em Tempo Real Terminologia: → ∆∆∆∆Rn: magnitude do sinal gerado pela PCR (Rn –
PCR em Tempo Real
Terminologia:
→ ∆∆∆∆Rn: magnitude do sinal gerado pela PCR (Rn – Baseline)
- Normalização do “reporter” pelo background
PCR em tempo real
PCR em Tempo Real Terminologia: → Threshold: nível de ∆Rn (determinado automaticamente ou manualmente), utilizado
PCR em Tempo Real
Terminologia:
→ Threshold: nível de ∆Rn (determinado automaticamente ou
manualmente), utilizado para a determinação do CT
→ Acima do Baseline e dentro da fase exponencial da curva
PCR em tempo real
PCR em Tempo Real Terminologia: PCR em tempo real
PCR em Tempo Real
Terminologia:
PCR em tempo real
PCR em Tempo Real Terminologia: PCR em tempo real
PCR em Tempo Real
Terminologia:
PCR em tempo real
PCR em Tempo Real Terminologia: Diluição de uma mesma threshold amostra CT PCR em tempo
PCR em Tempo Real
Terminologia:
Diluição de uma
mesma threshold amostra
CT
PCR em tempo real

PCR em Tempo Real

Terminologia:

PCR em Tempo Real Terminologia: C T : cycle threshold: ciclo onde a reação cruza o

C T : cycle threshold: ciclo onde a reação cruza o limiar de detecção (threshold)

PCR em tempo real
PCR em tempo real
C T : cycle threshold: ciclo onde a reação cruza o limiar de detecção (threshold) PCR