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Factores que condicionam a actividade microbiana

INDICE

1 - INTRODUÇÃO

2 - PARÂMETROS INTRÍNSECOS

2.1 - pH

2.2 - Humidade e aw

2.3 - Potencial de oxi-redução (potencial redox)

2.4 - Nutrientes

2.5 - Substâncias inibidoras

2.6 - Estruturas biológicas

3 - PARÂMETROS EXTRÍNSECOS

3.1 - Temperatura

3.2 - Humidade relativa

3.3 - Presença e Concentração de Gases

4 - CONCLUSÕES

Cristina Aleixo de Távora 1


Factores que condicionam a actividade microbiana

1 - INTRODUÇÃO

Como já vimos os alimentos são, de um modo geral, de origem animal


ou vegetal, o que justifica que, para se conhecer a evolução da microflora
alimentar, seja indispensável compreender as características dos tecidos
animais e vegetais que podem influenciar o desenvolvimento dos
microrganismos.
O problema fundamental de gestão do crescimento microbiano
prende-se com os seguintes aspectos:
- Contaminação & patogénicos / produção de toxina
- Controlo dos teores e multiplicação dos microrganismos o que é
conseguido por
• matando microrganismos relevantes
• reduzindo / inibindo multiplicação microbiana
• promovendo o crescimento dos microrganismos desejáveis
(sem prejuízo da segurança ou qualidade)

É indispensável conhecer os modos de acção dos diferentes


parâmetros e suas interacções para:
- gerir o desenvolvimento dos microrganismos
- prever as consequências do seu desenvolvimento
- interpretar as observações feitas sobre um alimento alterado.

Nos produtos alimentares, as condições físico-químicas actuando


sobre as reacções enzimáticas vão influenciar o metabolismo e
multiplicação celulares dos microrganismos, o que se traduz por
modificações:
- da duração da fase de latência
- da extensão da fase exponencial
- da duração e do nível da fase estacionária antes da lise
celular.

Todos os alimentos contêm populações micorbianas mistas. A taxa de


crescimento de cada organismo depende de vários factores que
condicionarão qual o grupo ou grupos de microrganismos contaminantes.

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O desenvolvimento microbiano é, pois, afectado pela natureza da fonte


de carbono e de energia do meio, pela presença de água, minerais, factores
de crescimento, anti-oxidantes, ácidos orgânicos ou substâncias de
actividade determinada. A composição do meio/produto está, portanto, em
relação directa com certos parâmetros como pH, aw, potencial de oxido-
redução, teor em nutrientes, constituintes anti-microbianos / estruturas
biológicas - são os factores intrínsecos.
Por outro lado, o desenvolvimento microbiano é igualmente afectado
por outros parâmetros que fazem parte do ambiente do alimento como a
composição gasosa, a temperatura, a humidade relativa ou a presença de
certos inibidores de origem exógena - são os factores extrínsecos.
Há, ainda, a considerar os factores tecnológicos que intervêm durante
o processamento / manufactura do alimento
• tratamentos físicos
• adição de químicos ou conservantes
• alterações de pH devido à manipulação
• contaminações ambientais
bem como os factores implícitos dependentes do desenvolvimento da
microflora e que podem ter actividade sinergística ou antagonista (produtos
alterados poderão favorecer o desenvolvimento de outros tipos de
microganismos).
É conhecendo o modo de actuação destes parâmetros sobre os
microrganismos que se pode condicionar a evolução destes no alimento,
escolhendo o método de tratamento tecnológico mais adequado para o fim
em vista, e que geralmente tem em conta um ou vários destes parâmetros,
com a finalidade de permitir uma melhor conservação do produto alimentar.
A estabilidade e segurança microbiológicas dependem, pois, da
combinação dos efeitos destes 4 grupos de factores. Estes são,
deliberadamente, manipulados, por forma a obter a melhor conservação dos
alimentos.
Embora, nesta exposição se vá tratar de cada um dos factores
isoladamente e da sua actuação individualizada sobre os microrganismos,
geralmente é preciso ter em conta actuações conjuntas e indissociáveis. É,
no entanto, impossível interpretar estes complexos tipos de actuação, sem
primeiro esquematizar como cada parâmetro, intrínseco ou extrínseco,
interfere por si só sobre o desenvolvimento ou sobrevivência da flora
microbiana.

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2 - PARÂMETROS INTRÍNSECOS

Os alimentos são uma matriz quimicamente complexa e prever quando


e a que velocidade os microrganismos se vão desenvolver num dado
alimento é uma questão difícil. A maioria dos alimentos contêm os nutrientes
necessários ao desenvolvimento microbiano. Vários outros factores
estimulam, inibem ou limitam o crescimento dos microrganismos nos
alimentos.
Destes factores que são inerentes aos tecidos animais e vegetais,
destacam--se pela sua importância na Microbiologia e Tecnologia
Alimentares os seguintes: pH, Humidade e aw, Potencial de oxido-redução,

Nutrientes, Substâncias inibidoras, Estruturas biológicas.

2.1 - pH

2.1.1 - Definição

É o logaritmo do inverso da concentração em iões hidrogénio duma


solução.
Dá uma indicação da actividade destes iões sobre os constituintes do
meio. Tem influência nas reacções químicas e bioquímicas e, por
consequência, sobre os microrganismos.

2.1.2 - Comportamento dos microrganismos a diferentes pH

A gama de valores de pH em que ocorre desenvolvimento de um


microrganismo é definida por um valor mínimo e por um valor máximo. Existe
um valor óptimo para cada microrganismo no qual o crescimento é óptimo.
Quando nos deslocamos do pH óptimo para qualquer das direcções, há uma
diminuição da taxa de crescimento microbiano.

Através de numerosos estudos, foi já possível determinar que a


maioria das bactérias se desenvolve melhor em substratos cujo pH varia
entre 4,5 e 9,0 com um óptimo a 6,5 - 7,5. Existem algumas, raras, que se
desenvolvem a pH<4,0 - é o caso de bactérias acéticas ou lácticas que
suportam pH inferiores a 3,5.

QUADRO I

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Valores de pH, limites e óptimos, de crescimento de alguns microrganismos


(seg. Jay, 1986)

Microrganismo pH mínimo pH óptimo pH máximo


Escherichia coli 4,3 6,0-8,0 9,0
Salmonella typhi 4,0-4,5 6,5-7,2 8,0-9,6
Staphylococcus 4,2 6,8-7,5 9,3
Clostridium 5,5 6,0-7,6 8,5
perfringens 5,6 6,6-7,0 8,0
Pseudomonas
Bactérias 4,0 5,4-6,3 9,2
acéticas 3,3 5,5-6,5 10,5
lácticas 1,5-3,5 4,5-6,8 8,0-11,0
Bolores 1,5-3,5 4,0-6,5 8,0-8,5
Leveduras

A maior parte dos Bolores são ácido-resistentes situando-se o seu


óptimo entre 4 e 6, com valores extremos de 2 a 9 para as Leveduras e de 2
a 11 para os Bolores.
As Bactérias, em especial as patogénicas, são geralmente mais
exigentes quanto ao pH dos substratos em que se desenvolvem do que os
Bolores e as Leveduras. Entre as patogénicas, Vibrio e Clostridium são mais
sensíveis às variações de pH que a maior parte das bactérias, enquanto E.
coli, Salmonella e Staphylococcus são mais resistentes.
Os valores apresentados no Quadro I não devem ser tomados
rigidamente pois sabe-se que estão relacionados com outros parâmetros de
crescimento.Para além disso, estirpes duma mesma espécie apresentam
disparidades importantes na adaptabilidade às variações de pH. Estudos
efectuados evidenciaram mesmo uma influência da natureza do ácido sobre
a toxicidade nos microrganismos: o acetato é mais tóxico que o lactato que,
por sua vez, é mais que o citrato.
Como se pode ver no Quadro II, a maior parte dos frutos tem um pH
inferior a 3,5 o que está bastante abaixo do desejável para a maior parte das
Bactérias responsáveis por alterações dos Alimentos e para a totalidade das
patogénicas. Por isso se observa que, em geral, as alterações destes
produtos são devidas a Bolores e Leveduras que conseguem desenvolver-se
nestes baixos valores de pH. Também no Quadro II se pode ver que muitos
vegetais e a quase totalidade dos restantes produtos têm pHs finais da

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ordem dos 5,0 ou mais. Este facto torna todos estes alimentos aptos a
sofrerem alterações provocadas por uma gama muito variada de
microrganismos - Bactérias, Bolores e Leveduras - além de que constituem
um substrato onde a proliferação de bactérias patogénicas é possível, sendo,
pois, susceptíveis de causar problemas à saúde do consumidor.

2.1.3 - Modo de acção

A acção do pH dobre o crescimento dos microrganismos situa-se a 3


níveis: o meio, a permeabilidade membranar e actividade metabólica.

A disponibilidade de certos nutrientes no meio é modificada pelo


equilíbrio iónico. É o caso dos iões metálicos. A pH ácidos os iões Mg
formam complexos insolúveis. A pH básicos são o Zn, o Ca e os iões férricos
que são complexados. Sob esta forma, estes iões indispensáveis como
cofactores de enzimas são dificilmente utilizáveis. Esta propriedade é
aplicada para carenciar Aspergillus niger em Mg: baixa-se o pH a 3,0 no
início da fermentação, afim de se induzir a produção de ácido cítrico,
alterando o metabolismo.

A permeabilidade membranar é igualmente afectada pelas variações


das concentrações dos iões H+ e OH-. Em meio ácido as permeases
catiónicas são saturadas em iões H+ o que limita ou anula o transporte de
catiões indispensáveis. Em meio alcalino são os iões hidroxilo que saturam a
membrana impedindo a transferência de aniões essenciais.

As reacções enzimáticas têm um valor óptimo de pH para além do


qual a cinética enzimática é perturbada. Toda a variação do pH
citoplasmático vai diminuir a actividade enzimática e, portanto, o
crescimento.
Os ácidos fracos têm, relativamente aos ácidos fortes, uma influência
sobre o desenvolvimento dos microrganismos, ligada às suas propriedades
de dissociação em função do pH e à fraca permeabilidade da membrana aos
iões. Os ácidos nitroso e acético , por exemplo, têm em meio ácido uma
fracção não dissociada fraca mas não negligenciável, enquanto são
totalmente ionizados a pH neutro ou alcalino.
É a fracção não ionizada que é activa, a qual representa apenas uma
percentagem, mas que vai penetrar na célula e libertar os iões em função do
pH citoplasmático próximo da neutralidade.

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Estes ácidos fracos são utilizados como conservantes dos alimentos e


são eficazes em pequenas doses em meio levemente ácido. Utilizam-se
preferencialmente em produtos fermentados, charcuteria, sumos de frutos,
etc.

2.1.4 - pH dos alimentos

A importância do pH nas alterações de origem microbiana é tão


grande que o estudo da sensibilidade da flora contaminante a pequenas
alterações dos valores de pH tem preocupado de há muito os
Microbiologistas Alimentares.
O pH dos alimentos depende da quantidade de substâncias ácidas ou
básicas presentes, do efeito tampão do produto, o qual está relacionado com
o seu teor proteico. Alterações no valor do pH dos alimentos pode reflectir a
ocorrência de actividade microbiana e em alimentos fracamente tamponados
(ex. vegetais) podem-se observar variações consideráveis. No caso dos
animais podem haver variações significatias do pH do músculo, conforme o
estado de fadiga/stress do animal.
Um exemplo deste facto são os numerosos trabalhos feitos sobre a
variação das alterações das carnes de animais relacionadas com as
condições em que se processou o abate. O pH do músculo é próximo da
neutralidade. Após a morte do animal há sempre uma rápida descida do pH,
motivada pela transformação do glicogénio em ácido láctico. A paragem da
circulação sanguínea e o consumo do O2 residual estimulam a fermentação

láctica do glicogénio por enzimas endógenas. Mas tendo por exemplo uma
carne de vaca, que à partida tem um pH de cerca de 7,4, este atinge 5,6 no
caso do animal ter tido um repouso correcto, enquanto que se o animal se
encontrava fatigado na altura do abate o pH não desce abaixo de 6,2. Esta
diferença de 0,6 no valor do pH é suficiente para alterar completamente as
características de conservação da carne, devido a permitir a proliferação de
uma flora muito mais variada.
Por outro lado, a capacidade do produto alimentar se autoproteger das
alterações do seu pH varia com a sua composição química. Quanto mais rico
em proteínas for o alimento tanto maior é essa capacidade de
"Tamponamento" e, portanto, maior a sua possibilidade de se defender das
quebras do pH por proliferação microbiana.

No Quadro II apresenta-se o pH de alguns alimentos.

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QUADRO II
Valores aproximados do pH de alguns alimentos (segundo Jay, 1986)

Produto pH

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LEGUMES

Feijões 4,6-6,5

Couves 5,4-6,3

Cenouras 4,9-6,0

Milho 7,3

Alface 6,0

Azeitonas 3,6-3,8

Cebolas 5,3-5,8

Batatas 5,3-5,6

Espinafres 5,5-6,0

Tomates 4,2-4,9

FRUTOS

Maçãs 2,9-3,3

Bananas 4,5-4,7

Figos 4,6

Melões 6,3-6,7

Laranjas (sumo) 3,6-4,3

Uvas 3,4-4,5

Limões 2,2-2,4

CARNE

Vaca 5,3-6,2

Porco 5,3-6,4

Vitela 6,0

Frango 5,8-6,4

PESCADO

Peixes 6,5-6,8

Ameijoas

Camarões 6,5

LACTICÍNIOS 6,8-7,0

Manteiga

Soro 6,1-6,4

Leite 4,5

Natas 6,3-6,5

6,5

Pode pensar-se que a acidez dos frutos represente uma defesa natural
contra a sua destruição pelos microrganismos, já que o seu baixo teor em
proteínas lhes impede de se protegerem pelo método do "Tamponamento" e
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a sua riqueza em hidratos de carbono os designa como substrato de eleição


dos microrganismos fermentadores. De facto, este tipo de alimentos são
alterados sobretudo por bolores. As leveduras que se encontram na
superfície dos tegumentos desenvolvem-se nos sumos após ruptura das
paredes ceulares.
Há que ter em conta os casos em que o pH de um alimento não
favorece o desenvolvimento bacteriano, mas como resultado do metabolismo
de outros microrganismos (Bolores e leveduras) pode haver alteração do
valor de pH que permite o desenvolvimento bacteriano.
Há ainda a considerar os alimentos cujo baixo pH é devido, não às
suas características próprias mas à acção de microrganismos. Estes,
actuando sobre substratos altamente degradáveis, fermentam-nos sem os
inutilizar, tornando-os, até, mais ricos do ponto de vista nutricional, e
aumentando-lhes significativamente a estabilidade. Estes casos com acidez
dita biológica, e dos quais são exemplos destacáveis os leites fermentados,
representam um modo natural de preservar alimentos perecíveis por
abaixamento do pH.

2.2 - Humidade e aw

2.2.1 - Definição

Um dos métodos mais antigos utilizados pelo Homem para a


conservação dos alimentos foi a desidratação. Este método foi baseado
empíricamente na impossibilidade de multiplicação microbiana na ausência
de água.
Mais recentemente, vários investigadores entre os quais se pode
destacar Scott, demonstraram que as exigências em água dos
microrganismos devem ser definidas em termos de água livre (aw - activity
of water) ou Actividade da Água e não de Humidade no sentido clássico do
termo.
As moléculas de água estão, no estado líquido puro, livremente
orientadas e podem-se rearranjar facilmente. Quando outras substâncias
(solutos) são adicionadas à água, as moléculas de água orientam-se na
superfície do soluto e as propriedades da solução alteram-se drasticamente.
A célula microbiana deve competir com as moléculas de soluto pelas
moléculas de água disponíveis.

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Dum modo geral, as bactérias são competidores fracos (excepto


Staphylococcus aureus) e os bolores são excelentes competidores.

A água é utilizada para o crescimento dos microrganismos de 2


maneiras diferentes:
- como solvente dos nutrientes, o que permite o seu transporte
e a sua disponibilidade no citoplasma.
- como agente químico de reacções de hidrólise necessárias às
sínteses microbianas e às reacções energéticas.

A aw indica a disponibilidade em água do meio para reacções

químicas, bioquímicas, para uma alteração de estado ou para uma


transferência através de uma membrana semi-permeável.

Este parâmetro aw é definido pela relação existente entre a pressão

de vapor de água do substrato em estudo e a pressão de vapor da água pura,


à mesma temperatura.

p
a w = ___
po

Sendo: p - valor da pressão da solução


po - valor da pressão do solvente (em geral água)

A aw varia entre 0 e 1.
Para o caso da água destilada:

aw = 1

Para a maior parte dos alimentos frescos:

aw = 0,99

Quadro III

Valores mínimos de aw necessários para o crescimento de grupos de


microrganismos importantes em Microbiologia Alimentar (segundo Jay, 1986)

Microrganismo aw mínimo

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Bactérias de 0,91
deterioração 0,88
Leveduras de 0,80
deterioração 0,75
Bolores de deterioração 0,65
Bactérias halófilas 0,60
Bolores xerófilos
Leveduras osmófilas

2.2.2 - Comportamento dos microrganismos

Como se pode observar no Quadro III, a maior parte das Bactérias


responsáveis por alterações pejorativas dos alimentos não crescem com a w
<0,91 enquanto que os Bolores se desenvolvem com aw = 0,80. Quanto às

Bactérias responsáveis por toxi-infecções alimentares, uma das menos


exigentes quanto a este parâmetros é Staphylococcus aureus que se
desenvolve em substratos cujo aw ≥ 0,86.
Os Bolores e Leveduras crescem numa gama de valores de aw

bastante extensa, tal como já foi referido para o pH, podendo observar-se
crescimento quanto aw = 0,60.
As estirpes que resistem a valores de aw extremamente baixos são

designados "xerofílicos" (o que significa que gostam da secura) sendo este


termo aplicado em geral aos Bolores, enquanto que entre as Bactérias se
distinguem as halófilas (que gostam de sal) e entre as Leveduras as
osmófilas (que preferem altas pressões osmóticas).
Nos produtos alimentares de baixa aw (0,61 a 0,85) observam-se,

frequentemente, alterações devidas a bolores já que nestes valores as


bactérias se revelam pouco competitivas.
As leveduras osmófilas e os bolores xerófilos desenvolvem-se,
preferencialmente, nos valores mais baixos desta gama. Verifica-se, no
entanto, que a formação de esporos fúngicos e a produção de micotoxinas
exigem uma aw mais elevada que a necessária para o crescimento ou

germinação dentro da mesma espécie.

Qualquer diminuição do valor da aw afecta a taxa de crescimento

bacteriano: a maior parte das espécies bacterianas tem uma taxa óptima
entre 0,990-0,995. Para valores mais baixos o crescimento é retardado:

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- Staphylococcus aureus sofre uma redução de 10% do seu


máximo para uma aw de 0,90.

A natureza do soluto influencia os valores de aw requeridos pelas


bactérias: para o mesmo valor de aw, Clostridium perfringens suporta melhor

o glicerol que a glucose ou o Na Cl.

Há vários métodos para conseguir o abaixamento do valor do a w,

conseguindo deste modo diminuir a deterioração dos Alimentos:

• Aumentando a concentração das soluções, obriga-se a água livre a


combinar-se quimicamente com os solutos, evitando-se, assim, que
esteja disponível para os microrganismos. É o caso das salgas ou
das edulcorações.

• Aumentando a concentração em gelificantes.

• Congelando os alimentos, combina-se a acção inibidora da


temperatura com a solidificação dos cristais de água, que por esse
facto deixa de estar disponível.

• Desidratando o alimento, o que consegue reduzir drasticamente a


água livre, melhorando sensivelmente a capacidade de
conservação. O caso mais exemplar é o do leite.

• Liofilisando o alimento, o que consiste em congelar a temperatura


muito baixa, após o que se faz uma sublimação no vácuo.

2.2.3 - Mecanismo de acção

A diminuição da aw provoca um fenómeno de plasmólise da célula.

Este fenómeno diminui ou pára o crescimento dos microrganismos por


inibição da actividade enzimática
A fig. 1 resume o mecanismo de adaptação a uma diminuição da aw.

Fig.1 - Mecanismo de adaptação metabólica às diminuições da a w do meio (seg.

Sperber, 1983)

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Quando a aw passa de 0,995 a 0,950 observa-se um aumento da

concentração de potássio citoplasmático. Este vai activar a enzima


glutamato-desidrogenase que transforma o -cetoglutarato em glutamato,
que se acumula e permite o retorno à turgescência.
Alguns microrganismos podem em seguida, adaptar-se a a w inferiores

a 0,950, descarboxilando o glutamato em ácido  amino-butírico ou


reduzindo-o a prolina.

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2.2.4 - Aw dos alimentos e desenvolvimento microbiano

O quadro 4 apresenta os valores médios de aw dos principais produtos

frescos.
Quadro IV
Valores aproximados de alguns produtos alimentares (seg.Chirife, 1982)

Produtos alimentares Aw

Vaca 0,990-0,980

Porco 0,990

Peixe 0,994-0,990

Charcuteria 0,950-0,850

Leite 0,995

Cenouras 0,989-0,983

Cogumelos 0,995-0,989

Batatas 0,985

Tomates 0,991

Maçãs 0,980

Cerejas 0,977

Uvas 0,986-0,963

Limões 0,984

Melão 0,991-0,988

Laranjas 0,988

Pêssegos 0,985

Confeitaria 0,800-0,750

Cereais 0,700

Todos os produtos são favoráveis ao desenvolvimento bacteriano,


excepto os frutos que têm, preferencialmente, uma flora fúngica ligada aos
baixos valores de pH e a uma aw mais baixa que nos outros produtos

frescos, devido ao teor em açúcares livres.


O valor da aw pode afectar drasticamente a capacidade da
temperatura (tratamento térmico) afectar uma bactéria. Por exemplo, uma
população de Salmonella typhimurium sofre uma redução de 10 X após um

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tratamento a 60°C durante 0,18 minutos se a aw do meio fôr 0,995. Se a aw


baixar para um valor de 0,94 serão necessários 4,3 minutos, à mesma
temperatura de 60°C, para causar a mesma diminuição na população
microbiana.
Está demonstrada a relação entre a w, temperatura e nutrientes.

Assim:

• A capacidade de desenvolvimento dos microrganismos é diminuída,


seja qual for a temperatura, quando se reduz o aw;

• A gama de aw que permite o desenvolvimento de uma determinada

estirpe é máxima à temperatura óptima de crescimento;

• A presença de nutrientes aumenta a gama de aw na qual o

desenvolvimento é possível.
O valor mínimo de aw para um microrganismo é, geralmente, o valor
mínimo no qual ocorre crescimento. No aw mínimo, o crescimento será
mínimo, aumentando com a aw. Para valores abaixo do valor mínimo, a
bactéria não morre necessariamente, embora alguma % da população possa
morrer. O microrganismo pode-se manter dormente mas infeccioso.
Mais importante, é que a aw é apenas um factor e os outros (pH,
temperatura, etc.) deverão, também, ser considerados. É a interrelação dos
diferentes factores que determina se um dado microrganismo se
desenvolverá ou não.
A aw de um alimento não é um valor fixo. Pode variar com o tempo e
pode variar consideravelmente entre alimentos semelhantes de diferentes
origens.

2.3 - Potencial de Oxi-redução (ou Potencial Redox)

2.3.1 - Definição

Já há vários anos que foi verificada a incapacidade de adaptação de


certos microrganismos a diferenças do potencial de oxi-redução dos meios
de cultura.
O potencial de oxi-redução (potencial O/R) de um substrato pode ser
definido como a capacidade desse substrato para perder ou ganhar
electrões.

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A oxidação de um elemento ou composto corresponde à perda de


electrões ou à adição de oxigénio. A redução de um elemento ou composto
corresponde ao ganho de electrões.
Portanto, as substâncias que cedem electrões com facilidade são
designadas como agentes redutores, enquanto que aquelas que facilmente
captam os electrões são agentes oxidantes.
Quando os electrões passam de um composto A para outro composto
B, cria-se uma diferença de potencial que pode ser medida com instrumentos
apropriados, é expressa em milivolt (mv) e designada pelo símbolo Eh.
Quanto mais oxidado estiver um substrato mais positivo será o seu
potencial eléctrico.
Quando a concentração em elementos oxidantes for igual à dos
elementos redutores o potencial é zero.
O meio é caracterizado pelo seu potencial de oxido-redução mas
também por um certo efeito tampão que limita a sua variação graças a uma
reserva de substâncias dadoras ou receptoras de electrões.

2.3.2 - Comportamento dos microrganismos

Os microrganismos são classificados em função das suas exigências,


muito diferentes em O 2, e/ou da sua resistência. Tradicionalmente

distinguem-se:

• os aeróbios estritos (Pseudomonas, Microccus, Bacillus ) -


exigem O2 como aceitador final de electrões, não têm capacidade de utilizar
a via fermentativa e possuem catalase para eliminar o H 2O2.

• aeróbios facultativos (Enterobacteriaceae, Staphylococcus) -


podem-se desenvolver na presença ou ausência de O 2. Possuem cadeia

respiratória, as enzimas necessárias à fermentação e são catalase positiva.


Por vezes, nota-se que em anaerobiose há exigências suplementares em
factores de crescimento (leveduras).

• anaeróbios estritos (Clostridium, Propinibacterium, etc.) e os


micro-aerófilos - têm um metabolismo fermentativo obrigatório. São catalase
negativa e inactivados pela presença de O 2, de forma variável, em função da

pressão parcial deste gás.

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Os aeróbios exigem valores de Eh positivos enquanto que os


anaeróbios exigem valores negativos. Há nos alimentos substâncias que
ajudam a manter o Eh negativo, e que são por exemplo: os grupos SH nas
carnes e o ácido ascórbico e os açúcares redutores nos frutos e legumes.

De acordo com Frazier o potencial O/R de um alimento é determinado


por:

• Potencial O/R característico do alimento.


• Capacidade de equílibrio
• Tensão em oxigénio da atmosfera que rodeia o alimento.
• Capacidade de penetração da atmosfera no interior do
alimento.

O Eh dos alimentos varia muito, de acordo com a sua origem. Assim os


de origem vegetal, e em especial os sumos, têm valores de Eh entre +300 e
+400 mv, o que explica a frequência com que são alteradas por bactérias e
bolores aeróbios. Por outro lado as carnes "em peça" têm Eh da ordem dos
-200 mv, as carnes picadas rondam os 200 mv, os queijos oscilam entre - 20
e - 200 mv, e estes valores tem grande relevância para entender e prevenir
as degradações mais prováveis de todos estes produtos.

2.4 - Nutrientes

Para que os microrganismos se desenvolvam normalmente nos


alimentos, é necessário que tenham à sua disposição diversos factores:

• Água
• Fontes de energia (pelo menos uma)
• Fontes de azoto (pelo menos uma)
• Sais minerais
• e eventualmente O2 e/ou factores de crescimento como as

vitaminas.

Os microrganismos encontrados nos alimentos são


quimiorganotróficos e utilizam preferencialmente o C como fonte de energia.
Os prototróficos podem-se desenvolver a partir de uma fonte de N mineral e

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de um hidrato de carbono - é o caso de certas estirpes selvagens de E. coli,


B. subtilis ou de certas Pseudomonas.
Os auxotróficos (Lactobacillus, Streptococcus ) exigem um ou mais
aminoácidos bem como factores de crescimento eventuais, tais como
vitaminas ou bases azotadas.

As exigências dos microrganismos em água foram já tratadas em 2.1,


quanto aos outros nutrientes podemos dizer que os Bolores são os menos
exigentes seguindo-se por ordem crescente de exigências as Leveduras, as
Bactérias Gram - e as Bactérias Gram +.
Como fontes de energia os microrganismos dos alimentos utilizam
açúcares, alcoois, peptideos, aminoácidos, ácidos orgânicos e os seus sais,
havendo algumas raras estirpes que são capazes de utilizar amidos e
celulose, degradando-os em açúcares simples, enquanto outras estirpes,
também raras, atacam as gorduras utilizando-as como fonte energética. Os
microrganismos diferem significativamente entre si quanto à capacidade de
utilizarem até os açúcares mais simples. Assim muitos deles não são
capazes de utilizar a lactose não podendo, portanto, desenvolver-se no leite.
Certas Leveduras não conseguem atacar a maltose. Esta variedade de
actuação é utilizada para classificação das Bactérias. No entanto, mesmo
aqueles microrganismos que praticamente não utilizam açúcares, são
capazes de utilizar a glucose.
As principais fontes de azoto dos microrganismos heterotróficos são
os aminoácidos, embora algumas estirpes sejam capazes de utilizar
moléculas mais complexas como peptidos e proteínas de alto peso
molecular, enquanto outras como certas Pseudomonas podem satisfazer as
suas exigências em azoto através da utilização de amoníaco ou de nitratos.
Quanto às exigências vitamínicas, elas incidem em especial sobre o
complexo B, mas as quantidades exigidas são pequenas e a maior parte dos
alimentos são capazes de as contemplar. Além disso quase todos os
microrganismos, com excepção de algumas Bactérias Gram +, em especial
certas Bactérias lácticas, são capazes de sintetizar a maior parte destes
compostos essenciais.
Dum modo geral os produtos alimentares contêm todos os nutrientes
necessários ao desenvolvimento dos microrganismos. No entanto, as
diferenças de composição observadas têm um efeito selectivo sobre a flora
microbiana.

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2.5 - Substâncias Inibidoras

2.5.1- Definição

Certos alimentos contêm naturalmente substâncias que manifestam


um comportamento capaz de inibir ou mesmo destruir os microrganismos.
Ex: A lactenina é o factor anticoliforme dos leites crús, a lisozima da clara do
ovo.
Por outro lado, o desenvolvimento de certos microrganismos num
alimento produz determinadas substâncias que podem ser inbidoras para
outros microrganismos.
Ex: As Propionibactérias do queijo produzem ácido propiónico que inibe os
Bolores; certas estirpes de Streptococcus lactis produzem nisina que pode
inibir o Clostridium butyricum , indesejável em certos tipos de queijo.
Em oposição a estes factos há a capacidade revelada por certos
microrganismos de destruirem alguns compostos inibidores existentes nos
alimentos.
Ex: Certos Bolores e Bactérias degradam os compostos fenólicos e o ácido
benzóico, que são adicionados aos alimentos; certas Leveduras destroem o
dióxido de enxofre; os Lactobacilli inactivam a nisina.
Existe uma gama muito variada de substâncias inibidoras, de
composição química e de modos de acção heterogéneos. Encontram-se no
estado natural dos tecidos animais e vegetais. Quando adicionadas
artificialmente pelo homem para a conservação dos alimentos são
designados por aditivos.

2.5.2 - Comportamento dos microrganismos

Conforme já se disse certos alimentos contêm naturalmente


substâncias anti-microbianas - é o caso da lisozima nos ovos e no leite, ou
dos óleos essenciais contidos nas especiarias ou do gossipol, antioxidante
presenta no algodão.
A lisozima tem uma actividade específicamente anti-bacteriana pois
hidrolisa a parede celular. Os óleos essenciais e o gossipol têm um espectro
mais largo sendo igualmente anti-fúngicos.

Afim de estabilizar os alimentos adiciona-se, por vezes, subtâncias que


impedem a proliferação microbiana.
Dum modo geral, as bactérias Gram+ são sensíveis específicamente a
numerosas moléculas tais como os citratos, as nisinas, os butilidroxianisol

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Factores que condicionam a actividade microbiana

ou butilidroxitolueno, bem com moléculas mais conhecidas pela sua acção


anti-fúngica como os sorbatos ou os benzoatos.
As Gram- são mais resistentes que as Gram+, mas são menos
sensíveis aos aditivos de largo espectro citados, aos quais é conveniente
adicionar SO2.

De referir, ainda, os ácidos láctico e acético, produtos de


fermentações ou utilizados como aditivos de larga actividade anti-bacteriana
e o ácido propiónico e a pimaricina que são utilizados mais como anti-
fúngicos.
Os conservantes adicionados aos alimentos são, na maior parte das
vezes, ácidos fracos, antisépticos, anti-oxidantes, antibióticos, depressores
da aw e substâncias de actividade mista.

2.6 - Estruturas Biológicas

As características das estruturas de protecção física de determinados


alimentos constituem óptimos factores impeditivos da entrada da microflora
contaminante e aumentam significativamente a sua conservação. É o caso
do tegumento das sementes, da casca dos frutos, das conchas dos mariscos,
da casca dos ovos, da pele dos animais.
A sua eficácia diminui após a recolha ou abate quer naturalmente por
decomposição microbiana, quer porque o "envelope" protector é eliminado
ou danificado.
A estrutura interna, organizada em células separadas por membrana e
tecido conjuntivo nos animais ou por paredes celulósicas nos vegetais,
limita a propagação e portanto a proliferação dos microrganismos na massa
do produto. Produtos tais como o leite, que não têm esta organização
compartimentada, serão muito mais vulneráveis.
No decorrer dos tratamentos tecnológicos (pelagem, corte,
prensagem, etc.) suprimem-se estas estruturas, homogeneiza-se o alimento e
favorece-se o desenvolvimento dos microrganismos.

Em resumo, o conjunto destes parâmetros intrínsecos constitui um


modo natural de preservar os tecidos animais e vegetais da degradação
microbiana.
Conhecendo os parâmetros mais importantes em cada alimento pode
prever-se quais os microrganimos com maior probabilidade de o alterar e
pode-se agir de forma orientada.

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3 - PARÂMETROS EXTRÍNSECOS

Os parâmetros extrínsecos dos alimentos são as características do


ambiente, em especial de armazenamento, que afectam tanto o alimento
como a sua microflora e pela sua importância destacam-se: Temperatura,
Humidade, Presença e Concentração de Gases.

3.1 - Temperatura

É um dos factores mais importantes no desenvolvimento dos


microrganismos e que tem tido, ao longo do tempo, uma aplicação quase
generalizada na conservação de produtos frescos e congelados.

3.1.1- Comportamento dos microrganismos

A maior parte dos microrganismos desenvolve-se a temperaturas


médias superiores ou iguais a 20°C. Geralmente, aceita-se que as células
microbianas podem crescer a temperaturas entre -18°C e 90°C. Nestes
valores extremos o crescimento é limitado mas a actividade metabólica pode
ser significativa.
Distingue-se o efeito da temperatura sobre o crescimento das células
microbianas do efeito da temperatura na sua sobrevivência.

3.1.1.1 - Efeito da temperatura no crescimento

Tal como no caso do pH existe uma gama de temperaturas para o


crescimento microbiano, com um valor óptimo, um mínimo e um máximo. A
taxa de crescimento nos valores extremos e a temperatura óptima de
crescimento determinam a classificação do microrganismo, relativamente à
temperatura.

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De acordo com as temperaturas de crescimento é habitual


caracterizar-se três grupos fundamentais de microrganismos:

• Psicrófilos e psicrotróficos
Os psicrófilos são microrganismos verdadeiramente adaptados ao frio.
Encontram-se pouco em meio alimentar, mais vulgarmente nas regiões
polares.
Desenvolvem-se a 0°C e têm o óptimo entre 15° e 20°C.
Os psicrotróficos, mais conhecidos, são capazes de se adaptar e de se
desenvolver a temperaturas próximas de 0°C mas têm o óptimo a 25°-35°C, o
que os aproxima dos mesófilos. São caracterizados por um metabolismo
lento e são pouco competitivos com os outro alimentos quando a
temperatura aumenta.(Fig. 2).
Os psicrotróficos são os microrganismos dominantes nos produtos
refrigerados, carnes, peixes, leite, legumes etc. São exemplo bactérias dos
géneros Pseudomonas, Alcaligenes, Erwinia, Corynebacterium,
Flavobacterium, Lactobacillus ou Streptomyces, bem como bolores e
leveduras.
A sua velocidade de crescimento lento permite-lhes invadir os
produtos alimentares em 1 a 3 semanas, com um tempo de geração de cerca
de 24h a 0°C.
O seu metabolismo mantem-se muito activo a estas temperaturas,
particularmente na produção de enzimas hidrolíticas (lipases e proteases), o
que coloca problemas tecnológicos (leite e derivados) e organolépticos
(rancidez, aromas e sabores desagradáveis).
Raramente são patogénicas.

• Mésofilos
Multiplicam-se a temperaturas entre 20° e 45 °C com o óptimo a 37°C.
A sua taxa de crescimento é elevada e a duração da multiplicação
relativamente curta. O seu comportamento é comparável ao dos
psicrotóficos (Fig.3).
Encontram-se nos alimentos conservados à temperatura ambiente ou
nos alimentos refrigerados quando a cadeia de frio é interrompida.

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Os principais géneros e espécies bacterianos são mesófilos. São


também incluídas as espécies patogénicas, para o homem e para os animais,
e são, na maior parte, saprófitas naturais.

Fig.2 - Comparação do crescimento de diferentes microrganismos


a. Termófilos (B. stearothermophilus a 55°C)
b. Mesófilos (E. coli a 37°C)
c. Psicrotróficos (Yersinia enterocolitica a 4°C)

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• Termófilos
São capazes de crescimento a altas temperaturas, de 45° a 80°C, com
um óptimo a 55°C.
Caracterizam-se por uma taxa de crescimento muito elevada mas com
uma duração de crescimento curta , conforme se pode observar na Fig.3.
Os termófilos encontram-se na água, ar, solo. São representados
sobretudo pelos géneros bacterianos Bacillus e Clostridium e pelos bolores
Aspergillus, Thamnidium, etc.
Entre os termófilos distinguem-se os termotróficos, que são mesófilos
susceptíveis de se desenvolver a temperaturas elevadas. É o caso das
bactérias lácticas.

3.1.1.2 - Resistência dos microrganismos à temperatura

Quando se pensa no efeito da temperatura na resistência dos


microrganismos pensa-se, geralmente, nos valores elevados que os
microrganismos podem suportar. Os esporos bacterianos são dos mais
resistentes bem como alguns de bolores que suportam tratamentos de
várias horas a temperaturas superiores a 100°C.
A característica de termotolerância pode ser adquirida quer por
mutação quer por adaptação das células a temperaturas elevadas por
"patamares" sucessivos.
No que diz respeito à resistência das células a baixas temperaturas,
de notar que a maior parte dos microrganismos resiste melhor a um
tratamento de congelação se este fôr efectuado num curto espaço de tempo.
Isto está relacionado com a formação de microcristais intracelulares que
alteram muito menos as células que os cristais que se formam durante a
congelação lenta.
Qualquer que seja o modo de congelação, traduz-se por deformações,
lesões, destruição das estruturas celulares e uma maior ou menor
mortalidade das células. Em geral, as bactérias Gram+ são mais resistentes
que as Gram-. A sobrevivência das células é aumentada se o tratamento fôr
aplicado a células em fase estacionária.
Para finalizar, de salientar a importância das condições de
descogelação: E. coli apresenta uma melhor taxa de sobrevivência se a
descongelação se fizer durante 1h a 18°C do que durante 18h a 4°C.

3.1.2- Modo de acção


Cristina Aleixo de Távora 25
Factores que condicionam a actividade microbiana

A temperatura determina o estado físico da água no meio e, portanto,


a sua disponibilidade para o crescimento dos microrganismos. Tanto a
congelação como a ebulição diminuem a fracção líquida e provocam
alterações a nível celular.
A temperatura actua sobre a velocidade das reacções químicas e
bioquímicas. Nos sistemas vivos, muito complexos, o efeito global duma
variação de temperatura traduz-se por uma modificação da taxa de
crescimento e do tempo de geração. Tem, também, uma acção diferencial
sobre as vias metabólicas e provoca alterações no tamanho celular,
secreção de toxinas, pigmentos, polissacáridos, etc.
Estudos in vitro de cinética enzimática mostram poucas ou nenhumas
diferenças na velocidade das reacções de oxidação dos açúcares entre
psicrófilos e mesófilos. Relativamente aos termófilos numerosos trabalhos
referenciam a termostabilidade das suas enzimas. Também as proteínas
membranares, ribossomas e flagelos são mais termostáveis nos termófilos.
Por oposição, certas proteínas de psicrófilos são mais termolábeis que as
dos outros dois grupos e são inactivadas na gama dos 30°-35°C.
A diferença de termosensibilidade de certos elementos celulares não
permite explicar o conjunto dos comportamentos dos microrganismos
relativamente às temperaturas e suas variações. A continuidade dos
fenómenos de crescimento exige o funcionamento do metabolismo, a
permanência das transferências membranares e, portanto, a funcionalidade e
a integralidade da membrana citoplasmática.
Este domínio tem sido largamente estudado e verificam-se diferenças
significativas no comprimento médio das cadeias de ácido gordos dos
lípidos membranares, bem como alterações do comprimento da cadeia em
resposta às alterações da temperatura. Nos psicrófilos, os ácidos gordos dos
lípidos membranares contêm uma forte proporção de insaturados,
assegurando um ponto de solidificação baixo, o que permite a continuação
das transferências membranares mesmo a baixa temperatura. No entanto
apresentam, também, um ponto de fusão igualmente baixo, o que explica o
carácter termolábil da membrana. A percentagem de ácidos gordos
saturados aumenta nos mesófilos e termófilos, com as propriedades físicas
e as consequências biológicas aferentes.

O conhecimento dos parâmetros intrínsecos do alimento, bem como


da sua microflora, é essencial para uma escolha adequada das condições em
que deve processar-se o seu armazenamento, de entre as quais se destaca,
pela sua importância, a temperatura.

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3.2 - Humidade Relativa

Este parâmetro é importante quer por interferir no a w interior do

alimento quer por condicionar o desenvolvimento da microflora de


superfície.
Assim, quando se armazena um alimento com baixo valor de a w numa

atmosfera com alta Humidade Relativa (HR), verifica-se uma captação dessa
humidade pelo alimento, o que favorece a multiplicação da microflora. Por
outro lado, ao armazenar certos produtos alimentares, com alto a w em

condições de baixa HR observa-se uma desidratação da superfície do


alimento que, embora geralmente não prejudique a sua qualidade
microbiológica, se pode traduzir em perdas de outra natureza (organoléptica,
de textura, económicas).
É, pois, extremamente delicada a escolha das características de
armazenamento dos alimentos. Em geral, tem de se ter em conta o conjunto
inseparável dos dois parâmetros Temperatura e Humidade Relativa.

3.3 - Presença e Concentração de Gases

Desde 1917 que se conhecem os efeitos do armazenamento de


produtos vegetais em condições de atmosfera controlada, ou seja, em
atmosfera enriquecida em C O2 até cerca de 10%. A partir de 1928 este tipo

de armazenamento foi desenvolvido com aplicação comercial para frutos e


em especial para maçãs e peras. Foi demonstrada a capacidade inibidora
deste tipo de atmosfera em relação aos Fungos - Bolores e Leveduras -
responsáveis por degradações, mais ou menos importantes, destes produtos,
embora ainda não tenha sido totalmente esclarecida a verdadeira causa
dessa inibição. Pensa-se, no entanto, que o C O2 aumente a capacidade

natural do fruto para resistir à multiplicação fúngica.


Também se conhece a capacidade das atmosferas ricas em ozono
para conservar determinados tipos de alimentos impedindo a proliferação de
microrganismos à superfície. No entanto, como este gás é um forte agente
oxidante, tem, também, uma actuação indesejável acelerando a rancificação
das gorduras, pelo que estas atmosferas são totalmente desaconselhadas
para o armazenamento de alimentos com alto teor lipídico.
Cristina Aleixo de Távora 28
Factores que condicionam a actividade microbiana

Embora cada um dos factores mencionados tenha um papel


importante, a interrelação dos diferentes factores é que determinará como e
quando um microrganismo se desenvolverá num determinado alimento. Os
resultados desta interacção são, na maior parte das vezes, imprevisíveis,
dado que os fenómenos de sinergismo ou antagonismo que possam existir
estão ainda pouco esclarecidos

4 - CONCLUSÕES

Estivemos a descrever, individualmente, a influência de determinados


parâmetros físico-químicos no desenvolvimento microbiano. Na realidade,
estes parâmetros interagem e há que considerar, globalmente, a sua acção
associada à dos próprios microrganismos.
No decorrer do seu desenvolvimento, os microrganismos modificam a
composição e certos parâmetros do alimento (pH, Pot. O/R, aw, etc.); a sua
actividade metabólica diminui o teor de certos nutrientes e aumenta o de
compostos residuais, os quais podem actuar quer como factores de
crescimento quer como substâncias anti-microbianas. Consequentemente há
uma modificação do equilíbrio das microfloras ou da sua sucessão por
fenómenos de antagonismo ou sinergia.
O conjunto destes processos culmina ou na elaboração de produtos
fermentados ou na alteração do produto.
Entre os fenómenos de antagonismo podemos citar o caso das
bactérias lácticas relativamente à flora banal ou psicrotrófica. Os efeitos
inibidores são atribuídos à baixa do pH, à produção de H 2O2 e de

bacteriocinas.
As sinergias são igualmente frequentes. Encontra-se, por exemplo, nas
bactérias lácticas em relação com as leveduras nos fermentos ou na
estrutura complexa do kefir. É também o caso da metanização - as bactérias
metanogénicas são dependentes das acidogénicas que produzem as
moléculas de ácido fórmico e o hidrogénio de que as primeiras necessitam.
Existem igualmente numerosos exemplos de efeitos combinados de
factores físico-químicos no crescimento microbiano. Podem-se citar os
complexos sorbatos-nitritos para inibir as Salmonella, sorbatos-pirofosfatos-
Na Cl-pH aplicados para impedir Listeria monocytogenes de proliferar, bem

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Factores que condicionam a actividade microbiana

como o efeito combinado de aw, pH e temperaturas sub-óptimas na produção


de enterotoxina por Staphylococcus aureus .
Os exemplos podem-se multiplicar pois as combinações experimentais
dependem do microrganismo, do alimento e dos aditivos em presença, tendo
em conta a legislação e vigor.

Há, no entanto, que reter:

• Cada alimento é caracterizado por um conjunto de parâmetros.

• Cada alimento é, em geral, mantido em atmosferas caracterizadas


por outro conjunto de parâmetros.

• Os microrganismos apresentam exigências específicas para o seu


desenvolvimento

• O conhecimento desses dois grupos de parâmetros e dessas


exigências permite ao Microbiologista Alimentar prever, com certo
rigor, os riscos de degradação mais prováveis para cada tipo de
Produto Alimentar.

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