. . UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANA Departamento de Bioquimica e Biologia Molecular re <3 BIOQUIMIC. a ) Série Didatica n. 69 Coordenagao de Processos Técnicos. Sistema de Bibliotecas. UFPR Universidade Federal do Paran4, Departamento de Bioquimica e Biologia Molecular. Bioquimica : aulas praticas / Universidade Federal do Parana, Departamento de Bioquimica e Biologia Molecular; Carmen Lucia de Oliveira Petkowicz... et al.| — 7. ed. - Curitiba : Ed. UFPR, : 2007. : 188p. : il 1. Bioquimica. I. Petkowiez, Carmen Lucia de Oliveira. IL Titulo, CDD 574.192 CDU 577.1 ISBN 9788573350371 Ref. 465 DIREITOS DESTA EDIGAO RESERVADOS A EDITORA UFPR Rua Joao Negrio, 280 - Centro Tel.: (41) 3360-7489 / Fax: (41) 3360-7486 Caixa Postal 17.309 80010-200 - Curitiba - Parana - Brasil editora@ufpr.br www.editora.ufpr.br 2007 APRESENTAGAO O propésito deste Manual de Aulas Praticas de Bioquimica é facilitar 0 aprendizado de nossos alunos, esclarecendo, por meio de experimentos simples, muitos dos fendmenos bioquimicos. A nova versao deste Manual foi inteiramente revisada e atualizada, adquirindo uma caracteristica mais jovem, tal como 0 jovem grupo de docentes que nela trabalhou. Foram eles os professores doutores Carmen Lucia de Oliveira Petkowicz, Leonardo Magalhaes Cruz, Glaucia Regina Martinez, Rose Adele Monteiro e Silvia Maria Suter Correia Cadena. Com esta nova edigao, o Departamento de Bioquimica e Biologia Molecular cumpre uma de suas importantes miss6es: a de proporcionar ensino de qualidade, aliando a oferta de aulas praticas em paralelo as atividades tedricas das disciplinas, facilitando o aprendizado dos alunos € proporcionando uma melhor vivéncia dos laboratérios. Mesmo considerando que as condigées de oferta de novas metodologias estao longe das ideais, esta obra apresenta-se como um importante recurso pedagdégico complementar, pois disponibiliza protocolos de execucao das atividades praticas, assim como alguns de seus principios fundamentais. O texto vem também acompanhado de exercicios como um ponto de partida para que os académicos possam, inclusive, pesquisar em textos mais avangados os desdobramentos e interpretagdes dos experimentos desenvolvidos. Espera-se obter um melhor rendimento na integragao do aprendizado tedrico com o pratico, © que resulta em um ganho para o aluno. A todos aqueles que colaboraram para que esta nova edicao fosse possivel, ficam registrados Os nossos agradecimentos. Chefia do Departamento de Bioquimica e Biologia Molecular 2003-2006 Profa. Dra. Maria Benigna Martinelli de Oliveira (Chefe do Depto. de Bioquimica e Biologia Molecular) Profa. Dra. Maria Berenice Reynaud Steffens (Suplente da Chefia)SUMARIO Introdugao ao laboratério / 9 PH e tampoes (parte I) / 15 PH e tampoes (parte Il) / 27 Proteinas: reacdes de caracterizacao e precipitacao / 39 Caracterizagao da enzima urease da soja/ 49 Caracterizagao de uma enzima mitocondrial: succinato desidrogenase / 57 Caracterizagao dos triacilglicerdis de dleo vegetal / 63 Extragao e caracterizagao do amido / 69 Extragao e caracterizacao de acidos nucléicos / 75 Purificagao e caracterizagao de DNA de cebola / 81 Determinacao da concentracao de proteinas / 89 Fracionamento das proteinas do leite e sua dosagem pelo método do biureto / 101 Cinética enzimatica (parte |) / 105 Cinética enzimatica (parte Il) / 113 Hidrdlise acida e enzimatica do amido / 119 Hidrdlise enzimatica do amido - curva de tempo para a atividade da amilase salivar / 129 Determinagao de uréia em material biolégico / 133 Determinagao da atividade de transaminases SGOT (Glutamico- oxalacética; ou Aspartato aminotransferase — AST) e SGPT (Glutamico- pirdvica; ou Alanina aminotransferase — ALT) / 139 Acao de enzimas proteoliticas / 145 Nitrato e nitrito redutase de plantas / 151 Determinagao da concentragao de acido ascorbico / 161 Filtragao em peneira molecular / 167 Separacao eletroforética de proteinas / 171 Eletroforese de acidos nucléicos em gel de agar / 177INTRODUGAO AO LABORATORIO Instrugées gerais O laboratério é um lugar de trabalho sério e nao deve servir para experimentos nao programados. As orientagdes enumeradas a seguir devem ser obedecidas. 1. Nao é permitido comer ou fumar dentro do laboratério. 2. E indispensavel 0 uso do avental e recomendavel o uso de dculos de seguranga. 3. Erecomendada aleitura das praticas com antecedéncia. 4. Somente os experimentos indicados na aula devem ser realizados. 5. Nao troque os reagentes de uma bancada para outra. 6. Tendo qualquer duvida, solicite aos professores os devidos esclarecimentos. 7. Cuidados especiais devem ser tomados durante o manuseio de acidos e bases fortes e materiais biologicos. 8. Comunique os professores quando houver material quebrado na bancada ou danos nos aparelhos. Quando isto acontecer, nao utilize estes materiais. Se houver quebra de material durante o experimento, comunique 0 professor imediatamente. 9. Ao final de cada aula, limpe todo o material. Descarte os residuos em frascos apropriados. Passe agua de torneira nos tubos e outros materiais utilizados. As pipetas devem ser colocadas dentro das cubas com as pontas para baixo.Instrugdes técnicas 1. Use sempre uma pipeta para cada reagente, a fim de evitar contaminagoes. 2. Leia duas vezes os rdtulos dos reativos antes de utiliza- los. 3. Atencao para nao trocar as tampas dos reagentes. 4. Para aquecer 0 tubo de ensaio na chama direta (bico de Bunsen ou fogareiro) observe se o tubo esta externamente seco, caso contrario, seque-o antes de efetuar a operacdo. Para que 0 tubo seja uniformemente aquecido, utilize pingas especiais e mantenha o tubo em constante agitacao. Nunca dirija a boca do tubo para si ou paraum colega, pois podera ocorrer um esguicho e atingi-lo. 5. Espere sempre que 0 vidro quente volte a esfriar antes de pega-lo. Lembre-se: o vidro quente aparenta estar frio. 6. Terminado o uso do bico de Bunsen ou fogareiro, verifique se as torneiras do gas estao bem fechadas, evitando assim explosées e intoxicag6es. 7. Nunca abra ou deixe abertos frascos de liquidos inflamaveis (éter, alcool, acetona, benzeno, etc.) nas proximidades de chamas. 8. Nunca devolva solugao para o frasco estoque, porque pode estar contaminada. 9. Antes de introduzir pipetas nas solucées, certifique-se de que estejam limpas. 10. Para verificar o odor da substancia, nunca leve o rosto diretamente sobre o frasco. 11. O uso das pipetas: - Paravolumes de0e 1 mL, usar pipeta de 1,mL graduada ao centésimo. - Entre 1 e 2 mL, usar pipeta de 2 mL graduada ao centésimo. f - Entre 2 e 5 mL, usar pipeta de 5 mL graduada ao décimo - Entre 5 e 10 mL, usar pipetas de 10 mL graduada ao décimo. Recomenda-se 0 uso de pro-pipetas. 12. O liquido no interior da vidraria forma menisco e a leitura deve ser na altura dos olhos. 10 Solugdes |. Métodos para expressar a concentragao das solugdes Aconcentragao de uma solugao pode ser expressa em fungao da quantidade de soluto em um volume definido de solugao, ou como aquantidade de soluto em uma massa definida de solugao ou solvente. Para melhor entendimento, alguns conceitos quimicos: MOL - E quantidade de matéria (n) de um sistema contendo tantas entidades elementares (moléculas, atomos, radicais, ions ou elétrons, como for 0 caso) quantos sao os atomos contidos em 0,012 kg de carbono 12. O mol 6 a unidade padrao de grandeza da quantidade de matéria. MASSA MOLAR (M.M.) - E razao da massa pela quantidade de matéria. A massa molar de uma substancia é expressa em unidade g/mol. Por exemplo, a massa molar do hidroxido de sddio é 40,0 g/mol. Adenominagao de massa molecular deve ser substituida por massa molar. CONCENTRAGAO (em quantidade de matéria) - de um soluto A 6 0 quociente entre a quantidade de matéria do soluto A eo volume da solugdo e é expressa em mol/L. Molaridade era o termo anteriormente utilizado. CONCENTRAGAO (em massa) - de um soluto A 6 0 quociente entre a massa do soluto A eo volume da solucao e é expressa em kg/ms. Il. Outras expresses para concentragao das solugdes PORCENTAGEM EM PESO (% p/p) — corresponde a gramas de soluto em 100 g de solugao. PORCENTAGEM EM VOLUME (% v/v) — corresponde a mililitros de soluto em 100 mL de solucao. thPORCENTAGEM EM PESO POR VOLUME (% p/v) — corresponde a gramas de soluto em 100 mL de solugao. Exemplo de calculo Calcular a concentragao (em quantidade de matéria) de uma solugao de fenilalanina (M.M. = 165,2) contendo 10 mg em 50 mL. 0,01 n = 00108 _ 9.00006 mot 165,2¢/mol 10006 mol £,00006 mol — 9.00121 mol/L lll. Reciprocidade nos calculos com solucées Duas solugdes de concentragao igual e volume igual contém amesma quantidade de soluto. Se, por diluigéo, o volume é aumentado, diminui a concentragao, existindo uma relagao reciproca entre os dois; do que se deduz que 0 produto do volume pela concentragao é constante. C.xV, =O, xP, onde: C, eC, = concentragao das solugées 1 e 2, respectivamente V, eV, = volume das solucées 1 e 2, respectivamente Exemplo de calculo Quantos mililitros de uma solugéo de NaCl 1 mol/L sao necesséarios para preparar 100 mL de NaCl na concentragao de 0,5 mmol/L? 12 1 mol/Lx¥V, =100 mL x0,0005 mol/L x=0,05 mL Exercicios 1. Se 18,2 g de glucose sao dissolvidos em 1 L de agua, qual 6 aconcentragao (em quantidade de matéria) de glucose (M.M. 182 g/ mol) na solugao resultante? 2. Qual o volume de uma solugao 50 mmol/L de glucose que contém 1 mg de glucose? 3. Qual a massa de guanidina (em g) necessaria para fazer 200 mL de uma solucao 500 mmol/L? (M.M. da guanidina = 59 g/mol). Referéncias ALMEIDA, G. Sistema internacional de unidades (SI): grandezas e unidades fisicas. 2. ed. Lisboa: Plétano,1997. MARTIN, A. N. Principios de fisico-quimica para farmacia y biologia. Madrid: Alhambra, 1967. RENDINA, G. Experimental methods in modern biochemistry. W. B. Saunders Company, 1971 13pH E TAMPOES (PARTE 1) Objetivos Determinar o pH de solugées utilizando o método colorimétrico (indicadores de pH). Reconhecer a capacidade tamponante de solugées. Relacionar os conhecimentos adquiridos ao funcionamento dos tampoes de importancia bioldgica. Relagao tedrico-pratica Conceitos de acidos e bases lonizagao da agua Definigao de pH e pKa Capacidade tamponante Fundamento Acidos e bases Segundo as definigd6es de Brénsted-Lowry, acidos sao substancias que doam prétons, e bases aceitam prétons. 15CH;COOH =—= H*+CH;COO CHjNH;’ => H* + CHsNH2 a Acido Base CHs;COO’ + H* === CHsCOOH CHyNH, +H* == CH;NH,* se Base Acido Os acidos podem ser classificados como acidos fortes ou fracos de acordo com a facilidade com que doam seus prétons em solugao aquosa. Acidos fortes sao aqueles que estao quase que completamente dissociados em solugao aquosa. O HCI é um exemplo de acido mineral forte. Assim, quando 0,1 mol/L de HC! é dissolvido em agua, 0,1 mol/L de fon proton e 0,1 mol/L de fon cloreto sao formados: Hcl > H + cr Antes da dissolugao 0,1 mol/L 0 0 Apés a dissolugao 0 0,1 mol/L. 0,1 mol/L A equagao acima precisa de dois esclarecimentos: a) na verdade, a dissociagao de HCI nao é completa mas, para finalidades praticas, a concentragao de HCI na solucao é igual a0 eade H* e Cl igual a0,1 mol/L; b) a equacao real nao é a de dissociagao de HCl, mas a agua age como base e recebe prétons: HCI+H,O === H,0°+Cr Esta equacao mostra que qualquer acido dissolvido em Agua doar protons para a base agua. O equillbrio estara tanto mais a direita quanto mais forte for o acido. Na pratica, a equagao de dissociagao simples é preferida para facilitar o tratamento. Os acidos fracos sao aqueles que se dissociam parcialmente em agua. O Acido acético, um dos acidos organicos mais simples, 6 um exemplo de acido fraco. 16 lonizagao da agua A agua pode agir tanto como um acido como uma base. De fato, em Agua pura ocorre a seguinte reagao: H,O +H,O <== H;07 + OH" onde a agua é simultaneamente um acido e uma base de Brénsted. Para facilitar, esta equagao pode ser escrita como: HO =—= H*+OH cuja constante de acidez é [#"[0H7] [4,0] Kaz= O Ka da agua é igual a 1,8 x 107°mol/L a 25 °C. Como a agua éum acido fraco, apenas uma fragao muito pequena se dissocia e sua concentracao pode ser considerada constante e igual a 55,55 mol/L. (H" [OH] 18x10" = 55,55 Kw= Kax[H,0]=55,55 x 1,8 x 107° =1,0 x 10°" =[H* ]x[OH"] Kw € denominado produto idnico da agua e expressa a relagao de concentracao de protons e ions hidréxido em solugdes aquosas. Em agua pura a 25°C, [1°] =[OH ]=1,0x107 mol/L 7 (Definigao de pH ae Como 0 acido acético 6 um acido fraco, pode-se considerar x j f oe que x << 0,1, entao: Os valores de concentragao de protons e fons hidroxido em solugées diluidas s40 muito pequenos. Em 1909, Sérensen introduziu o ‘i 5 termo pH como uma forma mais pratica de expressar concentragao de iJ x°=18x10° x01 étons. O pH foi definid prétons. O pH foi definido como x=1,3x107 mol/L pH = ioe = -log[H™] i] Como x = [H*], logo pH = 2,87. De forma semelhante, pOH é definido como: Usando 0 mesmo raciocinio, pode-se calcular o pH de uma mistura formada por 0,1 mol de acido acético e 0,1 mol de acetato de pOH =~log[OH™] sddio em um litro de agua: a Substituindo esses termos na equacgao do produto iénico da [ Reacao CH,cOOH => OH” + CH;COO™ gua: Inicio 0,1 0 01 pH + pOH =14 Reage/forma ex +X +X Equilibrio 0,1-x x 01+x Solugdo-tampao Nesse caso, x = 1,8 x 10° mol/L, logo pH = 4,74. | i Considere agora as seguintes situagdes A e B: | Para calcular 0 pH de uma solugao com 0,1 mol de acido 9 9 o acético dissolvido em um litro de agua, sabendo-se que o Situagéio A: adicionando-se uma pequena quantidade de H* Ka =1,8x10~ mol/L a 25 °C, pode-se usar a seguinte tabela: (0,001 mol) nessa solugo, 0 novo pH pode ser calculado da seguinte forma: Reagao CH;COOH =—> H* + CH,COO Inicio 01 0 0 O H* se combina com 0 CH,COO e forma CH,COOH. Entao teremos novas concentragdes de CH,COO e de CH,COOH, como. Reage/form: x +x ax indi eage/forma indicado abaixo: Equilibrio 01-x x x [CH,COO™]=0,1—0,001 = 0,099 Substituindo na equagao da constante de ionizagao: [CH,COOH] =0,1+0,001 = 0,101 | K _ [H*][CH,COO | 18x10° 2 | ae CH,COOH] Ol-x Refazendo o calculo obtém-se 0 novo valor de pH = 4,75¢ 18 19 i ae (Situagao B: adicionando-se uma pequena quantidade de H~ (0,001 mol) em agua sem a presenca dessa mistura, 0 pH pode ser calculado da seguinte forma: PH inicial = 7,0 pois HO =—= H* + OH. Se H* forem adicionados, a concentragao de prétons e ions hidréxido mudara. Considerando Kw = 1,0x 10"* mol/L, se 0,001 mol/L de HCI for adicionado a agua pura, a nova concentracao de prétons sera 0,001 mol/L (HCI é um acido forte e, portanto, se dissocia completamente) e a de ions hidréxido 1,0 x 10", mantendo o valor de Kw = 1,0 x 10°* mol/L. Dessa forma, o pH final = 3,0. Por que na situagao A o pH quase nao se alterou e na situagao Bo pH se alterou bastante? Uma mistura como a da situagao A contém um reservatorio de Acido protonado e também de acido desprotonado (base conjuga- da). A adicgao de H* nao promoveu uma variagao da [H*], pois ele foi consumido pela base conjugada. Ja na situagao B nao ha um reservatério de base conjugada para se combinar com o H+, “sobra” H* e entao o pH muda. Esse tipo de mistura -um acido com sua base conjugada -é conhecida como solugao-tampao. Ou seja, uma solucao que resiste a variagao de pH quando se adiciona H* ou OH. Essa regra vale para misturas de acido protonado e sua base conjugada a partir da proporgdo de 1:10 até 10:1, o que na pratica corresponde ao intervalo de pH entre o pKa + 1, ou seja, para o exemplo. do acido acético, esta substancia funciona como um tampao de pH = 3,74 a pH = 5,74. A capacidade tamponante depende da proporcao entre o Acido protonado e sua base conjugada, mas também depende da concentracao total dessas espécies: quanto maior a concentracao de ambos, maior a capacidade tamponante, pois nesse caso maior é 0 “reservatdrio” de espécies capazes de manter a [H*] sem grandes alteragoes. Determinagao do pH de uma solugao Para determinar 0 pH de uma solugao, podemos usar certos compostos que tém a capacidade de mudar de cor em fungao da [H*]. 20 Essa mudanga de cor pode acontecer em um pH diferente para cada composto. Esses compostos sao conhecidos como indicadores acido base e sao, na verdade, acidos fracos que mudam de cor se estao protonados ou desprotonados. Essa mudanga de cor vai acontecer na regiao proxima ao seu pKa. A dissociagao de um indicador acido (HIn) em forma simplificada é a seguinte: Hin = Iv+H* (acido) (base) corA corB Aadicao de acido a solugao de indicador aumenta a concen- tragao de H*, reprime a dissociagdo do indicador e ha predominancia da cor da forma acida. A adigao da base diminui a concentragao de H*, a equacao se desloca para a direita, produzindo mais indicador ionizado (In) e predominancia da cor basica. A cor do indicador é, portanto, uma fungao do pH da solucao. Para determinar 0 pH de uma solucao, adicionam-se algumas gotas de solucao de um dos indicadores mencionados e compara-se a cor desenvolvida com a cor de uma série de tampdes de pH conhecido e contendo a mesma quantidade de indicador. Os indicadores universais sao misturas de varios indicadores, a fim de abranger um intervalo mais amplo de pH. Os papéis indicadores sao papéis impregnados de um indicador ou de indicadores e sao usados para determinagao aproximada do pH. O método potenciométrico é o mais preciso para a determina- cao do pH. Usa-se, geralmente, o aparelho chamado potencidmetro, que consiste de um eletrodo de vidro, um eletrodo de calomelano e um sistema para medida de voltagem. O potencial é dado pelo eletrodo de calomelano (cloreto mercuroso em contato com solugao saturada de KCl). O eletrodo de vidro compde-se de um bulbo de vidro especial contendo HCI 0,1 mol/L em contato com um eletrodo metalico. Quando 0 eletrodo de vidro é imerso em uma solugao de concentragéo de H* desconhecida, cria-se um potencial entre as solugées interna e externa. Como a voltagem do eletrodo de calomelano é constante, a diferenca de potencial entre os dois eletrodos é diretamente relacionada com a concentracao de H* da solucao desconhecida. 27Tabela 1. Caracteristicas gerais de indicadores, indicadores universais e papéis universais Indicador pk Cor e zona de pH. Azul de timol (Acido) 1,7 1,2vermelho 2,8 amarelo Amarelo de metila 3,3 1,2vermelho 4,0 amarelo Laranja de metila 3,5 3,1 vermelho 4,4 amarelo Azul de bromofenol 4,0 3,1 amarelo 4,7 azul Verde de bromocresol 47 3,8 amarelo 5,4 azul Vermelho de metila 5,0 4,2 vermelho 6,3 amarelo Vermelho de clorofenol 6,0 5,1 amarelo 6,7 vermelho Purpura de bromocresol 6,2 5,4 amarelo 6,7 vermelho Azul de bromotimol 71 6,1 amarelo 7,7 azul Vermelho de fenol 78 7,0 amarelo —_8,6 vermelho Vermelho de cresol 8,3 7,4amarelo —_9,0 vermelho Azul de timol (alcalino) 8,9 8,0 amarelo 9,6 azul Fenolftaleina 9,4 8,3 incolor 10,0 vermelho Indicador universal 3,0 vermelho; 4,0 alaranjado; 5,0 laranja; 6,0 (laranja de metila, vermelho de amarelo; 7,0 verde amarelado; 8,0 verde metila, azul de bromotimol e azulado; 9,0 azul; 10,0 violeta e 11,0 fenolftaleina) purpura papel de tornasol vermelho 4,5 azul 8,3 papel de vermelho do congo azul 3,0 vermelho 4,5 papel indicador universal Solugdes-tampao em sistemas bioldgicos Em sistemas biolégicos, as solugdes-tampao sao essenciais para manter o pH. Muitos compostos podem formar solugdes-tampaéo, como H,PO,/HPO,? e H,CO,/HCO,;. Embora os aminoacidos apresentem grupos ionizaveis, como COOH e NH,”, os pKas desses grupos estao fora da regiao de pH do meio celular (entre 6,9 e 7,4); 0 nico aminoacido com capacidade tamponante nessa regiao é a histidina, pois o pKa de seu grupo lateral é 6,0. 22 Técnica |. Escala-padrao de pH 1. Preparar uma bateria de 8 tubos e identifica-los com os valores de pH (de 3 a 10). 2. Colocar em cada tubo 1 mL de cada solugao-tampao. 3. Adicionar 5 gotas do indicador universal. 4. Adicionar 9 mL de agua destilada. ll. Determinagao do pH e verificagao dos fatores que influenciam o pH 1. Preparar uma bateria de 4 tubos e identifica-los como A, B,CeD. 2. Adicionar 5 gotas de indicador em cada tubo. 3. Adicionar 10 mL de agua destilada nos tubos Ae C. 4, Adicionar 1 mL do tampao de pH 7,0 + 9 mL de agua nos tubos Be D Determinar 0 pH de cada solugao, comparando com aescala-padrao de pH e anotar o resultado na tabela de resultados 5. Adicionar 1 gota de NaOH 0,1 mol/L nos tubos A e B. Observar e determinar 0 pH de cada solugao, comparando com a escala-padrao de pH e anotaro resultado na tabela de resultados 6. Soprar o ar expirado (com cuidado) por 15 segundos no tubo A e por 1 minuto no tubo B. Observar e determinar o pH de cada solugao, comparando com a escala-padrao de pH e anotar o resultado na tabela de resultados 237. Adicionar 1 gota de HCI! 0,1 mol/L nos tubos C e D. Observar e determinar 0 pH de cada solugao, comparando com a escala-padrao de pH e anotar o resultado na tabela de resultados 8. Continuar a adit obter a cor do tubo C. 10 de HCI ao tubo D, gota a gota, até Determinar quantas gotas de HCI devem ser adicionadas até que se obtenha a mesma coloragao do tubo 3 e anotar o resultado na tabela de resultados Tabela de resultados Tubos __|Amostra pH | gua destilada TuboA |+ 1 gota de NaOH 0,1 mol/L + ar expirado por 15s ‘Solugao de pH 7,0 TuboB [+ 1 gota de NaOH 0,1 mol/L + ar expirado por 1 min [agua destilada + 2 gotas de HCI 0,1 mol/L Solugao de pH 7,0 TuboD | +2 gotas de HCI 0,1 mol/L n° de gotas p/ ter 0 pH = ao tubo C Tubo C 24 Exercicios 1. Vocé dispde de duas substancias (A e B), conforme indicado abaixo: Substancia (A): acido acético (CH,COOH) (pKa = 4,76) Substancia (B): acido fosférico (H,PO,) (pKa, = 2,14; pKa, = 6,86 e pKa, = 12,4) a) Para cada substancia, escreva a equagao de dissociagao para cada pKa. b) Escolha uma delas para preparar uma solugao-tampao em pH = 2,5. Justifique sua escolha. 2. Explique como funciona a manutengao do pH por uma solugao-tampao. 25pH E TAMPOES (PARTE II) Objetivos Determinar a variagao de pH de uma solucao de glicina 0,1 mol/L apos adigdes sucessivas de NaOH 0,1 mol/L. Relacionar as observagdes com a curva de titulagao desse aminoacido e identificar as regides caracteristicas. Relagao teérico-pratica Conceitos de acidos e bases lonizagao da agua Definicao de pH e pKa Titulagao acido-base Equagao de Henderson-Hasselbach Capacidade tamponante Valores de pKa de aminoacidos Aminoacidos e proteinas: estrutura e fungao Fundamento Titulagao acido fraco monoprético —base forte Quando uma solugao 0,1 mol/L de acido acético é titulada com NaOH 0,1 mol/L, temos: 27CH3;COOH + OH’ =—* CH;COO' + HO Esta primeira reagao produz um aumento rapido do pH no inicio da titulagao (figura 1). No entanto, com o aumento da concen- tragao de acetato, que é uma base moderadamente forte, temos: CH3COO’ +H" === CH;COOH Portanto, enquanto uma reagao consome acido acético, a outra o produz. Estes efeitos contrarios fazem com que, apés titulagao de cerca de 10% do acido, a taxa de aumento do pH pela adicao da base diminua. O pequeno incremento no pH pela adigao de base continua até que cerca de 90% do acido esteja neutralizado. A partir deste ponto, a taxa de variagao do pH se acentua porque a concen- tragao de acido acético j4 é muito baixa na solucao e pequenas adi¢oes de NaOH provocam grande aumento no pH. O pH sobe rapidamente, atingindo o ponto de equivaléncia, em que todo 0 acido foi neutralizado. Finalmente, a curva atinge uma regiao onde o pH varia relativamente pouco, mas é fungao apenas da diluigao da base adicionada a solucao. A curva de titulagao de um acido fraco chama a atengéo em dois aspectos: a) aregiao onde o pH varia muito pouco com a adicao de NaOH; b) oponto de equivaléncia é superior a 7,0. Como acetato é o produto final da titulagao e é uma base forte, temos: CH;COO' +H,O0 =— = CH3COOH + OH” Justificando o pH maior que 7,0 no ponto de equivaléncia. 28 14 glicina pH 7 1,0 0,5 0 60,5 1,0 Equiv. de HCl Equiv. de NaOH. Figura 1. Curva de titulagao do Acido acético e da glicina Equagao de Henderson-Hasselbach A regiao onde o pH varia pouco na curva de titulagao é uma regiao tamponada e constitui uma solugao-tampao. A relagao entre pH, concentragao de acido e de base conjugada pode ser determinada matematicamente. Assim, podemos relacionar [H*], [CH ,COOH] e [CH ,COO}: oa [H*][CH,COO] [CH,COOH] Aplicando logaritmo em ambos os lados e rearranjando: [CH,COO"] H = pKatl PIAS PLES CH COOH Para um acido HA, 29[4] H = pKa +log-——— pH = pKat+ 8 nal onde A é a base conjugada e HA 0 acido nao-dissociado. Esta 6 a equagao de Henderson-Hasselbach, que descreve a variagao do pH de uma mistura de um acido fraco nao-dissociado e sua base conjugada. Se a concentragao de HA for muito menor do que a de A” (mais do que 10 vezes), quando for adicionada uma base, 0 pH aumentara por falta de HA para neutraliza-la e vice-versa. Assim, se as concentragdes destas duas espécies (par acido-base conjugados) estiverem num intervalo de até [A] / [HA] = 0,1, a solugao resistira ao aumento do pH quando uma base forte for adicionada, ou diminuigao por excesso de Acido forte. A relagao de concentragées esta automa- ticamente ligada ao pH pela equagao de Henderson-Hasselbach. Isto quer dizer que um dado par acido-base conjugado sé pode ser usado para formar uma solugao-tampao num certo intervalo de pH. Este intervalo pode ser determinado. Para [41 19 [H4] pH = pKa+logl0 pH = pKa+1 Para deel [H4] pH = pKa +log0,1 pH = pKa-1 Ou seja, 0 intervalo em que o par [4 ]/(HA] funciona como tampao vai de PH = pKa—1 até pH = pKa~+1 e este intervalo é denominado faixa de tamponamento do par acido-base conjugado. O 30 par acido acético/acetato, cujo pKa é 4,74, apresenta uma faixa do tamponamento entre pH = 3,74 e 5,74. Assim, se 0 pH da solugao tampao precisa ficar entre 6,0 e 6,5, o acido acético/acetato nao sera um bom tampao. O par H,PO,/HPO,,? (pKa = 6,8) seria mais apropriado. Quando as concentragées de HA e de A forem iguais, a equacao de Henderson-Hasselbach produz um resultado importante: A PH = pKa +log hse (HA) =[4" Tent: (714) _ [4] le pH = pKa+logl pH = pKa Isto é, quando metade do acido fraco for consumida (meio caminho da titulagao), o pH da solugao resultante sera igual ao pKa do acido fraco. Este é o método mais usado para determinagao do pKa de um acido fraco. Uma solugaéo-tampao também pode ser formada pela mistura de uma base fraca e seu acido conjugado. Por exemplo, o par NH,/NH,* funciona como um sistema tampao, pois: NH3 + H* =—= NH,” =e ~~ NH, OH 2 NH3 +H,O Titulagao acido fraco diprotico —base forte Quando uma substancia possui mais de um grupo ionizavel, a curva de titulagao se torna mais complexa. Os aminoacidos estao nesta categoria. A glicina, o aminoacido mais simples, possui dois grupos ionizaveis: os grupos amino e carboxila nas suas formas protonadas. Nesta forma, a glicina pode ser representada como: *NH,CH COOH 37Ambos os grupos (RNH,,* e RCOOH) sao grupos acidos fracos. A titulagao deste acido com uma base forte deve passar por dois estagios. O primeiro é a titulagao do grupo acidico mais forte, a carboxila: *NH3CH,COOH + OH === ‘NH3CH;COO™ + H,0 O produto desta reacao possui uma carga negativa e uma positiva, mas a carga liquida desta espécie é nula. Este ion é chamado de zwiterion ou ion dipolar. Este primeiro estagio é muito semelhante a titulagao do acido acético (figura 1). Contudo, a adigao de mais NaOH produz um perfil diferente. Isto ocorre porque o segundo grupamento acidico reagira com o OH. *NH,;CH,COO’ + OH) 2—* NH2CH,COO + H,O O perfil assemelha-se a uma sobreposicao de duas curvas de titulagao (figura 1) e, de fato, é isto mesmo o que o ocorre. A titulagao de cada um dos grupos ionizaveis pode ser tratada individualmente pela equagao de Henderson-Hasselbach, permitindo a determinacao de pKa dos dois grupos acidos. Accurva da titulagao da glicina na figura 1 mostra que o grupo carboxila possui pKa de 2,34, e o grupo amino, 9,60. O pKa do grupo mais acidico 6 denominado pKa, e do grupo menos acidico pKa,. E importante notar que o pH do meio determina a presenga das diferente espécies: 1) pH menor do que 2,34, predomina *NH,CH,COOH 2) pH = 2,34, [*NH,CH ,COOH] = [*NH,CH,COO} 3) 2,34 < pH < 9,6, predomina *NH,CH,COO: 4) pH = 6,0, existe quase somente a forma de jon dipolar *NH,CH,COO 5) pH = 9,6, ['NH,CH,COO} = [NH,CH,COO}] 6) pH > 9,6, predomina NH,CH,COO- O pH no qual a soma das cargas da molécula é igual a zero é denominado de ponto isoelétrico ou pl. Quando o pH = pl, praticamente todo aminoacido esta na forma de zwiterion e, se submetido a um campo 32 elétrico, nao migrara naquele pH. Teoricamente este pH pode ser determinado como a média aritmética dos pKas dos grupos carboxila e amino, quando nao existem grupos ionizaveis na cadeia lateral. Assim, para a glicina: pt = PKA + pKa, _234+9,60 _ 5 97 2 2 Técnica Determinacao do pH de uma solugao de glicina sob adicdes sucessivas de NaOH 1. Colocar em um béquer 10 mL de uma solugao de glicina 0,1 mol/L. Determinar o pH da solugao usando a escala-padrao de pH e anotar o resultado na tabela de resultados > 2. Adicionar 1 mL de NaOH 0,1 mol/L até um total de 9 mL. Observar, determinar o pH da solugao PARA CADA ADIGAO usando a escala-padrao de pH e anotar o resultado na tabela de resultados > 3. Adicionar NaOH 0,1 mol/L gota a gota até pH > 8. Observar, determinar o pH da solugao PARA CADA ADICGAO usando a escala-padrao de pH e anotar 0 resultado na tabela de resultados > 4. Adicionar 1 mL de NaOH 0,1 mol/L até um total de 10 mL. Observar, determinar 0 pH da solugao PARA CADA ADICAO usando a escala-padrao de pH e anotar o resultado na tabela de resultados > 33Tabela de resultados Adig&io de NaOH 0,1 mol/L Inicio Observagées pH Deta9mL Gota a gota +10 mL Exercicios Histidina + O° H N NH,+ H 1. Construa a curva de titulagao da histidina (pKa, = 1,8; pKa, = 6,0 e pKa, = 9,2). 2. Desenhe aestrutura do aminoacido quando o pH for igual ao pKa,, pKa, e pKa... 3. Em qual pH esse aminoacido tem carga liquida igual a zero? Qual a sua estrutura no pl? 4. Indique as regides de pH nas quais esse aminoacido pode atuar como solucao-tampao. Referéncias ATKINS, P;; JONES, L. Principios de quimica: questionando a vida moderna e 0 meio ambiente. Bookman, 2001. NELSON, D. L.; COX, M. M. Lehninger: principios de bioquimica. 3. ed. Sao Paulo: Sarvier, 2002. RENDINA, G. Experimental methods in modern biochemistry. Philadelphia: W. B. Saunders, 1971 34 Informagdes complementares Lista de reativos: solugdes-tampao de pH 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9; 10 solugao de glicina 0,1 mol/L em pH 2,5 solugao-tampao fosfato 0,1 mol/L em pH 7,0 solugao de indicador universal hidréxido de sdédio 0,1 mol/L Acido cloridrico 0,1 mol/L PV Pops Preparo dos reativos: 1. Solugao-tampao na faixa de 3-10 Pesar 5,0 g de Acido bérico e dissolver em 1 L de agua destilada, adicionar 5,6 mL de acido ortofosférico e 4,8 mL de acido acético glacial, completar para 2 L com agua destilada. O pH da mistura fica em torno de 1,9. A partir desta solugdo, adicionar NaOH 0,2 mol/L para obter os pH desejados. Assim, para pH 3,0 sao usados 46,7 mL de NaOH para 250 mL da mistura de acidos e para pH 10,0 sdo usados 100 mL de NaOH para 121,7 mL da mistura de acidos. 2. Solugao de glicina 0,1 mol/L em meio acido Dissolver 7,5 g de glicinaem 1 L de HCI 0,1 mol/L 3. Solugao-tampao fosfato 0,1mol/L pH 7,0 Solugao A: Pesar 27,8 g de fosfato de sddio ou potassio monobasico e dissolver em agua destilada em balao volumétrico de 1 litro, para obter solugao 0,2 mol/L. Solugdo B: Pesar 53,65 g de fosfato de sddio dibasico (Na,HPO,.7H,0) ou 71,7 g (Na,HPO,.12H,0) edissolver em agua destilada em balao volumétrico de 1 litro, para obter solugao 0,2 mol/L. A tabela abaixo apresenta a relacdo entre os volumes das solugdes A e B € os pH resultantes. 356 Bil] mes UInu| L947 Misturar 39,0 mL da solugao A com 61,0 mL da solugao Be diluir para 200 mL para obter a solugao de tampao fosfato 0,1 mol/L, pH 7,0. 4. Solugao de indicador universal Pesar 0,05 g de laranja de metila, 0,15 g de vermelho de metila, 0,30 g de azul de bromotimol, 0,35 g de fenolftaleina e solubilizar em alcool etilico a 66%, completando o volume para um litro. Informagées sobre os reagentes: 1. Laranja de metila MM: 305,353 g/mol Formula molecular: C,,H,,N,O,S salts 3) Estrutura: 36 2. Vermelho de metila MM: 269,299 g/mol Formula molecular: C,,H,.N,O, 151 152 Estrutura: 3. Azul de bromotimol MM: 624,382 g/mol Formula molecular: C,,,H,,Br,O,S Estrutura: 4. Fenolftaleina MM: 318,323 g/mol Formula molecular: C,,H,,O, Estrutura 37PROTEINAS: REACOES DE CARACTERIZAGAO E PRECIPITAGAO Objetivos Evidenciar a presenga de proteinas por meio de reagdes de coloragao e verificar a precipitagao de proteinas com e sem desna- turagao. Relagao teérico-pratica Estrutura de proteinas Fundamento Reagoes de caracterizagao As proteinas reagem com uma variedade de compostos, formando produtos coloridos. A maioria das reagdes de caracterizagao de proteinas ou aminoacidos se deve a presenga de ligagdes ou grupos quimicos especificos. Existem reagdes de coloragdo que sao especificas para certos grupos funcionais de aminoacidos encontrados nas proteinas, enquanto outras reagdes, chamadas de gerais, caracterizam 39grupamentos comuns a todas as proteinas. Entre as reagdes consideradas gerais estao a reagao da ninhidrina e a reacao do biureto, as quais caracterizam grupos amino e ligagdes peptidicas, respec- tivamente. Reagao da ninhidrina Os grupos o-amino de aminoacidos livres, grupos amino terminais de peptideos e proteinas, e grupo e-amino da lisina reagem com aninhidrina formando um produto de cor violeta, quando a solugao é aquecida (figura 1). A intensidade da cor é proporcional 4 concentragao de aminoacidos. Por esse motivo a técnica 6 utilizada para sua determinagao quantitativa. Os iminoacidos (prolina e hidroxiprolina) formam produtos amarelos. ° R ‘OH ~ “aN NH 6 ° ° , \ +H | ° OH Figura 1. Reago da ninhidrina com aminoacido Reagao do biureto A reacgao do biureto se deve as ligagdes peptidicas, sendo positiva para peptideos com mais de dois aminoacidos e proteinas. As proteinas ou peptideos, quando tratados com uma solugao de sulfato de cobre em meio alcalino, desenvolvem uma coloragao lilas caracteristica. A cor é atribuida 4 formagao de um complexo de coordenacao entre 0 Cu** e atomos de nitrogénio (provenientes de ligagdes peptidicas) de cadeias adjacentes (figura 2). Os dipeptideos dao reagao negativa por apresentarem apenas uma ligacao peptidica. 40 Figura 2. Complexo formado pelo Cu com os nitragénios de ligagdes peptidicas O nome da reacao é derivado do composto biureto (figura 3), 0 qual também da reacao positiva neste teste. i q H2N — C — NH—C— NH, Figura 3. Estrutura do biureto Asolugao de sulfato de cobre em meio alcalino que é utilizada. na reacao do biureto é conhecida como reativo do biureto. Reagoes de precipitagao A solubilidade das proteinas 6 muito variavel e depende da distribuigao e da proporgao dos grupos polares (hidrofilicos) e apolares (hidrofébicos) na molécula. Fatores como o pH do meio, a concentragao | de sais e a constante dielétrica do solvente também afetam a solubilidade. Muitas proteinas sao soltiveis em Agua ou solucées salinas. Uma vez que as proteinas podem possuir muitos grupos carregados positivamente e negativamente provenientes das cadeias laterais dos aminoacidos, as moléculas podem interagir umas com as outras, com pequenos ions de cargas opostas e com a agua. Assim, ocorrem interagdes proteina-proteina, proteina-agua e proteina-pequenos ions. Se a interagao proteina-proteina é grande e a interagao proteina-agua é pequena, a proteina tendera a ser insoltivel. Por outro lado, se a interagao proteina-agua é alta, a proteina tendera a ser sollivel. Qualquer condigao que altere estas interacdes podera afetar a solubilidade das proteinas. 41Em geral, a desnaturagao diminui a solubilidade das proteinas. Areducao da solubilidade pode ser explicada pela exposicao de radicais hidrofébicos e outros que prejudiquem as interagdes proteina-agua e favorecam as interagoes proteina-proteina. Existem varias condig6es desnaturantes, tais como tempera- turas elevadas, pHs extremos, sais de metais pesados e solventes organicos. Temperaturas elevadas aumentam a agitagao térmica, afetando as interacdes que estabilizam a estrutura tridimensional das proteinas (pontes de hidrogénio, interagdes hidrofébicas). Condigées de pHs extremos, por causa da adigao de acidos ou bases fortes, alteram o estado de ionizagao dos aminoacidos, afetando as interagées idnicas que estabilizam a estrutura tridimensional das proteinas. Além disto, as bases provenientes de certos acidos fortes podem interagir com as cargas positivas presentes na proteina, formando sais que resultam na desnaturagao e precipitagao. A precipitagao de proteinas pela adigao de sais de metais pesados é atribuida a combinagao do cation metalico (Pb**, Hg**, etc.) com cargas negativas que podem estar presentes na proteina, resultando na formagao de sais insoluveis (proteinato de chumbo, proteinato de mercurio, etc.). A precipitagao é favorecida quando o pH esta do lado alcalino do ponto isoelétrico da proteina gragas ao aumento do numero de cargas negativas na proteina. Solventes organicos também podem interferir nas interagdes que estabilizam a estrutura tridimensional das proteinas (pontes de hidrogénio e interagdes hidrofébicas), promovendo desnaturagao e precipitacao. Entretanto, neste caso ha um fator adicional envolvido no mecanismo de precipitacao, a constante dielétrica do solvente. A forga das interagdes eletrostaticas (F) depende da magni- tude das cargas envolvidas (q,, q,), da distancia entre os grupos carregados (r) e de uma propriedade fisica do solvente conhecida como constante dielétrica (e). A relagao entre a forca de atracao eletrostatica e os parametros mencionados é dada pela lei de Coulomb: F=q,xq,/exrP A constante dielétrica é uma medida derivada do momento dipolar da molécula e pode ser determinada por medidas de capacitancia. Em termos simples, a constante dielétrica é uma medida da assimetria de carga intrinseca ou induzida em um campo elétrico. A Agua apresenta uma constante dielétrica elevada, ¢ =80, atenuando as 42 interagdes idnicas. Assim, a forga de atragao entre moléculas protéicas contendo radicais com cargas opostas é baixa, fazendo com que predominem interagdes proteina-agua em vez de interagdes proteina- proteina. Os solventes organicos apresentam constantes dielétricas inferiores & da agua (por exeMPIO, €,,.,2ono= 235 Egtanoi= 24105 € corotomio= 4,8). Consequientemente, as interagoes idnicas nestes solventes sao muito mais fortes do que em agua. Portanto, a adicdo de um solvente organico a uma solugao aquosa de proteina pode conduzir a precipitacao, por favorecer interagdes eletrostaticas proteina-proteina. Em baixas temperaturas (0°C ou menos), os solventes organicos podem promover precipitagao somente por efeito da constante dielé- trica. Nestas condigées, as proteinas podem ser precipitadas sem desnaturagao. As proteinas também podem ser precipitadas sem sofrer desnaturacao por variagao do pH e por alteragdes da forga iénica do meio. Muitas proteinas podem ser precipitadas ao se variar o pH da solugao até o seu ponto isoelétrico. O ponto isoelétrico de uma proteina é definido como 0 pH no qual a carga liquida da molécula é zero. Neste PH, a solubilidade das proteinas em solugao aquosa é minima, pois a presenga de um niimero equivalente de cargas positivas e negativas na superficie da molécula aumenta a atragao idnica, minimizando a repulsao eletrostatica entre as cadeias. A solubilidade das proteinas também pode ser alterada pela presenca de sais. A capacidade dos sais neutros de influenciar a solubili- dade de muitas proteinas é uma fungao da forga idnica (I). A forga iénica de uma solugao salina é uma fungao tanto da concentragaéo como da valéncia dos cations e anions que formam o sal, sendo definida como: 1 = %3M,xZ? Onde M, 6a molaridade do joni, e Zé asua valéncia. A soma é feita para todos os fons. Para NaCl, por exemplo, Z,,, = +1eZ,, = -1,e uma vez que M,,, = M,,, para uma solugao de NaCl a forga idnica equivale @ concentragao (In. = Myac)- Assim, para eletrdlitos 1:1, a Nac ica é igual a molaridade do sal, mas isto nao ocorre quando forga, ionecivalentes ou de valéncia maior estao envolvidos. Estes ions multivalentes conferem maior contribuigao individual a atmosfera iénica do que os ions monovalentes, uma vez que o quadrado da carga iénica é incluido no calculo da forga idnica e, neste caso, | > M. 43Em baixa forga iénica, os sais aumentam a solubilidade de muitas proteinas, um fendmeno denominado “salting-in”. O efeito é atribuido a interagao da proteina com o sal, causando diminuigao na interagao proteina-proteina. Um efeito oposto na solubilidade das proteinas é obtido na presenga de sal em elevada forga iénica. As proteinas podem ser precipitadas sem desnaturacao por meio da adicao de um sal em alta forga iénica. O fenédmeno é conhecido como “salting out” e, embora envolva varios aspectos fisico-quimicos, pode-se considerar que a adigao do sal remove a agua de hidratagéo das moléculas, resultando na predominancia de interagdes proteina-proteina. Observa-se uma grande diferenca entre os diferentes sais quanto ao seu efeito na solubilidade das proteinas. Sais tri ou divalentes sao mais eficientes em promover a precipitagao por “salting out”, sendo o (NH,),SO, 0 mais utilizado, por causa da sua alta solubilidade, permitindo obter solugdes de elevada forga idnica. A forga iénica requerida para a precipitacao varia para as diferentes proteinas. Assim, uma mistura de proteinas pode ser fracionada pela adigao de concentragées crescentes de (NH,),SO,. Técnica |. Reagdes de coloragao 1. Reagao da ninhidrina Tubo 1: 2 mL de ninhidrina + 5 gotas de proteina 10%, banho- maria fervente por 5 min. Anotar o resultado. 2. Reagao do biureto Tubo 2: 1 mL de proteina 10% + 1 mL de reativo do biureto. Anotar o resultado. Tubo 3: 1 mL de agua destilada + 1 mL do reativo do biureto. Anotar 0 resultado. 44 ll. Reagdes de precipitagao 1. Temperatura elevada Tubo 4: 2 mL proteina 10%, aquecer em banho-maria fervente por 3 minutos. Anotar o resultado. 2. Acido forte Tubo 5: 1 mL proteina 10% + 1 mL de acido tricloroacético 10%. Anotar o resultado. 3. Sal de metal pesado Tubo 6: 1 mL de proteina 10% + 1 mL de acetato de chumbo 5%. Anotar o resultado. 4, Solvente organico Tubo 7: 1 mL de proteina 10% + 3 mL de alcool etilico. Anotar 0 resultado. Ill. Efeito da adigao de sais sobre a solubilidade da proteina adivions WL2 K4me) Tubo 8: 2 mL de solugao contendo precipitado esbranquigado de proteina + NaCl 1 mol/L gota a gota, até o precipitado redissolver. Tubo 9: 2 mL da solucao anterior + aproximadamente 4 mL de solucao saturada de sulfato de aménio. Observar. Adicionar 4 a6 mL. de agua destilada e observar 0 efeito. — 45Exercicios 1. Em que se fundamenta a reacao da ninhidrina e que classes de substdncias reagem positivamente? 2, Em que se fundamenta a reagao do biureto e que grupos nas proteinas sao responsaveis por esta reagao? 3. Qual a importancia da reagao do biureto? 4. Qual 6 a importancia das reacdes de precipitagao de proteinas por sais de metais pesados? Explique 0 mecanismo da precipitagao. : 5. Explique os mecanismos que levam uma proteina a dissolver-se em um pequeno aumento na forga idnica da solugao e os mecanismos que levam uma proteina a precipitar por um grande aumento na forga idnica da solugao. 6. Que mudangas ocorrem com uma proteina quando em contato com o etanol? 7. As solubilidades de duas proteinas em fungao da con- centragao de sulfato de am6nio estao mostradas no diagrama abaixo. Como esta observacao pode ser usada para separar as proteinas A e B? 4—ProteinaA —a- Proteina B Solubilidade (mg/mL) 0 1 2 3 4 5 Concentragao de sulfato de amonio (mol/L) 46 Referéncias DANIEL, L. J.; NEAL, A. L. Laboratory experiments in biochemistry. New York: Academic Press, 1967. 301 p. DRYER, R.L.; LATA, G. F. Experimental biochemistry. New York: Oxford University Press, 1989. 514 p. LEHNINGER, A. Principios de bioquimica. 3. ed. Sao Paulo: Savier, 2002. 970 p. MATHEWS, C. K.; VAN HOLDE, K. E. Biochemistry. Red Wood City: The Benjamin Cummings, 1990. 1129 p. MORRIS C. J. O. R.; MORRIS, P. Separation methods in biochemistry. 2. ed. London: Pitman Publishing, 1976. 1045 p. OSER, B. L. Hawk's physiological chemistry. 14. ed. New York: Mac-Graw, 1965. 1472 p. Informag6es complementares Lista de reativos: - Solugao de proteinas 10% (v/v) . Solugao de ninhidrina 0,1% (p/v) . Reativo do biureto . Acido tricloroacético (TCA) 10% (p/v) Acetato de chumbo 5% (p/v) Alcool etilico absoluto Solugao contendo proteina precipitada Cloreto de sddio 1 mol/L Solugéosaturada de sulfato de aménio 75% (p/v) CRNOTAONS Preparo dos reativos: 1. Solugao de proteinas Preparar uma solucao de clara de ovo a 10% (v/v) em solugao salina (NaCl 0,9 g/100mL) ou tampao fosfato 10 mmol/L, pH 7,0. 472. Solugao de ninhidrina Dissolver 100 mg de ninhidrina em 100 mL de tampao fosfato 0,01 mol/L, pH 7,0. Conservar em frasco escuro e em geladeira. 3. Solugao contendo proteina precipitada Adicionar agua destilada a 15 mL de clara de ovo pura até a formacao de precipitado esbranquigado. 48 CARACTERIZAGAO DA ENZIMA UREASE DA SOJA Objetivos Demonstrar a natureza protéica da enzima. Determinar qualitativamente a atividade enzimatica de uma enzima. Demonstrar a desnaturacao protéica. Exemplificar a inibigao enzimatica. Demonstrar a especificidade da agao enzimatica. Relagao tedrico-pratica Proteinas e enzimas Fundamento A urease ocorre em algumas bactérias e plantas, sendo facilmente extraida da soja cine max). A urease catalisa a hidrdlise da uréia em aménia e didxfdo de carbono (figura 1). 49a a yo — > o=c=0 HON NH. HOH e : : DIOXIDO DE UREIA AGUA CARBONO = AMONIA Figura 1. Reacdo catalisada pela enzima urease Em meio aquoso, a aménia e o didxido de carbono, produtos da reacao catalisada pela urease, formam carbonato de aménio a partir de trés reagdes que ocorrem espontaneamente (figura 2). 2NH, +2H,O 2—*= 2NH,OH HIDROXIDO DE AMONIO CO,+H,O === HCO, ACIDO CARBONICO 2NH,OH +H,CO, < (NH,),CO, + 2 H,O CARBONATO DE AMONIO Figura 2, Reagdes que levam a formagao de carbonato de aménio a partir de aménia, didxido de carbono e Agua A atividade da enzima pode ser verificada pela formacao do carbonato de aménio, que é um sal de carater basico, e cuja presenca pode ser revelada por meio de um indicador acido-basico, como vermelho de fenol. O indicador passa de cor amarela em meio acido ou neutro para cor vermelha em meio basico. A tiouréia (figura 3), um composto estruturalmente andlogo a uréia, pode ser utilizada pela urease, formando aménia como um de seus produtos. A eficiéncia catalitica 6 pelo menos seis vezes menor que aquela na qual a uréia é o substrato. A interagao da uréia coma urease é cerca de 15 a 30 vezes mais forte que a da tiouréia, o que pode ser interpretado pela participagao de uma ligacao de hidrogénio com 0 oxigénio da uréia no sitio ativo, tornando a uréia o substrato preferencial. 50 f Ce H,N NH, TIOUREIA Figura 3. Estrutura quimica da tiouréia, um andlogo da uréia Como a urease contém grupos sulfidrila no seu sitio ativo, a enzima é inibida por ions de metais pesados, como sais de merctirio em concentragées reduzidas (10% mmol/L). Técnica |. Reagao do biureto 1. Em um tubo marcado “A”, colocar 2 gotas da solugao de urease, 2 mL de agua destilada e agitar. 2. Adicionar 2 mL do reativo de biureto e misturar. 3. Emum tubo marcado “B”, colocar 2 mL de agua destilada, 2 mL do reativo de biureto e misturar. 4, Comparar a cor nos dois tubos e interpretar o resultado. ll. Teste de atividade da urease 1. Utilizar dois tubos de ensaio e marcar “C” e “D”. 2. No tubo “C”, colocar 3 mL de tampao fosfato 1 mmol/L, pH 7, contendo 1% de uréia, e 2 gotas de urease. 3. No tubo “D” (branco) colocar 3 mL de tampao fosfato 1 mmol/L, pH 7, sem uréia, e 2 gotas de urease. 4. Em ambos os tubos adicionar uma gota de solugao de vermelho de fenol. 5. Agitar e incubar pop minutos a 37°C. 6. Observar se ha mudanga de cor. 7. Comparar a reagao dos tubos C e D e interpretar 0 resultado. 51Ill. Especificidade da enzima 1. Utilizar dois tubos e marcar “E” e “F”. 2. No tubo “E”, colocar 3 mL de tampao fosfato 1 mmol/L, pH 7, contendo 1% de uréia, e 2 gotas de urease. 3. No tubo “F”, colocar 3 mL de tampao fosfato 1 mmol/L, pH 7, contendo 1% de tiouréia, e 2 gotas de urease. 4. Em ambos os tubos adicionar 1 gota da solugao de vermelho de fenol. 5. Agitar e incubar por 5 minutos a 37 °C. 6. Comparar o resultado com aquele do teste Il. IV. Reacao de Heller 4. Em um tubo de ensaio, colocar 4 gotas de solugao de urease e 2 mL de agua destilada. 2. Agitar. 3. Manter o tubo inclinado e adicionar pela parede 1 mL de Acido nitrico concentrado, sem agitar, formando duas fases. OBS.: O Acido nitrico é corrosivo. Use luvas e 6culos de seguranga. 4. Observar a reacdo na interfase e interpretar 0 resultado, V. Efeito do calor 4. Em um tubo de ensaio, colocar 2 mL de agua destilada e 2 gotas de urease. 2. Agitar e ferver durante 2 minutos. 3. Emoutro tubo, colocar 3 mL de tampo fosfato 1 mmol/L, pH 7, contendo 1% de uréia, adicionar 1 mL da solugao de urease fervida anteriormente e 1 gota da solugao de vermelho de fenol. 4. Misturar e incubar por 5 minutos a 37 °C. 5. Observar e comparar 0 resultado com aquele do teste Il. 52 VI. Efeito de sais de mercurio 4. Em um tubo de ensaio, colocar 2 mL de agua destilada e 2 gotas da solugao de urease. 2. Agitar e adicionar cuidadosamente 1 gota de.cloreto de mercurio a 0,01%. 3. Agitar e adicionar 3 mL de tampAo fosfato 1 mmol/L, pH 7, contendo 1% de uréia, e 1 gota da solugao de vermelho de fenol. 4. Misturar e incubar por 5 minutos a 37 °C. 5. Comparar o resultado com aquele do teste I. Exercicios 4. Qual éareacao catalisada pela urease? 2. Qual éa fonte de urease utilizada nos experimentos? 3. Como pode ser evidenciada a natureza protéica da enzima? 4. Explique 0 uso do indicador acido-base vermelho de fenol no teste de atividade da enzima. Qual é a justificativa para se empregar um tampao diluido (1 mmol/L) na incubagao para medida da atividade de urease? 5. Explique o resultado obtido quando a enzima foi previamente fervida. 6. Explique o resultado obtido no teste VI. Referéncias DANIEL, L. J.; NEAL, A. L. Laboratory experiments in biochemistry. New York: Academic Press, 1969. 301 p. LOPREORE, C.; BYERS, L. D. The urease-catalysed hydrolysis of thiourea and thioacetamide. Arch. Biochem. Biophys. Vv. 349, n. 2, p. 299-303, 1998. DIXON, N. E. et al. Jack bean urease (EC 3.5.1.5). V, On the mechanism of action of urease on urea, formamide, acetmide, N-methylurea, and related compounds. Can. J. Biochem., v. 58, n. 12} p. 1335-1344, 1980. 53Informagoes complementares Lista de reativos: Solugao de urease Acido nitrico concentrado Tampao fosfato 1 mmol/L, pH 7 Tampao fosfato 1 mmol/L, pH 7,0, contendo 1% de uréia Tampao fosfato 1 mmol/L, pH 7,0, contendo 1% de tiouréia Reativo de biureto Cloreto mercurico 0,01% (p/v) . Vermelho de fenol OPNODAONH= Preparo dos reativos: 1. Reativo de biureto Dissolver 1,5 g de sulfato de cobre pentaidratado e 6 g de tartarato duplo de sédio e potassio em 500 mL de 4gua destilada. Adicionar cuidadosamente 300 mL de hidroxido de sédio 10% (p/v) com constante agitacao e completar o volume para 1 litro com agua destilada. 2. Solugao de vermelho de fenol Dissolver 0,1 g de vermelho de fenol em 250 mL de agua destilada alcalinizada com 2,82 mL de NaOH 0,1 mol/L. 3. Extragdo da urease de soja Pesar 15 g de farinha de soja e colocar em erlenmeyer de 250 mL. Adicionar 100 mL de glicerol a 75% em agua. Arrolhar o erlenmeyer e agitar a suspensao manualmente por 15 minutos. Colocar no refri- gerador até o dia seguinte. Filtrar 0 extrato glicerinado em gaze, espremendo levemente com um bastao. A solugaéo de urease assim obtida é estavel por cerca de seis anos quando conservada em refrigerador. 54 Informagées sobre os reagentes: 1. Vermelho de fenol MM: 354,377 g/mol — Formula molecular: C,,H,,0,S ‘10! ta) HO Estrutura: [7 ‘o i Bs, 55CARACTERIZAGAO DE UMA ENZIMA » MITOCONDRIAL: SUCCINATO DESIDROGENASE Objetivo Caracterizar a fragao mitocondrial pela presenga da succinato desidrogenase. Relagao teérico-pratica Proteinas e enzimas (propriedades e inibigdo enzimatica) Respiragao celular — Ciclo de Krebs e fosforilagao oxidativa : Asuccinato desidrogenase (Complexo II ou succinato: ubiqui- nona oxidoredutase) 6 uma enzima funcional do Ciclo de Krebs e da cadeia respiratéria. O complexo II promove a oxidagao do succinato a fumarato, com a concomitante reducao da coenzima flavina adenina- dinucleotideo (FAD). O FADH, assim formado transfere dois elétrons para centros ferro-enxofre e estes para o heme b, que também sao constituintes do complexo Il. A transferéncia de elétrons segue via Fundamento 57ubiquinona através dos demais constituintes da cadeia respiratoria até 0 oxigénio molecular, que € o aceptor final de elétrons, sendo entao reduzido a H,O (figura 1). Espaco Intermembranas Membrana Moconal By be vee vende gn” tema a I | (JUS omar } aa HO Matriz Succinato Fumarato Mitocondrial ST) Figura 1. Representagao esquematica da cadeia transportadora de elétrons e do ciclo de Krebs, com destaque para a reagdo catalisada pela succinato desidrogenase (Complexo Il). UQ = ubiquinona Asuccinato desidrogenase é inibida de forma competitiva pelo malonato, um analogo estrutural do succinato. Aatividade desta enzima pode ser determinada utilizando-se aceptores artificiais de elétrons. Estes aceptores possuem potenciais redox que favorecem sua redugao preferencial em relagao aos transportadores de elétrons naturais da cadeia respiratoria. Um aceptor de elétrons muito utilizado para esta finalidade é 0 2,3,5-trifeniltetrazdlio, que possui uma cor amarela e, quando reduzido a trifenil-formazana, passa a apresentar uma coloragao vermelha (figura 2). Desta forma, ao aceitar os elétrons provenientes da oxidagao do succinato, 0 2,3,5- trifeniltetrazolio (amarelo) 6 reduzido a trifenil-formazana (vermelho), evidenciando a atividade enzimatica. 58 f 4 I K, | | “SO = 0 ors +H for 2.3.5-TRIFENIL-TETRAZOLIO. ‘TRIFENIL-FORMAZANA, (SOLUGAO AMARELA) (SOLUGAO VERMELHA) Figura 2. Redugao do cloreto de 2,3,5-trifenittetrazdlio a trifenil-formazana Técnica |. Determinagao da atividade da succinato desidrogenase Malonato Na 0,1 mol/L pH 7,3 Tubos 42 3 4 5 6 Reagentes (mL) Tampao fosfato 0,02 moll pH7.3_| 14 | 13 | 1.2] 12 [1.0001 Succinato Na 0,5 mol/L pH 7,3 01 | e-d[01 | 04 | 04 | 10 Tetrazélio 0,56 % 0,25 [0,25 | 0,25 | 0,25 | 0,25 | 0,25 Susp. de mitocdndrias Susp. de mitocéndrias fervida por 10 min em banho-maria* *Suspensao mitocondrial fervida: em tubo de ensaio pipete 3,0 mL de tampao fosfato 0,02 mol/L PH 7,3 e 0,2 mL da suspensao mitocondrial. Leve ao banho fervente por 10 min. Incubar todos os tubos a 37 °C. Observar a mudanga de cor desde os 10 min até os 30 min de incubagao. Interpretar os resultados em fungao dos componentes de cada tubo. 59Exercicios 1. Qual éareacao catalisada pela succinato desidrogenase? 2. Qual é 0 aceitador final de elétrons normal na mitocéndria e 0 utilizado no experimento? 3. Como vocé concluiu que realmente houve catalise? 4. Explique 0 que aconteceu no tubo 5 em presenga de malonato e em que este resultado se diferencia do resultado do tubo 6. 5. Qual é a fungao dos tubos 1, 2 e 3? Referéncias CECCHINI, G. Function and structure of complex II of the respiratory chain. Annu. Rev. Biochem, v. 72, p. 77-109, 2003. DANIEL, L. J.; NEAL, A. L. Laboratory experiments in biochemistry. New York: Academic Press, 1967. NELSON, D. L.; COX, M. M. Lehninger: principios de bioquimica. 3. ed. Sao Paulo: Sarvier, 2002. TRIBE, M.; WHITTAKER, P. Chloroplasts and mitochondria. Studies in biology. London: Eduard Arnold, 1972. Informag6es complementares Lista de reativos: 1. Meio de extragao 2. Cloreto de 2,3,5-trifenil-tetrazdlio 0,56% (p/v), pH 7,3 3. Succinato de sddio 0,5 mol/L pH 7,3 4, Malonato de sddio 0,1 mol/L pH 7,3 . Suspensdo de mitocéndrias com concentragao de proteinas entre 40 e 50 mg/mL. 6. Tampao fosfato 0,02 mol/L pH 7,3 a 60 Preparo dos reativos: 1. Meio de extragao Sacarose 0,32 mol/L em tampao fosfato 0,02 mol/L contendo EDTA 0,01 mol/L, pH da mistura ajustado para 7,3. 2. Isolamento e obtencao da suspensao de mitocéndrias O figado cortado em pedagos é suspenso em 5 volumes de meio de extragao e homogeneizado mecanicamente utilizando um homogeneizador de Van Poter ou liquidificador a baixa velocidade. A suspensao € centrifugada por 10 minutos a 1000 g e o sobrenadante centrifugado a 8000 g por 10 minutos. O precipitado é suspenso em meio de extragao e usado como fonte de enzima. 3. Solug&o de succinato de sédio Pesar 9,2 g de acido succinico e dissolver em 50 mL de agua destilada, titular até pH 7,3 com uma solugao NaOH 10 mol/L e completar o volume para 100 mL. 4. Solug&o de malonato de sédio Pesar 1,04 g de acido malénico, dissolver em 50 mL de agua destilada, ajustar o pH da solugao para 7,3 com uma solugao de NaOH 10 mol/L e completar o oe para 100 mL. Informagées sobre os reagentes: 1. Cloreto de 2,3,5-trifenil-tetrazdlio MM: 334,802 g/mol — Férmula molecular: C,,H, CIN, 191 18) i r\. fh N Estrutura:CARACTERIZAGAO DOS TRIACILGLICEROIS DE OLEO VEGETAL Objetivo lsolar triacilglicerdis e evidenciar sua hidrdlise alcalina (reagao de saponificagao) por meio de testes especificos para os produtos de hidrdlise (sab6es). Relagao tedrico-pratica Quimica e metabolismo de lipidios Fundamento Os lipidios se caracterizam por sua insolubilidade em agua e solubilidade em solventes organicos, como cloroférmio, éter, benzeno, mistura de Folch (cloroférmio:metanol). Varias classes de lipidios apre- sentam acidos graxos como componentes estruturais. Lipidios dos grupos dos acilglicerdis ou glicerideos, ceras, fosfolipidios e glicolipidios apresentam acidos graxos esterificados em suas estruturas. Estes compostos, mediante aquecimento em presenga de bases fortes, como hidréxido de sdédio ou hidréxido de potassio, sofrem hidrdlise, produ- zindo sais de s6dio ou potassio de acidos graxos ou sabdes. Gracas a esta propriedade, estes lipidios sao denominados de lip{dios saponificaveis, 63ja que podem ser caracterizados pela saponificagao. Ahidrdlise alcalina da agua, as moléculas de sabao se orientam em uma camada na qual de um triacilglicerol catalisada por hidrdxido de potassio produz glicerol as cabecas polares interagem com a agua e as caudas apolares perma- e sais potassicos de acidos graxos (figura 1). necem fora do liquido. Esta disposigao provoca 0 abaixamento da tensao : superficial da agua. il Os sabées também possuem poder emulsificante, visto que, H,c—0—¢-(,)-cH=ch-(cH,) cH, quando agitados com éleo ou gordura, em meio aquoso, interagem 7 com estes a partir das caudas apolares, produzindo goticulas carregadas Hco—0—G-(cH,)-ch=cH-(H,)-cH, + 3 KOH ———> que se mantém em emulsao. ° A Sob condigées especificas, os Acidos graxos dos sabdes podem ser precipitados. A adicao de acidos fracos, como acido acético, leva a formagao de acidos graxos insolliveis por causa do baixo grau TRIOLEIL-GLICEROL OU TRIOLEINA de dissociacao (figura 3). H,c—o—¢-| cH,)-cH=cH-(cH,)-cH, HC — oH | + | He— on + 3cH,—(¢H,)-cH=ch- cH,)-coo" K* H,);¢H=CH-(cH,)-coo kK" + H,c-COOH ——> H.Goa OLEATO DE POTASSIO AcIDO ACETICO | Ba | GLICEROL, OLEATO DE POTASSIO (SABAO) cH; (cH,)-cH=cH-(cH,)-coon + H,C- coo” K" | | Figura 1. Reagdo de saponificagao | ACIDO OLEICO ACETATO DE POTASSIO | 5 ; ss M | Os sab6es sao moléculas anfipaticas, apresentando em sua Figura 3. Reagao de precipitagao de sabao com acido acético estrutura uma longa cadeia hidrocarbonada (cauda apolar, lipofilica) e | um grupo carboxilato (cabega polar, hidrofilica). Os sabes precipitam quando sao usados em aguas ricas em I sais de calcio ou magnésio (Aguas duras). Os fons calcio e magnésio | Ste (metais alcalino-terrosos) da agua reagem com os acidos graxos |} = =cH-(cH,)-coo” K DT nee H I | cHy (x,)7 cH CH, )7 formando sais insoltiveis (figura 4). i) ee q | CAUDA APOLAR CABEGA POLAR ieee | {LIPOFILICA) (HIDROFILICA) 2 ch; (c,)-cH=cH-(cH,)-coo Kk" + cacl, ——> 1) Figura 2. Natureza polar e apolar de uma molécula de sabao GLEATO DE FOTASSION CLORETO DE CALCIO. | Por causa de seu cardter anfipatico, em solugao as moléculas cuz (cH,)-cH=cH-(cH,)-coo™ oot oxcl de sabao se associam por interagdes hidrofébicas entre as caudas Ee negativamente em sua superficie. Os liquidos apresentam tensao superficial, uma tendénciaa minimizar sua area superficial por causa da atragao das moléculas da superficie do iquido pelas moléculas de dentro do liquido. Na superficie apolares, formando micelas, apresentando grupos carboxilato carregados OLEATO DE CALCIO CLORETO DE POTASSIO Figura 4, Reacdo de precipitagéo de sabao com cloreto de calcio 64 65Os sabées também podem precipitar pela adigdo de excesso de eletrdlitos, os quais reprimem a dissociagao dos sabes, fazendo com que as micelas percam a carga e precipitem. Técnica |. Extragao do dleo vegetal (triacilglicerdis) 1. Emum béquer de 100 mL pesar 10 g de soja moidae seca. 2. Adicionar 25 mL de acetona e agitar por 5 min. 3. Filtrar com papel de filtro para outro béquer de massa conhecida. 4. Lavar o residuo com 10 mL de acetona por duas vezes. 5. Evaporar 0 filtrado em banho-maria a temperatura de 50°C, com agitagao constante até a eliminagao da acetona. 6. Observar o residuo amarelo e oleoso, pesar 0 béquer e, por diferenga de peso, calcular o rendimento da extracao. Il. Saponificagdo do dleo extraido 1. Em um tubo de ensaio grande, colocar 15 gotas de dleo vegetal e 5 mL de solugao de potassa alcodlica. 2. Adicionar pérolas de porcelana para evitar ebuligao tumultuosa. 3. Aquecer em banho-maria fervente durante 30 minutos. Nestas condig6es, 0 dleo € saponificado, obtendo-se uma solucao opalescente de sais de potassio de acidos graxos (sabGes) e glicerol. Esta mistura contendo sabées sera utilizada nos experimentos subseqientes. lll. Testes para caracterizagao dos sabes Repartir a solucao contendo sab6es em quatro tubos de ensaio (se necessario, diluir com 4 mL de agua destilada) e realizar os seguintes testes: Abaixamento da tensao superficial Ao primeiro tubo, adicionar 2 mL de agua, agitar a solucao de saboes e verificar a formagao de espuma. 66 Precipitagao de acidos graxos Ao segundo tubo, adicionar gota a gota acido acético concen- trado até notar o aparecimento de um precipitado branco de acidos graxos. Precipitagao de sabées de calcio Ao terceiro tubo, adicionar cloreto de calcio a 10% gota a gota até notar o aparecimento de um precipitado de sabées de calcio. Precipitagao por excesso de eletrolitos Ao quarto tubo, adicionar igual volume de solugao saturada de cloreto de sddio e observar a formagao de um precipitado de sabao. Exercicios 1. Escrever a reacao de hidrdlise alcalina de um triacilglicerol diferente de trioleina. 2. Por que se utiliza etanol na reagao de saponificagao? 3. Explicar a agao detergente dos sab6es. Referéncias CAMPBELL, M. K. Bioquimica. 3. ed. Porto Alegre: Artmed, 2000. MckKEE, T.; McKEE, J. R. Biochemistry. An introduction. 2. ed. New York: McGraw-Hill, 1999. OSER, B. L. Hawk's physiological chemistry. 14. ed. New York: McGraw-Hill, 1965. Informagées complementares Lista de reativos: Solugao de potassa alcodlica Acido acético concentrado Solugao de cloreto de calcio 10% (p/v) Solugao saturada de cloreto de sddio Ona 67Preparo dos reativos: i a EXTRAGAO E CARACTERIZAGAO DO AMIDO 1. Solucao de potassa alcodlica Misturar 1 volume de hidroxido de potassio 40% (p/v) e 1 volume de etanol 95%. Objetivo | lsolar amido de batata e caracteriza-lo por meio de reagdes de coloragao e precipitacao. } Relagao tedrico-pratica Estrutura de carboidratos Fundamento O amido é 0 principal carboidrato de reserva vegetal, além de ser 0 mais importante da alimentagao humana. E encontrado na forma de granulos nos cloroplastos das folhas, nas frutas, nas sementes e i tubérculos. A quantidade de amido em sementes e tubérculos como a | batata é extremamente alta, podendo chegar a 75% do peso seco. Os granulos de amido sao insoltiveis. Quando uma suspensao | de amido é aquecida, os granulos se desintegram, formando uma Vii] solucao coloidal. O amido pode ser precipitado destas solugdes em condigdes que promovam sua desidratagao, tais como adigao de alcool etilico ou solugao saturada de um sal. Estruturalmente, 0 amido consiste de uma mistura de dois homopolimeros de glucose, a amilose e a amilopectina. A amilose é 68 69um polissacarideo linear formado por unidades de D-glucose unidas por ligagées glicosidicas do tipo a (14). A amilopectina é altamente tamificada, sendo formada por unidades de D-glucose ligadas o (1 4), mas com pontos de ramificagao « (16). A freqiiéncia de ramificagoes ao longo da cadeia principal é de uma a cada 24-30 unidades de glucose. Por causa de sua estrutura regular, a amilose adota uma conformagao em hélice com seis unidades de glucose por volta. Nao se sabe ao certo se a amilopectina adota algum tipo de conformacgao preferencial. Extremidade Extremidade nao redutora redutora B. Ramificagao Ponto de ramificagao a(16) Cadeia principal Figura 1. Representago de um segmento da cadeia de amilose (A) ¢ de amilopectina (B) 70 Existem varias reagdes que permitem caracterizar a presenca de carboidratos em uma solugao, entre as quais a reagdo de Molisch. Nesta reacao, os carboidratos sao desidratados a um derivado furfural, ou hidroximetil-furfural, quando na presenga de um acido concentrado sobre uma pentose ou hexose, respectivamente. Os derivados furfliricos, entdo, condensam-se com 0 o.-naftol (reativo de Molisch), formando um produto de cor violeta. Esta reagao é positiva para todos os carboidratos, livres ou polimerizados. No caso do amido, inicialmente ocorrera hidrdlise pela acao do acido sulfurico, liberando moléculas de glucose. Na reagao positiva, formar-se-4 uma zona de cor violeta e verde na interfase. Um teste bastante utilizado para detectar a presenga de amido 6 a reagdo com iodo, que utiliza o lugol (mistura de iodo e iodeto de potassio). Moléculas de iodo podem ser ocluidas pela hélice da amilose, formando um complexo azul escuro. No complexo amido-iodo, as moléculas de iodo esto paralelas ao eixo da hélice. Seis voltas da hélice (contendo 36 unidades de glucose) so necessarias para produzir a cor azul caracteristica do complexo. O componente do amido responsavel por esta coloragao caracteristica é a amilose, entretanto a reagao com a amilopectina da origem a uma coloragdo marrom-avermelhada. Este complexo se dissocia por aquecimento gracas a perda da estrutura helicoidal, e volta a se formar quando a solugao é resfriada. Técnica |. Extragao do amido 1. Raspar um pedago de batata com uma lamina de vidro. 2. Transferir a raspa para um béquer de 100 mL. 3. Adicionar 50 mL de agua destilada e agitar vigorosamente com um bastao de vidro. 4, Filtrar o material com uma gaze, recolhendo 0 filtrado em um béquer de 150 mL e espremer delicadamente a gaze. 5. Deixar em repouso por 10 minutos e, a seguir, remover cuidadosamente o liquido sobrenadante. O depésito no fundo do béquer 60 amido que foi extraido da batata e sera utilizado para o preparo de uma solugao. 71ll. Preparo da solugao de amido 1. Manter aproximadamente 50 mL de agua fervendo em um béquer. 2. Acrescentar aproximadamente 50 mL de Agua fria ao depésito obtido anteriormente. 3. Adicionar agua fervente lentamente e com constante agitagao a suspensao de amido. 4. Continuar 0 aquecimento até que se forme uma solugao opalescente. Utilizar esta solugao para as reagdes de caracterizacao e precipitacao. Ill. Reagdes de caracterizagao do amido 3.1. Reagao com iodo 1. Emum tubo de ensaio, pipetar 2 mL de solugao de amido. 2. Adicionar 3 gotas de lugol. Notar 0 aparecimento de cor azul intensa. 3. Aquecer cuidadosamente direto na chama até observar o desaparecimento da coloragao azul. 4. Resfriar o tubo em Agua corrente. Observar. 3.2. Reagao de Molisch 1. Emum tubo de ensaio, pipetar 2 mL de solugao de amido. 2. Adicionar 3 gotas do reativo de Molisch e misturar. 3. Inclinar o tubo e deixar escorrer pela parede 2 mL de acido sulfurico concentrado, de modo que os dois liquidos nao se misturem. Observar a interfase. Obs.: O Acido sulfurico é corrosivo. Use luvas e Oculos de seguranga. IV. Precipitagao do amido 4.1. Precipitagao com solugao salina 1. Em tubo de ensaio, pipetar 5 mL de solugao de amido. 72 2. Adicionar 5 mL de solugao saturada de sulfato de aménio e agitar fortemente. 3. Deixar em repouso por 10 minutos. 4. Filtrar. 5. Pesquisar, separadamente, no filtrado e no precipitado, a presenca de amido pelo teste do iodo. 4.2. Precipitagao com alcool etilico 1. Em tubo de ensaio pipetar 5 mL de solucao de amido. 2. Adicionar 5 mL de alcool etilico e agitar. 3. Filtrar. 4. Pesquisar amido como no experimento anterior. Exercicios 1. Qual é 0 principio da reagao de Molisch e o que acontece quando é aplicada a um polissacarideo? 2. Por que predomina a coloragao azul na reagao amido + iodo, se o amido é uma mistura de dois polissacarideos diferentes? 3. Por que ocorre a precipitagao do amido quando, em solugao aquosa, é tratado com etanol ou sulfato de aménio? Referéncias CAMPBELL, M. K. Bioquimica. 3. ed. Porto Alegre: Artmed, 2000. DANIEL, L. J.; NEAL, N. Laboratory experiments in biochemistry. New York: Academic Press, 1967. NELSON, D. L.; COX, M. M. Lehninger: principios de bioquimica. 3. ed. Sao Paulo: Sarvier, 2002 OSER, B. L. Hawk's physiological chemistry. 14. ed. New York: Mac-Graw, 1965. RENDINA, G. Experimental methods in modern biochemistry. W. B. Saunders Company, 1971 73\ Nu Informagoes, complementares Lista de reativos: Acido sulfuirico concentrado Reativo de Molisch Solugao de lugol Solugao saturada de sulfato de aménio Alcool etilico TROD = Preparo dos reativos: 1. Reativo de Molisch Dissolver 5 g de o-naftol em 100 mL de alcool etilico. 2. Solugao de lugol Dissolver 1 g de iodo e 5 g de iodeto de potassio em 100 mL de agua destilada. 3. Solugdo saturada de sulfato de aménio Dissolver 76 g de sulfato de aménio em 100 mL de agua destilada. Informagées sobre os reagentes: 1. onaftol MM: 144,17 g/mol Formula molecular: C,,H,0 Estrutura: 74 EXTRAGAO E CARACTERIZACAO DE ACIDOS NUCLEICOS Objetivo Demonstrar a presenga dos acidos desoxirribonucléico (DNA) e ribonucléico (RNA) em extrato celular por meio de reagées especificas. Relagao tedrico-pratica Estrutura de acidos nucléicos Fundamento A evidéncia da presenga dos acidos nucléicos em extratos celulares de mamiferos por técnicas especificas requer células em quantidade suficiente e em meio livre de interferentes que possam causar lise celular ou hidrdlise dos acidos nucléicos por nucleases. A completa extracao dos acidos nucléicos é essencial para a determinagao indireta da sua estrutura ou quantificagao por espectrofotometria. Ahidrélise acida branda dos acidos nucléicos remove seleti- vamente todas as bases ptricas (rompimento das ligacdes N-glicosidicas entre adeninas e guaninas e a desoxirribose), sem afetar as ligagées fosfodiéster entre o grupo fosfato e a desoxirribose do esqueleto nucleotidico. 75oT As desoxirriboses livres de bases ptricas geram grupamentos aldeidicos livres que, por sua vez, sofrem desidratagao, originando como produto aldeidos 5-hidroxilevulinicos. Estes aldeidos formados reagem com a difenilamina, gerando um produto de coloragao azul (com absorbancia maxima em 595 nm). Assim, a reagao da difenilamina 6 util para caracterizar, indiretamente, a presenga de DNA (figura 1). HC-OH + H HC-OH H,C-OH Ho H,C-OH 2-DESOXIRRIBOSE = ——ALDEIDO-DELTA- HIDROXI-LEVULINICO DIFENILAMINA COMPLEXO DE COR AZUL Figura 1. Reagao da difenilamina para caracterizagao do DNA O RNA pode ser evidenciado pela reagdo do orcinol para pentoses (ribose). Neste caso, a molécula de RNA é submetida a um meio fortemente Acido, criado pelo reativo do orcinol, promovendo a hidrdlise tanto das ligagdes N-glicosidicas quanto fosfodiéster. Portanto, os produtos de hidrolise formados serao: a ribose, na forma livre, bases puricas (adeninas e guaninas), bases pirimidicas (citosina, uracila) e acido fosforico. A ribose, neste meio fortemente acido, sofre desidratagao, gerando como produto o furfural, que, por sua vez, reage com 0 orcinol, gerando como produto um complexo de cor verde (com absorbancia maxima em 670 nm), indicando assim a presenga de RNA (figura 2). Areagao como orcinol nao é tao especifica quanto a reagao da difenilamina, uma vez que todas as pentoses, incluindo a desoxirribose do DNA, iro reagir em alguma extensao. 76 CH,OH OX OH Te 7 + 3H0 4 MEIO FORTEMENTE HC. Ae Hy ACIDO + Fe’? ‘0 \ oH OH FURFURAL D-RIBOSE cH, HO’ ‘OH ORCINOL COMPLEXO DE CONDENSACAO DE COR VERDE Figura 2. Reacgdo do orcinol para caracterizagao do RNA Técnica |. Preparo do homogeneizado SAo utilizados figados isolados de ratos. Os animais sao anestesiados com éter, mortos e os figados removidos. A seguir, 0 tecido é homogeneizado com 9 volumes de solugao de acido citrico 2%. Este procedimento nao sera executado em aula. O homogeneizado de figado de rato estara disponivel, pronto para uso. OBS.: A fungao do citrato é inibir as nucleases, que poderiam hidrolisar os acidos nucléicos. Il. Extragao dos acidos nucléicos 1. Em um tubo de centrifuga, colocar 2 mL do homogeneizado de figado de rato preparado no item | 77Ni 2. Adicionar 2 mL de acido tricloroacético (TCA) 20% e misturar. OBS.: Esse passo produzira uma solugao final de TCA 10%, capaz de precipitar as proteinas, nucleo- proteinas e acidos nucléicos; todo o restante do material celular presente no homogeneizado perma- nece no sobrenadante. Deixar em repouso por 20 min. Centrifugar a 2.500 rpm por 5 min. Descartar o sobrenadante. Ressuspender o sedimento em 4 mL de TCA 5%. Aquecer em banho-maria fervente durante 20 minutos. NOAA OBS.: O tratamento do precipitado com TCA 5% a quente provoca o rompimento das associagdes nao covalentes entre acidos nucléicos e proteinas. Nestas condigées precipitam-se as proteinas, enquanto os acidos nucléicos permanecem em solugao. 8. Centrifugar a 2.500 rpm por 5 min. 9. Transferir o sobrenadante claro para um tubo de ensaio. OB: Ste extrato (0 sobrenadante) devera conter o DNAe RNA dos 2 mL do homogeneizado original. Ill. Reagao para caracterizagao do DNA 1. Preparar dois tubos: Ae B. 2. Adicionar ao tubo A 1 mL do extrato obtido no item Il, contendo acido nucléico, e ao tubo B, 1 mL de agua destilada. 3. Adicionar 2 mL do reativo de difenilamina aos tubos Ae B. 4. Adicionar 2 gotas de HCI concentrado. 5. Misturar e manter os tubos em banho-maria fervente por 10 min. 6. Retirar os tubos do banho-maria e deixar resfriar a tempe- ratura ambiente. 7. Comparar os tubos A e B e interpretar o resultado. 78 IV. Reagao para caracterizagao do RNA (reagdo de Bial) 1. Preparar dois tubos: C e D. 2. Adicionar ao tubo C 1 mL do extrato obtido no item Il, contendo acido nucléico, e ao tubo D, 1 mL de agua destilada. 3. Adicionar 2 mL do reativo de orcinol aos tubos C e D. 4, Misturar e manter os tubos em banho-maria fervente por 15 min. 5. Retirar os tubos do banho-maria e deixar resfriar a tempe- ratura ambiente. 6. Comparar os tubos C e D e interpretar o resultado. Exercicios 1. Porque é necessario 0 tratamento com TCA 5% e a quente durante 0 isolamento? 2. Qual é 0 produto da acao de um acido forte sobre a ribose? Referéncias PLUMER, D. T. Nucleic acids — an introduction to pratical biochemistry. 2. ed. London: McGraw-Hill, 1978. Informagdes complementares Lista de reativos: Acido tricloroacético 20% e 5% Acido citrico 2% Reativo de difenilamina Reativo de orcinol PeNa 79Preparo dos reativos: 1. Solugdo de acido tricloroacético (TCA) 20% (p/v) Pesar 20 g de TCA e dissolver em agua destilada. Completar 0 volume para 100 mL de solucao com agua destilada. OBS.: O TCA 6é corrosivo. Use luvas e 6culos de seguranca. 2. Solugao de acido citrico 2% (p/v) Pesar 2,0 g de acido citrico e dissolver em agua destilada. Completar o volume da solugao para 100 mL com agua destilada. 3. Reativo de difenilamina Dissolver 1,0 g de difenilamina em 100 mL de acido acético glacial e adicionar 2,75 mL de acido sulfurico (H,SO,) concentrado. 4. Reativo de orcinol Dissolver 0,2 g de orcinol em 60 mL de acido cloridrico concentrado e adicionar 0,2 mL de cloreto férrico (FeCl,) 10%. Informag6ées sobre os reagentes: 1. Difenilamina MM: 169,222 g/mol Férmula molecular: C,,H, ,N Estrutura: (S<) 2. Orcinol MM: 124,137 g/mol Férmula molecular: C,H,O, CH, Estrutura: Ho ‘oH 80 PURIFICAGAO E CARACTERIZACAO DE DNA DE CEBOLA Objetivo Extrair, purificar e demonstrar algumas propriedades fisicas do DNA de células vegetais. Relagao tedrico-pratica Estrutura de acidos nucléicos Propriedades fisicas de acidos nucléicos Fundamento Amolécula de DNA é formada por duas cadeias (ou fitas) de nucleotideos unidas por pontes de hidrogénio formadas entre as bases nitrogenadas que compdem cada uma das cadeias (figura 1). As ligagdes sao feitas entre as bases A e T (duas pontes de hidrogénio) e as bases CeG (trés pontes de hidrogénio). As pontes de hidrogénio sao um tipo de ligagao fraca, podendo ser rompidas e as cadeias do DNA separadas. Este processo ocorre na célula na ocasiao da replicagao, transcrigéo e recombinagao e € conhecido como DESNATURACAO. Por outro lado, duas fitas de DNA que sejam complementares podem formar pontes de hidrogénio entre suas bases, num processo conhecido como 81\ Ni RENATURAGAO. Ambos os processos podem também ocorrer in vitro e a maneira mais facil de desencadea-los € por aquecimento/ resfriamento, respectivamente, de uma solugao contendo DNA. Agu AGUCAR | Citosina Figura 1. Pontes de hidrogénio possiveis de serem formadas entre as bases nitrogenadas de cadeias complementares no DNA Esta propriedade do DNA tem larga aplicagao tecnolégica em uma técnica muito empregada em Biologia Molecular para estudos de diversidade, paternidade, tipagem, produgao de transgénicos, analises clinicas, entre outras, a PCR (Reagao em Cadeia da Polimerase - do inglés Polymerase Chain Reaction). Nesta técnica, uma solugao contendo DNA (denominado DNA molde) é aquecida, permitindo a separagao de suas fitas (desnaturagao). Em uma etapa seguinte, a amostra é resfriada até um ponto em que possa ocorrer a renaturagao entre cada uma das fitas do DNA molde com dois pequenos fragmentos sintéticos de DNA (oligonucleotideos ou iniciadores), complementares a uma regido especifica em cada uma das fitas do DNA molde. Os iniciadores ligados marcam entao a posigao inicial para que a enzima que faz a copia do DNA na replicagao, a DNA polimerase, possa copiar uma nova fita de DNA a partir da incorporagdo de nucleotideos complementares a fita original. Este ciclo de temperaturas se repete cerca de 25 vezes, permitindo a multiplicagao exponencial de uma regiao especifica do DNA, por exemplo, um gene (figura 2). Desta forma, diz- se que o fragmento de DNA foi amplificado. O processo de desnaturagao altera propriedades fisicas do DNA, como a absorgao de luz ultravioleta (luz UV) e a viscosidade. Desta forma, a desnaturagao do DNA pode ser acompanhada espectro- fotometricamente, podendo-se observar um aumento na absorbancia sob luz UV (medida a 260 nm), ou pela diminuigao da sua viscosidade, marcando 0 tempo necessario para o escoamento de um determinado volume de solugao. A desnaturagéo é progressiva e a temperatura na 82 —_—— —=, © — 3 ge 2 Bad 5 3 3 ~~ £3 ~— 4 a ¥ 2. ~ feud ——— 2 eS SS Deed Figura 2. A reagao em cadeia da polimerase (PCR) qual 50% do DNA se encontra desnaturado é denominada TEMPERA- TURA MEDIA DE FUSAO ou Tm (do inglés melting temperature). Uma vez que cada par GC apresenta trés pontes de hidrogénio, ele é mais estavel que 0 par AT, que apresenta duas pontes de hidrogénio. Quanto mais pares GC presentes no DNA, maior serd a energia necessaria para separar as duas fitas. O valor de Tm aumenta em cerca de 0,4 °C cada vez que a quantidade do par GC aumenta em 1%. Assim, cada molécula de DNA tem uma Tm caracteristica que depende principalmente da proporgao de pares de base GC (contetido GC ou GC%) e que pode, inclusive, ser usada para diferenciar o DNA de diferentes espécies (figura 3). Por exemplo, uma solugao de DNA com 40% de GC (tipico de genoma de mamiferos) apresenta uma Tm de 87 °C, enquanto um DNA com 60% de GC (observado em algumas bactérias) tem uma Tm de 95 °C. 8350% Porcentagem de DNA desnaurado Tmt Tm2 Temperatura (°C) Figura 3. Curva de desnaturacao do DNA. A temperatura média de fusdo, Tm, é caracteristica para cada organismo e depende da composigao de bases nitrogenadas da molécula de DNA Técnica |. Preparo do extrato de cebola 1. Descascar uma cebola de tamanho médio. 2. Ralar a cebola em ralador comum ou utilizar um proces- sador de alimentos. E importante que nao haja grandes pedagos de cebola. 3. Pesar cerca de 50 g de cebola ralada e adicionar 100 mL. da solugao de lise. 4. Deixar a mistura em temperatura ambiente por 10 a 20 Este procedimento nao sera executado em aula. O extrato de cebola estara disponivel, pronto para uso. Il. Filtragem da solugao de DNA min. 1. Filtrar a suspensao em um funil contendo algodao, recolhendo 0 filtrado em uma proveta. Anote o volume de solugao recuperado na proveta apos a completa filtragem. 84 lll. Reacao para caracterizagao do DNA 1. Transferir 4,0 mL do filtrado (obtido no item Il) para um tubo de ensaio. 2. Adicionar 2 volumes (8,0 mL) de etanol 95%, procurando nao misturar as duas solugdes. Oetanol 95% precipita o DNA. Observar a formacgao de um precipitado esbranquigado na interface entre as duas solugdes. Este é o DNA precipitado! 3. Com a ajuda de um bastao (ou alga) de vidro, enrolar o material esbranquigado (DNA) e transferir para um novo tubo de ensaio. 4. Adicionar 0,5 mL de agua, dissolver o DNA e adicionar 1,5 mL do reativo de difenilamina. 5. Em um outro tubo de ensaio, adicionar 0,5 mL de agua e 1,5 mL de difenilamina. 6. Colocar os dois tubos em banho-maria a 100 °C por 10 min. 7. Comparar os resultados obtidos. A reagao de caracterizacao do DNA com 0 reativo de difenilamina é descrita na pratica “Extragao e caracterizagao de acidos nucléicos”. IV. Determinacao da alteragao na viscosidade do DNA causada por desnaturacao 1. Transferir o filtrado restante (obtido no item II) para um béquer. 2. Adicionar 2 volumes de etanol 95%, procurando nao misturar as solugdes. 3. Com a ajuda de um bastao de vidro, retirar o DNA e transferir para um béquer. 4. Adicionar 10 mL de agua para dissolver o DNA. 5. Dividir, em volumes iguais, a solugao em dois tubos de ensaio. 6. MEDIDA DE TEMPO DE ESCOAMENTO: pipetar a solugao de um dos tubos com uma pipeta graduada de 0,2 mLe cronometrar o tempo de escoamento da solugao entre as marcas de 0,0 mL até 0,15 mL. 85Anotar 9 tempo de escoamento. Neste caso o DNA esta na sua conformagao nativa, na forma de dupla hélice. Nestas condigdes, o DNA forma uma solugao de alta viscosidade. 7. Aquecer 0 outro tubo em banho-maria com gua fervendo por 10 min. 8. Repetir a medida de tempo de escoamento do item 6. Agora o DNA foi desnaturado pelo calor e encontra- se na forma de simples fita (suas cadeias de nucleo- tideos esto separadas). Nestas condig6es, a viscosi- dade da solugao diminui. 9. Resfriar a solugao em gelo por 15 min. 10. Repetir a medida de tempo de escoamento do item 6. O resfriamento permite a renaturacao da molécula de DNA, causando novo aumento na viscosidade da solugao. Exercicios 1. Qual a fungao dos componentes da solugao de lise? 2. Aquese deve a diferenca de viscosidade do DNA observada nos experimentos? Referéncias LEWIN, B. Genes VI. Oxford University Press, 1997. 1270 p. ZAHA, A. (Org,). Biologia molecular basica. 3. ed. Porto Alegre: Mercado Aberto, 2003. 424 p. 86 Informag6des complementares Lista de reativos: 1. Solugao de lise 2. Alcool etilico 95% v/v 3. Reativo de difenilamina Preparo dos reativos: 1. Solugao de lise Misturar 0,1% do detergente dodecilsulfato de sédio (SDS) em 25 mmol/L de EDTA pH 8,0. 2. Reativo de difenilamina Dissolver 1 g de difenilamina em 100 mL de acido acético glacial e adicionar 2,75 mL de acido sulfuirico (H,SO,) concentrado. _ Informagées sobre os reagentes: 1. Dodecilsulfato de sédio (SDS) MM: 266,398 g/mol Estrutura: Formula molecular: C,,H,,0,S 2. Acido Etilenodiaminotetracético (EDTA) MM: 292,243 g/mol Formula molecular: C,,H,,N,O, 87Estrutura: a 0” OH O EDTA possui a capacidade de complexar (quelar) ions metalicos, tais como ferro (Fe**), cromo (Cr*%), calcio (Ca*?) e magnésio (Mg**). Sua estrutura possui 4 grupos carboxilicos acidos que, em fungao do pH, podem estar ou nao protonados. Esta molécula possui ainda dois grupos amino, também capazes de se protonar/desprotonar. 3. Difenilamina MM: 169,222 g/mol Formula molecular: C,,H, |N #*%, f{ 4 Estrutura: ¢ _/ ¥\ 7 88 DETERMINAGAO DA CONCENTRAGAO DE PROTEINAS Objetivos Reconhecer a importancia dos métodos espectrofotométricos na determinagao da concentracao de diferentes compostos. Elaborar curva de calibragao e estabelecer a sensibilidade de um método espectrofotométrico. Determinara concentracao de proteinas por meio de calculos especificos envolvendo diluig6es. Relagao teérico-pratica Estrutura de proteinas Fundamento Espectrofotometria A espectrofotometria 6 uma técnica analitica que utiliza o espectro eletromagnético para determinar a concentragao de espécies quimicas. O espectro eletromagnético é um Conjunto de ondas eletromagnéticas. Uma onda eletromagnética é composta por um 89campo elétrico e outro magnético, que se propagam perpendicularmente ecom a mesma direcdo. Toda onda eletromagnética pode ser carac- terizada por seu comprimento de onda (A), e por sua frequéncia (v). oO comprimento e a frequéncia de uma onda estao relacionados ao seu contetido energético. Quanto MENOR o comprimento de onda e MAIOR a freqiiéncia de uma onda, MAIOR sera sua energia. Surpreenden- temente, a fisica moderna encara 0 espectro eletromagnético também como composto por particulas, os fotons. A quantidade de energia que cada foton possui é denominada quantum (plural: quanta). Na técnica de espectrofotometria, um feixe de luz atravessa uma solugao ou material biolégico contendo moléculas capazes de absorver luz. Sendo assim, parte da luz incidente sera absorvida, enquanto o restante atravessara a solucao e sera detectado pelo aparelho. Estimando-se a quantidade de luz absorvida, é possivel determinar a concentragao do composto em solugao. Inimeras moléculas bioldgicas tém a propriedade de absorver luz, como: citocromos, clorofilas, proteinas, DNA, etc., o que permite sua quantificagao por esta técnica. Normalmente, a absorgao de luz por um composto ocorre em varios comprimentos de onda. Se for feita uma varredura, ou seja, a determinagao da quantidade de luz absorvida em diversos comprimentos de onda para um determinado composto, observamos que ha um comprimento de onda no qual a absorgao 6 maxima. A faixa mais utilizada do espectro vai de 200 nm (ultravioleta) a 1.000 nm (infravermelho). O espectro visivel, ou seja, aquele que 6 percebido pelo olho humano (cores), vai de 380 a 750 nm (figura 1). Compostos que absorvem na faixa do visivel so naturalmente coloridos, mas mesmo aqueles que nao absorvem luz no visivel podem ser indiretamente detectados por reagdes quimicas especificas que gerem produtos coloridos. A espectrofotometria, também denominada fotometria ou colorimetria, é indicada para determinar a concentragao de solutos normalmente corados, como também os incolores mas passiveis de adquirir cor mediante o emprego ajustado de certos realivos. Compostos desconhecidos podem ser identificados por seus espectros caracteristicos no ultravioleta, visivel ou infravermelho. As concentragdes de solugdes de compostos conhecidos podem ser determinadas medindo-se a absorgéo em um ou mais comprimentos de onda. Reagées enzimaticas podem ser freqiientemente seguidas medindo-se espectrofotometricamente o aparecimento de um produto ou desaparecimento de substrato. 90 Tipo de Raios gama yess 9 Raios X Uy] Jintaver- | Microondas | “Ondas de radio Gompririants 2-log It Entao: Tt(%) A 1 2 100 oO 0 °° e A transmissao é medida em termos de luz incidente e luz emergente mas, na realidade, os instrumentos nao medem luz incidente, uma vez que, se ela for considerada para efeito de calculo, a solugao absorvente parecera mais concentrada do que realmente é, por causa da absorgao do tubo e dos outros reagentes eventualmente utilizados. Por isso, é necessario descontar todas as interferéncias possiveis durante a medida da absorbancia de um soluto especifico. Para tanto, faz-se a calibragao do espectrofotémetro com uma solugao contendo um sistema como o estudado, exceto o composto de analise, em um tubo ou cubeta igual Aquele que ira conter a solugao-problema. Este tubo 6 conhecido como “branco” e com ele calibra-se o instrumento para 100% de trans- mitancia, o que significa zero de absorbancia. 93Curva-padrao ou de calibragao Adeterminagao da concentragao de um soluto em uma solugao- problema pelo método espectrofotométrico envolve a comparagao da absorbancia da solugao-problema com uma solugao de referéncia, da qual j4 se conhece a concentragao do soluto. Em geral, sao utilizadas solug6es-padrao do composto que se deseja quantificar, com diferentes concentragées, e sua absorbancia é determinada. Com os valores de absorbancia e concentragao conhecidos, pode-se tragar um grafico cujo perfil 6 conhecido como “curva de calibragao” ou “curva-padrao”. Areta, que deve passar obrigatoriamente pela origem, indicaa Propor- cionalidade entre o aumento da concentragao e da absorbancia, ea porgao linear corresponde ao limite de sensibilidade do método espectrofotométrico para o soluto em questao. Aplicando-se a lei de Lambert-Beer, ao se plotar o valor da absorbancia da amostra-problema no grafico da curva de calibragao pode-se, por projecao, determinar a concentragao do soluto. Esta consideragao somente sera valida se as absorbancias, tanto do padrao quanto da solugao-problema, forem determinadas usando-se as mesmas condigdes experimentais (comprimento de onda ), espessura 0) e coeficiente de extingao molar (e)). Considerando-se entao duas solugées, padrao (P) e desconhecida (D), tem-se que: Ap=exlxC, @ Ap=exlxCy Como ¢ e/ sao iguais para as duas situagoes, tem-se que: Entao: 94 Determinagao da concentragao de proteina em uma amostra pelo Método do Biureto O biureto é o composto formado pelo aquecimento da uréia a 180 °C. Quando este composto é colocado em presenga de uma solugao de sulfato de cobre em meio fortemente alcalino, forma-se um composto de cor azul. A cor é devida ao complexo de interagao entre 0 ion cUprico e os quatro atomos adjacentes de nitrogénio. Este tipo de reagao acontece com peptideos que contenham no minimo duas ligagdes peptidicas e com proteinas em geral. Substancias que contenham duas carbonilas ligadas diretamente ou por meio de um atomo de nitrogénio também apresentam coloragao azulada quando na solugao alcalina de sulfato de cobre. O nome “Reagao do Biureto” para a formacao de complexos corados na presenca de sulfato de cobre, mesmo na auséncia de biureto, foi mantido. Esta reagao é facilmente aplicavel quando se deseja demonstrar a presenga de proteinas em materiais bioldgicos, podendo, inclusive, ser aplicada na quantificacao, uma vez que 0 complexo apresenta absorgao maxima a 545 nm. A concentracao de proteina e/ou peptideos no meio influenciara na intensidade da cor: uma solugao de proteina apresentara matizes de violeta; quando a solugao apresentar elevada concentragdo de peptideos, a cor tendera para o rosa. Asensibilidade do método é de 0,5 a 5 mg de proteina/mL. 95| Nk Técnica Identifique durante o procedimento técnico os tubos cuja composigao é descrita a seguir. Lembre que em técnicas espectrofotométricas estes sempre estarao presentes. Tubo branco = ira conter todos os reagentes do ensaio, menos a amostra. E utilizado para “zerar” 0 aparelho, descontando a cor dos reagentes utili- zados no ensaio. Solugao-padrao = ira conter a mesma classe de substancia presente na amostra, porém de concen- tragao conhecida e que sera utilizada para confecgao da curva de calibragao. “Amostra” =ira conter uma solugao de substancia conhecida cuja concentragaéo pretende-se deter- minar, . Curva de calibragao 1. Organizar uma bateria com seis tubos de ensaio. 2. Identifica-los com numeros de 1 a6. 3. Adicionar os reagentes conforme a tabela: _]TUBO 1] TUBO 2] TUBO 3[TUBO 4 | TUBO 5] TUBO 6 | REAGENTES (mL) Solug&o-padrao de proteina | — 02 | 04 | 06 | 08 1.0 (Smgimt) ee — [Agua destilada 10 08 04 | 02 = Reagente do biureto 50 | 5.0 50 | 50 50 4. Agitar e deixar em repouso por 10 minutos. 5. Utilizar o tubo 1 para calibrar o espectrofotémetro: 0 de absorbancia em 540 nm (ou 0 fotocolorimetro com filtro verde). 6. Determinar a absorbancia das solugées dos tubos 2 a6. 7. Tragar, em papel milimetrado, o grafico: concentragao final de proteina (mg/mL) na abscissa e absorbancia (A) na ordenada. Interpolar a melhor reta possivel, passando pela origem dos eixos cartesianos. 96 ll. Determinacgao da concentragao de proteina em amostra-problema 1. Separar 4 tubos de ensaio. 2. Identifica-los como tubos A, B, Ce D. 3. Adicionar os reagentes conforme a tabela. TUBOA | TUBOB | TUBOC | TUBOD [REAGENTES (mL) Amostra’ z = 1,0 05 | 04 Agua destilada 70 0,0 05 | 06 Reagente do biureto 50 | 5.0 5,0 5,0 4. Agitar e deixar em repouso por 10 minutos. 5. Determinar a absorbancia das solugGes desconhecidas, utilizando o tubo A para calibrar o espectrofotémetro (100% de trans- mitancia em 540 nm) 6. Determinar a concentragao de proteina (mg/mL) presente nas amostras-problema, utilizando o grafico da curva de calibracao (item |). Obs.: Considere as diluigde: Exercicios 1. Qual a finalidade e o fundamento da técnica espectro- fotométrica? 2. Conceitue: faixa de sensibilidade do método espectro- fotométrico. 3. Determine a composigao e defina a importancia dos tubos branco e padrao na determinagao da concentragao de um composto pela técnica espectrofotométrica. 4, Um determinado composto apresenta um maximo de absorgao em 660 nm. Para uma concentragao de 0,75 mmol/mL foi obtida uma absorbancia de 0,4. Sabendo-se que 0 limite de sensibi- lidade do método utilizado é de 0,1 mmol/mL a 3 mmol/mL, calcule a concentragao deste mesmo composto correspondente a uma absorbancia de 0,85. 97Niu 5. Trés mililitros de uma solugao de azul de metileno (sol. A) foram diluidos a 7,5 mL com agua destilada (sol. B). A absorbancia da solugao B a 550 nm foi de 0,4. Como vocé determinaria a concentragao da solugao A? Referéncias ANDERSON, S. C.; COCKAYNE, S. Clinical chemistry — concepts and applications. Philadelphia: W.B, Saunders Pub.,1993. DANIELS, L.; HANSON, R.; PHYLLIPS, J. A. Chemical analysis. In: GERHARDT, P; MURRAY, R. G. E.; WOOD, W. A.; KRIEG, N. R. (Eds.). Methods for general and molecular bacteriology. ASM. Washington, 1994. p. 542-545. NELSON, D. L.; COX, M. M. Lehninger: principios de bioquimica. 3. ed. S40 Paulo: Sarvier, 2002. Informagées complementares Lista de reativos: 1. Solugao-padrao de proteina: albumina de soro bovino 5mg/mL. 2. Solugdo de proteina (albumina de soro bovino) de concentragao desconhecida 3. Reagente do biureto Preparo dos reativos: 1. Reativo de biureto Dissolver em 500 mL de agua destilada: - 1,5 g de sulfato de cobre pentaidratado - 6,0 g de tartarato duplo de sédio e potassio Adicionar 300 mL de solugao de hidréxido de sddio 10% (p/v), com constante agitacao. i 98 Adicionar agua destilada suficiente para 1 litro de solugao. 2. Solugdo-padrao de proteina Pesar 250 mg de albumina de soro bovino e dissolver em 50 ae agua destilada. Aliquotar em fragoes de 10 mL e conservar a-20° 99areca FRACIONAMENTO DAS PROTEINAS DO LEITE E SUA DOSAGEM PELO METODO DO BIURETO Objetivo Apresentar um exemplo de aplicagao pratica da espectro- fotometria. Relagao tedrico-pratica Proteinas: estrutura e fungao Fundamento O leite contém trés proteinas importantes: caseina, lactoal- bumina e lactoglobulina, todas com alto teor de aminoacidos essenciais, @ em proporcoes relativas que variam nas espécies animais. A caseina constitui cerca de 85% das proteinas totais no leite bovino e cerca de 40% das proteinas totais no leite humano. O termo caseina se aplica a um grupo heterogéneo de proteinas que contém grupos de fosfoserina, cuja fungao é ligar calcio. Estas proteinas estao presentes no leite na forma de micelas, ou seja, particulas carregadas formadas por agregados de proteina, calcio e outros ions presentes, mas também como proteina globular em solucao. Quatro classes de moléculas diferentes podem ser diferenciadas por sua mobilidade eletroforética: alfa (a); beta (6); gama 101Nlkat (y) € capa (x). Lactoglobulina e lactoalbumina também podem ser separadas, por eletroforese, em fragoes alfa (a) e beta (f). Quando ocorre um decréscimo do pH do leite, normalmente 6,6-6,9, para pH 4,6, ocorre a precipitagao das micelas provavelmente pela perda de cargas negativas importantes para sua estabilidade em solugao. Este processo é conhecido como precipitagao isoelétrica da caseina. O ponto isoelétrico de uma proteina 6 0 pH no qual sua carga liquida é zero; nessa condigao, a interagdo proteina-proteina é maior, ocasionando a precipitagao pela diminuicao da solubilidade. Em condigoes naturais isto acontece, por exemplo, quando se da a colonizagao do leite por microrganismos e a fermentagao da lactose a acido lactico acidifica 0 meio, causando a precipitacao da caseina. Em condigées controladas, este processo permite a fabricagao de coalhadas, queijos e iogurtes. Técnica |. Precipitagao isoelétrica da caseina — proteinas do filtrado (PF) 1. Transferir 10 mL de leite bovino para um copo de béquer de 50 mL. 2. Adicionar 10 mL de agua destilada morna. 3. Com uma pipeta de 2 mL, acrescentar solugao de acido cloridrico 2%, gota a gota e com agitago constante, até que se observe a coagulacao do leite. 4. Anotar o volume de acido adicionado. 5. Aguardar a sedimentagao do precipitado e filtrar o sobrenadante. A concentragao de proteinas do filtrado devera ser determinada pelo método do biureto, como descrito no item Ill. Il. Proteinas totais (PT) 1. Diluir 0,5 mL de leite bovino em 9,5 mL de.Agua destilada. A concentragao de proteinas totais devera ser determinada pelo método do biureto, como descrito no item Ill 102 Ill. Determinagao da concentragao das proteinas do filtrado (PF) e das proteinas totais (PT) pelo método do biureto Determinar a concentragao de proteinas, como especificado na tabela abaixo: Tubo 2 | Tubo PF | Tubo PT Reagentes(ml) [Agua destilada ii 04 Solugac 0 de proteina (5 mg/ml.) 0.6 Filtrado 10 [== Leite total diluido -~ | 1,0 Reativo do biureto_ a 5,0 5,0 5,0 1. Agitar e deixar em repouso por 10 minutos. 2. Determinar a absorbancia em espectrofot6metro (540 nm). 3. Determinar a concentragao de proteina (mg/mL) utilizando acurva de calibragao previamente tragada. 4. Fazer as corregdes necessarias tendo em vista as diluigdes da amostra. 5. Expressar o resultado em gramas de proteina por 100 mL de leite (9%). 6. Calcular a porcentagem de caseina do leite total. Exercicios 1. Para adosagem de proteinas do leite utilizou-se 1 mL do mesmo diluido 1:20. A absorbancia desta aliquota (devidamente tratada com 0 reativo do biureto), determinada em espectrofotémetro a 540 nm, foi de 0,04. Utilizando a curva de calibragao obtida no laboratério durante a aula pratica, calcule a concentragao de proteinas totais em gramas por 100 mL de leite puro. 103| Referéncias CRUZ, T. A. C.; GUERRA, L. B. Leite e lactagao. In: VIEIRA, E. C.; FIGUEIREDO, E. A.; ALVAREZ-LEITE, J. |.; GOMEZ, M. V. Quimica fisiolégica. 2. ed. Rio de Janeiro: Atheneu, 1995. NELSON, D. L.; COX, M. M. Lehninger: principios de bioquimica. 3. ed. Sao Paulo: Sarvier, 2002. 104 CINETICA ENZIMATICA (PARTE 1) Objetivos Demonstrar experimentalmente 0 estudo da cinética enzimatica usando a invertase como enzima-modelo. Analisar 0 efeito da variagao da concentragao de enzima e do tempo de incubagao sobre a atividade enzimatica. Relagao tedrico-pratica Enzimas: estrutura e fungao Quimica de carboidratos Fundamento < Reagao da invertase e dosagem de acuicares redutores pelo método do 3,5-dinitro salicilato (DNS) Asacarase ou invertase é uma enzima que catalisa a hidrdlise da molécula de sacarose em c-D-glucose e B-D-frutose (figura 1). 105= HoH \! Zs Invertase 0. oH HY) #6) > \ + Ki wal wo (0 \—Jonox HO jou ost “Jeon nee onan H OH OH H Sacarose a-D-glucose B-D-frutose Figura 1. Hidrdlise da sacarose catalisada pela enzima invertase Essas unidades de hexose resultantes, em meio fortemente alcalino e a quente, formam enedidis. Estes, por sua vez, podem ceder elétrons para reduzir o reagente 3,5-dinitrosalicitato (de cor amarela forte) a 3-amino-5-nitrosalicilato (de cor laranja-marrom forte). Cada mol de acucar redutor presente na solugao formara 1 mol de 3-amino-5- nitrosalicilato (figura 2). Pela determinagao da luz absorvida a 540 nm pelo 3-amino-5-nitrosalicilato, é possivel determinar a concentracao de acucar redutor presente na solugao. A sensibilidade da técnica de determinagao de aguicar redutor pelo DNS é de 1-20 mmol de glucose. HW 0 HoH thon Con ») Hoon HoH o a-D-glucose GH,oH at HoH.C phon ote ar 7 H-t-on A ko ao) —= OH cH,0H at fe nol on, + aol Enediol on A uton f-D-frutose PRODUTOS DE OXIDAGAO DO ENEDIOL, Figura 2. Formacao do enediol e reacao com 0 3,5-dinitrosalicilato (DNS) 106 Cinética enzimatica Enzimas sao proteinas que catalisam reagdes que, sob condi- oes naturais, seriam muito lentas. O aumento da velocidade de uma reagao se deve a diminuicao da energia livre de ativagao. O estudo da velocidade das reagdes quimicas chama-se cinética. A cinética enziméatica tem por objetivo a compreensao do mecanismo de agao das diferentes enzimas e da velocidade das reagées por elas catali- sadas. Este estudo avalia também as alteragdes na velocidade da reagao ee eeteee a modificagdes de parametros experimentais, como a entragao do substrato, o tempo de incubacao, a temperatura de incubagao ou a variagao do pH. Em 1913, Leonor Michaelis e Maud L. Menten propuseram uma teoria geral para a atividade enzimatica, na qual: Enzima + Substrato <> Complexo Enzima-Substrato >Enzima + Produto E+ S$ @ (ES) => E—E + P Um procedimento comum para se determinar a velocidade de uma reagao enzimatica consiste em se misturar enzima com substrato e se observar a formagao de produto imediatamente apés se fazer a mistura. Desta forma, evita-se a interferéncia da variagao da concentracao do substrato e tem-se que sua concentragao sera muito proxima do valor inicial. Esta situagao aplicada a um experimento cinético permite a medida da velocidade inicial da reagao (Vo), quando a [S] é geralmente muito maior que [E], ou seja, pode-se considerar a concentragao de substrato como sendo sempre saturante (figura 3). Produto Tempo Figura 3. Determinacao da velocidade inicial (V,) em fungao do tempo de incubacao para cada concentragao de substrato [S] 107O estudo do efeito da variagao da [S] na velocidade inicial da reacgao, quando [E] e tempos de incubagao sao constantes, fornece um grafico com um perfil de hipérbole retangular perfeita: ial de reag&o) V, (velocidade i Km [s] Figura 4. Efeito da concentracao de substrato [S] sobre a velocidade da reagao. Km = constante de Michaelis-Menten Em baixa concentragao de substrato [S] tem-se quase toda a enzima na forma livre e a velocidade sera proporcional a concentragao de substrato. O equilibrio de E + S = ES sera deslocado para ES a medida que [S] aumenta. A velocidade maxima (Vmax) desta reagao sera atingida quando toda a E esta presente como ES. Nessa situagao, a concentracao de enzima livre [E] é infinitamente pequena. Nestas condigées, E esta saturada por S e cada molécula de enzima estara catalisando a formagao de produto tao rapidamente quanto as condigdes experimentais o permitirem. Neste caso, qualquer aumento em [S] exercera um efeito desprezivel sobre Vmax. Esta condi¢ao existira quando [S] for suficientemente elevada para que toda E estejana forma de ES. O tratamento matematico da reagao E + S = [ES] =E + P permitiu o desenvolvimento da equacao de Michaelis e Menten: , — Vnaxx[5] ~ Km+{[S] onde Km é€ conhecida como Constante de Michaelis e representa a concentracéo de substrato necessaria para se atingir a metade da velocidade maxima. Km é expressa em mol/L. 108 oO valor numérico de Km é de interesse por diversas razées: : 1. Km é uma constante particular de cada enzima para um determinado substrato e seu valor fornece um meio de comparagao entre as enzimas. 2. Uma variagao no valor real de Km induzida por um ligante é uma maneira de regular a atividade enzimatica. 3. Quando se conhece Km, podem-se ajustar as condigdes experimentais para se obter [S] > > Km e se determinar a velocidade maxima da reagao. : 4. Km indica a interagao de substratos alternativos para uma determinada enzima. O substrato com menor valor de Km tem uma afinidade maior para a enzima. : 5. Km permite avaliar se a um nivel intracelular de substrato a enzima estara ativa. : Nessas consideragées, admitiu-se que a concentragao de enzima era fixa. Entretanto, a velocidade da reacao varia de maneira diretamente proporcional a concentragao de enzima, desde que haja concentragao de substrato suficiente (figura 5) [E] Figura 5. Efeito da concentragao de enzima [E] sobre a velocidade da reacdo Sabe-se ainda que a velocidade da reagao enzimatica depende do pH do meio. Em geral, observa-se uma regiao de pH na qual a atividade enzimatica é otima (figura 6). 109Produto pH Figura 6. Efeito do pH sobre a formagao de produto quando sao mantidas as mesmas condigées de [E], [S], tempo e temperatura Técnica |. Efeito da variagao da concentragao da enzima 1. Organizar uma bateria com seis tubos de ensaio. 2. Identifica-los com numeros de 1 a6. 3. Adicionar os reagentes conforme a tabela: TuBO | TUBO | TUBO | TUBO | TUBO | TUBO 1 2 3 4 5 6 REAGENTES (ml) Tansee GOSH jo | io | to | 10 [ 10 | 10 | Agua destilada 40 | 09 0.8 06 0,2 : Sacarose (0,2 mollL) a 05 | 05 | 05 | 05 | 05 | 05 ‘Solucdo de enzima (0,05 mgimL) : of [| 02 [ 04 | 08 | 40 4. Levar a bateria de tubos ao banho-maria a 25 °C. 5. Incubar durante cinco minutos. a 6. Adicionar 1,0 mL de solugao de 3,5-dinitrosalicilato a cada um dos tubos. 7. Levar a bateria de tubos para aquecer em banho fervente durante cinco minutos. s 8. Deixar resfriar por cinco minutos. 110 9. Adicionar 6,5 mL de agua destilada a cada um dos tubos. 10. Calibrar 0 espectrofotémetro a 540 nm com 0 tubo 1. 11. Proceder a leitura das absorbancias dos demais tubos. 12. Tragar 0 grafico: Concentragao de enzima (mg/mL) (abscissa) x Absorbancia (ordenada). 13. Interpretar o resultado. Il. Efeito da variagao do tempo de incubagao 1. Organizar uma bateria com cinco tubos de ensaio. 2. Identifica-los com numeros de 1 a5. 3. Adicionar os reagentes conforme a tabela: Tuso |TUBO |TUBO |TUBO [TUBO 1 2 3 4 5 REAGENTES (mL) ‘Tampao acetato (0,05 mol/L pH 4,7) 10 | 40 \gua destilada a 4.0 08 Sacarose (0,2 mol/L) 0.5 05 Solugdo de enzima (0,05 mg/mL) 2 0,2 Atencao 4. Levar os tubos 3, 4 e 5 ao banho-maria a 25°C. 5. Incubéa-los durante 5 min (tubo 3); 10 min (tubo 4) 6 15 min (tubo 5). 6. Adicionar 1,0 mL de solugdo de 8,5-dinitrosalicilato aos tubos 1 € 2. 7. Imediatamente apds a retirada do tubo do banho-maria, adicionar 1,0 mL de solugao de 3,5-dinitrosalicilato. 8. Ao término da incubagao do tubo 5, levar a bateria de tubos para aquecer em banho fervente durante cinco minutos. 9. Deixar resfriar por cinco minutos. 10. Adicionar 6,5 mL de agua destilada a cada um dos tubos. 11. Calibrar 0 espectrofotémetro a 540 nm com o tubo 1. 12. Proceder a leitura das absorbancias dos demais tubos. 13. Tragar 0 grafico: Tempo (min) (abscissa) x Absorbancia (ordenada). 14. Interpretar o resultado. 117CINETICA ENZIMATICA (PARTE Il) Objetivos Demonstrar experimentalmente o estudo da cinética enzimatica usando a enzima invertase como modelo. Analisar 0 efeito da variagao do pH da solucao tampao e da concentragao de substrato sobre a atividade enzimatica. Técnica Ill. Efeito da variagao do pH do tampao sobre a atividade enzimatica 1. Organizar uma bateria com nove tubos de ensaio. 2. Identificd-los com numeros de 1 a9. 3. Adicionar os diferentes tampdes e os demais reagentes conforme a tabela: 113TUBO | TUBO | TUBO | TUBO] TUBO | TUBO | TUBO | TUBO TUBO. REAGENTES (mL) ‘Tampa pH 2,0 ‘Tampao pH 3,0 Tampaio pH 4,0 ‘Tampao pH 5,0 ‘Tampao pH 6,0 TampaopH7,0__ ‘Tampao pH 8,0 ‘Tampao pH 9,0 [Agua destilada Sacarose (0,2 mol/L) Solugéo de enzima (0,1 mg/mL) Atengao: a enzima é sempre a Ultima adigao 4. Levar a bateria de tubos ao banho-maria a 25 °C. 5. Incubar durante cinco minutos. i 6. Adicionar 1,0 mL de solugao de 3,5-dinitrosalicilato a cada um dos tubos. 7. Levar a bateria de tubos para aquecer em banho fervente por cinco minutos. ‘ 8. Deixar resfriar por cinco minutos. 9. Adicionar 6,5 mL de agua destilada a cada um dos tubos. 10. Calibrar o espectrofotémetro a 540 nm como tubo 1. 11. Proceder a leitura das absorbancias dos demais tubos. 12. Tragar o grafico: pH (abscissa) x Absorbancia (ordenada). 13. Interpretar 0 resultado. IV. Efeito da variagdo da concentragao do substrato 1. Organizar uma bateria com oito tubos de ensaio. 2. Identifica-los com numeros de 1 a 8. : 3. Adicionar os reagentes, variando a concentragaéo de sacarose, conforme a tabela: TUBO | TUBO | TUBO [TUBO | TUBO [ TUBO | TUBO | TUBO 1 2 3 4 5 6 7 8 REAGENTES (mL) ‘Tampao acetato 10 | 10 | 140 | 40 | 40 | 40] 40 | 40 (0,05 moW/L pH 4,7) [Agua destilada 13 | 03 [03 | 03 Sacarose 0,01 mol/L | Sacarose 0,02moVL[ — | — Sacarose 0,05 mol/L. Sacarose 0,1 mol/L Sacarose 0,2 movL [| | — [| — | — | 40 Sacarose 0,3 moV/L 10 Sacarose 0,4 mol/L 10 Solugao de enzima | 02) 02 [02 [ 02) 02) 02 | 02 | 02 (0.1. mg/mL) l Atengao: a enzima é sempre a ultima adigao 4. Levar a bateria de tubos ao banho-maria a 25 °C. 5. Incubar durante cinco minutos. 6. Adicionar 1,0 mL de solucao de 3,5-dinitrosalicilato a cada um dos tubos. 7. Levara bateria de tubos para aquecer em banho fervente por cinco minutos. 8. Deixar resfriar por cinco minutos. 9. Adicionar 6,5 mL de agua destilada a cada um dos tubos. 10. Calibrar 0 espectrofotémetro a 540 nm com o tubo 1. 11. Proceder a leitura das absorbancias dos demais tubos. 12. Calcular a concentragao final da sacarose em cada tubo. 13. Tragar 0 grafico: Concentracao final de substrato (mmol/L) x Absorbancia. 14. Interpretar os resultados. Exercicios 1. Descreva a reagao enzimatica da invertase. 2. Como se pode determinar a concentragao dos produtos da reacao catalisada pela invertase? 3. Qual o Km obtido para a invertase? Qual o seu significado? 4. Qual 0 pH timo determinado para a invertase? Qual o seu significado? 115Referéncias ASARE-BROWN, E.; BULLOCK, C. Simple practical investigations using invertase. In: WOOD, E. J. (Ed.). Practical biochemistry for colleges. Oxford: Pergamon Press, 1989. BERG, J. M.; TYMOCZKO, J. L.; STRYER, L. Bioquimica. 5. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2004. MARZZOCO, A.; TORRES, B. B. Bioquimica basica. 2. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1999. NELSON, D. L.; COX, M. M. Lehninger: principios de bioquimica. 3. ed. Sao Paulo: Sarvier, 2002. Informagées complementares Lista de reativos: 14. Solugao de enzima invertase (0,05 e 0,1 mg proteina/mL) 2. Substrato: sacarose 0,2 mol/L 3. Tampao acetato 0,05 mol/L; pH 4,7 4. Solugao alcalina de 3,5-dinitrosalicilato 5. Solugdes-tampao: pH 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0 e 9,0. Preparo dos reativos: 14. Isolamento da invertase a partir de leveduras Pesar 50 g de leveduras secas (fermento de pao), suspender em 250 mL de bicarbonato de sédio 0,15 mol/L e manter em banho- maria a 37 °C durante 6 horas, com agitacao ocasional. Centrifugar por 20 minutos a 3.500 rpm. Coletar o sobrenadante, que co ntém a enzima invertase ativa. Como este procedimento é uma purificagao parcial eno sobrenadante poderao ser encontradas enzimas de muitas outras vias metabdlicas, este material é dito extrato bruto. Conservar a temperatura de 4°C. Normalmente, a concentracao de enzima para os ensaios éde 0,1 mg proteina/mL. 116 2. Solugdo de sacarose 0,2 mol/L Usar esta solugao para obter o 6 is di utras solugdes mai i sacarose. i is diluidas de 3. Solugao-tampao acetato 0,05 mol/L pH 4,7 a) solugao de acetato de sdédio 0,05 mol/L b) solugao de acido acético 0,05 mol/L. Misturar 150 mL da solugao “a” e 300 mL da solugao “b”. 4. Reativo de 3,5-dinitrosalicilato (DNS) Dissolver por aquecimento 5 g de acido 3,5-dini icili em 100 mL de NaOH 2 mol/L. atest Separadamente, dissolver também cot i ite, ve ym aquecimento 150 de tartarato duplo de sédio e potassio em 250 mL de agua estilada, Misturar as duas solugdes e completar o vol lum com agua destilada. i oooe 5. Solugao tampao fosfato 0,05 mol/L pH 6,0; 7,0 e 8,0 Preparar conforme a tabela da pagina 36. ; Informagées sobre os reagentes: 1. 3,5-Dinitrosalicilato (DNS) MM: 228,116 g/mol — Formula molecular: C,H,N,O, ° SA Ne HO. Estrutura: oz. oz 117HIDROLISE ACIDA E ENZIMATICA DO AMIDO Objetivos Demonstrar a hidrlise acida e enzimatica do amido. Evidenciar a hidrdlise do polissacarideo por meio de reagdes especificas. Elaborar curvas de tempo pela determinagao de acucares redutores resultantes da hidrdlise. Relagao tedérico-pratica Estrutura de carboidratos Enzimas Fundamento O amido é uma mistura de glucanas que as plantas sintetizam como seu principal alimento de reserva. E depositado nos cloroplastos das células vegetais como granulos insoluveis compostos por a-amilose e amilopectina. A c-amilose é um polimero linear de milhares de unidades de glucose unidas por ligagdes glicosidicas « (14). J4a amilopectina consiste de unidades de glucose unidas por ligagdes « (14), sendo, entretanto, uma molécula ramificada, por possuir ligagdes o (16) a cada 24 a 30 unidades de glicose (figura 1). » 119| Hidrdlise enzimatica—as amilases sao enzimas que catalisam a hidrolise do amido e estao amplamente distribuidas na natureza: a-amilase da saliva e do suco pancreatico, f-amilase do matte, yamilase de fungos, etc. A classificacao das amilases é feita de acordo com 0 seu modo de agao sobre homoglucanas. As a-amilases sao endo- enzimas, isto 6, atuam ao acaso é no interior da molécula, as - € y- amilases sao exo-enzimas, atuam a partir das extremidades nao redutoras do polimero. A a-amilase, salivar e pancreatica, catalisa a hidrdlise das ligages glicosidicas o. (14) da amilose, amilopectina e do glicogénio, produzindo, na clivagem inicial, oligossacarideos de 6 ou 7 unidades de glucose, que sao posteriormente degradados a maltotriose e maltose. A maltose nao é substrato para a enzima. A glucose pode aparecer entre os produtos finais da reagao, desde que o tempo de acéo da enzima sobre as glucanas seja prolongado. Hidrélise acida — em presenga de acidos fortes e sob aque- cimento a 100 °C, as ligagdes glicosidicas podem ser hidrolisadas. oO Acido a quente hidrolisa tanto as ligagoes o. (14) como « (16). Em fungao do tempo de hidrélise sao encontrados como produtos interme- diarios dextrinas e oligossacarideos, sendo a glucose 0 produto final da hidrdlise acida. 120 ~~ A) HO Extremidade nao 7 Extremidade redutora redutora B) Ramificago Ponto de ramificago a(16) Cadeia principal Figura 1, Representacdo de um segmento da cadeia da amilose (A) e de amilopectina (B) Acompanhamento da hidrdélise do polissacarideo por meio de reagdes especificas ' Reagao com iodo —a reagao com iodo é utilizada para a Pesquisa do amido, que forma com ele um complexo colorido. A amilose da origem a uma coloragaéo negro-azulada, enquanto a amilopectina da origem a uma coloragao vermelho-violacea. Em fungao do tempo. de hidrélise sao encontrados como produtos intermediarios dextrinas e oligossacarideos, sendo a glucose o produto final da hidrdlise acida. As dextrinas, dependendo do seu tamanho e complexidade molecular, desenvolvem diferentes coloragdes com 0 iodo: as dextrinas maiores 121podem desenvolver cor azul ou purpura, as de tamanho intermediario dao coloragao avermelhada e as menores nado desenvolvem cor em presenc¢a de iodo. ; Dosagem de acucares redutores pelo método do 3,5 di- nitrosalicilato (DNS) — durante a hidrolise do amido sao liberadas unidades de glucose que, em meio fortemente alcalino e a quente, formam enedidis. Estes, por sua vez, podem ceder elétrons para reduzir oreagente 3,5-dinitrosalicitato (de cor amarela forte) a 3-amino-5-nitro- salicilato (de cor laranja-marrom forte). Cada mol de acucar redutor presente na solugao formara 1 mol de 3-amino-5-nitrosalicilato. Pela determinagao da luz absorvida a 540 nm pelo 3-amino-5-nitrosalicilato, é possivel determinar a concentragao de agticar redutor presente na solugao. A sensibilidade da técnica de determinagao de acuicar redutor pelo DNS é de 0,2 mg a 2,0 mg de glucose. Oligossacarideos Dextrinas Maltotriose Maltose _-lsomaltose Glucose | tL Enediol jie ie \ \ Ker yh h Hidrélise Amido) ——> T I ic I OH co0o- i coo- OH / 100°C OH 3,5-dinitro-salicilato L 3-amino-5-nitrosalicilato (cor amarela forte) | (produto — cor laranja-marrom forte) Y PRODUTOS DE OXIDAGAO DO ENEDIOL Figura 2, Reacao do 3,5-dinitrosalicilato (ONS) para evidenciar a presenga de acticares redutores 122 Técnica |. Curva de calibragao para dosagem de agcucar redutor — reagao do 3,5-dinitrosalicilato (DNS) Sensibilidade do! Método: 0,2 mg a 2,0 mg de glucose. 1. Organizar uma bateria com seis tubos de ensaio. 2. Identificé-los com numeros de 1 a6. 3. Adicionar os reagentes conforme a tabela: TUBO GLUCOSE 2 mg/mL AGUA DESTILADA 1 (branco) a 1.5mb 2 0.1 mL (0,2 mg) 1,4mL 3 0,2 mL (0,4 mg) —_413mL 4 0,4 mL (0,8 mg) ee me 5 0,8 mL (1,6 mg) 0,7 mL 6 1,0 mL (2,0 mg) 0,5 mL 4. Em cada tubo, adicionar 1,0 mL do reativo DNS. 5. Aquecer em banho-maria fervente por 5 minutos, 6. Resfriar os tubos e adicionar, a cada tubo, 7,5 mL de agua destilada. 7. Lera540 nm e anotar as absorbancias. 8. Tragar um grafico, colocando as concentragées na abscissa e as absorbancias na ordenada. 9. Interpretar os resultados. Il. Hidrdlise acida do amido Acompanhe os procedimentos representados na figura 3. 1. Colocar 5 mL de solugao de amido em um tubo de ensaio eleva-lo aum banho-maria fervente. Deixar 5 minutos para homogeneizar a temperatura. 2. Adicionar ao tubo 0,2 mL de acido cloridrico concentrado, misturar e imediatamente retirar 0,4 mL, que deverao ser transferidos Para outros dois tubos (0,2 mL em cada) para a realizacao do teste do iodo e de acticares redutores (este 60 tempo zero da reagao). 1233. Nos tempos de 5, 10, 15 e 20 min, retirar aliquotas de 0,4 mL, que deverao ser transferidas para outros dois tubos (0,2 mL em cada). Apos cada coleta, realize imediatamente os testes do iodo e de acuicares redutores, como descrito abaixo. Teste do iodo: Em um dos tubos contendo 0,2 mL da amostra coletada adicione 3 gotas de lugol e 10 mL de agua destilada. Dosagem de acucares redutores: No outro tubo contendo 0,2 mL coletados adicione 1,3 mL de agua destilada e 1,0 mL do reativo DNS. Apés a coleta da ultima aliquota (tempo de 20 minutos), executar os procedimentos abaixo para todas as aliquotas coletadas para dosagem de 4. Levar os tubos correspondentes aos tempos zero, cinco, dez, quinze e vinte minutos ao banho-maria fervente por 5 min. 5. Resfriar os tubos por 5 min e adicionar, a cada tubo, 7,5 mL de agua destilada. 6. Lera540 nm e anotar as absorbancias. 7. Utilizando a curva de calibragao construida anteriormente, calcular a quantidade de agucar redutor formado (em mg de glucose) durante o curso da hidrdlise. Tragar um grafico, colocando mg de glucose na ordenada e tempo de hidrdlise na abscissa. 8. Interpretar os resultados. Ill. Hidrdlise enzimatica do amido Acompanhe os procedimentos representados na figura 3. 1. Colocar 5 mL da solugao de amido a 1% (p/v) em um tubo. de ensaio e leva-lo a um banho-maria a 37 °C. Deixar durante 5 minutos para homogeneizar a temperatura. Durante este tempo, proceda a diluigao da salivacom tampao imidazol (0,1 mol/L pH 7,2): 1:2, 1:20 ou 1:50. Asaliva devera ser coletada de varios individuos. 2. Adicionar a solugao de amido (37 °C) 0,2 mL da solugao de saliva diluida, agitar e retirar imediatamente 0,4 mL, que deverao ser 124 transferidos para outros dois tubos (0,2 mL em cada) para a realizagao dos testes do iodo e de agticares redutores (este é 0 tempo zero da reagao). Imediatamente apés a retirada das aliquotas, recolocar 0 tubo de hidrdlise no banho 37 °C. Este procedimento de coleta devera ser tepetido nos tempos de 5, 10, 15 e 20 min de hidrdlise. Apés cada coleta, realize imediatamente os testes do iodo e de acticares redutores como descrito abaixo: Teste do iodo: Em um dos tubos contendo 0,2 mL da amostra coletada, adicione 3 gotas de lugol e 10 mL de agua destilada. Dosagem de acucares redutores: No outro tubo contendo 0,2 mL coletados adicione 1,3 mL de agua destilada e 1,0 mL do reativo DNS. Apos a coleta da ultima aliquota (tempo de 20 minutos), executar os procedimentos abaixo para todas as aliquotas coletadas para dosagem de aguicares redutores. 3. Levar os tubos correspondentes aos tempos zero, cinco, dez e vinte minutos ao banho-maria fervente por 5 min. 4. Resfriar os tubos por 5 min e adicionar, a cada tubo, 7,5 mL de agua destilada. 5. Lera540 nm e anotar as absorbancias. Adicionar: 0,2 mL de HC! (hidrélise Scida) ou 0,2 mL de saliva diluida (hidrolise enzimética) Solugao de amido 1% ‘A 100°C (hideise acide) ow AST (hidrdlise enzimaiica)| Retirar 0,4 ml. nos tempos zero, 5, 10, 15 0 20 minutos do hidrélise 0.2L. Dosagem de acticaros Teste do iodo. redutores. Adicionar: Adicionar: 1,3 mL de Agua destiada 3 gotas de lugol 1,0 mL de DNS. 10 mL de agua destilada Obs. Apés a ultima coleta (20 minutos) Figura 3. Representacao esquematica dos procedimentos técnicos de hidrdlise acida e enzimatica do amido 1256. Utilizando a curva de calibragao construida anteriormente, calcular a quantidade de aguicar redutor formado (em mg de glucose) durante o curso da hidrdlise. Tragar um grafico, colocando mg de glucose na ordenada e tempo de hidrdlise na abscissa. 7. Interpretar os resultados. Exercicios 4. Comrelacao a natureza dos produtos de hidrdlise, diferen- ciar a agao de um acido mineral e da a-amilase salivar sobre o amido. 2. Em que se fundamenta o método do 3,5-dinitrosalicilato para a dosagem de agticares redutores? 3. Explicar os resultados obtidos nas hidrdlises acida e enzimatica do amido, em fun¢ao da evolugao das cores obtidas (zero, 5, 10, 20 e 40 min) com 0 iodo. 4. Supondo que a hidrdlise acida mineral do amido fosse parcial a ponto de permitir o isolamento preferencial de dissacaridios, qual seria a estrutura desses dissacaridios (tipos de ligagdes glicosi- dicas)? Obs.: recordar que o amido é constituido de dois tipos de polissacarideos. Referéncias SUMMER, J. B. The estimation of sugar in diabetic urine using dinitrosalicylic acid. J. Biol. Chem., v. 62, p. 287-290, 1924. THOMA, J. A.; SPRANDLIN, J. E.; DYGERT, S. Plant and animal amylases. In: BOYER, P. D. The enzymes. 5. ed. New York: Academic Press, 1971 VOET, D.; VOET, J.; PRATT, C. W. Fundamentos de bioquimica. 1. reimp. Porto Alegre: Artmed, 2000. Informagdes complementares Lista de reativos: 126 1. Solugdo de amido 1% (p/v) 2. HClconcentrado 3. Solugao de Saliva Solugao padrao de glucose contendo 2 mg/ml em acido benzdico 0,1% 5. Solugao de lugol 6. Reativo do 3,5-dinitrosalicilato (DNS) AS Preparo dos reativos: 1. Solugao de amido 1% (p/v) Suspender 1 g de amido em 20 mL de agua destilada fria, adicionar, com agitagao, 70 mL de agua destilada fervente. Deixar esfriar e completar o volume para 100 mL. 2. Solugao de lugol Pesar 1 g de iodo, 5 g de iodeto de potassio e dissolver em 100 mL de agua destilada. | 3. Reativo de 3,5-dinitrosalicilato (DNS) Dissolver, com aquecimento, 5 g de acido 3,5-dinitrosalicilico em 100 mL de NaOH 2 mol/L. Separadamente, dissolver, também com aquecimento, 150 g de tartarato duplo de sddio e potassio em 250 mL de Agua destilada. Misturar as duas solugdes e completar o volume para 500 mL com agua destilada. Informag6es sobre os reagentes: 1. 3,5-dinitrosalicilato (DNS) MM: 228,116 g/mol — Formula molecular: C,H,N,O, 0. 0H . Yo” HO, Estrutura: “t ise o o 127HIDROLISE ENZIMATICA DO AMIDO - CURVA DE TEMPO PARA A ATIVIDADE DA AMILASE SALIVAR Objetivos Tragar uma curva de tempo para a reacao de hidrdlise do amido pela amilase salivar. Quantificar o substrato, utilizando uma solugao de iodo/iodeto de potassio. Relagao tedrico-pratica Quimica de carboidratos Enzimas Fundamento A digestao do amido, principal fonte de carboidrato da dieta humana, é iniciada na cavidade bucal. A saliva contém uma amilase que hidrolisa ligagdes o:(14). As amilases sao enzimas que catalisam ahidrdlise do amido e estao amplamente distribuidas na natureza: o- amilase da saliva e do suco pancreatico, B-amilase do malte, y-amilase de fungos, etc. A classificagao das amilases é feita de acordo com o seu modo de acao sobre homoglucanas, ou seja, as w-amilases sao endo-enzimas, isto é, atuam ao acaso e no interior da molécula, as B- e 129y-amilases Sao exo-enzimas, atuam a partir das extremidades nao redutoras do polimero. A a-amilase, salivar & pancreatica, catalisa a hidrdlise das ligages glicosidicas o(14) da amilose, amilopectina e do glicogénio, produzindo, na clivagem inicial, oligossacarideos de 6 ou 7 unidades de glucose, que sao posteriormente degradados a maltotriose e maltose. A maltose nao é substrato paraa enzima. Aglucose pode aparecer entre os produtos finais da reagao, desde que o tempo de agao da enzima sobre as glucanas seja prolongado. Aamilose e a amilopectina formam complexos com o iodo. A amilose da origem a uma coloragao negro-azulada, enquanto a amilopectina da origem a uma coloracao vermelho-violacea. Em funcao do tempo de hidrdlise sao encontrados como produtos intermediarios dextrinas e oligossacarideos. As dextrinas, dependendo do seu tamanho e complexidade molecular, desenvolvem diferentes coloragdes com 0 iodo: as dextrinas maiores podem desenvolver cor azul ou purpura, as de tamanho intermediario dao coloragao avermelhada e as menores nao desenvolvem cor em presenga de iodo, assim como a maltose e maltotriose. Técnica 1. Preparar uma solugao de saliva diluida 1:50, conforme descrito abaixo: Coletar um pouco de saliva de 2a3 doadores em um béquer. Transferir 0,1 mL de saliva (evitar pegar so espuma da solug&o de saliva) para um tubo de ensaio contendo 4,9 mL de tampao imidazol 0,05 mol/L pH 7,2 e misturar. 2. Organizar uma bateria com cinco tubos de ensaio. 3. Identificd-los com numeros de 1 a5. 4. Adicionar os reagentes conforme atabela: a TUBO [TUBO | TUBO | TUBO THEO 4 2 3 [ 4 5 [REAGENTES (mL) = ii Agua destilada 40 | — = | = = ‘Solugao de amido 1% = | 40 | 10 | 40 [4.0 [Saliva diluida em tamp&o imidazol 0,05 moV/L pH 7.2 Cos tos | os | 0s | 0s | \ 130 5. Manter os tubos 1 e 2 na bancada e levar os tubos 3, 4 0 5 ao banho-maria a 37 °C. ; 6. Incubé-los durante 10 min (tubo 3), 20 mit arr ( )s in (tubo 4) e 30 7. Apés 0 término da incubagao de todos os tubos, adicionar 3 gotas de lugol e 5 mL de agua destilada em cada um dos tubos. 8. Ajustar o espectrofotémetro a 640 nm (filtro. 3 0 tubo 1 (branco). ( ieee 9. Proceder a leitura das absorbancias dos demais tubos. 10. Tragar 0 grafico: Tempo de incubagao em min (ab: Absorbancia (ordenada). 2 Beet 11. Interpretar o resultado. Referéncias VOET, D.; VOET, J.; PRATT, C. W. Fundamentos de bioquimica. 1. reimp. Porto 4 3 ica. 1. reimp. ZANCAN, G. T.; AMARAL, D. Determinagao da c-amilase salivar. In: Praticas de bioquimica geral. Curitiba: Instituto de Bioquimi iversidade ; : ioqu Federal do Parana, 1967. p. 74-76. es 131Informagdes complementares Lista de reativos: Solugao de amido 1% (p/v) Solugao de lugol Solugdo tampao imidazol 0,05 mol/L pH 7,2 Saliva (mistura de 2 ou 3 doadores) Fon = Preparo dos reativos: 1. Solugao de amido Suspender 1 g de amido em 20 mL de agua destilada fria, adicionar, com agitagao, 70 mL de agua destilada fervente. Deixar esfriar e completar o volume para 100 mL. 2. Solugao de lugol Pesar 1 g de iodo, 5 g de iodeto de potassio e dissolver em 100 mL de agua destilada. 3. Solugao tampao imidazol 0,1 mol/L pH 7,2 : Pesar 3,4 g de imidazol e dissolver para 700 mL, com agua destilada. Ajustar o pH para 7,2 em potenciémetro e completar o volume para 1.000 mL com agua destilada. 132 DETERMINAGAO DE UREIA EM MATERIAL BIOLOGICO Objetivos Dosar uréia em amostra de urina. Reforcar 0 aprendizado sobre aplicagéo dos métodos fotocolorimétricos. Reforcar os calculos envolvendo diluigao e fatores de corregao. Relagao teorico-pratica Enzimas do ciclo da uréia Fundamento Auréia 6 hidrolisada cataliticamente pela urease, dando origem aos produtos CO, e NH,, que, em solugdo aquosa, formam H,CO, e NH,OH. Estes tiltimos reagem entre si, dando carbonato de aménio. Oreativo de Nessler reage com a aménia liberada, formando rapidamente um complexo colorido cuja coloragéo vai desde amarelo até alaranjado intenso, dependendo da concentragao de aménia presente. Este complexo colorido permanece em solugao coloidal, mas flocula se deixado em repouso, recomendando-se entao a imediata leitura da cor apés a adigdo do reativo. O mecanismo da reagao nao 133NMG esta completamente elucidado, admitindo-se, porém, a formagao de H,NHg,I,. A sensibilidade da técnica espectrofotometrica quantitativa com 0 reagente de Nessler oscila de 10 a 90 mg de nitrogénio. A taxa normal de uréia excretada nos mamiferos 6 de 20a 30 g/ 24 horas. Balango nitrogenado em mamiferos: A uréia € 0 principal produto de excregao nitrogenada em mamiferos, sendo sintetizada no figado (ciclo da uréia) a partir da aménia resultante da desaminagao oxidativa de aminoacidos e a partir da hidrdlise de grupos amida presentes na glutamina e asparagina. Este metabdlito 6 excretado pelos rins e a sua determinagao, tanto no sangue quanto na urina, indica o estado de balango nitrogenado nos mamiferos. Técnica |. Curva de calibragao com solugdo-padrao de sulfato de am6nio a 472 mg% Obs.: Sulfato de aménio a 472 mg% = 100 mg% de nitrogénio. 4. Separar 6 tubos de ensaio e adicionar os reagentes como indicado na tabela abaixo: Tubos 7 4 2 3 47s] 6 | (branco)) — sada 7 (mL) _ 7 0 | 6 ‘Sol-padrio de NH,SO, (mL) 15 4 x . Agua destilada (mL) 10 85 6,0 “8 if Reativo de Nessler (mL) _ eserves ce eH) 2. Misturar o contetido de cada tubo. Aguardar 1 minuto, € ler aaabsorbancia a 415 nm (filtro azul). Calibrar o aparelho com 0 tubo branco. oe 3. Tracgar um grafico, plotando as concentragdes de nitrogénio (mg) no eixo das abscissas e as respectivas leituras de absorbancia no eixo das ordenadas. 134 ll. Dosagem de uréia na urina 1. Separar dois tubos de ensaio e adicionar os reagentes, como indicado abaixo: Tubo 7 (branco da amostra): 1,0 mL de agua destilada e 2 gotas de solucao de urease Tubo 8 (amostra): 1,0 mL de urina e 2 gotas de solugao de urease 2. Incubar a 50°C, durante 30 minutos. 3. Apdés a incubagao, centrifugar os contedos dos dois tubos e, aos sobrenadantes, adicionar 9,0 mL de agua destilada e 1,0 mL do reativo de Nessler. Misturar e ler, ap6s 1 minuto, a absorbancia do tubo 8 (amostra) a 415 nm (filtro azul), calibrando 0 aparelho como tubo 7 (branco da amostra). 4. Calcular o resultado em gramas de uréia por 24 horas. Obs.: Para transformar miligramas de nitrogénio uréico em miligramas de uréia basta multiplicar pelo fator 2,14 (sabendo-se que a massa molecular da uréia é 60 e a massa do nitrogénio molecular é 28, a razao 60/28 resulta em 2,14). Exercicios 1. Empregando a equagao anterior, calcular a taxa de excrecdo de uréia, supondo uma urina diluida 50 vezes e um volume urinario em 24 horas de apenas 450 mL. 2. Justifique a utilizagao de sulfato de aménio como padrao na determinagao de uréia. 3. Que componente dos produtos da reagao catalisada pela urease é analisado com 0 reativo de Nessler? 4. Por que anecessidade de dois tubos brancos, 0 tubo 1 € 0 tubo 7, para o ensaio? 5. Se a concentragao determinada na amostra exceder 0 limite de sensibilidade da técnica (90 mg de nitrogénio), que procedi- mento deve ser adotado? 135Referéncias ZANCAN, G. T.; GOMES, V. Praticas de bioquimica clinica. Curitiba: Universidade Federal do Parana, 1967. p. 86-90. Informagées complementares Lista de reativos: 1. Solugao de urease 2. Reativo de Nessler 3. Solucao-padrao de sulfato de am6nio Preparo dos reativos: 1. Solugao de urease Dissolver 150 mg de urease em 100 mL da solugao de EDTA (acido etileno-diamino-tetraacético, sal tetrassddico); 1%, pH 6,5. 2. Reativo de Nessler * Solucao A: dissolver 12 g de bicloreto de merctirio em 100 mL de agua destilada a 60 °C * Solugao B: dissolver 14,8 g de iodeto de potas- sio em 100 mL de agua destilada a 60 °C. Misturar as duas solugGes para obter um precipitado vermelho de iodeto de merctirio. Sedimentar e lavar o precipitado varias vezes com Agua destilada. Adicionar 14 g de iodeto de potassio e Agua destilada em quantidade suficiente para dissolver o precipitado. Passar para um balao de 200 mL e juntar 40 g de hidréxido de sddio isento de carbonato, ou seja, uma solugao de NaOH 40% p/v. Completar o volume para 200 mL. Deixar em repouso em frasco escuro, durante 48 horas, e decantar o liquido limpido (reativo de Nessler) para outro frasco escuro. 136 3. Solugao-padrao de sulfato de aménio [(NH,), SO 472 mg% (equivalente a 100 mg% de nitrogénio) eels Dissolver 472 mg de sulfato de am6nio dessecado a vacuo, por 24 horas, em um volume final de 100 mL com solugao de H,SO, 0,1 mol/L. 4. Solugao de trabalho Diluir 100 vezes a solugao original, de modo s soll fF que 10 mL contenham 100 mg de nitrogénio dissolvidos em H,SO, 0,1 mol/L. Anotar ° volume urinario de 24 horas e diluir a urina com agua na proporgao de 1:100, 1:150, 1:200 e 1:250. 137DETERMINAGAO DA ATIVIDADE DE TRANSAMINASES SGOT (GLUTAMICO- OXALACETICA; OU ASPARTATO AMINOTRANSFERASE - AST) E SGPT (GLUTAMICO-PIRUVICA; OU ALANINA AMINOTRANSFERASE - ALT) Objetivos Determinar a atividade de SGOT e SGPT no soro. Elaborar uma curva-padrao para a determinacao da atividade das enzimas acima citadas. Relagao tedrico-pratica Aminoacidos, proteinas e enzimas Determinacao de atividade enzimatica: definigao de unidade de enzima Enzimas de importancia clinica -marcadores teciduais Uteis no diagndstico de diferentes patologias Curva-padrao Espectrofotometria 139Fundamento ‘As transaminases so enzimas que catalisam a transferéncia de um grupo amino de um c-aminoacido para um o-cetoacido, sendo o cofator desta reacao 0 pirodoxal fosfato. Atransaminase glutamico-pirtivica (SGPT), ou alanina amino- transferase (ALT), catalisa a reagao: DLalanina + c-cetoglutarato —piruvato + acido glutamico Atransaminase glutamico-oxalacética (SGOT), ou aspartato aminotransferase (AST), catalisa a reagao: Acido aspartico + o-cetoglutarato — Acido oxalacético + Acido glutamico Os cetoacidos formados reagem com 2,4-dinitrofenilhidrazina, dando osazonas que, em meio alcalino, se coram de laranja-averme- Inado. A cor é proporcional a quantidade de cetoacido formado. Unidade de atividade transaminasica: Uma unidade corres- ponde a 4,82 x 10“ umol/L de cetoacido formado por minuto; 6 a quantidade de enzima que produz um decréscimo de absorbancia de 0,001/min por cm de passo de luz, nas condigdes da técnica. A unidade internacional (|.U.) é definida como a quantidade de enzima que converte 4 micromol de substrato por minuto por litro de soro. Multiplicando-se as unidades obtidas com este método por 0,48, pode-se fornecer o resultado em Unidades Internacionais. Técnica |. Técnica para SGPT 14. Em dois tubos, marcados SGPT e B, colocar 1 mL de substrato e levar ao banho-maria a 37 °C. O tubo chamado B sera 0 tubo branco. 140 2. Colocar no tubo marcado SGPT 0,2 mL de soro e incubar por 30 min. 3. Apds este tempo, adicionar aos tubos (SGPT e B) 1 mL de 2,4-dinitrofenilhidrazina, e 0,2 mL de soro ao tubo B. Misturar e deixar em repouso por 20 min. 4. Colocar nos dois tubos 10 mL de NaOH 0,4 mol/L. Misturar. 5. Ler, apés 5 min, contra o tubo B em espectrofot6metro a 505 nm (filtro verde). 6. Verificar o resultado na curva-padrao para SGPT. |. Técnica para SGOT Seguir a técnica descrita no item |, substituindo o substrato SGPT pelo substrato SGOT. A incubagao é feita por 60 min. Verificar o resultado na curva-padrao para SGOT. Il. Curva-padrao calibragao Tubos | Piruvato | Substrato | Substrato | H,O Correspondéncia em SGOT SGPT U. RAIML SGPT SGOT B 1,0 mL. 1,0mL__|0,2 mL 0 0 . 0,1 mL. 0,9 mL. 0,9mL__|0,2 mL 20 23 Z 0,2 mL 0,8 mL 0,8mL__|0,2 mL 50. 55 3 0,3 mL 0,7 mL 07 mL__|0,2mL 83. 95 4 0,4mL 0,6 mL. 06mL__|0,2mL 425 148 5 0,5 mL 0,5 mL 0,5mL__|0,2 mL 190 216 14. Adicionar 1 mL de solugao de 2,4-dinitrofenilhidrazina. 2. Deixar em repouso por 20 minutos. 3. Adicionar 10 mL de NaOH 0,4 mol/L. Ler apés 5 minutos e tragar a curva. 1. Sensibilidade do método: = Até 125 U.Ri/mL para SGPT Até 160 U.Rf/mL para SGOT 2. Valores normais de referéncia: 5 a 35 U.Rf/mL para SGPT 8a 40 U.Rf/mL para SGOT 141Exercicios 4. Calcular as unidades internacionais de referéncia para SGPT e SGOT. 2. Por que o branco da amostra recebe outra sequéncia na mistura dos reativos? 3. Explique por que se usa piruvato para a construgao da curva de calibragao. 4. Sealeitura da solugao em anilise for mais alta que o limite maximo da curva de calibragao, 0 que vocé devera fazer para dar um resultado certo de determinacao? Referéncias REITMANN, S.; FRANKEL, S. A colorimetric method for the determination of serum glutamic oxalacetic and glutamic pyruvic transaminases. Amer. J. Clin. Pathol., v. 28, p. 56-63, 1957. ZANCAN, G. T.; GOMES, V. Praticas de bioquimica clinica. Curitiba: Universidade Federal do Parana, 1967. Informagdes complementares Lista de reativos: 1. Tampao fosfato - pH 7,4 0,1 mol/L 2. Piruvato 2 mmol/L 3. Substrato para SGOT 4. Substrato para SGPT 5. 2,4-dinitrofenilhidrazina 1 mmol/L 6. Hidrdxido de sddio 0,4 mol/L 142 Preparo dos reativos: 1. Solugao de piruvato 2 mmol/L 22 mg de piruvato de sédio em 100 mL de agua destilada. Preparar e guardar congelado. > 2. Solugao de substrato para SGOT Pesar 2,66 g de acido DL-aspartico e 30 mg de acido a-ceto- glutarico e dissolver em 20 mL de NaOH 1 mol/L. Ajustar o pH a 7,4 e completar 0 volume para 100 mL com tampao fosfato. Preparar no momento do uso. > 3. Solugao de substrato para SGPT Pesar 1,78 g de DL-alanina e 30 mg de acido oceto-glutarico e dissolver em 5 mL de NaOH 1 mol/L e ajustar 0 pH. Completar o volume para 100 mL com tampao. Preparar no momento do uso. > 4. Reativo de 2, Pesar 20 mg 2, de Acido cloridrico 1 mol/L. initrofenilhidrazina initrofenilhidrazina e dissolver em 100 mL Conservar em frasco escuro. > 143ACAO DE ENZIMAS PROTEOLITICAS Objetivo Demonstrar a agao de uma enzima proteolitica (endopep- tidase). Calcular a atividade enzimatica em mmol de tirosina liberada. Relagao tedrico-pratica Enzimas peptidases Protedlise Fundamento As enzimas proteoliticas (proteases) sao peptideohidrolases, uma vez que catalisam a hidrdlise de ligagdes peptidicas. As enzimas que catalisam a hidrolise das ligagdes peptidicas nas extremidades sao chamadas de exopeptidases (peptidases), as quais podem ser divididas em aminopeptidases (extremidade amino-terminal) ou carboxipeptidases (extremidade carboxi-terminal). Por agao das exopeptidases sao liberados, usualmente, um aminoacido apds o outro, mas em alguns casos podem ser liberados dipeptideos ou tripeptideos. As endope- Ptidases (proteinases) promovem a hidrdlise de ligagdes peptidicas em pontos determinados das cadeias polipeptidicas, nao afetando suas extremidades. Elas reconhecem e ligam-se a pequenas seqUiéncias de 145aminoacidos e entao catalisam a hidrolise da ligagao peptidica especifica para um dos aminoacidos. Na tabela abaixo estao indicadas algumas proteinases e suas especificidades: Nome Ocorréncia pHétimo _ [Especificidade Quimiotripsina Intestino delgado 78 Tyr Val Phe J Leu Arg Tripsina Intestino delgado 75-85 __|Argl Gly Pro Lys1Val Pepsina A Estomago 13-3,0__ | Tyr Ala Val Phed Lys Papaina Frutos de mamoeiro 5,0 Argl Me Lys J Leul Gly l Catepsina D Iniracelular 30-46 |= pepsina Trombina Plasma sanguineo 74 [Argl Val (fibrinogénio) Termolisina Bacillus 60-100 | Tyr Leu Val Phe J Ala thermoproteolyticus A caseina 6 uma proteina adequada para a determinagao da atividade proteolitica de diferentes proteinases que promovem hidrdlise de ligagao liberando tirosina. A enzima de interesse é incubada com caseina durante um tempo determinado e, a seguir, a proteina nao hidrolisada é precipitada pela agao do acido tricloroacético. Apés filtragao, é feita a dosagem de tirosina liberada presente no filtrado. Na dosagem utiliza-se 0 reativo de Folin-Ciocalteu. Este reativo € reduzido em meio alcalino pela hidroxila fendlica das unidades de tirosina presentes nos peptideos resultantes da hidrdlise da proteina, formando um complexo de cor azul, de 6xido de molibdénio. Quanto maior a atividade hidrolitica da enzima, tanto mais intensa sera esta coloragao. Utilizando-se um padrao de tirosina, pode-se avaliar quantitativamente a atividade da enzima, definindo-se como uma unidade de enzima a quantidade de enzima que produz a cor equivalente a 1 mmol de tirosina por minuto. Técnica I. Curva de tempo da atividade de endopeptidase 1. Separar 4 tubos de ensaio: tubo Z (tempo zero) e tubos 1, 2 e 3 para os tempos 10, 20 e 40 minutos, respectivamente. 2. Ao tubo Z adicionar 1 mL de caseina e 1 mL da solucao de enzima e imediatamente 2 mL de Acido tricloroacético. O Acido tricloroacético (TCA) precipitara as proteinas. 146 3. Aos tubos 1, 2 € 3 adicionar 1 mL de caseina e 1 mL da solugao de enzima. Misturar bem e incubar a 40 °C. 4. Nos tempos de 10, 20 e 40 minutos, interromper a reagao pela adicao de 2 mL de acido tricloroacético. 5. Filtrar 0 contetido de cada tubo, usando papel Whatman n° 40 e em tubos de ensaio novos devidamente identificados. Utilizar estes filtrados para dosagem de tirosina liberada. ll. Avaliagdo da atividade enzimatica pela dosagem de tirosina liberada 1. Separar 5 tubos de ensaio novos e identifica-los: tubo branco; tubo Z (tempo zero da curva de tempo) e tubos 1, 2 3 (tempos 10, 20 e 40 minutos da curva de tempo). 2. Adicionar os reagentes conforme a tabela: Tubo. Branco : 3 Padrao Filtrado = mt |i mL = Padréo de tirosina (0,2 mol) | — = = Tmt H,0 Tm = = = Na,CO; (0,4 moll) Sm Smt | Smt | Smt [Reativo de Folin-Ciocalt Tmt tme_ | tmb. | tmb, 3. Misturar, esperar 15 min e ler em espectrofotémetro a 660 m (ou fotocolorimetro com filtro vermelho). 4. Calcular a concentragao de tirosina liberada nos diferentes tempos. OBS.: O calculo deve ser feito utilizando a relagao: 1 mmol de tirosina (em 1 mL de filtrado) = D.O. amostra/D.O. padrao x conc. do padrao (0,2 mmol/ _mi). 5. Tragar um grafico: mmol de tirosina (ordenada) x tempo em minutos (abscissa). Exercicios 1. Conhecendo a especificidade e o pH otimo das endopep- tidases, indicar que atividade esta sendo determinada. 2. Que alteragao deveria ser feita no sistema de incubagaéo para medir a atividade de pepsina? 147Referéncias ICHISHIMA, E. Purification and mode of assay for acid proteinase of Aspergillus saitoi. Methods in enzymology, v. 19, p. 397-406, 1970. KARLSON, P. Introduction to modern biochemistry. 4. ed. New York: Academic Press, 1975. Informagoes complementares Lista de reativos: 1. Tampao fosfato 0,1 mol/L, pH 7,0 (poderdo ser utilizados outros tampées de acordo com o pH otimo da enzima) 2. Solugao de caseina 5% (p/v) 3. Acido tricloroacético 0,4 mol/L 4. Carbonato de sddio 0,4 mol/L (solugao recém-preparada). 5. Solugao de enzima proteolitica em tampao fosfato 0,1 mol/L, PH 7,0. . Padrao de tirosina 1 mmol/L . Reativo de Folin-Ciocalteu NO Preparo dos reativos: 1. Solugdo de caseina Dissolver com agitagao 1,5 g de caseina em 30 mL de NaOH 0,1 mol/L. Ajustar a pH 7,0 com H,PO, 0,1 mol/L, adicionar 20 mL de tampao fosfato 0,1 mol/L, pH 7,0 e completar o volume para 100 mL. Essa solugao deve ser utilizada dentro de 24 horas. 2. Solugao de enzima Diluir a enzima (preparacao comercial — pancreatina proteomix) em tampao fosfato 0,1 mol/L, pH 7,0 até que contenha de 0,2 a 0,9 unidades por mL. 3. Solugdo-padrao de tirosina 1 mmol/L Dissolver 18,1 mg de tirosina em 100 mL de HCI 0,2 mol/L. Para uso, diluir 5 vezes. 148 4. Reativo de Folin-Ciocalteu Em um frasco de 1.500 mL, ao qual possa ser adaptado um condensador de refluxo, colocar: 100 g de tungstato de sdédio (Na,WO,.2H,O) + 25 g de molibdato de sédio (Na, MoO,.2H,O) + 700 mL de agua destilada + 50 mL de dcido fosférico a 85% p/p + 100 mL de acido cloridrico concentrado. Adaptar o condensador e ferver durante 10 h. Adicionar, a seguir, 150 g de sulfato de litio (LISO,) + 50 mL de Agua destilada e algumas gotas de bromo. Ferver durante 15 min sem condensador, para remover 0 excesso de bromo. (Ferver em uma capela para evitar irritagao causada pelos vapores de bromo). Deixar esfriar e completar o volume para 1 L. Este reativo deve ser diluido de tal maneira que corresponda a um acido 1 mol/L quando titulado com NaOH 0,1 mol/L. 149NITRATO E NITRITO REDUTASES DE PLANTAS Objetivos Demonstrar a atividade das enzimas de assimilacao de nitrato em plantas. Determinar as atividades da nitrato e nitrito redutases em folhas. Relagao tedrico-pratica Metabolismo do nitrogénio Fundamento Organismos fotossintéticos eucaridticos (vegetais superiores e algas verdes) obtém a maior parte do seu nitrogénio do nitrato (NO,). A primeira etapa na assimilagao do nitrato 6 sua redugao a nitrito (NO,) pela enzima nitrato redutase (NAR). Posteriormente, por agao da enzima nitrito redutase (NIR), 0 nitrito 6 reduzido a ion aménio (NH,*), que é entao incorporado em aminoacidos, protefnas, Acidos nucléicos, etc. Esta sequiéncia de reages pode ser representada da seguinte forma: ANAR catalisa a seguinte reagao: NOs + NAD(P)H + H’ + 2e° > NO, + NAD(P)’ + HO 151onde NAD(P)H indica NADH ou NADPH. A forma mais comum da enzima utiliza somente o NADH, enquanto outra forma, encontrada predominantemente em tecidos nao-clorofilados, como raizes, pode usar tanto o NADH quanto o NADPH. As NAR de plantas superiores sao formadas por duas subunidades idénticas com trés grupos prostéticos cada: FAD, heme e um complexo formado entre o molibdénio e uma molécula organica denominada pterina. Estes grupos transferem elétrons internamente na enzima, recebendo-os do NAD(P)H e transferindo-os ao NO, (figura 1). ff cH, N. AW a He. cH, ie Zz HAN N Nw ‘Molécula de pterina oxidada cH, HC HEME, 2e No; +——{ioco+——{ Heme | FAD Je —— NADH a |__| Heme + —[ FAD + —~! NADH COMPLEXO DOADOR DE MOLIBDENIO ELETRONS IPTERINA Figura 1. Transferéncia de elétrons e redugao do nitrato catalisada pela NAR. Acima @ a esquerda: estrutura da pterina que forma um complexo com o Mo na NAR; acima @ a direita: estrutura do grupo heme. Abaixo: representagao esquematica da transferéncia de elétrons a partir do NADH até o NO,,, via grupos prostéticos presentes na NAR Nas plantas superiores e nas algas verdes, o doador de elétrons. para a redugao de NO, éanicotinamida adenina dinucleotideo reduzida (NADH), enquanto nas algas cianoficeas o doador é a ferredoxina reduzida (Fd...) 3 ANAR éaprincipal proteina contendo molibdénio encontrada nos tecidos vegetativos, e um dos sintomas da deficiéncia do molibdénio 60 acumulo de nitrato, devido a diminuigao da atividade da NAR. O NO. é reativo e toxico. As células vegetais transportam rapidamente 0 nitrito originado na reagao catalisada pela NAR do citosol para o interior dos cloroplastos, nas folhas, e nos plastideos, nas raizes. Nessas organelas, a enzima nitrito redutase reduz 0 nitrito a amé6nio, de acordo com a seguinte reagao: NO, + 6Fd,.,, + 8H* + 6e > NH,* + 6Fd,, + 2H,O O doador de elétrons fisiolgico para a redugao do nitrito é a Fd,¢, formada na fase luminosa da fotossintese. Portanto, a redugao de NO, a NH, esta diretamente acoplada as reages luminosas da fotossintese (figura 2). A NIR possui dois grupos prostéticos, 4Fe 4S e heme, que participam na redugao do aménio. NITRITO REDUTASE (NIR) LUZ 4 \ FOTOSSINTESE (Reagées Luminosas) Figura 2. Reducdo de nitrito a fon aménio catalisada pela NIR 153A atividade da.NAR no tecido foliar é induzida pela luz e pelo nitrato e varia em fungao do estagio de expansao da folha, sendo maxima quando a folha atinge sua total expansao, declinando com a maturagao ou envelhecimento da folha. Além disso, variagdes da atividade da NAR durante o ciclo vegetativo tem sido demonstradas em plantas de importancia agricola, como 0 feijao. Aatividade da NAR e da NIR sera determinada dosando-se o nitrito pela reagao de Griess-llosvay. Técnica |. Curva-padrao de nitrito (NO,) 1. Preparar 6 tubos de ensaio com os volumes dos reagentes indicados na tabela abaixo: REAGENTES j = a — lint 100 pratt. ee of 02 03 of 05 an ae 10 og 08 07 06 08 Rene | 40 40 40 40 40 | 40 2. Homogeneizar os tubos e incuba-los por 15 min a 30 °C. 8. Determinar as absorbancias a 540 nm (filtro verde), usando 0 tubo 1 para calibragao. OBS.: O tubo 1 néo contém KNO, e, por isso, espera- se que nao ocorra a reagao. O tubo 1 devera ser usado para calibragao do espectrofotémetro ou do fotocolorimetro (tubo branco). 4. Tragar 0 grafico: concentragao final de nitrito (nmol/mL) x absorbancia (A). I. Determinagao da atividade da nitrato redutase (NAR) de folhas de grama 1. Cortar folhas de grama recém-colhidas em quadrados de +2mm. 154 2. Pesar cerca de 0,2 g de folhas cortadas. Este procedimento nao sera executado em aula. As folhas de grama cortadas estardo disponiveis, prontas para uso. 3. Preparar 4 tubos de ensaio com os volumes dos reagentes indicados na tabela abaixo: TUBOS REAGENTES 5 z j 4 “Tampao fosfato, pH7,5 (ml) 25 25 25 25 KNOs 100 mmol. (mL) == as = 15 gua destiada (mL) 15 — 15 = Folhas (a) = = 02 02 4. Agitar os tubos e incuba-los por 30 min a 30 °C. 5. Transferir 1,0 mL de solugao de cada tubo para novos tubos de ensaio devidamente identificados. 6. Adicionar 4,0 mL de reagente de nitrito e incubar por 15 min a 30°C. 7. Determinar as absorbancias a 540 nm (filtro verde), usando 0 tubo 1 para calibragao. OBS.: O tubo 1 nao contém KNO, e nao contém folhas e, por isso, espera-se que ndo ocorra a reagao. O tubo 1 devera ser usado para calibragao do espectrofot6metro ou fotocolorimetro (tubo branco). O tubo 2 contém KNO, e nao contém folhas e servird para estimar a quantidade de NO,, contaminante presente no KNO, (tubo controle). O tubo 3 nao contém KNO, e contém folhas e servira para determinar 0 NO,; (formado a partir do NO,) ja presente nas folhas (tubo controle). O tubo 4 contém KNO, e contém folhas, consistindo no sistema completo, e sera usado para quantificar a atividade da nitrato redutase (NAR) a partir da reducao do nitrato a nitrito. 8. Calcular a quantidade de nitrito formado por grama de folha, usando a curva-padrao de nitrito feita no item | (“Curva-padrao de nitrito (NO,)”). 9. Interpretar os resultados. 155Ill. Determinagao da atividade da nitrito redutase (NIR) presente nas folhas de grama 1. Preparar 4 tubos de ensaio com os volumes dos reagentes indicados na tabela abaixo: j TUBOS REAGENTES 7 2 a a Tamplio fosfalo, pHT,5 (mL) | 25 25 25 25 KNO, 100 jmoV (mL) = 05 _ 05 | Agua destilada (mL) 15 1.0 15 10 Folhas (9) = eeeeeeoreeeeS ree? 02 2. Homogeneizar os tubos e incuba-los por 30 min a 30 °C. 3. Transferir 1,0 mL de solugao de cada tubo para novos tubos de ensaio devidamente identificados. 4. Adicionar 4,0 mL de reagente de nitrito e incubar por 15 min a30°C. 5. Determinar as absorbancias a 540 nm (filtro verde), usando 0 tubo 1 para calibragao. OBS.: O tubo 1 nao contém KNO, e nao contém folhas e, por isso, espera-se que nao ocorra reacao. O tubo 1 devera ser usado para calibragao do espectrofot6metro ou fotocolorimetro (tubo branco). O tubo 2 contém KNO, e nao contém folhas e sera usado para determinar a concentragao de NO, presente no inicio da incubagao. O tubo 3 nao contém KNO, e contém folhas e permitira estimar o nitrito presente nas folhas. O tubo 4 contém KNO, e contém folhas e permitira calcular a quantidade de nitrito reduzido a aménia pela diferenga entre os valores obtidos nos tubos 2 e4, Este ensaio tem por objetivo determinar a quantidade de NO, que foi reduzido a NH,* por acao da nitrito redutase (NIR). 6. Calcular a quantidade de nitrito reduzido por grama de folha usando a curva-padrao de nitrito feita no item | (“Curva-padrao de nitrito (NO,.)”); 7. Interpretar os resultados. 156 Exercicios 1. Qual é 0 produto da acao da enzima nitrato redutase sobre seu substrato? 2. Como é determinada aatividade da nitrito redutase? 3. Calcular as atividades especificas (mmol de NO,, produzi- dos ou consumidos por hora por grama de folha) para as enzimas nitrato redutase e nitrito redutase. Referéncias BARRYSCOTT, D.; NEYRA, C. A. Glutamine synthetase and nitrate assimilation in sorghun (Sorghun wulgare) leaves. Can. J. Botany, v. 57, p. 754-758, 1979. BEEVERS, L.; HAGEMAN, R. H. Nitrate reductase, Higher plants. Ann. Ver. Plant Physiology, v. 20, p. 495-522, 1969. FRANCO, A. A.; PEREIRA, J. C.; NEYRA, C. A, Seasonal patterns of nitrate reductase and nitrogenase activities. Phaseolus vulgaris. Plant Physiol., v. 63, p. 421-424, 1979. MEEKER, G. B.; PURVIS, A. C.; MEYRA, C. A.; HAGEMANN, Uptake and accumulation of nitrate as a major factor in the regulation of nitrate reductase activity in corn (Zea mays) leaves: effects of high ambient CO, and malate. In: BIELESKI, J.; FERGUSON, A. R.; CRESSWELL, M. M. Mechanism of regulation of plant growth. The Royal Society of New Zeland Wellington Bull., v.12, p. 45- 58,1974. SOLOMONSON, L. P. Algal reduction of nitrate. Microbiology. Washington D.C: Schlessinger ASM Pub. TAIZ, L.; ZEIGER, E. Fisiologia vegetal. 3. ed. Porto Alegre: Artmed, 2004. Informag6es complementares Lista de reativos: 1. Solugao de nitrito de potassio (KNO,) 100 mmol/L 2. Solugdo de Sulfanilamida 1% 3. Solugao de N-(1-naftil) etilenodiamina hidrocloreto 0,02% 1574. Reagente para nitrito 5. Tampao fosfato de potassio 0,2 mol/L, pH 7,5, contendo n-propanol 2% (v/v) . 6. Solucao de nitrato de potassio 100 mmol/L Preparo dos reativos: 1. Solugao de nitrito de potassio (KNO,) 100 mmol/L Pesar 8,5 mg de nitrito de potassio e dissolver com agua destilada para um volume final de 1.000 mL. 2. Solugdo de sulfanilamida 1% Dissolver 1,0 g de sulfanilamida em 100 mL de HCI 3 mol/L (250 mL de HCI concentrado diluido a 1.000 mL com agua destilada). Guardar em frasco escuro. OBS.: O HCI é corrosivo. Use luvas e oculos de seguranga. 3. Solugao de N-(1-naftil) etilenodiamina dihidrocloreto 0,02% Dissolver 20 mg de N-(1-naftil) etilenodiamina dihidrocloreto em 100 mL de agua destilada. Conservar em frasco escuro. 4. Reagente para nitrito Misturar 100 mL de sulfanilamida 1% com 100 mL da solucao de N-(1-naftil) etilenodiamina dihidrocloreto 0,02%. Guardar em frasco escuro. Preparar no momento de usar. ‘ 5. Solugdo-tampao fosfato 0,2 mol/L, pH 7,5, contendo n- propanol 2% (v/v) Pesar 34,84 g de fosfato de potassio monobasico (K,HPO,) & dissolver com agua destilada para um volume final de 1.000 mL (solugao A). Pesar 34,84 g de fosfato de potassico dibasico (KH,PO,) e dissolver com Agua destilada para um volume final de 1.000 mL (solugao B). Misturar 800 mL da solugao A com 300 mL da solugao B. Adicionar o n-propanol. 158 6. Solugao de nitrato de potassio (KNO,) 100 mmol/L Pesar 1,01 g de nitrito de potassio (KNO,) e dissolver com agua destilada para um volume final de 100 mL. Informag6es sobre os reagentes: 1. Sulfanilamida MM: 172,206 g/mol Formula molecular: CH,N,O,S IH, N I o=s=0 Estrutura: NH, 2. N-(1-naftil) etilenodiamina dihidrocloreto MM: 259,174 g/mol Formula molecular: C,,H,,CI,N, 2CI—H [ Estrutura: H, ie +H, ane 159DETERMINAGAO DA CONCENTRAGAO DE _ACIDO ASCORBICO _ Objetivo Avaliagao do teor de acido ascérbico (vitamina c) em sucos de frutas. Relagao tedrico-pratica Vitaminas Fundamento O Acido ascorbico (vitamina C) atua como doador de elétrons em reagdes enzimaticas e quimicas. Ele é necessario para pelo menos cito sistemas enzimaticos isolados, entre os quais procolageno-prolina dioxigenase, procolageno-lisina dioxigenase, dopamina oxidase, entre outros. Nestes casos ele pode atuar captando espécies oxidantes reativas ou reduzindo o fon férrico. Sua principal fungao é atuar na hidroxilagao do colageno, uma proteina fibrosa que da resisténcia aos ossos, dentes, tenddes e paredes dos vasos sanguineos. Residuos de prolina no colageno sao hidroxilados a hidroxiprolina, necessaria para manter a estrutura correta do colageno. A hidroxilacao é catalisada pela enzima prolil-4-hidroxilase. Na catdlise o Fe*? passa a Fe** e o ascorbato é 161necessario para reduzir novamente o Fe** a Fe** e iniciar um novo ciclo de catalise. O Acido ascérbico é também um poderoso antioxidante, sendo usado para transformar os radicais livres de oxigénio em formas inertes. Em plantas, encontra-se em altas concentragdes (de 2 a 25 mmol/L) e atua na desintoxicacao do perdxido de hidrogénio. A enzima ascorbato peroxidase catalisa a redugao do perdxido de hidrogénio a Agua, usando o ascorbato como agente redutor. O acido ascérbico é facilmente oxidado, sendo o fator de maior influéncia a pressao parcial do O,. Outros fatores sao: pH, temperatura, exposi¢ao a luz, ions de metais pesados (Cu*? e Fe**) presentes, entre outros. Ha varios métodos de dosagem de acido ascérbico baseados em seu poder redutor. Neste experimento sera usado 0 método de titulagao com 2,6-dicloroindofenol (DCIP), um corante indicador de oxidorredu¢do que, na forma oxidada, em meio acido, tem a cor résea, e na forma reduzida é incolor. Este indicador é reduzido pelo acido ascérbico. A reagao é realizada em meio acido para evitar a auto-oxidagao do acido ascérbico em pH elevado. O ponto final da titulagdo é detectado pelo aparecimento da coloragao rosada no titulado, que caracteriza o excesso de DCIP nao reduzido em solugdo acida. 162 HO—| ‘ig cl HO—CH ° « o - 0 —=N ‘OH ie OH OH a acido ascérbico 2,6-dicloroindofenol (reduzido) (oxidado - rosa em meio acido) HO—CH, al HO—CH Oo HO: 7 OH - \ fh oOo cl acido ascérbico 2,6-dicloroindofenol (oxidado) (reduzido - incolor em meio acido) Figura 1. Reagdo para dosagem de acide ascérbico (vitamina C) 163Técnica |. Suco de laranja comercial 4. Diluir 0,5 mL de suco de laranja comercial com 0,5 mL de agua destilada. 2. Acrescentar 5 mL de solugao de acido metafosforico. 3. Titular a mistura com a solugao de 2,6-dicloroindofenol, como foi feito na titulagao da solugao-padrao de acido ascérbico. 4. Repetir a operagao apds ferver por 5 min a mistura de suco de laranja com agua destilada. 5. Anotar os volumes da solugao de 2,6-dicloroindofenol usados em cada caso. ll. Tabletes efervescentes de acido ascérbico 1. Diluir o tablete de Acido ascérbico em agua destilada, de maneira a ter 0,3 mg/mL, partindo da concentragao estabelecida na bula. 2. Adicionar 1 mL desta solugao a5 mL da solugao de acido metafosforico. 3. Titular com a solugao de 2,6-dicloroindofenol, conforme descrito anteriormente. 4. Anotar o volume gasto. Ill. Concentragao de acido ascérbico 14. Calcular a concentragao de acido ascérbico nas amostras analisadas, considerando o volume gasto para titular a solugao-padrao de acido ascérbico. Exercicios 1. Qual 60 principio da dosagem de acido ascérbico pelo 2,6-dicloroindofenol? 2. Por que a dosagem de acido ascérbico no suco fervido difere daquela realizada sem este tratamento? 3. Por que os alimentos que contém vitamina C nao sao vendidos em embalagens transparentes? 164 Referéncias HELRICH, K. (Ed.). Official methods of analysis. 15. ed. Arlington: Association of Official Analytical Chemists, 1990. LEVINE, M. et al. An approach to recommended intake of Vitamin C. Methods in Enzymology, v. 281, p. 425-437, 1997. Informagoes complementares Lista de reativos: 1. Solugao de 2,6-dicloroindofenol 0,025% 2. Solugdo de acido metafosférico 3. Suco de laranja comercial 4. Solugdo-padrao de acido ascérbico Preparo dos reativos: 1. Solugéo-padrao de acido ascérbico Pesar 30 mg de acido ascérbico e dissolver em 100 mL de Acido metafosférico a 3% em acido acético 2% (v/v). Adicionar 1 mL desta solugao (contendo 0,3 mg de acido ascérbico) a 5 mL da solug¢aéo de acido metafosforico em um tubo de ensaio de 20 mm x 200 mm. Titular, com agitagao, a mistura, usando solugao de 2,6-dicloroindofenol 0,025% (DCIP), colocada em uma pipeta graduada de 10 mL, até a formacao de cor résea persistente por 30 s. Neste ponto, anotar a quantidade de DCIP reduzido por 0,3 mg de acido ascérbico. 2. Solugao de acido metafosférico Pesar 15 g de acido metafosférico, dissolver em 40 mL de Acido acético glacial e 300 mL de agua destilada e completar para 500 mL com agua destilada, filtrar em papel de filtro diretamente no frasco no qual sera armazenado. Obs.: A solugao pode ser mantida por 7 a 10 dias em refrigerad 165Informagées sobre os reagentes: FILTRAGAO EM PENEIRA MOLECULA\ 1. Acido ascérbico MM: 176,124 g/mol Formula molecular: C,H,O,, Estrutura: Ho—cH, HO—CH 0. H OH OH 2. 2,6-dicloroindofenol de sédio Objetivos MM: 290,077 g/mol Formula molecular: C,,H,CI,NNaO, J Estrutura: cr Demonstrar a aplicagao da cromatografia em peneira mole- cular como método de separagao e purificagao de compostos, oO” Na’ Verificar a separagéo de substancias quimicas de acordo com ° fae suas dimensdes moleculares. a Relagao tedrico-pratica Filtragéo em peneira molecular Fundamento Cromatografia de filtragdo em gel, permeagao em gel, peneira molecular ou cromatografia por excluséo 6 uma técnica amplamente utilizada para separagao de moléculas de acordo com o tamanho molecular. As substancias da amostra se movem a diferentes velocidades na coluna, e assim sao eluidas como bandas separadas. A coluna cromatografica contém um gel de polimero intercruzado com poros de tamanho selecionado, As moléculas maiores sao eluidas mais facilmente que as menores, pois sao muito grandes para penetrar nos poros do gel e, assim, percorrem um caminho mais direto através da coluna. As 166 167moléculas menores podem penetrar nos poros e dessa maneira se 5. Aplicar 0,5 mL da amostra e deixa-la penetrar lenta e equilibram rapidamente entre a fase movel, composta do liquido totalmente na coluna. intersticial, e a fase estacionaria, constituida da gua do interior do gel. 6. Em seguida, fazer a eluigao da coluna com NaCl 0,9% e Como ha duas vezes mais agua no espaco intersticial, as moléculas coletar as fragdes (0,5 mL) manualmente. pequenas gastam um tergo do tempo na agua intersticial e dois tergos 7. Leras fragdes em espectrofotémetro: dentro das particulas do gel, sendo eluidas depois. As moléculas de : Blue Dextran (M.M. 2.000.000 Daltons) +625 nm -filtro tamanho intermediario podem penetrar somente em parte na agua do vermelho; gel e assim serem separadas das moléculas maiores e menores. Quando Citocromo c (M.M. 11.700 Daltons) 500 nm —filtro verde; a coluna for padronizada, usando moléculas de massa molecular Cromato de K 500 nm - filtro verde. i conhecida, ela pode servir para a determinagao de massa molar de uma substancia em andlise. OBS.: Para aula de 2 horas, apenas aplicar as amostras e tracar o perfil de eluigao; para aulas de 4 horas podem-se montar as colunas, fazer aplicacao Técnica das amostras e tracar seu perfil de eluigao. |. Preparo do gel Para obter um fluxo satisfatério e uma boa separagao, 0 gel deve ser preparado com cuidado. Pesar a quantidade de Sephadex G- Interpretagao dos resultados 25 necessaria para o experimento, considerando que cada grama de 1. Tragar um grafico: absorbancia x volume de eluigdo (mL). Sephadex G-25 seco ganha 2,5 mL de gua. Adicionar a solugao salina 2. Calcular Kav (coeficiente de partigéo) para cada um dos em volume superior a capacidade de hidratagao e deixar no minimo3h componentes, usando a equagao: Kav = Ve - Vo / Vt ~ Vo em repouso. Apés a hidratagao, retirar as possiveis bolhas de ar Vt (volume total tedrico) >Vt = p x (r)? x h formadas, por aspiracao a vacuo. Para conservar o gel hidratado, em geladeira, use uma solugao de 0,02% de azida de sddio. vo volume da fase mével (volume morto) ve volume de eluigaéo dos componentes ll. Preparo da amostra vt volume total da coluna Misturar na proporcao de 1:1:1 as solugdes de 5 mg/mL de ati Blue Dextran, citocromo c e cromato de potassio. : Exercicios lil. Montagem da coluna 1. Qual é 0 principio da cromatografia de gel permeacao? 2. Qualaimportancia da utilizagao deste tipo de cromatografia? 3. O que significa quando o valor do Kav é igual a zero? E maior que 1? 4. Fixaracoluna em um suporte. Vedar a extremidade inferior. 2. Encher acoluna com NaCl 0,9% e adicionar a suspensao de gel lentamente, deixando sedimentar por gravidade até atingir a altura desejada. Medir e anotar o volume da coluna utilizada. 3. Verificar o fluxo da coluna: mL/min ou gotas/min. 4. Deixar escoar todo 0 excesso de liquido da superficie do gel. 168 169| aaa eo SEPARAGAO ELETROFORETICA DE ‘ PROTEINAS NELSON, D. L.; COX, M. M. Lehninger: principios de bioquimica. 3. ed. Sao Die a Paulo: Sarvier, 2002. eer eee WILSON, K.; GOULDING, K. H. Principles and techniques of practical biochemistry. Champam and Hall, 1986. Informag6es complementares Lista de reativos: 14. Gel Sephadex G-25 (capacidade de separagao de 100 a 5,000 Daltons) . : ; 2. Colunas de vidro ou de plastico (pipeta ou seringa descartavel de 5 mL ou 10 mL) 3. Solucdo de NaCl 0,9% (p/v) 4. Amostras de Blue Dextran, citocromo ¢ e cromato de K Separar as proteinas do sangue (soro ou plasma) por migragao eletroforética. Objetivo Relacao tedrico-pratica Proteinas e enzimas Fundamento Eletroforese € uma técnica de andlise para separacao de substancias que apresentam carga elétrica, em um campo elétrico. As substancias com carga positiva (cations) migrarao para o pélo negativo as substancias com carga negativa (anions) migrarao para o pdlo positivo. A técnica eletroforética em acetato de celulose apresenta algumas vantagens, como rapidez de execucao, alta reprodutibilidade e instru-mental simples. Varios fatores influenciam a separacao eletroforética, como tempo, potencial elétrico aplicado, pH, forga iénica da solucao tampao. efeito eletroendosmético, tamanho da molécula, como se descreve a seguir 170 177Tempo: quanto maior for o tempo de voltagem aplicada, maior sera o deslocamento das substancias em relacao a origem (ponto de aplicacao). A distancia percorrida para cada substancia sera diretamente proporcional ao tempo de aplicacao da voltagem, desde que todos os outros parametros se mantenham inalterados. Potencial elétrico: quanto maior for a voltagem aplicada, maior sera a distancia para cada substancia em um dado tempo, sendo a distancia percorrida diretamente proporcional a voltagem aplicada. PH: 0 pH da solugao utilizada no sistema eletroforético influen- cia grandemente a mobilidade das particulas em migracao, especial- mente se elas forem substancias anfotéricas, como é 0 caso das proteinas, aminoacidos e peptideos. Utilizando-se uma solugéo-tampao cujo pH seja igual ao ponto isoelétrico de uma dada proteina, esta se encontrara no sistema com carga liquida nula e conseqlientemente nao se deslocara no campo elétrico aplicado. No caso do pH do tampao se situar acima do ponto isoelétrico, a proteina estara com carga negativa e se deslocara para 0 pdlo positivo; quando o pH do tampao se situar abaixo do ponto isoelétrico, a proteina estara com carga positiva e se deslocara para 0 pdlo negativo. A mobilidade da substancia aumentara linearmente, dentro de pequena faixa, quanto mais distante estiver 0 PH do tampao utilizado do ponto isoelétrico da proteina. Forga iénica da solugao-tampao: a mobilidade de uma parti- cula sob a influéncia de um campo elétrico decresce com o aumento da forga iénica do tampao, de modo que maior mobilidade, e consequien- temente maior separagao, sera obtida com tampao de baixa forca idnica. Efeito eletroendosmotico: é um efeito perturbador da eletroforese que se deve a presenca de grupos carregados negativamente nos meios suportes, como papel, géis de poliacrilamida e de agarose. Estes grupos atraem ions carregados positivamente a partir da solugao- tampao, com a finalidade de manter a eletroneutralidade do sistema. O efeito macroscdépico é um transporte de liquido do anodo para o catodo, havendo assim movimento aparente de moléculas positivas para o catado e atraso aparente de moléculas negativas para o anodo (efeito contracorrente). Tamanho da molécula: quanto maior o peso molecular, menor sera a mobilidade eletroforética, desde que sejam comparadas moléculas com quantidade de carga elétrica equivalente. Os demais parametros devem se manter inalterados. 172 A técnica mais utilizada atualment a le para a separacdo de proteinas 6 a eletroforese em gel de poliacrilamida, que oe a separagao por diferen i i real pe ca de polaridade com aquela por peneira As proteinas plasmaticas podem ili Ser separada: técnica descrita acima (figura 1). i fea @,MACROGLOBULINA HAPTOGLOBINA cerulopiasmina ALBUMINA seantquimetrigsina GC globutina GLOBULIN INSOLUVEL rf lpoproteina TRANSFERRINA -gloprceina tide ‘oRosoMICOIE oF -aleapiina ta [— hemopexina «ctpping np BUPOPROTEINA toa © ‘ow protaina C oatva HI bbe ALBUMINAALFA-1 ALFA? BETA cana Figura 1. Perfil eletroforético das proteinas plasmaticas humanas Técnica |. Amostras Plasma sanguineo de céo ou coelho, Il. Eletroforese de proteinas 1. Colocar a solugao-tampao na cuba/fonte, tomando o cuidado de equalizar os volumes nos dois compartimentos eletrdédicos. 1732. Com auxilio de pinga, retirar as fitas da solugao-tampao (as fitas devem ficar imersas em tampao durante no minimo 10 min eno maximo 24 h) e remover o excesso de tampao com papel de filtro. 3. Picotar um dos cantos da fita para indicagao da polaridade. 4. Na fase opaca da fita, marcar a origem ou a linha de aplicagao de amostras com caneta vermelha, cuidando para que o lado picotado fique para baixo e para a direita. Marcar a origem a cerca de 4m da extremidade que mergulhara no compartimento catédico. 5. Colocar as fitas bem esticadas e retas no suporte, de tal modo que cada extremidade toque o tampao. Observar que o lado picotado devera ficar imerso no pdlo negativo. Como se fara a corrida em tampao alcalino, as proteinas deverao estar negativamente carregadas e, portanto, migrarao para o pdlo positivo. Por convengao, 0 polo negativo é de cor preta e 0 polo positivo € de cor vermelha. Como as proteinas estarao negativamente carre- gadas, a origem deve estar obrigatoriamente proxima ao polo negativo. 6. Aplicar com cuidado as amostras, utilizando aplicador. A quantidade aplicada deve ser no maximo de 2 pL. Com capilar, aplicar o marcador de corrida (azul de bromofenol). Deve existir uma certa distancia entre os pontos de aplicagado de amostra, para evitar que as amostras se misturem. 7. Fechar a cuba e ligar a fonte (200 V), deixando desenvolver aeletroforese por 45 a 60 min. A corrente aplicada devera ser de 1a1,5 mA\tira. Apés a corrida, a fonte deve ser retirada da tomada. 8. Remover as fitas e utilizar uma fita para coloragao de proteina com azul de Coomassie. Ill. Coloragao de proteinas com azul de Coomassie 4. Mergulhar a fita na solugao corante por 15 min, agitando lentamenie. 174 2. Passar a fita por banhos descorantes até Ju de corante seja retirado. ~ — Exercicios 1. Para que pdlo migrou cada fragao protéi plasma? Explique. ea protéica do soro ou 2. Que fatores afetam a separacao eletroforética das Q a 3. Que diferenca se espera obter no perfil eletoforéti proteinas do plasma e do soro? i aoa Referéncias SARGENT, J. R. Methods in zone electrophoresis |: eaneeNE phoresis. 2. ed. England: BDH SHAW, D. J. Electrophoresis. London: Academic Press, 1969. WILSON, K. E.; GOULDING, K. H. Princi i i V : : 1K. He iples and techniques of biochemistry. 3. ed. Londres: Arnold, 1989. oe Informagées complementares Lista de reativos: Suporte: fitas de acetato de celulose Solugao-tampao: tris-glicina 50 mol/L, pH 8,3 Solugao corante Solugao descorante Solugdo-padrao de albumina 2 mg/mL Soro ou plasma sanguineo Marcador de corrida: azul de bromofenol 3 mg/mL NOgRONRA 175 O azul de Coomassie interage com as proteinas, fazendo com que elas adquiram uma coloragao azul.| — oe ELETROFORESE DE ACIDOS NUCLEICOS EM GELDEAGAR 1. Solugdo corante Coomassie Blue P Azul de Coomassie R-250 a 0,25% em metanol: acido acético: Agua. 50 mL de metanol, 7 mL de acido acético e 43 de agua destilada. O metanol é téxico. Use luvas e 6culos de seguranca. A 2. Solugao descolorante Misturar 50 mL de metanol com 10 mL de agua destilada e 40 mL de acido acético a 5%. 3. Solugao-tampao TRIS-glicina 50 mol/L pH 8,3 a+ Pesar 3,004 g de tris (tris (hidroxiamino)-amino metano) e 14,413 g de glicina e completar em balao volumétrico para 1.000 mL. Objetivo Observar o perfil de migragao de diferentes “formas” de DNA em eletroforese em gel de agar bacteriolégico, Relagao tedrico-pratica Estrutura de acidos nucléicos Tecnologia do DNA recombinante Fundamento Eletroforese é definida como a migragao de particulas eletrica- / mente carregadas quando submetidas a um campo elétrico. Em bioqui- | mica, esta técnica é utilizada corriqueiramente para a separacgao de diferentes moléculas, como proteinas e acidos nucléicos (DNA e RNA). A velocidade de migragéo de uma molécula é determinada por sua carga liquida, seu tamanho e sua forma. O DNA é composto por duas cadeias polidesoxirribonucleoticas Em condigées fisioldgicas, os grupos fosfato esto ionizados, formando polianions, que, quando submetidos aum campo elétrico, migram para 0 polo positivo (catodo). Como 176 177suporte para eletroforese de DNA, utilizam-se géis de agarose, agar ou poliacrilamida, que iréo permitir a separagao dos fragmentos pelo tamanho da molécula, ou a visualizagao do perfil de migracao de plasmideos integros. A escolha da matriz de suporte deve-se a faixa de tamanho da molécula de DNA a ser analisada. O gel de poliacrilamida é indicado para separagao de fragmentos de DNA muito pequenos (5 a 500 pb — pares de base), enquanto agarose ou agar sao utilizados para fragmentos maiores que 500 pb. Variando-se a concentragao de agarose, pode-se separar DNA a partir de 200 pb até aproximadamente 50 kb (kilobases). A corrida é usualmente conduzida em um campo elétrico de forga e direcao constantes. Moléculas de DNA com tamanho superior a 10.000 kb podem ser separadas em gel de agarose, mas por eletroforese de campo pulsado, na qual a diregao do campo elétrico muda periodicamente. O gel é dissolvido em solugao-tampao TBE (tris-HCI 90 mmol/L PH 8,0; EDTA 2,5 mmol/L pH 8,0; acido bérico 90 mmol/L) ou TAE (tris- acetato 40 mmol/L; EDTA 1,0 mmol/L pH 8,0). Neste pH, os grupos fosfato estardo ionizados, e o DNA migrara do polo negativo para o pdlo positive quando submetido a um campo elétrico. A separagao de diferentes formas de DNA intacto (superenrolado ou relaxado) ou de fragmentos lineares originados por clivagem com enzimas se deve ao tamanho molecular e a conformagao. Os fragmentos menores e o DNA superenrolado migram mais rapido, distanciando-se mais da origem, enquanto os fragmentos maiores e 0 DNA relaxado migram mais lentamente, permanecendo mais préximos da origem. A baixa voltagem, a velocidade de migracao de fragmentos de DNA é proporcional a voltagem aplicada. Entretanto, se a forga do campo elétrico é aumentada, amobilidade de fragmentos de alta massa molecular aumenta de forma diferenciada. Para se obter boa resolugao de fragmentos maiores de 2 kb em gel de agarose, a corrida deve ser conduzida a nao mais que 5 V/cm (Volis/cm). Além disso, a concentragao do gel também influencia a resolugao. Por exemplo, a 12 V, fragmentos de 20 kb migram 10 mm em 5 hem gel de agarose 1%. Quando 0 objetivo é analisar produtos de clivagem por enzimas de restric&o ou endonucleases, aplica-se, paralelamente as amostras, um padrao de massa molecular, para que se possa estabelecer uma comparacdo entre os fragmentos de tamanho conhecido e os fragmentos cujo tamanho se quer determinar. Um padrao de massa molecular possui diversos fragmentos de DNA de tamanho conhecido. Apos a corrida, o DNA precisa ser corado para que possa ser visualizado. A revelagao da eletroforese consiste em submeter o gel a uma solugao corante e em seguida fazer o registro fotografico do perfil de migragao do DNA no gel. Em condigées de rotina, 0 corante mais 178 utilizado 6 0 brometo de etideo, por ser considerado bastante sensivel © permitir detectar 2 ng de DNA em uma banda de 0,5 cm. A molécula de brometo de etideo intercala-se entre as bases do DNA duplex e emite'luz fluorescente quando irradiada com luz ultravioleta (300 nm). A solugéo corante é feita como uma solugao estoque de 10 mg/mL em Agua destilada e utilizada, durante a revelacao, na concentracao de 0,5 a1 mg/mL. Apesar de representar um valioso corante para visualizagao do DNAno gel, este corante é considerado um mutagénico poderoso e com moderada toxicidade, sendo necessario muito cuidado no seu manuseio. Recomenda-se que sempre se usem luvas descartaveis e mascara no manuseio do pd e que se evite a contaminagao das superficies de trabalho. Como alternativa, pode-se usar 0 corante azul de metileno, na concentragao final de 0,25%, que detecta oligonu- cleotideos na concentracgao de 0,5 mg de DNA por 0,5 cm. Mesmo sendo considerado mais seguro que 0 brometo de etideo, o azul de metileno é considerado moderamente txico, e seu manuseio exige a protecao com luvas descartaveis. Técnica |. Preparo do gel de agar bacteriologico 4. Pesar 0,2 g de agar bacteriolégico e transferir para um frasco Erlenmeyer de 250 mL. 2. Adicionar 20 mL de tampao TBE. 3. Fundir a 100 °C até a completa dissolucao do agar. 4. Deixar resfriar até 50°C. 5. Transferir o gel para um suporte de plastico ou vidro contendo um pente para a formagao dos pogos de aplicagao de amosira. 6. Esperar o gel solidificar (cerca de 20 min). 7. Retirar o pente e transferir o suporte para uma cuba de eletroforese. 8. Adicionar tampao TBE a cuba. O volume devera cobrir 0 gel em no maximo 0,5 cm. ll. Preparo da amostra de DNA O plasmideo pTZ18R sera purificado de Escherichia coli estirpe 71.18, pelo método da lise alcalina. ; 1794. 1mLdeuma suspensdo de E. coli 71.18, com absorbancia de aproximadamente 1,0, 6 centrifugado por 1 minuto em centrifuga Eppendorf. O precipitado éressuspendido em 150 mL de uma solugao de glucose 50 mmol/L, tris/HCl 25 mmol/L, EDTA 10 mmol/L, pH 8,0. 2. Adicionar 150 mL da mistura de lise (solugao contendo 0,1% SDS e 0,2 mol/L NaOH). Logo a seguir, adicionar 50 mL de uma solugaéo que contém acetato de potassio 3 mol/L e acido férmico 1,8 mol/L. 3. Adicionar 50 mL da mistura fenol:cloroférmio:alcool isoamilico (25:24:1), agitar no vortex e centrifugar por 5 min. Coletar a fase superior e adicionar 2,5 volumes de etanol absoluto. Centrifugar 10 minutos. Desprezar 0 sobrenadante e acrescentar 1 mL de etanol a 80% ao precipitado. 4. Suspender o precipitado e centrifugar por 3 min. Verter o contetido e deixar o precipitado secar com 0 tubo emborcado sobre papel absorvente. Ressuspender o precipitado em 20 mL de agua destilada ou em uma solugao contendo tris/HCI 10 mmol/L, EDTA 1 mmol/L, pH 8,0. 5. Misturar em um tubo plastico de 1,5 mL:5 mL de solugao de Acido nucléico com 5 mL de corante para aplicagéo. Homogeneizar suavemente. Centrifugar rapidamente. O corante para aplicagao é uma solugao de ficoll a 25%, EDTA 1 mmol/L, tris/HCI 10 mmol/L pH 8,0 e azul de bromofenol 0,01% . Ill. Aplicagao da amostra 4. Com auxilio do pipetador de 20 uL, transferir a amostra do tubo para 0 pogo no gel de agar. \V. Corrida eletroforética 1. Conectar a cuba a fonte com cabos apropriados. 2. Desenvolver a eletroforese a 70 Volts por 1 hora. 3. Desligar a fonte e desconectar os cabos que ligam a cuba afonte. V. Revelacgao 1. Transferir 0 gel de Agar para uma cuba de vidro contendo asolucao corante para revelagao. Agitar suavemente. 180 O gel quebra facilmente, portanto tomar cuidado durante o manuseio. 2. Aguardar por 2 a3 minutos. 3. Descorar o gel em agua durante 20 min, trocando a agua 2a3 vezes. 4. Durante o processo de descoloracao podem-se observar as bandas de DNA. Exercicios 1. Qual o fundamento da técnica eletroforética? 2. Qualanatureza bioquimica e a estrutura da agarose? 3. Além da analise e purificagéo de Acidos nucléicos, indique outras aplicagées para a técnica de eletroforese 4. Diferencie a utilizagdo do brometo de etideo e do azul de bromofenol durante 0 processo de coloragho do DNA, Referéncias KARCHER, S. J. Molecular biology — a project approach. 1. ed. San Diego, California: Academic Press, 1995. MILLER, M. B. DNA technology in schools: a straightforward approach. Biotechnology Education, v. 4, p. 15-21, 1998. SAMBROOK, J.; FRITSCH, E. F; MANIATIS, T. Molecular cloning ~a laboratory manual. 2. ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999. v. 1. Informagdes complemenitares Lista de reativos: 1. Solugao corante para aplicagao da amostra: azul de bromofenol 0,25% e ficoll 400 25% em H,O, acrescido do corante xileno cianol 1872. Tampao para o gel e para a corrida eletroforética: TBE (tris-hidroxiaminometano - HCI 90 mmol/L pH 8,0; EDTA 2,5 mmol/L pH 8,0; Acido bérico 90 mmol/L) 3. Agar bacteriolégico DIFCO (1% em TBE) 4. Solugdo corante para revelacao: azul de metileno 0,25% em acetato de sédio 0,5 mol/L e pH 5,2 Materiais: 4. Suporte para o gel de agar 2. Pente para a formagao dos pocos de aplicagao no gel (capacidade de cada pogo: 10 pL) 3. Cuba de eletroforese 4. Fonte 5. Pipetadores automéaticos (20 ul; 200 ul e 1000 pL) e ponteiras autoclavadas 6. Microcentrifuga 7. Luvas ciruirgicas Preparo dos reativos: 1. Solugao corante para aplicagao da amostra Pesar 25 mg de corante azul de bromofenol e 2,5 g de ficoll 400, dissolver em 10 mL de agua destilada. Adicionar 0 corante xileno- cianol. Homogeneizar sem formar espuma e distribuir em aliquotas de 1 mL em tubos plasticos de 1,5 mL. Usar luvas para manusear os corantes. 2. Solugéo-tampao para o preparo do gel e para a corrida eletroforética TBE (tris-HCl 90 mmol/L pH 8,0; EDTA 2,5 mmol/L pH 8,0; Acido bérico 90 mmol/L). Para preparar um litro de tampao concentrado cinco vezes (estoque): 1. Pesar 54 g de tris base e 27,5 g de acido bérico. 2. Transferir os reagentes para um copo de béquer de 1 ie 182 3. Adicionar 500 mL de agua destilada e homogeneizar. 4. Adicionar 20 mL de EDTA 0,5 mol/L pH 8,0 e homogeneizar. 5. Completar o volume para 1 L com agua destilada. No momento do uso, diluir cinco vezes a solugao estoque. 3. Solugao corante para revelagao Azul de metileno 0,25% em acetato de sddio 0,5 mol/L pH 5,2. Utilizar luvas no preparo desta solugao corante. 183APENDICE A - PREFIXOS DE QUANTIDADE PREFIXO SIMBOLO MULTIPLO E exa 10° peta P 40% tera T 10% giga G 10° mega M 10° kilo k 10° hecto h 10? deca da 10° deci d 107 centi c 10? milli m 10° micro u 10° nano n 10° pico p 107 femto if 10° atto a 10° APENDICE B - ALFABETO GREGO alpha beta gamma delta epsilon zeta eta theta iota kappa lambda mu nu xi xZEr-A-OINMIODY MCE PAC SCSNM ALD 184 omicron pi rho sigma tau upsilon phi chi psi omega -S i L Glu__glutamato |M Met metionina N P Q log, (x y)=log,x+log, y Caracteristicas dos aminoacidos: a INO APENDICE D - VALORES DE pKa PARA ALGUNS i nt [os [a [ovo [| om [os [ om a a [ ACIDOS FRACOS fefefeiate[cis|s|ri{wfalylalelv|ilelei[aiw eso | a [ar | 76 [785 | Ta vet [ao [rer [ne | ri] 118 [05] oo |e me “ae| 290] 247 [92] a8 | 5 20 [a] 2962 28 10 [sa] a0 ae Keio DISSOCIAGKO BASE | pka ee || an] SA ln |S so| aaa ae Welds aauiea TsCOOH S H+ HyCCOO" aeatafo | ATE a 279[328|to08| 0 | Ore 5| 56 |e01|530|597|o02| 640 | 40] 574| 500 fon aménio | NH. 5 H'+NHs aménia | 9,25 eum ANAT Sale ie honors EMEA LAIN] Fcido carbénico HCO, 5 H™+ HCO; Bicarbonaio | 6.35 elt Tor Pree ee Bicarbonato HCO; SH" + CO," carbonato | 10,33 rte sos ou polar) Fiftco ou Agar) Acido formico HCOOH SH’ + HCOO 3,75 rae (ALATA [RATATAT A] AAA] OR | AFlArlarl ar] c [oR] AOR Acido latico CH;CH(OH)COOH $ H’ + CH;CH(OH)COO™ lactato | 3,86 IEE word a Ee sey Fenol CcHsOH SH" + CxO" | 9,89 aes : Ee equa P), Me (Mt) Grande (6) i . ae c fosfato — } Acido fosforioo HPO, 5 H' + H,PO, bidcido | 212 O carbono ligado aos grupos carboxila e amino é denominado carbono ‘ 1 ie TE 2 fosfato alfa nos aminoacidos. Quando o grupo R contém carbonos adicionais, Fostato bien HPO« & H+ HPO, monodcido | 7-24 eles sao designados seqiiencialmente por beta, gama, delta, eta, etc. Fosfato Pept Fa monoécido HPO.” 5 H' + POs fosfato | 12,67 Acido succinico | HOOCCH,CH,COOH 5 H+ HOOCCH,CH,COO” | succinato | 4,21 HOOCCH,CH,COO" SH’ + OOCCH,CH,COO™ 5,64 186 187pugs ee DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA E == == peeeee BIOLOGIA MOLECULAR - 2007 Sema} ith + fossa Slit | oe 7, i, J, |, aE . aie 2 fe LL a a | CORPO DOCENTE |, | atlate (de || ee, || Be fe | a8, eis imate de fee te le tele Carmen Lucia de Oliveira Petkowicz Ss lS Fo B [ |h n David Alexander Mitchell sete meee Elaine Machado Benelli Mee [ha | | Emanuel Maltempi de Souza os a T_T Eva Gunilla S. Carnieri [Sieg [mtntde [ico [aon | Hae Se TR [en [ise Fany Reicher el so gee pan Glaucia Regina Martinez at Bees, fee Guilhermina Rodrigues Noleto a See [tee [ee Guilherme Lanzi Sassaki oe [can two | tein | ate Jaime Paba Martinez Ste |S alia so | ‘eine pated Sie Joana Léa M. S. Ganter [iio [ite Lasiot [itio [ie [Sse [Sins [0 [ ni Juliana Maurer Menestrina 4 Leda Satie Chubatsu Leonardo Magalhaes Cruz Maria Benigna M. Oliveira Maria Eugénia Rabello Duarte Maria Berenice Reynaud Steffens Maria Eliane M. Rocha Miguel Daniel Noseda Philip Albert James Gorin Rose Adele Monteiro Selma Faria Z. Baggio Silvia Maria Suter Correia Cadena 188 ' testa @ obra @ foi @ impressa # na ¢ Imprensa # Oficial ¢ do istado ¢ de @ Sao Paulo ¢ SP @ Brasil ¢ em ¢ julho # de ¢ 2007 para # a @ Editora @ Universidade # Federal # do @ Parani @ i 190 se Seeseal ee Curie W eeie Ie M etre Melee on lone ( disciplinas como Introducao a Bioquimica, Bioquimica Celular, Bioquimica Net l Bioquimica Animal e Biofisica Veterinaria. Peas eae orc eren Tae CR oN UT eRe lool (CO) f oe ere linguagem clara, traz equa¢ tabelas e graficos, para facilitar a een ousOReleRsc Creel CMCC UES Rec) unidade sao propostos referéncias bibliograficas, o que possibilita um maior aprofundamento dos temas. tima edigao foi completamente revisada e 0s textos e figur foram atualizados a fim de tornar mais claros e diretos os experimentos em laboratério. Este trabalho 6 fruto de um esforgo conjunto dos professores do: Departamento de Bioquimica e Biologia Molecular da UFPR ao seus 35 anos de existéncia, e fornece ao estudante a éncia e exceléncia de douteres nas mais diversas disciplinas da Bioquimica. ISBN 978-85-7335-037- 1 stn 0371