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ECOLOGIA MICROBIANA1
2.1 A COLUNA DE WINOGRADSKY

Objectivos (1) Familiarização com conceitos como «colonização», «biodiversidade», «comunidades

microbianas», «biofilme», «ciclos biogeoquímicos», «reciclagem da matéria e dos elementos», (2)
Descrição dos tipos de microrganismos aquáticos, das suas exigências ambientais e dos seus tipos de
metabolismo.

Introdução Sergius Winogradsky (1856-1853) foi o pioneiro do estudo das comunidades

microbianas. Desenhou um sistema de laboratório para a sua observação, a «coluna de Winogradsky»,
que é simultaneamente uma lição sobre a ecologia e evolução microbianas. A partir dos primeiros
microrganismos – anaeróbios – do planeta, foram evoluindo todos os outros organismos, com formas
distintas – mais ou menos rentáveis - de obtenção de energia. O oxigénio, um simples produto rejeitado
pelo metabolismo fotossintético, com enorme toxicidade intrínseca, é actualmente imprescindível para
os considerados seres superiores que habitam o planeta, incluindo o homem.

A coluna de Winogradsky é um sistema laboratorial para «observação» do processo evolutivo, i.e., o

processo de adaptação aos diferentes ambientes empregando diferentes estratégias para a obtenção de
energia. Depois de selada e exposta à luz, na coluna desenvolve-se uma sucessão de comunidades
relacionadas com a concentração de oxigénio, de nutrientes e de luz, comunidades facilmente
distinguíveis pelas suas cores, onde a presença de cada uma delas depende da presença da anterior e
condiciona a seguinte.

Para melhor compreensão da terminologia a usar neste trabalho, apresenta-se seguidamente uma
breve revisão das estratégias metabólicas dos microrganismos.

Fototrofia
Organismos fototróficos obtêm energia da luz. Se o aceitador final de electrões for a água, liberta-se
oxigénio (fotossíntese oxigénica), mas se em vez de água é utilizado outro composto reduzido (H2S,
lactato, etc.) não se liberta oxigénio (fotossíntese anoxigénica).

Quimiotrofia
Organismos quimiotróficos obtêm energia da oxidação de compostos químicos inorgânicos (litotrofia)
ou orgânicos (organotrofia). A fermentação consiste numa oxidação parcial de matéria orgânica, ao
contrário da respiração que pressupõe a sua oxidação total. Dependendo do ultime aceitador de
electrões empregado na respiração, esta pode classificar-se como aeróbia (oxigénio molecular) ou
anaeróbia (SO42-, NO3-, CO2 ou outro composto inorgânico oxidado, que será então reduzido)

1
Modificado de: (1) GAMAZO, C., LÓPEZ-GOÑI, I. & DÍAZ, R. Manual práctico de microbiología. 3ª edição,
Masson, Barcelona. 2005; (2) PEPPER, I.L. & GERBA, C.P. Environmental microbiology – a laboratory manual. 2ª
edição, Elsevier Academic Press, Amsterdão, 2004.
Protocolos de Microbiologia Ambiental 2

Material e métodos

1. Colocar na coluna uma fonte de celulose (papel, erva, alface, etc.). A celulose deve
permanecer no fundo ou na zona intermédia da coluna, mas nunca na superfície, porque as
bactérias que degradam a celulose são anaeróbias.
2. Colocar na coluna um volume igual ao anterior de terra do fundo de um rio ou de um lago,
misturado com uma fonte de enxofre, por exemplo o conteúdo de um ovo.
3. Pressionar este material de forma a obter uma camada de cerca de 10 cm, fazendo com
saia todo o ar.
4. Colocar na coluna água do rio ou do lago, deixando uma camada de ar com cerca de 5 cm.
5. Tapar a coluna com uma película plástica transparente e colocar numa zona fresca mas
bem iluminada.
6. Examinar a coluna periodicamente durante várias semanas, anotando as alterações de cor
e a espessura das diferentes camadas.
7. Recolher amostras das diversas camadas com o objectivo de estudar os diferentes tipos
microbianos.

Resultados

Ao fim de seis semanas será possível visualizar, no mínimo, as seguintes camadas (comunidades) bem
diferenciadas (Figura 2.1):

Zona aeróbia superior (cor verde brilhante): rica em organismos aeróbios, normalmente flagelados,
assim como organismos fotossintéticos (cianobactérias filamentosas).

Zona aquática microaerófila iluminada (bandas verdes e avermelhadas sobre a camada sólida de
terra): contém H2S proveniente do fundo anaeróbio da coluna. Nesta camada predominam as bactérias
fotossintéticas anoxigénicas: bactérias verdes dependentes de enxofre (Chlorobium - células pequenas
com depósitos externos de enxofre) e bactérias púrpuras dependentes de enxofre (Rhodospirilum,
Rhodopseudomonas - células grandes com depósitos internos amarelos de enxofre).

Zona imediatamente acima da camada de terra (cor castanho claro): rica em H2S que difunde da zona
inferior anaeróbia, que é utilizado por organismos litotróficos (oxidantes de matéria inorgânica) como
Beggiatoa e Thiobacillus (filamentosa).

Zona anaeróbia (cor negra): colonizada por microrganismos capazes de realizar processos metabólicos
anaeróbios, tais como a fermentação e a respiração anaeróbia. Alguns géneros como Clostridium
degradam em anaerobiose a celulose, que pode ser fermentada em etanol, ácido acético ou ácido
láctico. Por sua vez estes produtos são respirados por bactérias como Desulfovibrio. Como consequência
da respiração anaeróbia produzem-se alguns compostos inorgânicos reduzidos característicos destes
ambientes (H2S, CH4) que surgem como bolhas de gás.

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Figura 2.1 Interpretação da coluna de Winogradsky. Fonte:

http://jan.ucc.nau.edu/doetqp/courses/env440/env440_2/lectures/lec23/lec23.html e
http://www.qb.fcen.uba.ar/microinmuno/SeminarioBiodiversidad.htm (consultados em 29 Junho 2007).

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Questões

1. Qual é o papel do H2S na sucessão-geração das diferentes camadas (zonas) de comunidades

microbianas?
2. Onde se localizam os organismos metanogénicos e porquê?
3. Desenvolva uma sequência de etapas que podem suceder-se no microcosmo da coluna, a
partir da fermentação dos açúcares derivados da degradação anaeróbia da celulose.

2.2 EXAME MICROSCÓPICO DOS MICRORGANISMOS DO SOLO

Objectivos (1) Utilização do microscópio para observação de microrganismos do solo e as suas

relações entre si e entre as partículas de solo.

Introdução A observação in situ dos microrganismos do solo permite verificar as inter-relações

entre os microrganismos e entre estes e as partículas de solo. Através da imersão de lâminas de vidro
dentro do solo é possível avaliar qualitativamente as relações espaciais existentes entre
microrganismos, i.e., a sua orientação em relação a outros e em relação às partículas de solo. Também
permite a observação de bactérias, actinomicetes e fungos. A técnica envolve a imersão de lâminas de
vidro no solo durante um certo período de tempo; a adição de nutrientes como glicose (fonte de
carbono) e nitrato de amónia (fonte de azoto) aumenta a velocidade de proliferação dos
microrganismos heterotróficos. Depois de remover a lâmina do solo, o material aderido é fixado com
ácido acético e corado para aumentar o contraste. A observação ao microscópio permite ver bactérias,
actinomicetes e fungos a crescer como colónias nas partículas de solo, geralmente com as bactérias a
delinearem as hifas dos fungos.

Material e métodos

Preparação

1. Pesar 150 g de solo num copo

2. Noutro copo, fazer uma solução de glicose a 1%, adicionar 200 mg de nitrato de amónia
(NH4NO3) e dissolver bem
3. Humedecer o solo com a solução preparada, adicionando pequenas quantidades de cada
vez até obter saturação e mexer com uma espátula
4. Espetar verticalmente2 lâminas de vidro dentro do solo, deixando 2 cm de fora
5. Cobrir os copos com “parafilm” e furar várias vezes para permitir a entrada de ar e ao
mesmo tempo impedir a evaporação excessiva
6. Incubar à temperatura ambiente durante uma semana

Observação

1. Remover as lâminas do solo pressionando-as até ficarem inclinadas, de forma que se

possam retirar de tal forma que a face superior não seja perturbada
2. Bater gentilmente com a lâmina no bordo da bancada de forma que salte a maioria do solo
aderido; limpar a superfície inferior da lâmina com papel húmido e deixar secar ao ar
3. Com cuidado para não tocar com os dedos, e debaixo de uma “ote”, colocar a lâmina de
vidro dentro de ácido acético a 40% durante 1-3 minutos
4. Lavar o excesso de ácido debaixo de água corrente (sem demasiada pressão para que os
microrganismos aderidos não sejam removidos)
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5. Usando um conta-gotas cobrir a superfície com corante de fenol e rosa de Bengal durante
5-10 minutos sem deixar que a lâmina seque
6. Lavar gentilmente a lâmina com água corrente ou com um esguicho de água, secar e
examinar ao microscópio usando a objectiva de 100× com óleo de imersão

Questões

1. Descreva o tamanho e a forma das células bacterianas, dos filamentos e dos esporos de
fungos e de actinomicetes.
2. Anote se há evidências da formação de colónias e qual a relação dos microrganismos uns
com os outros e com as partículas de solo.
3. Como é que distingue os fungos dos actinomicetes?
4. Como é que os microrganismos se orientam uns em relação aos outros e em relação às
partículas de solo?
5. Haverá competição entre microrganismos pelo espaço?
6. Qual lhe parece ter sido o factor limitante para o crescimento e para a actividade dos
microrganismos no solo?

2.3 FIXAÇÃO DE AZOTO POR MICRORGANISMOS SIMBIONTES: OBSERVAÇÃO DE BACTEROIDES DE RHIZOBIUM SPP.

Objectivos Descrição da morfologia de nódulos de leguminosas e reconhecimento da sua

funcionalidade; (2) Descrição da morfologia de bacteróides em nódulos de raízes de leguminosas; (3)

Introdução O azoto representa cerca de 80% da composição da atmosfera onde se encontra na

forma de N2. O azoto é absolutamente necessário para a síntese da matéria viva, já que representa uma
parte importante da composição de proteínas, ácidos nucleicos e nucleótidos. Poucos seres vivos têm a
capacidade de aproveitar o grande reservatório de azoto que é a atmosfera. Apenas algumas espécies
de procariotas são capazes de transformar azoto atmosférico em formas de azoto combinado: fixação
biológica de azoto. Este processo não só resolve o problema de necessidade de azoto de alguns
microrganismos como também tem uma grande importância no ciclo do azoto na natureza. Os
microrganismos que são capazes de fixar azoto podem fazê-lo de uma de duas maneiras: vivendo
livremente ou associados a um hospedeiro (simbiose). A existência de sistemas simbióticos fixadores de
azoto, em que bactérias fixam azoto em associação com raízes de plantas só foi confirmada nos fins do
século XIX. As associações mais conhecidas são as formadas por plantas leguminosas em cujas raízes
bactérias do género Rhizobium induzem a formação de nódulos. Rhizobium é um género de bactérias da
família Rhizobiaceae, ordem das Eubactereaceae, bactérias Gram-negativas, não formadoras de
esporos, aeróbias, não fermentativas, capazes de fixar N2 atmosférico em nódulos (cuja formação
induzem) de raízes de leguminosas. São microrganismos quimioheterotróficos e conseguem assimilar
uma grande quantidade de hidratos de carbono. As bactérias deste género podem viver livremente no
solo, mas só dentro dos nódulos fixam o azoto. Nesta relação simbiótica a bactéria fornece as enzimas
necessárias à fixação de azoto pela planta, e esta cede os hidratos de carbono necessários como fonte
de energia da bactéria. A especificidade da bactéria pela leguminosa manifesta-se com intensidade
crescente nos vários níveis de interacção, durante o processo de infecção-nodulação:

1) colonização pela bactéria da superfície radicular

2) curvatura e ramificação dos pelos radiculares
3) invasão e formação do filamento de infecção
4) formação e persistência do meristema nodular

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5) formação de vesículas que englobam bactérias

6) transformação de bactérias em bacteróides, dentro das vesículas
7) estabelecimento e manutenção de um metabolismo integrado, eficiente partilhado pelos macro
e micro simbiontes (planta e bactéria respectivamente), e tendo como consequência a efectiva
fixação de N2

Uma vez formados, os bacteróides já não podem voltar a transformar-se em bactérias normais e não
têm capacidade de reprodução - o processo é irreversível. Desta forma para isolar uma estirpe de
Rhizobium a partir de um nódulo, é necessário ter bactérias ainda não transformadas em bacteróides.
Além dos microrganismos capazes de fixar azoto em simbiose com plantas, existem outros capazes de
realizar fixação não simbiótica de azoto molecular. As bactérias a que se atribui esta faculdade
compreendem espécies que se podem agrupar do seguinte modo:

1) Fotossintéticas:
a. Anaeróbias: e.g. Chromatium vinosum
b. Aeróbias: e.g. Anabaena cylindrica
2) Não fotossintéticas:
a. Anaeróbias: e.g. Clostridium pasteurianum
b. Aeróbias: ex. Azotobacter vinelandii

As azotobacteráceas são aeróbias obrigatórias que habitam o solo, a água ou a superfície das folhas e
podem ser bacilos e cocos Gram negativos. Recorre-se a frascos escuros para evitar a utilização dos
meios de cultura por bactérias (fixadoras de azoto) fotossintéticas. Para evitar a multiplicação de
bactérias (fixadoras de azoto) anaeróbias incubam-se as culturas em aerobiose.

Material e métodos

1. Observar a raiz de uma planta leguminosa, descrevendo a posição, o tamanho, a forma, o

número e a cor dos nódulos
2. Preparar e secar uma lâmina
3. Recolher um nódulo de aspecto saudável, cortar ao meio com um bisturi e observar
macroscopicamente o respectivo interior, registando as observações
4. Com a ajuda de uma pinça, espremer o nódulo cortado sobre a lâmina até obter uma
pequena gota de líquido (ou esmagar o nódulo na lâmina, com a ajuda do cabo de uma
agulha)
5. Fazer uma preparação a fresco
6. Observar ao microscópio com a objectiva de 40×. Para focagem, escolher um campo denso,
corrigir as condições de observação e procurar um campo pouco denso para observação em
campo claro e em contraste de fase
7. Anotar as observações

2.4 CINÉTICA DA MORTE BACTERIANA: EXPOSIÇÃO À RADIAÇÃO UV

Objectivos (1) Verificação da letalidade da radiação UV; (2) Cálculo da percentagem de morte ao
fim de um dado tempo de exposição.

Introdução A Terra é constantemente bombardeada com radiações electromagnéticas de

diferentes tipos (Figura 2.2). A radiação solar inclui radiação visível, a radiação ultravioleta (UV) (Figura
2.3), os raios infravermelhos e as ondas rádio. As fontes da luz ultravioleta podem ser divididas em duas

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classes: a natural e a artificial. A fonte mais importante de radiações ultravioleta é o sol. As fontes
artificiais compreendem uma variedade de arcos e lâmpadas incandescentes.

Figura 2.2 Espectro electromagnético da radiação.

A dose de radiação ultravioleta é medida em microwatt segundos por centímetro quadrado (μWs/cm2).
Quanto maior for o microwatt e/ou o tempo de exposição maior será a dosagem utilizada. A radiação
ultravioleta é letal para a maior parte dos microrganismos (Tabela 2.1).

Tabela 2.1 Doses letais aproximadas de radiação UV para vários microrganismos

Microrganismo Doses letais de radiação UV (μWs/cm2)

Bactérias 2500-26400
Leveduras 6600-17600
Algas 11000-330000
Vírus 2500-22000

O mecanismo de acção é basicamente o mesmo para todos os microrganismos. O efeito letal da

radiação ultravioleta relaciona-se com o seu comprimento de onda, tendo sido demonstrado que o
comprimento de onda de 260 nm tem a maior actividade microbicida (Figura 2.3). O ADN isolado tem o
seu máximo de absorção a cerca de 260 nm e por isso, o efeito letal da radiação ultravioleta deve-se à
sua acção sobre a molécula do ADN. Na molécula de ADN a radiação ultravioleta afecta exclusivamente
as bases pirimídicas (timina e citosina) provocando um efeito de dimerização no qual se formam
dímeros entre moléculas adjacentes de timina na mesma cadeia nucleotídica. A letalidade destes
dímeros deve-se à sua capacidade para interferirem com a replicação e transcrição do ADN

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Figura 2.3 Espectro da radiação UV (100-400 nm).

Material e métodos

Preparação (consultar também a Tabela 2.2) Não esquecer de marcar os tubos com o tempo de
exposição e com a diluição

1. Retirar 1 mL de uma suspensão diluída de uma bactéria ou de uma levedura, fazer diluições
decimais sucessivas (10-1, 10-2, 10-3 e 10-4) e inocular por espalhamento à superfície 0.1 mL
das diluições 10-2, 10-3 e 10-4, fazendo 2 repetições
2. Colocar 10 mL de mesma suspensão numa caixa de Petri e expor à radiação UV durante 1
minuto
3. Retirar 1 mL, fazer 4 diluições decimais sucessivas (10-1, 10-2, 10-3 e 10-4) e inocular por
espalhamento à superfície 0.1 mL das diluições 10-2, 10-3 e 10-4, fazendo 2 repetições
4. Expor novamente a caixa de Petri à radiação UV durante mais 1 minuto (total=2 minutos)
5. Retirar 1 mL, fazer 3 diluições decimais sucessivas (10-1, 10-2 e 10-3) e inocular por
espalhamento à superfície 0.1 mL das diluições 10-1, 10-2 e 10-3, fazendo 2 repetições
6. Expor novamente a caixa de Petri à radiação UV durante mais 1 minuto (total=3 minutos)
7. Retirar 1 mL, fazer 2 diluições decimais sucessivas (10-1 e 10-2) e inocular por espalhamento
à superfície (2 repetições) 0.1 mL das diluições 10-2 e 10-1
8. Expor novamente a caixa de Petri à radiação UV durante mais 1 minuto (total=4 minutos)
9. Retirar 1 mL, fazer 1 diluição decimal sucessiva (10-1)
10. Inocular por espalhamento à superfície (2 repetições) 0.1 mL das diluições 10-2 e 10-1
11. Expor novamente a caixa de Petri à radiação UV durante mais 1 minuto (total=5 minutos)
12. Inocular por espalhamento à superfície (2 repetições) 0.1 mL da suspensão não diluída
13. Identificar as caixas de Petri com o número do grupo, repetição, tempo de exposição e
diluição inoculada
14. Inverter e incubar a 25ºC durante 24-48 horas

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Tabela 2.2 Diluições decimais a inocular em função do tempo de exposição à radiação UV.

Grupo Minutos de exposição à radiação UV Diluições a inocular

1 0 10-2 10-3 10-4
2 1 10-2 10-3 10-4
3 2 10-1 10-2 10-3
4 3 100 10-1 10-2
5 4 100 10-1
0
6 5 10

Contagens e cálculos

1. Contar as UFC nas caixas de Petri que apresentem um número contável (30-300 colónias).
2. Fazer uma média das 2 repetições e calcular o número de células/mL da diluição
3. Calcular o nº de células na suspensão original (sem diluições)
4. Calcular a % de morte de acordo com a seguinte fórmula:

𝑛ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑈𝐹𝐶 𝑛𝑜 𝑡𝑒𝑚𝑝𝑜 𝑑𝑒 𝑒𝑥𝑝𝑜𝑠𝑖çã𝑜 𝑥

% 𝑑𝑒 𝑚𝑜𝑟𝑡𝑒 = 100 − × 100
𝑛ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑈𝐹𝐶 𝑛𝑜 𝑡𝑒𝑚𝑝𝑜 𝑑𝑒 𝑒𝑥𝑝𝑜𝑠𝑖çã𝑜 0

5. Fazer um gráfico que mostre a diminuição do número de células da suspensão original de

microrganismos em função do tempo de exposição à radiação UV
6. Descrever a cinética de morte microbiana em função do tempo de exposição à radiação UV

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