Você está na página 1de 65

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS

APOSTILA DE AULAS PRÁTICAS


MICROBIOLOGIA – DCB063

Profa. Cíntia L. Ramos

2020

1
REGRAS DO LABORATÓRIO

1- 2-

3 - 4-

5- 6-

2
INSTRUÇÕES DE COMPORTAMENTO NO LABORATÓRIO

1- No caso de acidentes, comunicar imediatamente ao professor.

2- Limpar e desinfetar as bancadas e capelas no início e no final das aulas.

3- Ser cuidadoso com materiais que possam causar ferimentos na pele, como seringas,
pipetas Pasteur, lâminas de aço e vidros em geral.

4- Descartar o material utilizado nos locais apropriados.

5- Todo material utilizado deve ser devidamente identificado.

6- A alça de platina e agulha utilizadas na manipulação dos microrganismos devem ser


esterilizadas no bico de Bunsen antes e depois de utilizadas. Colocá-las sempre na posição
vertical no suporte e não sobre a bancada.

7- Nunca pipetar com a boca.

8- Não sair com nenhum material das aulas.

9- Não devolva o reagente ao frasco original. Nunca retire do frasco mais do que necessário.

10- Leia o roteiro de aula prática antes de iniciar qualquer prática. Anote os resultados
experimentais, discussões e conclusões. Faça todos os exercícios da apostila pois está será
conferida no final de cada aula.

11- Antes de deixar o laboratório em cada aula, ordenar todo o material usado, fechar a água,
o gás e desligar o interruptor e a tomada do microscópio. Mantenha o laboratório
organizado e limpo. Atenção especial com as bancadas, sua segurança pode estar em jogo;

Estas normas têm como metas:

· A segurança de cada um e de todos;

· O bom funcionamento do laboratório;

· A eficiência e eficácia na condução das práticas.

3
POR QUE ESTUDAR MICROBIOLOGIA?

MICROBIOLOGIA

MICROBIOLOGIA DE MICROBIOLOGIA
PESQUISA BÁSICA APLICADA

TAXONOMIA *Metabolismo *Imunologia *Controle de Infecções Microbiologia *Tecnologia de


MICROBIANA *Genética *Epidemiologia *Quimioterapia Ambiental Alimentos
*Ecologia *Etiologia E Bebidas
*Microbiologia
farmacêutica
*Engenharia genética

Bacteriologia
Ficologia
Micologia Fonte: Black, J.G. Microbiologia-
Parasitologia
Virologia
Fundamentos e perspectivas. 4 ed. 2002

4
Índice

Temas das aulas Página

1 Introdução ao laboratório de microbiologia 6

2 Preparo de meios de cultura 10

3 Ubiquidade microbiana 17

Preparo de lâminas a fresco e observação de Leveduras:


4 19
Morfologia, viabilidade e reprodução
Preparações Microscópicas fixadas e coradas:
5
Coloração de Gram 24

6
Fungos filamentosos: Morfologia macroscópica e microscópica 29

7 Cultivo de microrganismos: diluição e espalhamento 40

8 Obtenção de Cultura Pura: Técnicas de estrias simples e compostas 44

9 Análise de água: NMP 47

10 Metabolismo: respiração e fermentação 51

Identificação bacteriana: Enterobactérias


11 e 12 55

13 e 14 Controle do crescimento microbiano e antibiograma 60

5
Prática 1: Introdução ao Laboratório de Microbiologia
Materiais e Equipamentos

O laboratório de Microbiologia apresenta alguns equipamentos e vidrarias comuns a


outros laboratórios como de química ou análises clínicas. No entanto, algumas vidrarias são
exclusivas no uso da Área de Microbiologia. Basicamente um laboratório deve possuir autoclave,
microscópio, Câmara de Segurança Biológica (Capela de Fluxo Laminar), estufas de secagem e
bacteriológica, BOD, refrigeradores, balanças analíticas etc.

Objetivo
1-Reconhecer materiais, equipamentos e normas do Laboratório de Microbiologia;

Abaixo a descrição dos principais EQUIPAMENTOS:

a. Autoclave - Câmara de vapor com parede dupla, equipada com dispositivos que permitem o
enchimento da câmara com vapor saturado e sua manutenção em determinadas temperatura e
pressão por quaisquer períodos de tempo. A autoclave é um equipamento indispensável ao
laboratório de microbiologia na esterilização de meios de cultura, água, suspensões e descarte de
material contaminado.
b. Estufas de Esterilização (Fornos de Pasteur) - Esteriliza a seco toda vidraria
convenientemente acondicionada, a temperatura de 170 a 200o C por 1-2 horas.
c. Refrigerador - Utilizado na conservação de culturas de microrganismos sob baixa
temperatura, diminuindo o tempo de geração
d. Estufa bacteriológica - Favorece o crescimento de microrganismos pela incubação na
temperatura adequada.
e. Câmara de Segurança Biológica (Cabine de fluxo laminar) - Câmara asséptica, dotada de
exaustor e lâmpada fluorescente, sendo utilizada em repiques de microrganismos assegurando a
assepsia do material.
f. Microscópio óptico: Utilizado em observação de imagem ampliada até mil vezes por meio de
dois conjuntos de lentes: as objetivas, que ficam próximas do objeto, e ampliam a imagem real; e
as oculares, próximas do olho do observador, que ampliam a imagem novamente. É constituído
6
por duas partes – uma parte mecânica e uma parte óptica. Cada parte engloba uma série de
componentes constituintes do microscópio. A parte mecânica serve para dar estabilidade e
suportar a parte óptica. É constituída por base ou pé, parafusos macro e micrométricos, haste ou
braço, mesa ou platina, charriot, presilha, tambor ou revólver das objetivas canhão. A parte óptica
é constituída por fonte de iluminação, lente condensadora ou condensador, botão do condensador,
diafragma e pelas lentes oculares e objetivas – o conjunto de lentes que permitem a ampliação do
objeto. A ampliação dada ao microscópio é igual ao produto da ampliação da objetiva pela
ampliação da ocular. Devido a estes componentes serem de alta precisão e porque o microscópio
é um instrumento caro, requer cuidados especiais de transporte, utilização e manutenção.

g. Balança analítica – usada para se obter massas de sólidos e líquidos com alta exatidão.
h. Bico de Bunsen – é um bico de gás, alimentado por um tubo de borracha, fixado em uma base
metálica com entrada de ar, cuja chama é utilizada para técnicas de flambagem e esterilização de
materiais contaminados.

7
As principais VIDRARIAS são:
Erlenmeyer, proveta, béquer, pipetas automáticas, Placas de Petri, tubos de ensaio, lâminas e
lamínulas, Alça de Drigaslky, Pipeta de Pasteur, Câmara de Neubauer, alça de inoculação (ou de
platina), pissetas.
1)- 2)- 3)- 4)-

5)- 6)- 7)- 8)-

9)- 10)- 11)- 12)-

Exercícios:
1)- Descreva as funções dos materiais apresentados em aula.

8
2)- Explique o funcionamento e o princípio do funcionamento da autoclave.

3)- Qual a função do uso da Câmara de Segurança Biológica para os estudos de microbiologia e o
que iremos utilizar em nossas aulas para mesma função?

9
Prática 2
Preparo de meios de cultura

Todos os organismos vivos necessitam de uma variedade de elementos químicos que são
essenciais para a síntese e funcionamento normal dos componentes celulares. Estes elementos
estão presentes na natureza na forma de compostos orgânicos ou inorgânicos. O meio de cultura,
também denominado meio de cultivo, consiste em um material nutritivo, preparado em
laboratório, que se destina ao cultivo artificial dos microrganismos, devendo, portanto, fornecer
os nutrientes indispensáveis ao seu crescimento. As exigências nutricionais dos microrganismos,
em relação aos elementos requeridos, são bastante semelhantes àquelas exigidas pelas plantas ou
animais, ou seja, necessitam de carbono, nitrogênio, hidrogênio, oxigênio, enxofre, fósforo,
cálcio, potássio, magnésio, além dos micronutrientes e vitaminas. A diferença básica entre os
microrganismos e as plantas e animais é quanto à fonte de cada elemento. As plantas os utilizam
predominantemente na forma inorgânica e os animais, na forma orgânica. Os microrganismos
podem utilizá-los tanto na forma orgânica, inorgânica ou até mesmo gasosa. Entre os
microrganismos, os que são capazes de se desenvolver em meios inteiramente inorgânicos
(minerais) são chamados de autotróficos, enquanto outros microrganismos que exigem
compostos orgânicos como fonte de carbono e de energia são chamados de heterotróficos.
Dependendo da finalidade a que se destinam, os meios de cultura podem ser líquidos,
sólidos ou semi-sólidos. Os meios líquidos podem ser usados em estudos de crescimento, de
fermentação e na produção de biomassa, enquanto os meios sólidos são úteis para contagem e
isolamento de microrganismos. Por fim, os meios semi-sólidos são utilizados para fins muito
específicos, como, por exemplo, para a detecção de placas de lise em culturas bacterianas
infectadas por vírus ou avaliação de motilidade bacteriana. Os meios sólidos e semi-sólidos são
acrescidos de agente solidificante, o ágar, normalmente na concentração de 1,5% para os meios
sólidos e 0,75% para os meios semi-sólidos. O ágar consiste em uma mistura de dois
polissacarídeos: agarose e agaropectina. A agarose é formada por unidades repetitivas de
agarobiose (dissacarídeo formado por D-galactose e 3,6-anidro-L-galactopiranose) e ácido D-
glucurônico extraído de algas vermelhas (Gelidium corneum- alga marinha japonesa) a 80oC com

10
H2SO4 diluído. O ágar tem a propriedade de fundir-se a temperatura de 80 a 100oC e solidificar a
45oC.
Além disso, com respeito à sua composição, existem os meios de cultivo naturais, como
infusão de batata, sangue e leite, nos quais a composição química exata não é conhecida.
Existem, também, os meios sintéticos, contendo componentes químicos puros, orgânicos e/ou
inorgânicos, bem como aqueles que podem ser obtidos pela combinação de reagentes puros com
extratos naturais. A seguir, serão descritos os diferentes tipos de meios de cultura, os quais são
classificados em função da composição química e/ou função.

1. Meios de cultura complexos ou indefinidos: são meios de cultura nos quais os componentes
possuem todos os nutrientes requeridos pelos microrganismos, mas a quantidade exata não é
especificada. Esses meios de cultura são preparados com base em produtos naturais, como:
Extrato de carne - solução aquosa de carne bovina concentrada em pasta. Peptona- proteínas
que foram parcialmente degradadas por enzimas, como hidrolisado de caseína do leite,
hidrolisado de proteínas da soja, carne, gelatina e outras fontes de proteínas. Extrato de
levedura, sangue, soro, leite, extrato de solo e fluido de rúmen- todos esses materiais são
complexos e contêm açúcares, aminoácidos, vitaminas e sais.

2. Meios quimicamente definidos: são os meios nos quais a composição exata de cada nutriente
ou elemento químico é conhecido (Ex: Tabela 1). Adicionar ou retirar um determinado elemento
do meio permite conhecer se aquele constituinte em particular é essencial para o crescimento de
determinado microrganismo.

Tabela 1- Meio de cultura quimicamente definido para o crescimento de bactérias heterotróficas.

Ingrediente Função Quantidade


Glicose Fonte de carbono e energia 10 g
NH4H2PO4 Fonte de nitrogênio, tampão e íons 5g
K2HPO4 essenciais
Tampão e íons essenciais 1g
NaCl Íons essenciais 5g
Água destilada Solvente 1000 mL

11
3. Meios Especiais: são meios formulados com objetivos específicos, utilizados principalmente
nos trabalhos de isolamento e identificação de microrganismos. Podem ser:
3.1. Meios seletivos: são designados para favorecer do crescimento de um determinado
microrganismo ou grupo de microrganismos em detrimento de outros. Alguns meios seletivos
possuem corantes na sua composição (ex. verde brilhante), feniletanol e antibióticos, que inibem
determinados grupos de microrganismos. Para o isolamento de bactérias, pode-se utilizar meio
apropriado para o crescimento de bactérias e contendo também antibiótico contra fungos e vice-
versa. Para o isolamento de fungos, pode-se utilizar também meio cuja composição seja
desfavorável para bactérias, em função de pH e concentração de açúcares, como é o caso do meio
Sabouraud para o crescimento de fungos (Tabela 2).

Tabela2- Composição química do meio Sabouraud.


Ingrediente Função Quant.

Peptona Fonte de carbono, nitrogênio e elementos 10 g

Glicose Fonte de carbono e energia - Alta concentração inibe 40 g


crescimento de bactérias
Ágar Agente gelatinizante - ‘solidificante’ 15 g

Água destilada Solvente 1000 mL

pH Baixo pH inibe bactérias, mas permite crescimento 4,5


de fungos

3.2. Meios Diferenciais: são utilizados para diferenciar microrganismos entre vários tipos em
uma mesma placa. Muito utilizados para determinar qualidade de água e de alimentos em geral.
Existem meios que são diferenciais/seletivos, porque, além de permitir a diferenciação
entre diferentes grupos ou espécies, permitem a contagem de um grupo em detrimento de outro.
Estes podem distinguir entre grupos de organismos morfologicamente e bioquimicamente
relacionados, pois incorporam componentes químicos que, seguindo inoculação e incubação,
produzem mudança característica na aparência do crescimento da colônia bacteriana e/ou no
meio de cultura ao redor das colônias, o que permite a diferenciação. Os meios de cultura a seguir
são representativos desses dois tipos

12
I. Ágar Sal Manitol: Este meio de cultura contém alta concentração de sal, 7,5 % NaCl, que é
inibitório ao crescimento da maioria das bactérias, mas não para estafilococos. O meio de cultura
também realiza função diferencial: contém o carboidrato manitol, que alguns estafilococos são
capazes de fermentar e vermelho de fenol (phenolred), que é um indicador de pH para detectar
ácido produzido pela fermentação do manitol. Colônias de estafilococos exibem um halo amarelo
ao redor da colônia; estafilococos que não fermentam manitol não produzirão mudança na
coloração.

II. Agar Sangue: O sangue que é incorporado neste meio de cultura é um ingrediente de
enriquecimento para o cultivo de organismos exigentes como o Streptococcus spp. O sangue
também permite a demonstração de propriedades hemolíticas de alguns microrganismos,
particularmente estafilococos.

III. Ágar MacConkey: A ação inibitória do cristal violeta no crescimento de organismos Gram-
positivos permite o isolamento de bactérias Gram-negativas. A Incorporação de lactose, sais
biliares, e o indicador de pH vermelho neutro, permite a diferenciação de bactérias entéricas
devido à habilidade de fermentar lactose. Neste meio de cultivo, enterobactérias são separadas em
dois grupos:

a- Coliformes: produzem ácido como resultado da fermentação da lactose. A bactéria exibe


coloração vermelha na superfície da colônia. Escherichia coli produz maiores quantidades de
ácido pela lactose do que outras espécies de coliformes. Quando isso ocorre, o meio de cultura
que cerca o crescimento também se torna vermelho por causa da ação do ácido que precipita
sais biliares, seguindo-se, então, a absorção do vermelho neutro.
b- Bacilos da disenteria, tifoide e paratifoide: não são fermentadores de lactose, e, portando,
não produzem ácido. As colônias aparecem sem cor e frequentemente transparentes.

IV. Ágar EMB (Eosyn Methylene Blue Agar, Levine): a presença de lactose e os corantes eosina e
azul de metileno permitem diferenciação entre fermentadores e não fermentadores de lactose. As
colônias de E. coli apresentam coloração azul-preta com brilho metálico esverdeado causado pela
grande quantidade de ácido. Outra bactéria coliforme, como a Enterobacter aerogenes, produz
colônias espessas, mucoides e rosas neste meio de cultura. Bactérias entéricas que não fermentam
lactose produzem colônias sem cor, que, devido a sua transparência, parecem adquirir a coloração

13
roxa do meio de cultura. Este meio de cultura e também parcialmente inibitório ao crescimento de
organismos Gram-positivos e, portanto, o crescimento de gram-negativos é mais abundante.

V. Ágar PEA (Phenyl ethyl alcohol agar): Este meio de cultura e usado para o isolamento da
maioria de cocos Gram-positivos. O álcool fenil etílico inibe parcialmente bactérias Gram-
negativas, as quais podem formar colônias visíveis, cujos tamanho e número são muito menores
que em outros meios de cultura.

3.3. Meios de Enriquecimento: Meios convencionais enriquecidos com um ou mais


componentes químicos que favoreçam uma determinada população de microrganismo numa
população mista. Por exemplo, a adição de lactose no meio favorece o crescimento de bactérias
que produzem β-galactosidase, aumentando o seu crescimento exponencialmente. Além dos
meios de enriquecimento, podem-se utilizar outras técnicas de enriquecimento em função de
diferentes condições físicas ou físico-químicas, como pH, temperatura, atmosfera, etc.
Além dos requerimentos nutricionais, fatores físicos interferem no crescimento
microbiano, como temperatura, presença de oxigênio, de luz, salinidade e o pH. Cada espécie
bacteriana cresce sob faixas de temperatura características: psicrófilos (15-20oC), mesófilos (25-
40oC) e termófilos (45-60oC). Quanto à presença de oxigênio livre, existem bactérias aeróbias,
anaeróbias, anaeróbias facultativas e microaerófilas. Para a maioria das bactérias, o pH ótimo de
crescimento varia entre 6,5 e 7,5.

Esterilização de meios de cultura

A utilização de meios de cultura estéreis é uma condição essencial para se trabalhar com
microbiologia. Nesta aula prática teremos oportunidade de preparar meios de cultura líquido e
sólido e esterilizá-los por calor úmido em autoclave, um dos métodos de esterilização de meios
de cultura mais comuns no laboratório de microbiologia.
✓ A utilização de calor úmido é um dos métodos mais eficazes de destruição de
microrganismos. A morte das células microbianas por ação do calor úmido resulta da
desnaturação das proteínas e da desestabilização da membrana citoplasmática.
A autoclave torna-se uma câmara com vapor de água saturado à pressão de 1 atm acima
da pressão atmosférica, a que corresponde, em locais ao nível do mar, a uma temperatura

14
de ebulição da água de 121ºC. No laboratório de microbiologia, é usual sujeitar o material
a ser esterilizado a 121ºC durante 15 minutos, de modo a assegurar a morte de todas as
formas de vida bacterianas, incluindo a dos endósporos bacterianos mais resistentes ao
calor que as células vegetativas. Contudo, o tempo necessário para se esterilizar
convenientemente os materiais a esta temperatura depende da natureza do material a
esterilizar e/ou do seu volume. O calor úmido sob pressão é utilizado na esterilização de
meios de cultura que não contenham componentes termolábeis, na esterilização de
materiais de laboratório utilizados nos estudos de microbiologia.

Objetivos
1. Preparar os meios de cultura: caldo nutriente e ágar nutriente ou outro sugerido pelo professor
2. Executar esterilização em autoclave (calor úmido) dos meios de cultura.
3. Preparo das placas com meio de cultura.

Materiais
Reagentes (meio de cultura para preparo conforme descrição do fabricante)
Espátulas, provetas, béqueres, bastão de vidro, frascos Erlenmeyer, tubos de ensaio, tampões de
algodão, autoclave.

Procedimento
Preparo de meios de cultura: caldo/ágar nutriente.
Pesar isoladamente nos béqueres os componentes do meio de cultura para o volume final de
100mL de caldo nutriente;
1) Dissolva cada componente em béquer, adicionando um pequeno volume de água destilada e
agitando com bastão de vidro;
2) Transfira cada componente dissolvido para um frasco Erlenmeyer, misturando os
componentes;
3) Complete o volume com água destilada para 100mL, fazendo uso de uma proveta;

15
Para preparar o ágar nutriente adicione a um frasco Erlenmeyer contendo 50 mL do Caldo
Nutriente, 0.75g de ágar (1,5%).
Importante! 1o) O ágar não dissolve a temperatura ambiente e precisa ser fundido a 80-
100%; 2 o) Nunca ocupar mais que 1/3 do volume do frasco; 3º) os meios precisam ser
esterilizados antes do uso.

Tabela 3- Composição do meio de cultura Agar Nutriente


Composição Quantidade
Extrato de levedura 0,2g
NaCl 0,5g
Extrato de Carne 0,1g
Peptona 0,5g
Ágar 1,5g
Água destilada 100mL

Tabela 4- Composição do meio de cultivo BDA


Composição Quantidade
Caldo de Batata 50 mL
Dextrose 2g
Agar 1,5g
Água destilada 100mL

Exercícios
1) Cite as funções dos componentes dos meios de cultura Ágar Nutriente que você preparou.

2) Qual a indicação para a utilização de meios sólidos, líquidos e semi-sólidos?

16
Prática 3
Ubiquidade microbiana

Introdução
O nosso meio ambiente está repleto de microrganismos. Podemos encontrá-los no ar, na água, no
solo, nos vegetais, nos vários objetos e superfícies que nos circundam, etc. e é por isto que o
trabalho em microbiologia deve ser executado em condições de assepsia que impeçam a
contaminação dos meios usados com microrganismos adventícios.
Objetivos
1- Observar a ubiquidade dos microrganismos;
2- Observar o crescimento de colônias microbianas em meios de culturas líquidos e sólidos.

Materiais
Placas contendo ágar Nutriente (AN)
Tubos de ensaio contendo Caldo Nutriente
Estufa à 37°C

Procedimento:
(Todo procedimento deverá ser realizado próximo à chama do bico de Bunsen).
1. Uma placa de Petri contendo AN e um tubo de ensaio contendo Caldo Nutriente serão
expostas ao ar por 20 minutos.
2. Cada grupo receberá uma placa com AN e um tubo contendo Caldo Nutriente que serão
expostos à diferentes ambientes a critério de escolha de cada grupo. Ex. cabelo, dedo,
jaleco, unha, água, solo, etc.
3. Todas placas e tubos deverão ser identificados com o nome do grupo, o ambiente
pesquisado e data.
4. As placas e tubos de AN serão incubados em estufa à 37°C por 48h.
Caldos possuem mesma composição do meio, porém sem ágar.

17
Resultados
1. Descrever aspecto (filamentoso ou cremoso), coloração, brilho (brilhante ou opaca) das
colônias crescidas em Placa de Petri em cada meio de cultura.
Ambiente Aspecto (filamentoso ou Coloração Brilho (Brilhante ou
cremoso) opaca)
Ar

18
Prática 4
Preparo de lâminas a fresco e observação de Leveduras:
Morfologia, viabilidade e reprodução

Introdução
O termo levedura sempre foi associado à história do processo fermentativo. O significado
da palavra levedura provém do latim “levere” e significa suspender, referindo-se a produção de
gás carbônico durante a fermentação, levantando a superfície líquida como uma espuma.
Existem cerca de 800 espécies, distribuídas em 107 gêneros, de leveduras já identificadas
e caracterizadas no mundo. Essas espécies foram estudadas com base em pequeno número de
ambientes conservados. Isso provavelmente subestima a população real e diversidade de
leveduras presentes na biosfera e ainda não estudadas, bem como representa um vasto campo de
pesquisas na área de microbiologia. Esses fungos desempenham importantes funções em muitos
ecossistemas, contribuindo significativamente para a biodiversidade. As leveduras são fungos
unicelulares, pertencentes ao Reino Fungi, classificadas como Ascomycota ou Basidiomycota,
que se reproduzem vegetativamente por brotamento ou fissão, não produzindo corpo de
frutificação. A classificação nas divisões Ascomycota ou Basidiomycota é baseada em aspectos
da sexualidade (asco ou basídio) sendo as categorias taxonômicas baseadas na morfologia,
fisiologia e características genéticas. As leveduras podem ser classificadas em anamórficas ou
mitóticas (reproduzem-se assexuadamente por brotamento ou fissão) e teleomórficas ou
meióticas (reproduzem-se sexuadamente). Representam grupo muito heterogêneo de fungos
unicelulares, que diferem amplamente nas características morfológicas e fisiológicas. Em
leveduras, a reprodução assexuada é a forma primária de aumento do número de indivíduos na
população. Há dois modos básicos de reprodução assexuada em leveduras conforme a espécie:
fissão ou brotamento. No primeiro caso (por exemplo, em Schizosaccharomyces pombe) ocorre
mitose nuclear seguida de simples divisão celular eqüitativa. No segundo (por exemplo, em
Saccharomyces cerevisiae), paralelamente à mitose nuclear, forma-se na superfície da célula-mãe
uma pequena projeção - o broto - que, à medida que cresce, engloba material citoplasmático e um
dos núcleos resultantes da mitose. Posteriormente, o broto libera-se da célula-mãe da qual é
geneticamente idêntico. Na reprodução sexuada duas células haplóides de tipos sexuais diferentes
podem se fundir formando uma célula com dois núcleos que eventualmente se fundem formando

19
um núcleo diplóide. Este sofre meiose originando quatro núcleos haplóides e então quatro novas
células se formarão, cada uma com um dos quatro núcleos haplóides.
Esses microrganismos crescem em uma grande variedade de substratos, estão presentes
em habitats naturais, podem crescer associados ao homem e animais e também estão presentes
em indústrias ou ambientes de aplicação biotecnológica.
A biologia e a biodiversidade de leveduras são importantes para a caracterização e
preservação de espécies, principalmente aquelas com potencial para aplicação biotecnológica.
Provavelmente a mais difundida e conhecida aplicação biotecnológica de leveduras seja a
capacidade metabólica de transformar substratos complexos em bebidas fermentadas (cerveja e
vinho) e destiladas (uísque, rum e cachaça), bem como na fermentação de pães, em especial pela
espécie. Durante a vinificação outros gêneros de leveduras podem ser observados, todavia em
menor população que Saccharomyces ao final da fermentação, entre eles estão espécies de
Aureobasidium, Metschnikowia, Hanseniaspora, Cryptococcus e Rhodotorula.
Várias leveduras cujo hábitat natural é o solo têm potencial para utilização como
biorremediadoras e na associação com esporos de fungos micorrízicos favorecendo a simbiose.
Outras espécies produzem carotenoides, algumas são empregadas na produção de lipídeos e
derivados, outras estão envolvidas na produção e qualidade de alimentos fermentados indígenas,
como cauim, e bebidas como café, chocolate e cachaça.

Objetivos
1- Observar morfologia de colônias de leveduras
2- Diferenciar leveduras de brotamento e fissão e conhecer as estruturas de formação de ascos e
pseudomicélio.

Materiais
Isolados de leveduras que apresentem reprodução assexuada e sexuada.
Azul de metileno
Água destilada
Microscópio ótico
Lâminas e lamínulas
Alça de platina

20
Procedimento
1. Limpe bem uma lâmina com papel;
2. Esterilize a alça de repicagem, aquecendo-a ao rubro no bico de Bunsen;
3. Quando a levedura estiver em meio líquido, transfira assepticamente com a alça de
repicagem uma gota da cultura de leveduras para o centro da lâmina. Se a cultura estiver
em meio sólido, prepare uma suspensão de células da seguinte maneira: Coloque uma
gota de água destilada ou azul de metileno sobre a lâmina e colete o material
assepticamente, raspando, levemente a superfície do ágar com a alça de repicagem (com
cuidado para não retirar pedaços do meio de cultura, pois o crescimento do
microrganismo ocorre somente na superfície);
4. Manuseie corretamente o microscópio ótico (se você tem dúvida quanto à utilização do
equipamento, pergunte ao professor como usá-lo). Focalize o material, seqüencialmente,
com as objetivas de 4X, 10X e 40X;
5. Terminada a observação, desligue a luz; gire o revolver para encaixar a objetiva de menor
aumento, passando pela objetiva de 10X; abaixe a platina e retire a lâmina;
6. Após a observação, descarte a lâmina e a lamínula nas bandejas com detergente e
desinfetante, colocadas na bancada lateral.

Resultados
Desenhe as estruturas vegetativas e reprodutivas das leveduras observadas no microscópio.

21
Observações:
Levedura Morfologia das Tipo de reprodução (sexuada ou Estrutura observada (célula,
células assexuada/fissão ou brotamento) asco, pseudohifa, broto)

CARACTERÍSTICAS MICROSCÓPICAS
Reprodução Assexuada: Brotamento

Reprodução assexuada: fissão

Reprodução sexuada: ascósporos

22
Morfologia celular das leveduras

Dias & Schwan, 2010.

Fotomicrografias de células de leveduras (parte inferior): a) células elipsóides de


Kluyveromyces marxianus (microscopia eletrônica de varredura – MEV); b) Ascósporos de
Saccharomyces cerevisiae (microscópio ótico, MO, 400x); c) células globosas de S.
cerevisiae (MEV); d) células globosas de S. cerevisiae em brotamento unipolar (MO, 400x);
e) células globosas de S. cerevisiae em brotamento multipolar (MO 400); f) células
cilíndricas de Schizosaccharomyces pombe em fissão (contraste de fase, 100 x). Dias &
Schwan, 2010.

23
Prática 5
Preparações Microscópicas fixadas e coradas:
Coloração de Gram

Introdução
Microrganismos constituem um grupo de seres vivos de dimensões reduzidas e bastante
variáveis de acordo com o grupo a que pertencem. Os procariotos (bactérias e arqueas) variam
entre 200 nm e 2,0 m de diâmetro e de 2 a 8 m de comprimento. Os eucariotos (fungos, algas e
protozoários) constituem o grupo mais heterogêneo variando de 10 m a 100 m (célula vegetal).
Os vírus, cuja organização estrutural não corresponde a uma célula, variam de 27 nm
(bacteriófago X 174) até 300 nm (Pox vírus) de diâmetro. Levando-se em consideração que um
ser humano seja capaz de perceber, a olho nu, estruturas com diâmetro de 0,2 mm, para
observação dos microrganismos e seus detalhes, são necessários microscópios. Preparações
microscópicas compreendem técnicas pelas quais espécimes microbianos são colocados sobre
lâminas, para serem observados ao microscópio. Duas técnicas gerais permitem o exame
microscópio. Uma é a suspensão de microrganismos em meio líquido, onde podem ser
examinados vivos, com auxílio ou não de corantes vitais; na outra, as células microbianas são
fixadas pelo calor e coradas com corantes químicos específicos. A visualização microscópica a
fresco dos microrganismos é difícil, dado o reduzido tamanho destes e o índice de refração, que é
próximo ao da água, o que os torna praticamente incolores quando em meio aquoso. Apesar da
dificuldade de visualização, as preparações microscópicas a fresco são úteis para se observar o
tamanho e a forma natural das células microbianas. As preparações fixadas provocam, distorções
na morfologia das células, pela ação do calor e o efeito dos corantes sobre as células.
Normalmente, para uma boa visualização da morfologia de uma célula bacteriana, são
necessários aumentos de 1000 a 2000 vezes (objetiva de imersão – 100X). No entanto, para
observação de motilidade, arranjo e morfologia de bactérias espiraladas, é necessária a
observação a fresco.
Preparações microscópicas compreendem técnicas de tratamento de espécimes
microbianos em lâminas a serem examinadas ao microscópio. Células microbianas podem ser
examinadas vivas, a fresco, sobre lâminas, com auxílio ou não de corantes vitais (exemplo, azul
de metileno) ou podem ser fixadas pelo calor sobre lâmina e coradas com corantes químicos

24
específicos. A visualização microscópica a fresco é difícil devido ao tamanho reduzido e ao
índice de refração dos microrganismos. Mas apesar disto é útil para observar a viabilidade e
algumas atividades celulares, como motilidade e fissão binária, além de permitir observar o
tamanho e a forma natural das células microbianas.
Preparações microscópicas fixadas e coradas são úteis para visualizar os microrganismos
e diferenciá-los em grupos, para fins de diagnostico ou de estudos de suas propriedades. Existem
várias técnicas de preparação, desde as mais simples, como as preparações a fresco sem
coloração, até as que exigem maiores cuidados na montagem, como é o caso das preparações
fixadas e coradas. Nas preparações a fresco, em geral, são utilizados corantes que não
comprometem a vitalidade das células (não tóxicos). O uso de compostos orgânicos coloridos ou
corantes facilita a observação de células de microrganismos. Existem corantes que se ligam a
elementos químicos específicos da célula microbiana, corantes que fluorescem, que mudam de
cor na presença de reações químicas e corantes que facilitam a visualização. Em geral, os
microbiologistas usam preparações coradas para mostrar as diferentes estruturas de
microrganismos, para identificar suas estruturas internas e para ajudar a identificar
microrganismos similares. Corante é geralmente um sal, em que um dos íons é um cromóforo. Se
o cromóforo é positivo, o corante é básico ou catiônico, como por exemplo, o azul de metileno, o
cristal violeta e a fucsina. Se o cromóforo é negativo, o corante é ácido ou aniônico, como por
exemplo, o ácido pícrico. Corantes básicos são ideais para corar bactérias, porque os ácidos
nucléicos e alguns componentes da parede celular apresentam carga negativa e atraem os
cromóforos catiônicos. Nas técnicas de coloração simples, células microbianas são inicialmente
espalhadas sobre a lâmina, formando um esfregaço; em seguida, são fixadas pelo calor e coradas
com um único corante. Essa técnica é útil para visualizar a forma (cocos, bacilo ou espirilo) e o
arranjo de células bacterianas. Algumas estruturas internas das células também podem ser
visualizadas, como grânulos metacromáticos (polifosfato) e de glicogênio. Nesta aula prática,
serão realizadas técnicas de coloração simples, para comparar forma e arranjo de diferentes
células bacterianas.
A técnica de coloração diferencial requer o uso de pelo menos três reagentes químicos,
aplicados sequencialmente sobre o esfregaço fixado. O primeiro reagente é um corante que
confere cor a todas as células; o segundo reagente é um descolorante, que pode ou não remover
completamente o primeiro corante da célula ou de algumas de suas estruturas. As estruturas

25
descoloradas podem adquirir a cor de um segundo corante, corante de contraste. Assim, grupos
de células ou suas estruturas podem ser diferenciados, com base no corante que é retido. Técnicas
de coloração diferencial permitem não só a visualização de estruturas como flagelo, cápsula,
esporo e núcleo, mas também a separação de microrganismos em grupos. A técnica diferencial
mais importante em bacteriologia é a coloração de Gram, que separa as bactérias em dois grandes
grupos, Gram-positivo e Gram-negativo, sendo importante para o diagnóstico e classificação das
bactérias. A coloração de Gram envolve a aplicação de quatro soluções. Cristal violeta (CV),
primeiro corante que colore as células de roxo escuro. Lugol ou solução de Iodo (I), é a segunda
solução, um mordente que aumenta a interação entre a célula bacteriana e o primeiro corante,
formando um complexo insolúvel, Cristal violeta-Iodo (CV-I). Álcool, a terceira solução, é um
descolorante. As bactérias Gram positivas, quando lavadas com descolorante, retêm o complexo
CV-I e as bactérias Gram negativas perdem o complexo CV-I, ficando incolores. A ação do
álcool como removedor do complexo CV-I da célula depende da concentração de lipídeos e da
espessura da parede celular bacteriana. O último reagente é o corante de contraste, Safranina ou
Fucsina, diferente na cor do cristal-violeta, que colore as bactérias Gram-negativas de rosa-
avermelhado, mas não altera a cor roxo-escura (azulada) das bactérias Gram-positivas.

Objetivos
1- Realizar preparo de lâminas fixadas com coloração diferencial de bactérias para o exame
microscópico.
2- Diferenciar os grupos de bactérias corados por coloração de Gram

Materiais
Culturas bacterianas Alça de platina
Água destilada Microscópio óptico
Solução de cristal violeta
Solução de lugol
Solução de fucsina
Álcool
Cuba para coloração de Gram
Bico de Bunsen

26
Procedimento
Lâminas fixadas (Coloração de Gram)
1. Coloque uma gota de água destilada sobre a lâmina;
2. Transfira com a alça de repicagem, esterilizada em chama, uma pequena porção da
cultura bacteriana e misture a água fazendo movimentos circulares (esfregaço);
3. Deixe o esfregaço secar ao ar e então fixar na chama (3X);
4. Cobrir o esfregaço com solução de cristal violeta por 3 minutos e lavar
cuidadosamente com água;
5. Cobrir o esfregaço com lugol por 3 minutos e lavar cuidadosamente com água;
6. Descorar rapidamente o esfregaço com álcool e lavar cuidadosamente com água;
7. Corar o esfregaço com fucsina por 3 minutos e lavar cuidadosamente com água;
8. Deixar secar e observar ao microscópio óptico em objetiva de imersão (100X).

Cristal Violeta 3 min Lave cuidadosamente com água

Lugol 3 min Lave cuidadosamente com água

Lave cuidadosamente com etanol 95% e Fucsina ou safranina


em seguida dom água 3 minutos e lave com água
27
Resultados
Anotar as observações no quadro abaixo.

Microrganismo Forma celular Arranjo celular Gram (positiva Coloração


(cocos ou bastonete) (se presente) ou negativa) (roxo ou rosa)

Exercícios
1. Qual é a importância do Lugol (iodo) na coloração de Gram?

2. Qual a função do álcool na técnica de coloração de Gram?

3. Qual a diferença entre as células bacterianas que permitem diferenciar Gram positivas e
Gram negativas?

28
Prática 6
Fungos filamentosos:
Morfologia macroscópica e microscópica

Introdução
Os fungos filamentosos encontram-se amplamente distribuídos na natureza,
proliferando como saprófitas, parasitas ou como simbiontes. São heterotróficos,
multicelulares, geralmente aeróbios e apresentam reprodução assexuada e sexuada. Como
saprófitas, degradam a matéria orgânica transformando-a em formas químicas simples que
retornam ao solo. Se por um lado, os fungos saprófitas são úteis na reciclagem da matéria
orgânica, por outro, podem causar a deterioração de alimentos, tecidos vegetais e
ambientes. Como parasitas, causam doenças em vegetais e animais, inclusive no homem.
Os fungos podem atuar ainda em associações simbióticas de grande importância, como as
associações com outros organismos, tais como as algas, formando os liquens, ou com raízes
das plantas, formando as micorrizas.
Os fungos são caracterizados por uma distinta estrutura filamentosa, multinucleada,
conhecida como micélio (podendo apresentar-se com aspectos de algodão). O micélio é
formado por um conjunto de filamentos ramificados que se irradiam sobre ou dentro do
substrato utilizado como alimento. Cada um desses filamentos recebe o nome de hifa. A
hifa é constituída por uma parede tubular delgada e transparente, contendo no seu interior o
protoplasma. As hifas podem ser cenocíticas, ou seja, o protoplasma é contínuo, ou podem
ser septadas, quando o protoplasma é interrompido por paredes transversais denominadas
septos. Os fungos de maior importância para o homem são aqueles classificados no reino
Fungi, chamados de fungos verdadeiros, e alguns do reino Straminipila ou Chromista,
principalmente do Filo Oomycota. A reprodução sexuada em fungos pode ocorrer de
várias maneiras. Os esporos sexuados são formados pela fusão de duas células (gametas),
pelo processo denominado plasmogamia, que reúne dois núcleos em um único citoplasma.
A etapa seguinte é a fusão desses dois núcleos, no processo denominado cariogamia, com
a formação de um núcleo diplóide. A terceira etapa, meiose ou divisão redutora separa o
núcleo diplóide em núcleos haplóides, que são posteriormente delimitados por uma
membrana e parede celular, dando origem aos esporos haplóides. Como regra geral, os

29
esporos sexuados são produzidos menos freqüentemente e em menor número do que os
esporos assexuados. Há quatro tipos de esporos sexuados de fungos: Zigósporos,
Oósporos, Ascósporos e Basidiósporos. Quando estes são formados dentro de estruturas
em forma de saco, conhecidas como ascos, os esporos recebem a denominação de
ascósporos, e os fungos são incluídos na divisão Ascomycota. Tais esporos são
frequentemente encerrados em um corpo de frutificação, denominado ascocarpo. Os tipos
básicos de ascocarpo são: Cleistotécio, Peritécio, Apotécio, Ascostroma. Os esporos
sexuados dos fungos pertencentes a divisão Basidiomycota se desenvolvem em estruturas
em forma de clava, os basídios. Esses esporos são denominados basidiósposros e
geralmente ocorrem em número de quatro por basídio. Quando maduros, os basidiósporos
localizam-se na parte externa dos basídios sobre os esterigmas. Em muitas espécies, os
basídios e seus basidiósporos se organizam em corpos de frutificação altamente complexos,
denominados basidiocarpos, conhecidos popularmente por cogumelos, orelhas-de-pau,
bufos, etc.
As preparações microscópicas para observação de fungos são de extrema
importância, uma vez que a sua identificação depende, em grande parte, da observação de
características morfológicas, como o tipo de micélio e de esporos sexuados e assexuados. A
classificação dos fungos filamentosos baseia-se, principalmente, no tipo de micélio
vegetativo que o fungo apresenta, isto é, cenocítico ou apocítico, e na presença de
estruturas de reprodução sexuada e assexuada.

Objetivos
Observar as estruturas importantes para a identificação de alguns fungos, com
ênfase nas estruturas que caracterizam cada filo, como tipo de hifa, tipo de esporo e
estrutura onde os esporos são formados.

Materiais
Placas com culturas fúngicas
Lâminas, durex, corante azul de metileno ou lactofenol
Lâminas com estruturas de fungos para observação microscópica

30
Procedimento:
1. Adicionar uma gota do corante azul de metileno ou lactofenol na lâmina
2. Com o durex preso aos dedos, pressionar levemente sobre a colônia fúngica
3. Pregar durex com colônia fúngica sobre a lâmina contendo corante e observar em
microscópio
4. Observar estruturas fúngicas em microscópio (lâminas já preparadas)

Resultados:
Desenhar e identificar as estruturas (esporos, hifas) observadas no microscópio. Anotar o
aumento do microscópio.

31
REINO FUNGI
CARACTERÍSTICAS GERAIS DE FUNGOS

Micélio: conjunto ou emaranhado de hifas


Crescimento radial: formação de colônia fúngica
Hifas: filamento tubular microscópico
Tipos de hifas:
-Hifas septadas
-Hifas não septadas

Esporo: unidade reprodutiva.


Tamanho, forma e cores variadas

32
REINO Straminipila/Chromista- FILO Oomycota
Características gerais
→ Hifas não septadas
→ Reprodução assexuada: Zoósporos
→ Reprodução sexuada: Oósporos

33
REINO FUNGI
REINO Fungi: FILO Zigomycota
Características gerais
→ Hifas não septadas
→ Reprodução assexuada: esporangiósporos ou aplanósporos
→ Reprodução sexuada: zigósporo
Ex: Rhizopus stolonifer

Zigósporo

34
FILO Glomeromycota
Fungos endomicorrízicos
Estruturas: arbúsculos, vesículas e esporos
Micorriza: associação simbiótica entre fungos filamentosos e raízes de plantas
Segmento de raiz colonizado por Glomus mosseae. Raiz clarificada com KOH e corada
com azul de trípano para destacar o tecido fúngico.

Esporos : Gigaspora margarita (esporos claros), Scutellospora heterogama (esporos


marrons) e Gigaspora gigantea (esporos amarelos).

Azigósporo de Scutellospora gregaria

Hifa de sustentação Azigósporo de Acaulospora morrowae

35
FILO Ascomycota
Cacterísticas gerais – Ascomycota filamentoso:
→ Hifas septadas
→ Reprodução sexuada: ascósporos
→ Reprodução assexuada: conídios

Filo Ascomycota-Esporos assexuados


Alternaria
Conidióforos pigmentados, normalmente curtos ou alongados, produzindo em cadeia
simples ou ramificada de conídios. A forma do conídio é variável, grosseiramente elíptica a
ovalada. Causa a pinta preta do tomateiro e da batata.

Aspergillus
Conidióforos longos terminando em projeção tipo clava, lembrando baquetas. Da projeção
irradiam-se fiálides, dispostas em camada simples ou dupla, das quais se projetam cadeias
de conídios esféricos. Massa de conídios pode apresentar coloração variada. São saprófitas
comuns em produtos armazenados. Alguns podem produzir toxinas

36
Curvularia
Conidios escuros geralmente com três septos transversais, curvos em ângulo. Os segmentos
internos são normalmente maiores e mais pigmentados que os dois extremos. Causa
mancha de folha de milho.

Fusarium
Conidióforos hialinos de forma variável simples ou ramificados, neste caso curtos e
irregulares ou terminando em tufos de fiálides. Conidióforos isolados ou reunidos em
esporodóquio. Macroconídio com vários septos transversais, levemente curvos, lembrando
uma canoa. Microconídios sem septos e hialinos. As diferentes espécies causam diferenças
doenças em plantas.

Cladosporium
Conidióforos altos, escuros, eretos, ramificados irregularmente no ápice; conídios escuros,
com nenhum a três septos, variáveis em forma e tamanho, formando cadeias
frequentemente ramificadas, globosos ou subglobosos com 3 a 4,5 μm de diâmetro e
colônias de coloração cinza ou oliva.

37
Penicillium
Conidióforos longos, ramificando-se na parte terminal. Conídios esféricos e catenulados
produzidos em fiálides dispostas em número variável na ramificação terminal do
conidióforo (conjunto lembra vassoura). Massa de conídios com coloração esverdeada.
Algumas espécies podem causar podridão em frutos cítricos.

Pestalotia
Conídios com 4 septos transversais, apresentando três secções intermediárias pigmentadas e
as duas das extremidades, hialinas

38
FILO Basidiomycota
Características gerais
→ Hifas septadas
→ Reprodução sexuada: basidiósporo
→ Reprodução assexuada: conídios

Basidiósporos

39
Prática 7
Cultivo de microrganismos:
diluição e espalhamento

Introdução
Nos ambientes naturais os microrganismos se encontram, quase sempre, sob forma
de populações mistas. Assim sendo, para que seja possível estimar a população microbiana
e estudar as características das espécies que compõem estas misturas, é necessário fazer seu
cultivo e isolamento em cultura pura. Uma porção representativa da amostra é transferida,
com assepsia, para meio de cultura sólido (ágar) em placas de Petri. Células microbianas
contidas na amostra, suficientemente separadas, são imobilizadas no gel de ágar contendo
nutrientes e se multiplicam, formando um agregado de células idênticas denominadas
colônia. A contagem das colônias obtidas em placas possibilita a estimativa da população
microbiana presente nas amostras em estudo. As colônias são formadas a partir de uma
única célula ou um pequeno grupo de células que se dividem, sendo denominadas
Unidades Formadoras de Colônias (UFC). As técnicas utilizadas para estimar populações
microbianas são a ‘de mistura’ por espalhamento (alça de Drigalsky) e derramamento
(“pour-plate” ou profundidade). Normalmente, a população microbiana presente nas
amostras são mistas e podem apresentar elevada concentração. Desta forma, é necessário
fazer diluições sucessivas para realizar a contagem em placas e determinar a população
viável na amostra. Para isso, realizam-se quantas diluições forem necessárias para que
cresça na placa de Petri um número final de colônias entre 30 e 300, o que facilitará a
contagem e a estimativa da população microbiana presente. Nesse caso, o espalhamento é
feito por adição de uma pequena alíquota conhecida (normalmente 0,1 mL) sobre a
superfície do meio sólido e espalhando-se com alça de Drigalsky. Outra opção é a
utilização da técnica “Pour Plate”, na qual aplica-se primeiro a alíquota (1 mL) e depois se
verte o meio liquefeito e resfriado a 50oC, fazendo-se movimentos rotatórios até que a
suspensão de células fique bem distribuída no meio de cultura. O resultado será expresso
como UFC por mililitro da amostra.

40
Nesta aula prática, será realizado o procedimento para estimativa da população
microbiana pelo método de diluição em séria seguida por espalhamento em placas.

Objetivos
1- Realizar diluições seriadas de amostras microbianas para plaqueamento e contagem de
colônias determinando Unidades Formadoras de Colônias por mL da amostra original
(UFC/mL ou g)
2- Executar rotina de plaqueamento;
3 – Avaliar população microbiana em amostras

Materiais
Amostras
Erlenmeyer com 90 mL de solução salina estéril
Placas com meios de cultura Ágar Nutriente
Alças de Drigalsky
Pipetas (1 mL e 0,1 mL)
Tubos de ensaio com 9 mL de solução salina estéril
Estufa à 37°C
Diluição seriada
IMPORTANTE: Usar no máximo 100µL (0,1mL) de inoculo nas placas de Petri
quando usado a técnica de espalhamento em superfície.

41
Métodos de plaqueamento após realizada a diluição seriada

Procedimento
Contagem de bactérias pelo método das diluições em placas
1. A partir da amostra original: solo (10g em 90 mL de solução salina) ou leite (1 mL
em 9 mL de solução salina), realizar as diluições sucessivas, de 10-1 até 10-6
conforme figura acima;
2. Transferir 1 mL da amostra para tubo contendo 9 mL de solução salina estéril;
3. Homogeneizar;
4. A partir da diluição 10-4, proceder a inoculação de 0,1 mL em meio contendo ágar
nutriente;
5. Espalhar o inoculo pelo método de espalhamento em superfície utilizando o auxílio
de uma alça de Drigalsky; Cuidado: Somente passe a alça no fogo (vidro muito
quente pode estourar!)
6. Incubar as placas a 37°C durante 24-48 horas.

42
Resultados
Faça a contagem das colônias obtidas nas placas que obtiverem entre 30 e 300 colônias e
calcule a população total da amostra expressando a contagem em UFC/ mL (ou g):
Amostra Diluição do tubo Número de colônias População total
plaqueada obtidas (UFC) na amostra

População da amostra (UFC/mL ou g) = Número de colônias obtidas x fator de diluição


do tubo x fator de diluição da alíquota.

Exercícios
1- Por que ao realizarmos contagem em placas consideramos somente aquelas onde tenham
sido formadas entre 30 e 300 colônias?

2- Qual é a finalidade das diluições seriadas, efetuadas durante o procedimento de


enumeração de microrganismos?

3- Uma amostra de água tem 108 UFC/ml, qual a diluição necessária de modo que a
estimativa de contagem na placa final seja de 100 UFC/ml?

4- Com base no esquema abaixo, responda: a). Qual a diluição em cada etapa (A-F)?
b). Qual a diluição total em cada uma das etapas (A-F)?

43
Prática 8
Obtenção de Cultura Pura:
Técnicas de estrias simples e compostas

Introdução
Dentre as técnicas conhecidas para isolamento de microrganismos em cultura pura,
as mais comumente utilizadas são a técnica do esgotamento. O isolamento em meio de
cultura com ágar baseia-se no princípio de que quando se espalha uma quantidade
suficientemente pequena de material, pode-se obter células individuais que crescem em
colônias completamente separadas umas das outras. O isolamento é importante para
obtenção de culturas puras que poderão ser posteriormente estudadas e utilizadas para
diversos fins. Cultura pura é aquela em que todos os indivíduos se originaram a partir de
uma única célula e são mantidas geneticamente idênticas (clones). Os estudos
microbiológicos e suas aplicações são efetuados com a população dos microrganismos e
não com uma única célula, sendo somente válidos se realizados com populações de culturas
puras.
Nesta aula prática, será realizado o procedimento para obtenção de cultura pura pelo
método do esgotamento do inoculo em superfície de ágar, utilizando estrias simples ou
compostas.

Objetivo:
Realizar a técnica de isolamento/purificação por estrias simples e composta de colônias
obtidas na aula anterior.

Materiais
Placas com microrganismos da aula anterior
Placas com Ágar Nutriente
Alças de platina
Estufa à 37°C

44
Procedimento:
1. Esterilize a alça de repicagem e espere esfriar atrás da chama;
2. Transfira assepticamente uma colônia bacteriana utilizando alça de repicagem para a
superfície do meio de cultura;
3. Espalhe conforme uma das técnicas: estria simples ou estria composta;
4. Flambe novamente a alça, deixe-a esfriar no suporte;
5. Incube as placas em posição invertida, a 30oC, por 24 horas. Observe o crescimento
de colônias isoladas.

Fazer estrias no meio de cultivo Flambar a alça

Estria composta Estria composta

Estria composta Estria simples

45
Resultado
Esquematize o crescimento obtido na superfície da placa estriada.

Exercício:
Indique uma colônia que você selecionaria para o isolamento. Se você não obteve uma
colônia isolada, sugira as possíveis razões para essa falha e o que faria para corrigi-la.

46
Prática 9
Análise de água: NMP

A água para consumo deve ser isenta de microrganismos causadores de doenças e


de substâncias químicas prejudiciais à saúde. Microrganismos patogênicos não crescem em
águas relativamente puras, mas podem sobreviver por vários dias.
Para o controle bacteriológico de água seria necessário detectar a presença de
microrganismos patogênicos. Pareceria a princípio, mais natural que se procurasse isolar
diretamente da água os agentes responsáveis pelas doenças de origem hídrica. Infelizmente,
os procedimentos analíticos para bactérias patogênicos não são satisfatórios, pois uma vez
que os patógenos são muito mais fastidiosos que bactérias comuns, eles não são detectados
por técnicas microbiológicas normais. Assim, ao invés de testar a qualidade da água pela
presença de patógenos específicos, usa-se comumente verificar a presença de um grupo de
bactérias que serve como indicador da presença de contaminação: as bactérias coliformes.
As bactérias coliformes são membros da família Enterobacteriaceae e incluem os
gêneros Escherichia, Aerobacter e Klebsiella. São bacilos aeróbios ou anaeróbios
facultativos, Gram negativos, não esporulados e fermentam a lactose com produção de gás.
São habitantes naturais do trato intestinal do homem e de animais vertebrados superiores.
Uma vez que as doenças de maior importância epidemiológica transmitida pela água
resultam da ingestão de água contaminada por material fecal, a detecção das bactérias do
grupo coliforme na água constitui um método relativamente seguro, fácil e rápido de
determinar a poluição fecal, pois onde há bactérias intestinais, há contaminação com
material fecal, o que representa um perigo potencial.
A pesquisa do grupo coliforme se faz através dos testes presuntivo, confirmativo e
completo. Nas análises de rotina, normalmente se faz apenas o teste presuntivo, caso haja
necessidade, os testes subsequentes são realizados. Este teste é realizado pela técnica do
Número Mais Provável ou NMP. Esta técnica consiste em calcular o número provável de
microrganismos específicos numa amostra, ex. água, utilizando tabelas de probabilidade.
Diluições decimais da amostra são inoculadas em séries de tubos contendo meio líquido
seletivo. Os tubos são positivos quando têm crescimento e/ou produção de gás de
fermentação. A população bacteriana é determinada pela combinação de resultados
positivos e negativos numa tabela designada por tabela do NMP
47
Cuidados especiais devem ser tomados em relação à coleta de amostras, a fim de se
evitar alteração da biota microbiana presente na água.

Objetivos
1. Avaliar a população de coliforme em amostras de água
2. Utilizar a técnica NMP para avaliação de população de coliformes

Materiais:
● Frascos esterilizados para coleta de amostras;
● Pipeta de 10 mL, 1 mL e 0,1 mL esterilizadas;
● Tubos com caldo lactose para fermentação;
● Tubos de Durham.

Procedimento:
1. Colher as amostras de água, observando os cuidados requeridos para cada caso em
particular;
2. Agitar a amostra por 25 vezes;
3. Transferir com assepsia, 10 mL; 1 mL e 0,1 mL da amostra para os tubos com caldo
lactose formando 3 séries de 5 tubos (ver esquema).
4. Incubar os tubos a 37 °C por 48 horas.
5. Examinar os tubos com caldo lactose quanto a produção de gás. Anotar o número de
tubos positivos para cada diluição e determinar o número mais provável pela tabela

Resultados:
Preencher os dados abaixo e classificar a água.

48
Análise de água - Ficha

Procedência: Local da coleta: ( ) Caixa d’água


Remetente: ( ) Cisterna
Data da coleta: ( ) Córrego/rio:
Data do exame: ( ) Lagoa
Natureza da amostra: ( ) In natura ( ) Torneira
( ) Tratada:
( ) Filtrada:
Observações:
TESTE PRESUNTIVO
10 10 10 10 10 1 1 1 1 1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1

Caldo
lactosado
(+) positivo: presença de bolhas de ar
(-) negativo: ausência de bolhas de ar

NMP (Número Mais Provável de coliformes) por 100 mL:

NMP= 2- Água boa - NMP= de 2 a 11- Água suspeita - NMP= 11- Água ruim

Conclusão do Exame Bacteriológico:_______________________________________

Exercícios
1) Enumerar algumas doenças que podem ser transmitidas pela água bem como seu agente
etiológico.

2) Por que esse tipo de análise bacteriológica não pesquisa diretamente os germes
causadores da doença?

49
Tabela do NMP de coliformes por 100 ml da amostra e os limites de confiança de 95%,
quando são usados 5 tubos para cada volume de 10; 1 e 0,1 ml.

50
Prática 10
Metabolismo: respiração e fermentação

Introdução
Metabolismo é a soma de todas as reações químicas realizadas pela célula para se
manter viva e replicar. Estas reações podem liberar energia (CATABOLISMO) ou
consumir energia (ANABOLISMO). A forma mais importante de armazenar energia é o
ATP. As reações catabólicas “quebram” moléculas (preferencialmente carboidratos),
gerando ATP para a “construção” de novas macromoléculas no anabolismo. Os dois
principais tipos de catabolismo de carboidratos são a respiração, em que a glicose é
completamente quebrada, e a fermentação, em que ela é parcialmente quebrada. A glicólise
é a via mais comum para a oxidação da glicose e comum para os dois processos
(fermentação e respiração). O ácido pirúvico é o produto final. Nesta via, dois ATPs e duas
moléculas de NADH são produzidas a partir de uma molécula de glicose.

Respiração celular
Durante a respiração, moléculas orgânicas são oxidadas através da glicólise, ciclo de
Krebs e cadeia transportadora de elétrons. Na respiração aeróbica, O2 funciona como o
aceptor final de elétrons. Na respiração anaeróbica, o aceptor final d e elétrons é uma
molécula inorgânica que não o O2. O clico de Krebs consiste na descarboxilação do ácido
pirúvico produzindo uma molécula CO2 e um grupo acetil. Os grupos acetil de dois
carbonos são oxidados e os elétrons são capturados pelo NAD+ e FAD para a cadeia de
transporte de elétrons. A partir de uma molécula de glicose, a oxidação produz seis
moléculas de NADH, duas moléculas de FADH2 e duas moléculas de ATP. A
descarboxilação produz seis moléculas de CO2. Os elétrons são conduzidos á cadeia de
transporte de elétrons pelo NADH. A cadeia de transporte de elétrons é formada por
transportadores, incluindo flavo-proteínas, citocromos e ubiquinas. Para geração de ATP,
prótons são bombeados através da membrana gerando uma força próton-motiva enquanto
os elétrons se movem por meio de uma série de aceptores ou transportadores. A energia
produzida a partir do movimento dos prótons pela membrana é utilizada pela ATPsintase

51
para fazer ATP a partir de ADP e P. Em eucariotos, transportadores de elétrons estão
localizados na membrana mitocondrial interna; em procariotos, transportadores de elétrons
estão na membrana plasmática.
Em procariotos aeróbicos, 38 moléculas de ATP podem ser produzidas pela
oxidação completa de uma molécula de glicose na glicólise, no ciclo de Krebs e na cadeia
de transporte de elétrons. Em eucariotos, 36 moléculas de ATP são produzidas da oxidação
completa de uma molécula de glicose.
Na prática de hoje, utilizaremos o azul de metileno como indicador de reações de
oxidação e redução, que ocorre no processo respiratório. O azul de metileno apresenta
coloração azul na sua forma oxidada, e quando reduzido, torna-se translúcido.

Fermentação
A fermentação libera energia de açúcares ou outras moléculas orgânicas através da
oxidação parcial, produzindo menos energia que a respiração. O O2 não é necessário, mas
pode ocorrer na presença deste. Na fermentação, duas moléculas de ATP são produzidas
pela fosforilação em nível de substrato. Não existe cadeia de transporte de elétrons. Os
elétrons removidos do substrato reduzem NAD+ e o aceptor final de elétrons é uma
molécula orgânica. Na fermentação do ácido lático, ácido pirúvico é reduzido pelo NADH
a ácido lático. Na fermentação alcoólica, acetaldeído é reduzido pelo NADH para produzir
etanol. Fermentadores heteroláticos podem utilizar a via pentose fosfato para produzir ácido
lático e etanol.
Para ser “fermentável”, um composto precisa ser capaz de produzir intermediários
tanto oxidáveis quanto redutíveis, por isso, não pode ser nem muito oxidado e nem muito
reduzido. Os açúcares preenchem estas exigências admiravelmente e estão entre os
compostos mais fácil e amplamente utilizados pelos microrganismos fermentadores. Outras
substâncias, incluindo vários ácidos orgânicos, aminoácidos, purinas e pirimidinas podem
ser fermentadas por algumas bactérias. Os produtos finais de uma dada fermentação variam
com o tipo de organismo, natureza do substrato fermentável e, em alguns casos, com os
fatores ambientais temperatura e acidez do meio.
Contudo, a utilização de microrganismos fermentadores se presta devido principalmente à
transformação de um alimento para outro com características mais peculiares no sabor,

52
textura, aparência e digestibilidade, agregando-se assim valor a um produto primário, ou até
produzindo um novo alimento sem perda ou utilização de grandes quantidades de energia,
visto que se trata de um dos mecanismos de biossíntese de menor gasto energético. As
fermentações são controladas pelo homem através da escolha dos microrganismos, dos
substratos, da temperatura e pH adequados.

Objetivo
Observar a atividade metabólica microbiana (respiração e fermentação) nos diferentes
substratos/meios utilizados.

Respiração celular
Materiais
Tubos com culturas bacterianas E. coli e Staphylococcus
Solução de azul de metileno 1:10.000

Procedimento:
1. Adicionar 1 mL da solução de azul de metileno no tubo com a cultura bacteriana;
2. Incubar em estufa a 37°C por 15 a 30 minutos e anotar o resultado.

Resultados:
Coloração antes incubação:________________________________________________
Coloração após incubação:________________________________________________

Exercício
1. O que aconteceu com o azul de metileno após incubação do tubo? Por quê?

2. As alterações ocorridas com o azul de metileno são resultantes de reações de


oxirredução. Um microrganismo com metabolismo essencialmente fermentativo não
reduz essas substâncias. Com base nestas informações, em que etapa do
metabolismo respiratório você supõe que a reação ocorra?

53
Fermentação
Material
Água destilada morna
Farinha de trigo
Açúcar
Fermento biológico
Erlenmeyer
balões

Procedimento:
1. Adicionar aproximadamente 150 mL de água morna nos 3 Erlenmeyer
2. No primeiro adicionar 2 colheres de fermento biológico
3. No segundo adicionar 2 colheres de fermento biológico e 2 colheres de farinha de
trigo
4. No terceiro acionar 2 colheres de fermento biológico e 2 colheres de açúcar
5. Homogeneizar os 3 Erlenmeyer e colocar o balão na boca
6. Observar formação de gás

Resultados
Anotar os resultados obtidos na tabela abaixo:
Amostra (Erlenmeyer) Produção de gás
1. Água morna + fermento
2. Água morna + fermento + farinha
3. Água morna + fermento + açúcar

Exercício
1. Explique o que aconteceu no Erlenmeyer 3. Por que o mesmo não ocorreu nos
outros Erlenmeyer?

54
Práticas 11 e 12
Identificação bacteriana: enterobactérias

Introdução
Identificar um dado organismo como espécie baseia-se no preenchimento das
características atribuídas àquela espécie. O reconhecimento da fonte ou origem do espécime
(ambiente, espécie animal, tipo de patologia e localização) do organismo é às vezes
fundamental para identificação. A execução inadequada de um teste preliminar pode
confundir e prejudicar todo processo de identificação. Na rotina laboratorial são utilizados
certos testes chaves para reduzir o trabalho, o custo e abreviar o tempo requerido para
diagnóstico.

O processo de identificação dos microrganismos é efetuado através da determinação


de um número mínimo de propriedades (PROVAS BIOQUÍMICAS). Portanto, quanto
menor o número de observações efetuadas, maior o risco de erros de identificação.
Usualmente é necessário utilizar organismos como controles positivos e negativos para a
execução de cada teste.

Provas bioquímicas
A investigação das atividades metabólicas das bactérias “in vitro” é chamada de
Provas Bioquímicas e servem para auxiliar o microbiologista a identificar grupos ou
espécies de bactérias ou leveduras através da verificação das transformações químicas, que
ocorrem num determinado substrato, pela ação das enzimas de um dado microrganismo.
Como muitas vezes um determinado microrganismo possui um sistema enzimático
específico, promovendo transformação bioquímica específica, as provas bioquímicas
podem ser utilizadas na prática para a sua caracterização.

Para a realização das provas bioquímicas é necessário utilizar meios de cultivo


especiais contendo o substrato a ser analisado e fornecer ao microrganismo as condições
nutritivas e ambientais necessárias ao seu desenvolvimento. Na prática de hoje, serão
realizados uma série de provas bioquímicas para identificação de bactérias da família
Enterobacteriaceae.

55
Objetivo

1. Inocular bactérias em diferentes meios-teste;


2. Observar modificações nos meios-teste após cultivo microbiano e/ou adição de
reagentes;
3. Comparar resultados obtidos com chaves de identificação descrita na literatura.

Material
Placas com culturas de bactérias E. coli, Proteus sp., Serratia sp.
Meios de cultivo para testes de identificação bacteriana: Nitrito, Fenilalanina, Uréia,
Fermentação (lactose, glicose e manitol), Lisina Descarboxilase, Malonato, Indol, H2S e
Citrato.

Procedimento:
1. Inocular cada cultura bacteriana em todos os meio-testes.
2. Incubar à 37 °C por 24-48h.
3. Observar resultado e buscar espécie na chave de Identificação Bioquímica.

Meios-teste:
NITRITO
100 mL Caldo Simples; 0,1 g Nitrato de Potássio: 0,1 g; pH 7,6
Reativo de Griess-Ilosvay:
1- 5 g Ácido Sulfanílico; 1000 mL Ácido Acético 5N
2- 5 g Naftilamina; 1000 mL Ácido Acético 5N
Colocar algumas gotas de cada solução de Griess-Ilosvay no tubo de ensaio com bactéria
crescida. O aparecimento da coloração róseo-avermelhada indica reação positiva.
FENILALANINA
3 g Extrato de levedura; 2 g DL- fenilalanina; 1 g Na2HPO4; 5 g NaCl; 12 g Ágar; 1000 mL
Água Destilada; pH 6,9
Após incubação, gotejar 4 a 6 gotas de uma solução de cloreto férrico 10 % sobre o
crescimento. O aparecimento de cor verde indica reação positiva.
URÉIA

56
1 g Peptona; 5 g NaCl; 2 g KH2PO4; 1 g Glicose; 6 mL solução vermelho de fenol 0,2%; 10
g Uréia; 1000 mL água destilada; pH 6,9
Após incubação e crescimento, o aparecimento de coloração róseo-avermelhada indica
reação positiva.
FERMENTAÇÃO LACTOSE, GLICOSE E MANITOL
100 mL água peptonada; 0,0025 g vermelho de fenol; 1 g carboidrato (lactose ou glicose ou
manitol)
Após incubação, o aparecimento de coloração amarelada indica reação positiva.
LISINA DESCARBOXILASE
Meio básico: 5 g Peptona; 3 g Extrato de levedura; 1 g Glicose; 1 mL vermelho de
bromocresol (1,6 % em água); 1000 mL água destilada; pH 6,8
Lisina controle: meio básico sem aminoácido
Lisina teste: meio básico acrescido de 0,5 % de Lisina
Leitura: tubo controle: amarelo; tubo teste: roxo intenso indica reação positiva.
MALONATO
1 g Extrato de levedura; 2 g (NH4)2SO4; 0,6 g K2HPO4; 0,4 g KH2PO4; 2 g NaCl; 3 g
Malonato de Sódio; 0,25 g glicose; 0,025 g azul de bromotimol; 1000 mL água destilada
Alteração da coloração do indicador de verde para azul (pH 7,6) indica reação positiva;
MEIO SIM (para testes H2S, INDOL e MOTILIDADE)
20 g Peptona de caseína; 6,1 g Peptona de carne; 0,2 g Tiossulfato de Sódio; 3,5 g ágar; 100
mL água destilada; pH 7,3
H2S
Escurecimento do meio indica reação positiva
INDOL
Pesquisa de indol utilizando reativo de Ehrlich-Bohme:
Solução 1: 1 g p-dimetilaminobenzaldeído; 95 mL álcool etílico (95%); 20 mL HCl
concentrado
Solução 2: Solução aquosa de Persulfato de Potássio
Após crescimento, adicionar partes iguais das soluções 1 e 2. O aparecimento de um anel
róseo na superfície indica reação positiva.
MOTILIDADE

57
Inocular bactérias utilizando agulha, fazendo uma picada central até ¾ da profundidade
do tubo. Crescimento difuso indica motilidade positiva, as bactérias imóveis ficam
confinadas à linha da picada.
CITRATO
5 g NaCl; 0,2 g Sulfato de Magnésio; 1 g Fosfato de amônio; 1 g Fosfato de Sódio; 5 g
Citrato de Sódio; 0,08 g Azul de bromotimol; 20 g ágar; 1000 mL água destilada; pH 7,0
Alteração da cor verde do indicador azul de bromotimol para azul indica reação positiva.

Resultado
Completar tabela na próxima página.

Exercícios
1. De um modo geral, como são identificadas bactérias causadoras de doenças em
amostras clínicas?

2. No geral, em que se baseiam os testes realizados na aula prática para identificação


da bactéria?

58
IDENTIFICAÇÃO BIOQUÍMICA DE ENTEROBACTERIACEAE (MANUAL BERGEY, 1984)

Citrobacter Enterobacter Escherichia Klebsiela Proteus Salmonella Serratia Shigella Yersinia Resultado
da amostra
Nitrito + + + + + + + + +
Fenilalanina - - - - + - - - -
Uréia +/- +/- - +/- + - +/- - +
Lactose +/- - +/- + - - - - +/-
Glicose + + + + + +/+ +/+ + +/+
Manitol + + +/- + - + + +/- +
Lisina - +/- +/- +/- - + +/- - -
Malonato +/- +/- +/- + - - - - -
Indol +/- - +/- +/- +/- - - +/- +/-
H2S - - - - +/- + - - -
Motilidade + + +/- - + +/- + - -
Citrato + + - + +/- +/- + - -
- = 0 a 10 % das amostras são positivas; +/- = 26 a 75 % das amostras são positivas; + = 90 a 100 % das amostras são positivas.

Bactéria identificada_________________________________________

59
Prática 13 e 14
Controle do crescimento microbiano e antibiograma

Introdução

Os microrganismos podem ter seu crescimento controlado por agentes químicos e físicos, os
quais podem atuar eliminando ou impedindo o seu crescimento, criando condições nas quais eles
não podem se reproduzir. Uma grande variedade de métodos pode ser utilizada, como, por
exemplo, calor, radiações ionizantes, etc. A esterilização e desinfecção ou desinfestação de
materiais são etapas básicas quando se trabalha num Laboratório de Microbiologia.

Conceitos importantes referentes aos diferentes métodos de inibição do crescimento


microbiano:

 Esterilização- é o processo pelo qual eliminam-se todas as formas vivas presentes em um


material ou ambiente. A esterilização pode ser realizada pelo calor, pela radiação pela filtração e
por agentes químicos. Esses processos destroem células microbianas numa progressão
geométrica; portanto, quanto menor à população inicial, mais rápida é a esterilização. É
fundamental em todos os procedimentos microbiológicos. Os materiais, a água, os vasilhames
utilizados na preparação de meios de cultura e soluções nutritivas para o crescimento de
microrganismos devem ser isentos de qualquer forma de vida. As relações tempo/temperatura e
volume/área do material ou meio a ser esterilizado, bem como a eficiência de penetração ou
difusão do agente letal, devem ser considerados na definição do processo de esterilização.
 Desinfecção- é a eliminação parcial (ou redução) do número de microrganismos
(principalmente patogênicos) presentes em um material inanimado (utensílios, equipamentos,
paredes, chão, mesas, etc). A desinfecção é feita por agentes químicos-que são os desinfetantes.
 Assepsia- conjunto de processos (técnicas) utilizados para impedir a entrada de
microrganismos em local que não os contenha
 Sanitização- é o tratamento que leva a diminuição da vida microbiana nos utensílios
alimentares e equipamentos de manipulação de alimentos até os níveis seguros de saúde publica.
Processo realizado com agentes químicos que podem ser sabão ou detergente e desinfetantes do
tipo sanitizantes.

60
 Antissepsia- Semelhante a desinfecção, porém relacionada a tecidos vivos. É feita, também,
por meio de agentes químicos, denominados antissépticos, em concentrações adequadas para
estes tecidos.

MÉTODOS DE ESTERILIZAÇÃO/DESINFECÇÃO/ASSEPSIA
Agentes Físicos: Calor, radiações, filtração.
Calor: é um dos mais importantes métodos usados para o controle do crescimento de
microrganismos. Acima da temperatura ideal de crescimento o calor vai promover a desnaturação
de proteínas estruturais e enzimas, levando a perda da integridade celular e morte. Exemplos de
uso de calor são calor úmido (autoclave, fervura, vapor fluente), pasteurização, calor seco (estufa
esterilizadora).
Baixas temperaturas: Métodos de controle dos microrganismos porque causa diminuição na taxa
de crescimento e na atividade enzimática. Métodos que empregam baixa temperatura pode ser:
refrigeração, congelamento.
Radiações: constituem num método eficaz para reduzir ou eliminar os microrganismos. O
material a ser esterilizado é submetido à ação de radiação ionizante (Raios X, ) e ultravioleta
(UV). A ação mais prejudicial é no DNA, mas atinge outras moléculas como proteínas. Leva a
morte celular.
Filtração: normalmente utilizada para esterilização de meios líquidos e gases que são sensíveis ao
calor (proteínas, aminoácidos, antibióticos, vitaminas). Os filtros mais usados são: acetato,
policarbonato, porcelana, cerâmica, papel-celulose e filtros de membrana (éster de celulose) com
poros de diâmetro conhecidos.
Outros métodos físicos de controle do crescimento microbiano: Dessecação, Liofilização,
Defumação, Remoção de Oxigênio, Vibração Ultra-Sônica.
Agentes Químicos: são substâncias químicas de origem natural ou sintética usadas para eliminar
ou inibir o crescimento dos microrganismos. Visam esterilização, descontaminação, desinfecção,
anti-sepsia de materiais ou ambientes (salas cirúrgicas, câmaras assépticas, bancadas de
laboratório). Sua ação depende de vários fatores como concentração, tempo de contato, pH,
temperatura, tipo de microrganismos, etc. Apresentam efeitos:
Efeito estático - inibição do crescimento. Em condições normais os microrganismos voltam a
crescer.

61
Efeito biocida - morte dos microrganismos.
Exemplos de agente químicos: Desinfetantes, agentes alquilantes, oxido de etileno, fenol,
clorofórmio, álcool, metais pesados, compostos halogenados, etc.

Objetivo:
Verificar a eficácia de métodos químicos no controle do crescimento microbiano.
Métodos químicos: detergente e iodo
Material
Placas de Agar Nutriente
Swab
Detergente
Álcool iodado a 2%

Procedimento:
1. Dividir a placa com AN em quatro partes (controle, detergente, álcool 70% e iodo);
2. Carimbar o dedo sem lavar (controle), lavado com detergente e tratado com álcool 70% e
solução de álcool iodado a 2 % nos locais apropriados da placa;
3. Incubar em estufa a 37°C por 24-48 h.
4. Anotar resultados de crescimento/ausência de crescimento dos diferentes tratamentos.

Resultados
Anotar os resultados na tabela abaixo.
Tratamento Crescimento
Controle
Iodo
Álcool 70%
Detergente

62
Métodos químicos: antibiograma
Material
Tubos de ensaio com culturas bacterianas Staphylococcus sp. e Proteus sp.
Placas de Petri com Ágar Muller-Hinton
Swabs estéril
Discos com antibióticos

Procedimento
1) Inocular assepticamente as suspensões bacterianas nas placas com Ágar Muller-Hinton
com auxílio do swab, tomando cuidado para que toda placa fique coberta;
2) Com auxílio de uma pinça previamente flambada, transfira assepticamente os discos de
papel contendo os antibióticos para a superfície do meio de cultura inoculado. (OBS: cada
placa deve conter um disco de cada antibiótico);
3) Incubar as placas em estufa à 37oC, por 24 horas.
4) Observar o crescimento bacteriano e as zonas de inibição em torno dos discos de papel.
Medir o diâmetro (mm) da zona de inibição com régua e anotar os resultados na tabela
abaixo.

Resultado
Anote o tamanho (mm) do diâmetro dos halos de inibição obtidos para cada bactéria nos
diferentes antibióticos.
Halo de inibição (mm)
Antibiótico
Bactéria 1. 2. 3.
1.
2.

Sempre comparar com referência (sensível). Ex.:


Bactéria Cefoxitina Clindamicina Ciprofloxacina
Staphylococcus sp. ≥ 22 mm ≥ 17 mm ≥ 17 mm
Proteus sp. ≥ 22 mm ≥ 17 mm ≥ 17 mm

63
QUESTÕES

1). Existem diferenças do modo de ação dos antibióticos contra bactérias Gram positivas e Gram
negativas? Por quê?

2). Quais os principais mecanismos de ação dos antibióticos sobre as células microbianas?

3) Antibióticos que agem sobre o peptideoglicano são ativos contra fungos e vírus? Explique.

4)- Explique como age o iodo na célula microbiana para ser efetivo no controle do crescimento
microbiano.

64
Referências

ALEXOPOULOS, C.J. & MIMS, C.W. Introductory Mycology. Singapore: John Wiley &
Sons, 1979. 632 p.
BERGEY, D. H., BUCHANAN, R. E., & GIBBONS, N. E. (1974). Bergey's manual of
determinative bacteriology. Baltimore, Williams & Wilkins.
BROCK, T.D. & MADIGAN, M.T. Biology of microorganisms. New Jersey: Prentice Hall
International, 2012. 835 p.
BUCHANAN, R.F.; GIBBONS, N.E. Bergy’s Manual of Determinative Bacteriology. 8 th.
Ed. Baltimore, Wllians & Wilkins Co. 1974.
CAPPUCINO, J.G., SHERMAN, N. Microbiology: a laboratory manual. 6th Edição.491 p. 2001.
LARPENT, J. P. & LARPENT-GOURGAUD, M. Microbiologia Prática. São Paulo: Edgard
Blucher Ltda-USP, 1975. 162p.
LOURES, E. G. & GUIMARÃES, W. V. Microbiologia. Técnicas de laboratório. Principais
provas Empregadas para Identificação de Bactérias. Viçosa, Imprensa Universitária, U. F. V.
1981.
NEDER, R.N. Microbiologia: Manual de Laboratório. São Paulo: Nobel, 1992. 138p.
PRESCOTT, L.M.; HARLEY, J.P. & KLEIN, D.A. Microbiology. Dubuque: Wm. C. Brown,
1990. 868 p.
RIBEIRO, M.C.; SOARES, M.M.S.R. Microbiologia Prática: roteiro e manual: bactérias e
fungos. São Paulo: Editora Atheneu, 2000. 112p.
SILVA, N.; JUNQUEIRA, V.C.A.; SILVEIRA, N.F.A.; TANIWAKI, M.H.; GOMES, R.A.R.;
OKAZAKI, M.M. Manual de métodos de análise microbiológica de alimentos e água. São
Paulo: Blucher, 2017, 560 p.
TORTORA, G.J.; FUNKE, B.R. & CASE, C.L. Microbiologia. Artes Médicas Sul, Porto
Alegre, 2005

65