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,4. I '~ Inttr.odu~o

o surg ·mento at ~iI1gen:hm'ia G ~1'I!~tic:a, na deC'ad,a, de it)" foi 'U rna dloe'corr~1'fIda I1J!ft !arraiU da ~ til nde qua I1it.ud,i1l.d~ d{tc'O:L'1!nedme.1Il ~O($ qul2' ''''ii~hoi1! in. .s€! .ilI'CIll,!tlH.d;;U'iLdo na a,:rif::a d Bio~,og.~a Molecu lar, eBwol vendo pri net pa l.i.tl!i):m1r~ as billct~·.iiia,$ ,~ ::ie'IUS vlru s" Ei.Hr ,tanto, em contra ste com os d emais progre '"5<0$ v~i.i:fi(~do$ nesta aroea, a. advenjo da Engi!1!:i1I'n.a!l'iiill GeruHka teve um imp,,acto :form.i d?i v' "'I sobre a Bioteenol ogia, Hoje, 0< hQ~"i!le-ln pode Intervir diretamen ~ te sobre OS comandos d fli vida: e posslvel progmmnr gene,H,ea mente os organi smos vi V05F llI:iio a pm~<lI $; pa r a a, S IJlpClf.pJ.'()C~ iLl~a I;) de.' a gJJ.m1l melabollto, mas, .ill [OO,;l)" cl~ s'yb5tihldms q~'le ~6 . "iio normalmenre pr·odll,l::dda_$ POI[ ou ~:foOS or.g.arli s~ mos. il:"~l~ fi\1lci idade de It"ia.l.itip'ula.;;a.'o que propcrcjonam, os n icrorgamsmcs foram os prlmel [-0& a S{!·.r'{!ft'L rem'1l1pre'gados come I'WQ~~ed ei res da i:L1I,fo':r',ma~,1'I.!) ge.ll.~tiea hete;ro[,oga, Etn pri1i!cipio, qualquer prot!d'lrIil podle ii!J5si:m vi r a ser prod uzid (Ii em ferrn.el!1.ta~~:s tndustrle is. desde qu.'~ 0' ,8;(!tile- 'Q, ue a codlflea :se~fli enxertado num mlcrorga m'Li'~lno (ou, em outre s palavras, ~'!QI'!Ja!(kl) e passe a S€'Ji' 'po',It' >f!'Ue expressado. De (Ii:'Uie];;'! irnportancia e <Ii possibmdade que a nova tecnologia trouxe de amp~iHcaU' se-.q·(~endas mIlldh~ldi'!Jais de DNA: ,a" clonagem de urn dado fragme'IiI.~o de DNA permit· que, partlndo-se de <lip. '1f'I,~" uma mo~.ectl!la sil1!j~iI"II'iI pWQ,t:u2idas q'IJ,a:i:"'!;~idade5 mmitad,as desm'.O'i J'nes.m,a, mo,lecu·i;i}. De-polis qUi@: um fragmento de ON A tiver sldo asslm iSiolflido 12' .a mpnificado, s SU!ilJS :p'I['<Op'r,u~,d!~de-s. podlem set' e~:~ac~~dzaJdas eo a S,,"U1i, s-{!qu,@tl.t,~~ d]E! nucleorkleos dere 'm~i!\ada (:i;)ID p··edsio,. 0. que proporcionou um progresse "~'T~jgi1rtQ50 do conhecbnento b~5ico. Por OIl.U,I:'@ la do, a :reJ.,e-'I,~anda ]b"i oteeno I o,g I ca dleoo,;rre do tato de q ue .ill sitifreSE! de p.I"O etnas estra n~i[,a.:5 pelos mkIi:'O(l'ijflii'l!d'~Ii.'HJo$ 1e''i,1(!j a uma .impo,rt.a'['i.~ red u~ao dos (Us:OO:S· die produl1,;'a.o·, t'O'I!ll'a dta r iil'!"E!'t1i1S urn exem-

P~Qi p~!i:',m, ,prodiuzi f, peJ1!!S vias t. .. .:.iId,~~~ro,]jai81 5 ,l1l'ilg de, S;o'rJ:l1TIitos,'tilithrt(!i, um Mirmu,.. nio de vertebradcs, :saQ ]!u~cess.aiio.s 500,{O) oe.:rebroiS de camelro, Quando, se totli:seglU,mu, :POi meio da En,g,enJti!'.ri-i:! Ge-:I:iI~tiC'..iII ... ~n:x.extm,r. 0 ;gi2'ru~' da somatnstatlna na ood~ria E-5th~r.iClri~ fil~i~ 0' ,in,~m,o ,r'ellidimento, f,oi ak~]!!\~jik:i oom ,~'I'~iJln$ 7",511.;g de' ~(:l~ti.as .. 0 que se ob.'t'em de :n;-,a'lffie~'r~ !rtj,:p:1da ~ pouce dispendiosa,

Cha,m~-s~ dl2: EI'IIgel:llhi5Lr,~aJ GeJ1!.~Hk~ ao (onjiiJii'l;t,g, de '!:ecnicaJs ~l]Je tornam posstvEl ;j) ,ciL"ia~aQ d.e' novas CiDm~i~:lo1~{l;e5 ~J~iIlkSJ5., ][1je_xj5.te~J:E!S' lila, !Il~hjJ[\~~L A ruCOinl'ji,ilfbiIl.'~~o g'en.e~'~c:-a consiste ria fll):r.n'r[a~.Jo de novas c(ijrn:lib:~l1la'9oe:s '!1l5't~'I,r-ei5i de ,[;;e!1~.s" pOO'1J\~fiillm,til!B de. d:~ferel1:tes ,or,Vinh1;mos, 'pod~i'td,o'~, em, ,conSii!!q ~)@J:u:i:ll(. :su[-g~,r :rUJ'IlOS fen6Hpos. 'E.:tllt~r!ll:.:a,n:t'Q;" :n.a :ru!ih~I[\e'2:a, :til l[oewrnbiiJl~~~Q $~liiIetic<'L ~Dml?illI,t~ oeorre erU.re oeganismcs de uma mesma eS,pocie cu de e-.s.~des Iltmilo :pm~d:m:l!'me'J;l!te i!:\E!lacion2l,tlm.s. A :t;1:lg;enhar.iJ~ Ge"!iu!i~ica'r t~!'m;b~m OOi1'~C,u~iCu~~ sob 0; ,rJ.ome de Tec-no'log~,a do DNA :I!il:~omb~:n;'nllte-~ permitce' ~t'!!e' eontraeleraos ~ :r.1;;Ji~1!iI're7-~. Ii:.[} quit S!2' r.cfe~ a :reco:m'bifl~~;r), ge-netiC',iI)", Tt;!I.i!'f'liO'U,~M ~6SSi\11~,~ oon<BI:r!:.tilr novas ,es];lecies de m~~~ti~,1 gen,~'ti,CO'E atraves da iPe(iornlbin;;'l!~:'o re~l i:z~~~ al'tH,~~ eialmenje no :~:ru'bo:[at6rio entre' :r:'liloM;;;'ldas de DNA isoladas de ,org,41i1lismo(5, n~!;) -r'eia('!Q:nadU$- Hoj'@' ~m dli.ar as poosibi]idades d~ m!lltip'l,Jl~~a!) do :m,m:I:e1'~al g.e~ neti'()o em itl!.~bo die ensa ~g> (hJ vi'tiI'!IJ.I) :;fLO· p,~'aiti,c:::ull:1e:~!l't'E' mlTJ)i:~'ada5:: oo:Mi!.!:!]1!,rH,e dl.zer que a U1'li'C;iIJ l:imi,ta~iio reside ~r:1;;) Ca!Fmddacli!ll: ,il;-n~gili,laJ~i.'i.'8i do !pes(p.[~S8ldJ(ii.r,

.. _., ,

,Em 19'7~2\1" li1I,lUJfWl, exped~fi(~a Cj]l:i!!'? vj,r.I~ ,ft re\~oJ.lj,ldo.lliar toda ,1;1, p;esqt~~sa bio- 16gkoa, e' .:;~i,~,t perspecnvas i:t1lfldJH'as :p.lI'o:l .11! Biot'eicili.o1ogi,"I, lP'AI,,fn., 'BE.RG e' S.€ii.:I!S CO~ laberadnres'" de'JJ1..(irl!!iitll',at~WI!'ii Cj]u~ €!:t',iiI, ,p'0ssi''l,~e~, eortae hr. trill:'; n1Qiecul;;JJSi ,at! DNA de d.if.!2'r-e[IJ~s Qrige:n:;. e' ]ig~[" es :f~t~t!]",t1I.t6g oos,'1iltiIlJlIJ'ii!!S, entre eles, obte.lldo ,!;I_55im :mo]Jt;!(:Il]<"IiS hiibr.~~as, de DNA .. :h.lle'xj5ten.iles, na ]1ifh.l!'f~~~ .. Essa, iIi!):p~iI:',i~ileia ploneira flai real'iza.d;;i! pOii' i:r'H~rt"l'l~d'h)' diil: diversas 1:-nanm,plU.lac;3es g-.enetit'(!is e 'bihXJii,i:lD'b'l.ieas .. 'que. se ~:or.li1l.a1i',)!jm viaV'r£l'~:ii 3r~.;,j)S iiJ uma S4!ir~~ d!~ d~$C,obQ-'i!'tas, que' !QcmJ;\er~!!1'1 en'! 'r~p~!Chi, ~[i.cr}£!Si!'i.'o 1i;~OS ,5. anos 'q,llle ru'ihaceder,I:!'WL a 'e':(p'E!l'iei!'1!d~ dJePaul 8~rg, IErtl:r.etanto, niio f!;l"r~;;i! sr:;l'iftid.o gli.a,r,d.a r Qo iiJOV'O DNA no tube de ensaio, N~ vr:rd,filde'. a Eng~nha:r~.a, Ge['IJ~I'ica :p'J-eS$!UPOe' uma ,se--gil,1!li!d!;;Ji et~,p<lIi itJ' V~:VO~, qt1e 'c::o:nsiis~e na iJr1tro.O !,11~~() do ,i1'l!fi~!]",il''i..lll ~ gerl,~tieo. construido arti.fid::! Im,ent~ (DNA, .i'-:e~'.t,f&jH~'.I',ri,[?) numa ,c~hdsl vb!'a, ,(ltIJd!~ e~e' possa $t:;!' ~'l!'fjiil~jHlI;!s.ttJr. _ 'E$$m, etapa de traiO:fi£9't:ma~lQ .g.en~tka e mats de~:~cadla, [l~O' sendo pO'~;(;O:5' O§. pi,fQblreT'f>l.:is. que ;j] DNA rn{!!I1J'ado ill' VItro tet~ que 'f!':~Jr~.n.ta.il" no ~n:t~if.'iaii d1a c@~:!iJ.~;3i ,~,hra., PeI'F-a q]ue: h~n!n~ [\8-21 Imente 'LIm, sl\g;r:Mkado bio[ogko ... ,I! f1JetlEl'ss;;'ido (]I!,l!i! 0< DNA. ['I~ eombi]ij.a:Eif~'(l' 5ej;;i! '~t~ 0' ~f'iIl!ii~~'Ii$, mantidio .81.'0 ~,O[llgo, lias d i.visoes. eelularas da 'ce-' lula Q:r,~:gj,na1&me-nte h:'~I!:1!~.fonl:lad~, mill s~ ,<'!,l.i'lid.;l'J,t 'h:,~'u:'ii:SCi'it'6 e' trad l:I!:Z.ud,o na ptQte:uiJj,j que codlficae, em multos {,!:IJS{l!s,r 0 prod"lU"to do gene estt";;utgekrQ deve]'a ainda 50fret :p~S$O,S att~:c,~m,u.i8 die processameneo pos-traducional na 0&,1 ula hospedeira.

C'lJ.R'!iO' ,es'1'!.1!e!Tlli;1tiz3!dlo iliia :Fig_ 41.. :1." s[,(} 'QSSeit'licj..a.lm~ii:'Iil)!]" noo~;tI:t'i.os quasro passos [p<1Il',m, '1i)I nta ~x[?lfll"ie'!'1da desse t~PQ::

1) U [tt m~WdQ p.~,t .. 'i e:~i,"!!~r 'ft voUar a Iigar b~ :vJ:tro difer-e[lltes :m.'oMculas de DNA~, Qdg~n:~!'1Jcljo ~! mO:~~I,i,I,a de DNA. l'!2-C,om;b~:~;i}l'lltill:;

2:)1 'lJ:m. ~l~~'!~:ril.to 1:~n~:lsiPort'3do:J.' de g,e-mles\o. (10 vetot g,eni!tioo. que, ;j'JJO ser col'l!lUpl:tcado 'pe];i!J (;~hd~~ l'i!o$p~d:eir~,; poss;Lb.u~.ibll[',:ll que 0- ,g~ne E!:i'i~i!:',a.__fl,{;,((!~.ro qijj~ itr.al:!!spo:ltta ~<'I!mhl}m c seja;

;3) Um melc de iIll.troou;;::;ir 0 vet'ulr iiiljima ~h;tla viva, !i:'(!tPi!! 2:. die m[iJltup~ i· 1L.4r-lo;

4.) th:na ,mmJ'I.-e;ul['.a de seleeionar dei!iitre' 'ilJ,in<'l! grande popuLa\,.ffi),j· de ,~Ii,i'~~$, apenas ;i!Jqu~'I;;'I!s, q;ilJJe- tl.vertNn '~~H:'I.I"iUnl2'n'h~ ineorporado 0 DNA recomblnante.

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FJt_ura,"fi, I _, '~SI.l~~ ~ urn ~n·iQ.;fe =~n.~n.:i! Gtnt:~. N'!Jill(tJjOO Of. ernai-D, -D·o'h:J.kd!:· DNA..z:: ,oiupl3i'fiia.qJI!·.ro"1SJ:i:t ..... e 'ie'1:of e dMido pof 1IHi~flil:-O COO'!! ~ ~~d:: 1I'd~.Q. ~.t.!i ~.G.~ ~j!tlIt!~ !.Jli'I ~ il;lO~i1v-el ~~ 1!I1'fio'1.I-~ de. DNA ~f_ N'!.Jm.l.-=-nJr»de e~ '0- D<-~qlJC'~ ~ I±mt!t~· 'r~~ (';igr 1ITN;iQ~. tIi1ItU;I'C'II~ ~ oil ~ ¢~ri'i(I, g.e.1'1;.~;;.o" p3m a ~ ~'fi ~r:io:; -sfii.;:rs ruscctiJcti, Em~, asOOiis ~~,~ de: 1DNA.::Jo 1"J!>iI~lflIJm 1Iffiic:o·l.IJoo, a(;I q-~ k,1!~~;t.l!! ~1.~ DI\I.A I~', "" ,~ iI~i na 'iOfOOl.l~ ~ m.6iki,!l-<i5. g~ (~~r~,,~ do ON-A OO..-eta e de '!llTi f~.P 00 ~,~~, Esg~c"lmr.ioCfTJ~ pva'~IJ~,kr'rtiil~'1~fWIi!I~lao.ur~bOt:«ot(:IJacidjNL PJ-i'Ei.-o·q.iiIJ 0 ~I:or C'~f~ ~~!'Idil, loQ ~re;:n ~ iCrn ~~~ d¢ ~~, ~tI!!i'I~ .fi(~~ es ~Li.i!rs ~ OOft.':Nerern 0 ...-c1Qr'. kl ~ ~h~j:,jf. essas co9!.ihs ioo 0fijM' UfiI1!i3 ~~ de ~~.iI'il'lM ~~(~}.'~ pon~ do;; DNA~~~~.

4~'l ,~ IEl!I1Zimas de restr;i,ao: as 'WOUI!',iUi m'Ol\ecu'ISJres

'qlue oortam a morktdaJ, de DiNA em, pont'05, les,pecf~loo&

A. consitl'ILJc;aO do DNA 1r-.e-oornbiJ:1lan'te lr-.eqlLJer 'qu.e seja [po,~s[v~1 oo,rt~ii:' ,a;~ ~:ElfliMe'i:dfllS de DNA dl2: m,odio preelso if: :re,prodlut~~'vd", AL!}m de Slet nece$~·~d() cor~'at .0- \,i\ewr lOi!.Uli! uni(o pOOi!'~ espec~tk";)" oode' Sera i:nSle',dd:o 0 DNA estrange~~(,1', ,~ in:'iip[;"Ii:st:i:i:'lId'u'w:U q:Uiil! ,~o.dM as mil)I,~t:\i:U;;i.$ do '!ie~Q'g' se-ja'rfi ~Q~t"d~:5 ex .. 'rt~mente na mesma p'oo.;~ao. Co:nse>quenl!e'trtEnte" n~to, se rode re!!}Hzi!}[' esse i:ipo de OOljstii:'U~~O fiitii:',tlt''l!~S dill, c.~~,vailil?m 3J,>8'{'1j'hir,ifll de DNA do ve/tuf, Nil, 'V1(1-'~d.:id~1 a E[Q~n~;;IJd~ Gen~ti..ca ,$6 se ~ori,'H}'lJ pQ.~sfV'~I, <li1P6$ a dll;!soob~t~~, die '1!iI_'!t!:iiI" classe especlal die ,etlt.Zim~$" as if~]lj1jJCmi!.l!C'Uea_ses dh~ r~.stri~~Qr 'llVie rendeu Q P,remio, :N'obB~, a W" A:~biZ,~', H" Sr:i'~it~, if D. NaH'1I3I1:lS, ern) 1978,

A 'obser'l,~a";~Jo inil!?ia] de ,f,e-]1IOm~:n9 doe, ,res,tri~ao t.lrul-lIaJ s~do .r1il'",~t!']J cerea de 30 anos antes [pOI' UJRLA. @ ll,'IlJMANw, quQ. :~,a:'!I:~~~:El, d~:S-Cfi,~)(ti a (!'IIp.!li(:id,~,d~ ,q'I!IIE!' algumas oCe,pii!J5 da oacMd:il! E- ((.iN ,a,:p~,t!.-s~nJ,a m de se ,piroiti'Eger doll, inJec~a,o, por b8cller,i6f:'aJgos~, cu, :MS p!;ll~J'!,I,ras desses autores, doe' resJ'ri'lJ:gi,r i[!! c,~e8dm:!~:r1l,~\D' do ba(Ile-r-,uM:a;gtL H;o-j'Q' S-{!' sab~ ,q:Uifl' ra ~ m~ca:n.is..nlO de' dIQ:r~s,;) c-01il$:uste' !I:ii~ IPtl[;I!i:l,iI,I~~!o pe;l:;i 'b"'.;;;te.d;;'l! die !.1!rn~ ,gf1~i'[~'iI,a ~~p~z d.e' deg;r .. 1d~'r o 'ON',A viral invasor, .0 DNA pr--orl'locj, da bac ~'.d~ flea :Plro;~-egido do atsq ue pela enztma de ,rcs~:r,~~J,o P'O'l'q ue, ao mesmo tempo eli]l o(~,!il,e prcduz 31 e'n2~~ma de r'2M['i~tlJQot aJ b~(:t,t!t~~ '~'a'~'b-eim produz UJroa eiO;;:,:;im~ de' :m,(':id~:f:uca~ai;)~ pe!.r. ~'ia.('), da qua] sao ac res (-'€11-' tades ,g;~u,:pos, meti la a algumas das 'bases q ue ,co.fJ:lIr'0en.1i a ~q:ti€!nei3i de DNA que ,~ reecnheciela pela enzi,rrLin de ,r.es~:r,u~~lD !2'r.tlI 'l!tt~,st~o" Uin~ vez i1I.'IJetllad'~'i e:1!M :s;e>qil!encia d!~ix.a drt ;$~I" ~(ionhi~cud.l :_p<e:~i;II eri!zi!'t!:~ de J:'e5td,~ao. AS5i:Jml., [J8:ril t~rna deterrninade elJ:1i.z.:~rna die res,hi~ao, e?;!,iS.tE' uma ,e,n.zim..ili, de, m(j;d],fi{;':~· ~5:D cnrrespondenre e faJlru,~se. ,!?n,l siisteru:liiillS, de' r~s~!t'i~~o·n:'iiQt;Hfica:~~(Ii_

A'S endonucleases de restl'~:~!lJO ~fj:o sil1te-ti:zadm,s PO,f m,!ij,i ~,2i:S;,; ,s~n;~i) to~a$ .. as i@~p~cii@S, de ib~(:IlI}r:U~Si S~i!'lId.{.i' eO![;'ilti!!i~ 'ill m!'ll me~rrLa: i1:$pl!de bacteriana produair mais de 'um!i!l oe:nzima dJe :re5t:ri'!jao,. m:LS ~'a is. enzimas n.'!~.urLi::filfo,:t'fim, eneoatradas '!2'm ,olrg:UtiSnlOO ;f!u,c<'I!!I.'intkos. iEss.a, elasse d~ enzimas ,omp;[ee:rt~ d~ u'~s tlpM, qUi(!: dHiI?!J:'~rn QU;i}1:'fIt'O ~~ gl2i'Lfrt.iea, ~ ~t',,2;i:m"{)lo,g±a_ As en~i'mii!Js de res~r.il~a,o, de T'ipo [ e 'I'"iJ?o ] I l tern '~;UIIl modo de sJ'!ja'lJ! I.na:~s, complexo if' .rL~,O 8~,O' de 'lJI,i:mdadc '!l"n,~ IEr:1Ig.'f!,,nha ~~fl Get1l~ctka, Erril eontrapartida, S!I!.I!TI, .!!IS .enzimas de re$~'~~'il!o de" T:~p(li 'lit n:iQ teJ;'~,a, s:ido poss:~'vel ,a" El'ilgenhada Ge:ne~k2l,. Assim, daqui PO'I diii5!!!Jlte. '1ul;llnidQ h!l~a(mo:s ,e<!'t!: enzlmas de f<e>stri~,~:o,J' estaremos 11I.os ,r-efell:indo aquelas die Ttpo U.

As ensimas de ['est:ri,~cao sa:o' ellidlodle.:m:d,r~bo~:1Iud,e"1s,.QS", 'L.!'U end(:iiJliJ,!dea~ sss, que, reconhccem seq]O!r.}n,eins ~spiil:c,uHc~:s, de- nucleotldeos [loa molecula die. DNA ~ 'I;Qrt~ m: ,M d'!.1l~$ .;-~~tei.(i!S de 'IDNA nuzn PQoto d<e'nh~o desta S!2'q~i:d-~iCim", lhna determtnada enzirna de i[\e5tll"h;~"o ir,~, catal is{!I,ji fII q,~JQ':bii:'<'I! ,d.~ dup:U;;'jj fiu, ;i)Jpell;i)JS, qmlindo enccnrrar ag uela s@qU"nr;:ia 'p.<1I,r~i(:i;I!~,al't qjl,1!~ reeonhece, m. essa

;I?~i·':EC:',d,,;;.,d,e q'l.'~ faz da· enzimas d~ res·tt;c;~-o Insrrumeneos f'ao importantes

:Ef.i~nha . .-ia Gen,etk.a, Asstm, pOI' e'xettifp'kJ!,. a enzlma de [est['a~.jjo chamada ,~,N'~: (p(rOO u de! oili 'pe']:Th b ii,et~,iI'li7I. fi'(.11i!!u$ :~.r:!:l8:f.lTj~} co:d:.=!J Q ON A semente q Rando mcontll"ol!! UD1.a, seq ~f!-[;li(:ia de 6 nueleotfdeos eGAleG. [:~Oli ~ ua ve2 ,a I!nzim;$ll die re,5.t.ti'C~!D 1=1';j:mU, prodil,l2ida pililLa mesma bac:t@or.ia, s6 enrta 0 DNA quando !E!1Ilrortt,li'~ tirel. ~1~pii~i1il!:;;i~ hex~m~deotl" icc CAGcrG. A m;;JilQ.rioit das enalmes de ru:"Str.i(,lo reconhece s.eqdiie~.lc:iill.:s h~~i!1JtI.lIJdE:DHd.ka~,. moilS h~" t'ambem algumas ... CjJDJIIll OOiCQm'ffiui!cem .se-q~iertdas dl~ 4· ~ 12 :r:'iil,l("llooHdere,

Ad W'Litj.n.d,{l 'i,'l!!Ie 0$ 4: dB fel',entcs ili1'ideotlti .. i;!(lI.$ ccerram com a raesma f[l~ q:Qfnda ao lange. da molkt~18 de 0 ,,',1\ ell !cl,.I·Ua.- '" que uma dada seqflle~dllJ de ... p,. res d~ bases (bp) ceorrs em m:'l!rM iO'l i'1I i;ad~ 25 bp (O,:25l = ] /256) .. ,e;.L'h]lUl il~O u'rn.'jj d~ 6 'bfp o.c:or-L'ii!J 1iL 'c, cl!<li 4.0% DIP doil n-.QleGiJ.I].!:!, ~ nhet~.n:~o.. cnm.o a dlis.tr:l'Ib,u'u~ao die ~tiQ5 de reeonhecim '!'ito Ih;;'O e regular, uma d~'m:r.rn~l~ada re~i.~) do D _A pode :5e1' eortada !In •. h .... QIU menos, ,f,req 1lJI.e1l:1h:.IiYl!t='fl'h!' do .q~L~ ~, ti'!I~di~. ~:a~·Ustka, as cl Heront~$ h'''Sl!n'e:rdos o.r.~g~niltdos p.~Iil) dll.g~$t5.0 com uma enxl rna de nl:str.~~iio podem t.r.d~IDente- ser separados UI'iiS. dos {l'lIJ ~r'Q:5,.!' com base [10 seu tamanho, at:r,~ 'i,i~;; die elehuJor-ese '~1L g~1 d.e .a,t.;iJ![',u$e ' lil.l de pol iaC'riloi!Jmidi:L" A. .p:i r"ti,f d!~'S~$ d idos, {l pOSSI\r, I eenstruir 0, qiUe se Ch;;lil1loili de malJa ,de 7es~'ri,,,tJ.o. 0 q ue envol ',.1Il! :ill dE'b~nnEI'I!<1;t;5:o cia p.o5i~~Jo e doll 0. .ierttaQ~o de eada fragn:'Ii. ~itI:to lila. mo]iikl.uia de DNA Q.ri.~j.n,a1.

A__;s; 5e.q.iiendas Q'i2' reconhr cimento I1IO iON A. ,a.:p:resen tarn uma s~.n·I!C'ti:'i,a ro· t,a('iO',I:1I(lL ~m ge al, a s~il:ill\!!'i(:ia de reconhecimento consntui tlil''iI ,p.i:lIlJJ1IlBi'cmt\[J'. isto e.l' ,!:IS :2 fHas t~il'II a ITL' ~s·:ma ~eg'lien.d,ar 'f' um ,~:!.ida da esquerda pat" a d nfl:>-' ,~tf.l. e a nutra, da (j-u['Ie:~ta. ,piS! roll ;j!J esquerda (mJi, il!ln t!I!'rMIf1i$ dill;! DNi'". s.e arnlb;;!s saO. ,~id;as, na di ~~~t~o ;;. :pua 3' em ambas s~o' lidas i1j~, dJIf~~;\o 3· :pi!rra 5'}, As seq ti.en('.It'!' d~ reconhecimenm de ,iij,lgllmas ~!'i:..:ima;1i de i!'e~t!:'i~aQ e5t~ '0 apeesentadas na Tab ,;mo;ll 4, L

A p:r~i.mll;!;ET;i;Il enaima de ii:'estri~.J(ji ,fed l solada !!;'!!IllJl t9i'(t"J e h01'eo ja iS€: "::0- liI'hecem ililiais de 2:.500,., mso:~<'IId.lll'$ a p<litHt de uma vasta g;ruma de especles baete'rLrli nas, ,C ompr--e e ndende 230 d i f.~r'e:otes 5<eq·!J.e~Ij'",:i!:;j.s de rec onheci mi!:rUI( • E.i'ril rn t1j,to,s, cas os, dua S ou :nilil i~ enzlmas de res t r- (,~,O" provenienres de d i.it;!~l!'eI'ii· tes bacterias. ~('(J.nheQe·1!I1 :ill mesma se.q !l~.~d.a de DNA.: IIl!S';;'I $ enzirsas $;iio ella madas d~ :~S(lle:$q;!':~b:;o:me['05, Hoje·, i2'n.co.nUfIJlf:n·@~ ~Hsp{)II'Ii:l).rI~~S· <i;~)I'tII~:r'~~~ 1- m€nt€l ap:!'Q:dmada,merl'te 170 d.~f~:rilmtcs enzimas de res.~dc;,a.o ..

10 ,li'estllH'ado do corte pede ser dlferenre. segundo 21 I?:riI2:i,ln~ de te$~d~~=-o.

H;i el'tzim,}s· (]M;l:e cortam ,e)(',:Ha[n~i'i.I:e' no ,imI.eio (1.1 ~.' '1'uetIJli:;ia de' 'l;'e(o;l.lh~i'!:Jf1}e[!Jto". e,OnTIO ~ ,0 caso da Pt'~~,U e da A.~~~ I: (ver Jab- 4_ 1), orig;~na:rtdo (10 que se chama de ~ tl'rtl'i'i,idade ,ceg~ ou abrupt.a, nos fro;!J,g;mentolS, de DNA resultanres da sua ~'1iao. Por OUU"O I. dio,. tlilYil n(unero ,.;;on:5;idlerav,e~ de eneimas de re tl:'i~Jlo corta <J dupla fit, de :m./ilI'ii~h·~ a ger'~'u' e'xlremida,fil-s ~j1:MS nos ft.a.g:niu~lirto~ n;!:s.l,.i·Etil.lil'~-e5-

T,~'bela, !!Q.I - Enzirna5, doe- ~~. EstJo ~ ~ ,a~'"fIaS ~~;;Ie ro:~ e a6 "Se.qiii;,~ 00 DNA flU'! f~'OI1!t'IN~ A. "G e C t(,,;:~:Y!&m q; ~ de aden~, !i~. ~m e ,~, r~W!i'r'Iel"rIJ!:. H. .'ed"Ias ~ I) Pf!GlID em I!jIlie .a 'Cf"I~ .;irrn,~, uiYlil dJs. 'Us. de:lTUO diJ ~~ ~ I'~j-

mI5J~ Now qiJe ,0 !'ffi!h1!6;o ~ ~ ~we 1Ilri'lQ r;:rtJe.~ de ki d~

NOMIED,A, E:,NZIMA

QR'G 'N1SM.o ,PRODUIOR

S QtltNCIA DE RECON (i.~ttIM:(i;NTO

C;Uv\cr~HfSTICAS.

R"El.Ev AmES

S' ., ,G ... A AfT "---3' :J·",CT A A G .. __ 5'

Se-qu,i!\rTtc-iia p-alinilrolJli'r;;:w de " mJ.dootid-l"t,iS. Q ,Ct~FI gi!"C?i C1o:'T 'roid1,lld!~ ~ sivas,

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$;;."qii'birr;:ti;!i dl! $ i1rL:ld,eot(.. g"t.'i!: - • per ~j.( I} f i'ol!ollj i![ll-e no IX'lJA dl! m m((\~ro:s,

;;.;~r;;:,mid;if!! '~. (~!'li""i!rs. cern ~t(:I'1~"" oi,Il!; :fHa s:imf~r:."S I;!r.'tfI _).-.

Ondc N 'P~!C' <I: q~a~qrll(!( plI.Ir~na 'D1l!I ~~irimir;'~~Dill, Urn" d,iS r~I';1<S 'li~imil qr~l(, Jl!!"~I!,I:r. ;Cx~ . n~oc'S d/r; i!i'I ;!!JgS ,(:1.(:' '\;1 h~::;._

IS$() OC!y'['['I~ por-que tais. enztmas n~o eortam as. duas fitas da mQIe,cl!JI~ de DNA tapa <]I tcpo mas Ct-,d:;:n:n. de um '[fl{:lIdi0' r, d~se.li1Iron.~rii!Jd 0;"' dentro da 'f!<J]Uf:'nc-il!! de l[\eC'ol1·l'iIe",:iit'LS!<~to .. '0 q Ille ptQdti2 extremidade. de ((n·t~ doradas die curtas seqUi!"ndnt;. de t:i.'t~ simples, cemplementares e~ltte $1J como e.stl1. mostradc iP:iilrit.'.i1I 0. caw da enz:im,jIJ Reo RI na f~g,4.2"

-

~ . A. da, "'<a!iE!mr<l~ .1l'I~1>:I

D~_A Ir.n pq:OI:dfl difl pin 9Tllilii!I 0 ~ 0) iTh e~l~ernidl!dojllli ~:gIl'Si"'i!U

CTfAA s

ffiJ'll"ii · .. ·.2 - ~ de DNA ~ C~11IIi! ~ ~ f.ro 1Kj, U~ ~~ de- 1fl~C'(tJal' d£ dH?b ITttL CQi\~ido apems UI'Il.1. r;;:qOOtocia de r~1;o ~ a ~lcmc: g,: ~~ fro RI, ~ Em'l!Jla:fffi!1T.Ci-'OCfl1~.t'l; ~~.i c.::on";II!rtiIiJ ~ 1~1a mear' C'OfI1l'!1o:t~~.~ ,dq 'Il~ Em RI,

Asstm .... p(}:r' menor que seja lit semelhanea en.'t1:'C! !;IS $.il;!'i.~.'~ndas (!I,e- nucleo'I:udeos de.' d'!.J.i:'I$ ,altlloieeu'laJ5 die IDN A.. iii. enzima d@ ["esf.r,~~ao. $~b.l:!:i:' . eIliCO'~Ti't~..i~:~,· e ~(:!:rt~ii.'~ ambas ,a.$ 1110leeu las, :ne5~@ p on 'to. Fra:gme!f'ito!l: oil"igilti:'l,'dQ a piutir dl£! molecules de DNA dH~renb~~s. pOilem digerm.d,~ . p~la mesma '''"FfI.zhn.a de restr,~.:;ao. quando dotados dt;"! extremidades coesl vas, i[',~!o S€' assoclar com gra:t,-, d@ fadli(hl.de " ~l'fW'~S d~ 'C();1!'ilI,plejjlte!J:l'hlJ.'id;;l~iIl! de, se'QrCieIliJC~<li, como mcserado fL'i:'l, ,Fig" 4" L

Tod.a$ ~S' '(!lID z:hn::t d r:f. i:'~s.~l'ic;;ao dlv~:m @J :~igia'~~o fQ:d'od iCi5:Ire-·~,. d~i%a:l:1Ido, grup,os :5'" fu$:~.ilI,tQ; (5' iP) e 3' h~droxnill (3' OHJ' 1105 f:ragmen'to5, resultanees, qll,l~ ennstttuem eX,t'I,t,~ll£l'f1J-e' 0 SU,[I;$t!rflJto «iii! e."FII.zI'ma DNA UgfJ,se. As:si:m,.o~ Jrag:m,'l!t'I,to8 ge'rado.s por ,~'.Jo de Uflla snzlma die 'Ii'esh"~clo, 'pod'et,m,n'er f~dlmente reunidos ,i,!! tra ve.s d~ Hga~a,o, eevslente, por .ad~.'~ao da DNA ligase, que ca t,a llsa ill fG['ma~~'t() d~' I:'I!OV<8S :Mga,~ot;!'$ fosfo,a i.e·5;t~f.. ']" 8Jrnt.ei!]1 ~ p os:sf\te] [!Ii!',j} HZ81' a Uga.~'~'o entre fra.g;mle-n,tos de' 'ON A dot:ados. de ,e:dr~imr~d.ades ~'brli.l,ptas (eomo, 'PIi)'1'" !!l!}::emp 0 aqu ~·iiI$ ,~,cJtada5 p~h'l d.iges.t,a"o oom 8 enzima die re$~ti~1Jo Pli:.I'~r] I), emp'~g. ndo-se a 'IDN A :H~a:'e prcduzida per f. ''{i~',f: iII ~ re(;'btda pelo bader~6f'~go T4J.. 0 mode die' 'S!o da DNA li:g;j)::;e die E. G~j if: I;'}

da DN,A llgase de '14 S80 mui to 5em,e:~ha~ __ t'E!s", diferindo e~ ... he~ant'O qJ!Jq)![ltu <lira eo-fa t.Q,r requende: Bnquanto a :DNA I'UgJ! se de E. t(J1i [ie{~'u,oe]' NAD'.!' oil de T4, :requer ,AlP"

A.pe'SaJ;' da f.,;l!dm~\~o q IU~' ~iI1! O;Dt'rfm, pa r,'Jj <II ili!lt.1,~, d~' li~~I~~jOi qua:CiIdo r:ii¥: il;u~m::i!:.'J a millSiYlii1 ~ilZ.~~:N8i de, r€stric;ao p~Jra @,I[l;bl}s as e-.s.~ItLes die DNA 3 serem [~.:;ori:i]b!ifi,a;g,a$ s ~l,n:,~~in ~:.amh~.m, ~lE\n,u; ,~fi.eO([:l'Ve{j,l~e[jJt€!S., Cil:Jo.nri:D1 ,p'O[, ~xl!:m,plo.l tLIllii;1J e:;':;~~!!1:~l!cl~~de ['.talU v ~; $~:r .;;apaz (~ill: Sit': ~.rIItp.<71:~(l'lh~[" ,t:!:):m, ,qu'-il,qu~[" {m~lt.a exrremldade t:'cO',RI. 1110 l1loi!:lTte~1!to em qil;Ue' 0;1, I:~:..::'i.m.i;I, DNA ligase foil:' ~dl1dol1~da ,;;'1,([1 sistema, .ill ~gum.a:s. I:l1IDleClJJ,as, do vetor iraQ S€l ['€dr--ctula:riz;i!J[[, atraves da rea,~au' i;lfntr~ as $'U;;'Ii~ .2: e~trom'idad~1 sem que t!2'lj~,~m, ocorndo ,ne.I.'I!~.i'Hl'I..a, :li~s:er,~1'i!o, de DNA estra:n:g,~~ m" 'Pur Q"I,rb:o ~oilidQi '~'o!Iirnlb-lfm il".1lQ 5e fQl"lm,a'~' mCl1~~ las 'H;ri!b'ri,dilliS" ccntendo inser¢es de v.iido5 fragn-.enJQ5 do, DNA 'i1!;J;h'ange,u[\o :Be:~~:gados IQtlU'fr !Q'l@S ,i1I,a:rnv~s, das suas extremidades f>coHI" '(O:IiTIQ mostrado na Fig. 4.3, a r'E!d,.-cIU'm~dxo;l:~aD do p~,asm:LdrN:) rode ser e!vit<dtli, Sit, <'I;n!:es .ria etapa da DNA lig@Jsez 0 plasmideo Iinoe.=!J[,uz!l!;do' f!lJlr 5~~I;itFtl_,E!Hd!o ~ ,~~~j(:i d!;;Ii ,El'n;dTIi)a rosf,a;ta:S-E! ii!J('ali~ na, que remove os fo&f;i}~oG, das extremidades 5:' da moh~CIl;lI~, impedindo em >C'Ul:iJ$rM(u~l!IIcb <I, ''lr;.!ao da DN A :~~gas!2', rt.~j{!; substrate ~ cC(r"istlJ:!ltu'do de '(!-xt:r~,m,i~ dades 5']' e 3:'Ul:';1. AS!iihfri!. .. qua:ndo ,~$ 2. ~sp{idttS de D~lA <I. sete<lIiIi, te<:o'mib~ni;'IJd!n$ ~Qr--ern posras eril.1 ,pnl5e~~a uma da QIUJT.1Ii'e >cl.il 'DNA lig,aser as E!xt!fE!trrdda:des 5:'P d6S fli'ag .. t'iJti!',~to-s; do DNA eserangetro s~r~o, ligadas ,as ;fX~Nl":r.ddiii.d~ 3:.QH do plasm ideo,., ~!!':~ma (l~s fitas. :N a Quira f~fai S~btiil:rn '!!.1'r['J,Ol i:n:t.errl;J:p~-.i(~j 'P<~It,qii,iJ!2' t~lIJil[pO'Il!I,(iO IF'ooe[[,~ ccerrer ~ I'ugac;,iiio ,e-:nh'f;!' as ~J(~:r-eroid~de5 3'0]i do UN A @iSm t.rang.!I!!:i.ro com (10 p,laS'ln~dieo'r mas a CE&~!;a b!:iJc'ter.umli;ilJ e C@JP8JZ de Np~.rill:r tais in,b::lf:riJ,lllP~~(!; d!~ fi!:.2I :si'~:pl~sl de, moJo q!ll,'Il!'~, luua v,@:z donrro da ,t::e~'!i:ib," o plasrnideo, :rt!!i:'l!i!pe-~;;'Iira ;;'Ii :S:~,fiI i'r:'ite~t.ic~<lidle (l(H:b f.!l)ttn 21 d (nl a, I.. Oil;ut:ras; ;;'dtEtt",o;;)ti,'I,I';;}S, exlstentes para oontO.'nli!i!iir c pr.-oIMerJ:li:ill da fedi!:ic!!.IL!:!_r~z::!J~ao do vetor s~:r~o' explicadas ,n.'l!ai:s ad u~~'litl2'.

,4.,' ,_, V:etnres gem;e:tioos;: as IDiiO -lku'!as de' DNlA q,ue v,eioullam a pro,P.~i'o' des f!ra;gm~nto:s, de: DNA d)e Interesse

Um 'It~tQr g'e'l!IIeti:Lo nada m:a:~s @: que tuna mol@cu'~<"Iid~ DNA. qil,ll~ 'podl~ aceltar il:1!~'rodJ!J~oes de 'DNA est.ra:tl!gehltl< em re,gi6!E!5 n~Jo, essencials pa:ra a :5i':ta ,nlt~hipli.c@:~0io dentro da C!clh,da hospedena, T8Jis ,rrto,lecl1l1.as de ,ION A serallJ! .. 'P[)tt<l.llt,t).1 as h:.a:ns:p{;ii'l~.'do!~i']g; do. DN A he.ter61:D~0' P'~ii:'~ e :LIH,Hi(j,r d<ll .c&lti~,a hospedelre, 'pos5i'bl~] itan~Q ;;Ii $I!lI<iI ml,dti'p:~Jlc~~'ao,. $o;b ,~t f!lJl~m,r,i de uma n:~O'~e;Clii,~ '~!1!i 'tt~fbrudJa" f dleseJa vel qlLue Q DNA do \retoI possa ser ex t:L'i!!ddo em s-epa:r-adil!! do [)N A rtr'(jjm~!~J1'i"ll~eo clio hospedei ro, p~r@J f3itbllt,'n qru(!' S~ !i:',@CtlP~ro' .0 DNA >I;!~ttalli!g:eir(~ l'l!II~tid-[1 n~st~ vehjllt. :ETIitlf.e ,~'S b,1i(:Wti~Sr ::;;$u f.!i'eqli1en't-e[1'H~f!lte- en,~ ro!fljt[[~ d o~ elementos g,ell~Hko~ e;r.;;t [,!'!!,e[Orn055 Q-ooj QO 5." tii!li~ !0om,{!! p,~ii!JS]," ~dleo5' ~ VlrIJ5 ([;;!:tiG'l!i~r,i.6f~gus), (r~,~ preenehem esses ~qli.!li:s;utoo" :r.Qd]e[nos diser que !;'I eng. 'nilha~da GiI!n:~~'uit,a so. se tm:'ii'l!OU i.1l!',llI.1:i.dadi@ ,pO l:"q iIlif!' pl~j£:ln£d.'l?{li$ II? Vi'Fl,I$ baet'eri,!l!nos !lie most.t,a'!"am ;t~p~z~s; ~e :re:prodli,.i9~i[)' ap6s '" a(li~a,o de s€~l]e:~das de UNA es.'tJ:~Ili,g:e~ ras ao ;SIf'Y ge:ll1I{!Im~,

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N~o oOOrir\s ~Q

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P. OM

Fr,~gmBnto de D'NA. e~ tn.:ng Ell ~o·

~nterfl,lpelo. de lila ~ph~$

FIlUI';I!: 4.3 - ~30..b ~Of. P'~fiI evi"liir que; ~ rro~~~ '$-efJ'I ~ma. iro::~ de 0NA.e9i~ ;) O~OO ~·I~Ziidb e ~i '1fIefII1!! 5.!.Jlli'1'Iel:lOO a a!"~ @ . i'Ii'I3 f~ a_~. ¥tI~ di!' ser ~ ~ ~"'.fIo rl".l.~[OdE! DI\!)I'I.I£'5't~f,,':.jI'l.L1NA.~.

Para que '0 IDN A rEoombifilmne pessa perpetilJ.ilI r-se entre 00 deseendentes da ,.;;ehd~ viva que ,0 reeebeu i'!1iJ uci.a.l:m"e-nte. ou, em OIJ,il t,m".1S palavras, piiTa que 0 lDN A recO'ID.JtF11ii~I'IH:e- possa 8.f:1' r;IQrr.rJdQ, e precise q ue Q $iS~$maJ eJ'LdmJit~1i:9 ;j~ 5"n~S(!' die DNA (proce . 0 de l'!2'pHc8ic;ao do DNA) desea celul~ recofILhc~d 0 novo DNA .. P2I ra ~'~'t1I't'O. e necessa [i~ ~ 'pi'(!S~I"l~a, no v ,.~If. ... de '1..1 ma 5eq:~i!ncua c-orros:po[idie'l1te a I!.~nna. ;['iri;g!¥!n;l de ,I'~rlic,a\,~ 0' companvel OOnii {J; sistema de ;5Wtese de DN,,\, da ctHu1a ho ~ped .i:r~ .. Piasmid.eo5 ,Iii' ba,ct~r,ima,:gCl\S cont~ltl rais orlgens de rep:~l(~~" 0 e ap.lfese,nJam pi;JiIl'il;~if'ilto ,r~p~:iC'a~,l!io ;;ll,l'h<),~A)mo1., il1de,p "'Ili.d~:te 0:0' cromessomo da (e-]II,J~.a .. $t!n.do, 1'@'pHeados l1io:rma,~lnerlit,e pe-'~a celula hospedeira, ha '!,i'~r~ c6pias 0,12' rais replicons em. '~:odi:ls as il:.e·b;~~$ do done qt~e es.~·a e~ lula ir~ o.ri,ginar:flo fim de' sueessivas dl .. r~s5~$.

Per (iil;lllr(!l l;.ld{llr pin.l q WI.i12 iIIq_i1;ie-la$ otH t:ll las li-:ll:~~ H ,44l!!I'I~:r1il efetiv.ant~.!'ll.'h:!: i:nwlI"~ porado 0 novo D . A possan» ser idJe'n'tificadas (II repllcon deve ('(tii'l!l:e'J:" i;I,lgtllm ~.n~ que confira as. !:~~ i:flalS 'I,),!!ma nova caracl:E!:ri"stk:aJ, fa.ciln'l!I2Jll't·e ,de·tectavel (Ill <iI 11"(; ad OJ;" .g.£'IliIH.lco) , Os marcadores ,g.If'f1.'!Htt:ru> tmt'!!l$ treq ~,C{j;lH!'.~tri.etirte tlJilizii!i~ des p,ju"~ a lUafLip'i.Jli:!l~~,O- de ba.cf~fl'mas, do {1:5, g.enes de U!shl1t.enc'ia III drogas, As.sillJll~. das milhar ";5. de b:3ider.~a5 ,SU.bfiliui!U.aas aID' agf!ote ]['!It;e(ICi!Oso~ !piOod II~"· Seer '£a;tUment. seleeionadas ,:}q]Ui?n< 1$ 1?(~~C~S que hV1I;'!J;1etIit realmenre sid!o hlfe~t~]dOliS. ~11;r;;nr.e5' de uma . ir.l1rp':~e-s ~~rlie,jJ!dlH'~ sobre :I1Tl(!11Ci- coatende <11 d!!I:'·og~ m qil~.tlii!;)F a ~11I.a ~ :iI.S C,~~utls eram orisin Im,N'bt·~ senslveis.

o !pil'u:m', h',Q v tor a ser lI.Him.l2ado em Ellg~nh.al'"ii,a Genetica foi e p]~$.n~{d(!(Ji :p~5Cl (n r IJ.H11 pequeno dr(:t:~l!lJ< ex tra C'.~Q:f~los"$om:u('o de DN' A d,e dupla iita, ii.~tllJ!r~J da bs ;t1:~1:'i.1I. E .. CQlir portador ,tl.1f!' lU1:i! gene 'CI,ttil!' ("'P(1i1I f~re [;"'es.i:sU~['II(i~1. ~o antib.iotLoto, bd:r..;idd:ilna, COHEN !!1 ili/_ 1~~ uhlizf:Ii:M:m esse plas lli'd,!2'O'J' po . que ele C::O~1t it'll ha ap>~n~:5 um sJt io die' :re(,o']lLhec,um!~.n.IO pa ra a euzima do lI"e5tri\,;iiJo .f'GoRI e, (on5eq~ie:nt'o~m{!nh;!' .. ap6s dligesHio .po!!: esta enzhn.aj ~ eOfllvli?f.tud,[)· '111 UJ]1iJ!l!. m.,o.~ee.li.d:iJ l.i:t'il~·.iJlI'" .. dota da de !f!'xlre',mj~ad.es coesrv as. do ~'i.po EcoRl Q'lu.u'lJdlo es a moh~CUll;j!j de DNA ;Hnea]"'zada "',om pcsta em f:Jl'flS<l2'ffL,~a de diferen !:'e'cS f:rag:m:Ci!'I' los de UN A. dill! !l)t:I,tra prOeed~i"l(·i.;;ii,. porem ta mb~1'If'I obtidos pOl' tE E8~ la.o poe.·la E coRt e estamisture SU.'b 1tifI,~tl de a a!~aQ dia DN A I igase, forma 1",jJ! lOC1I-se d Uelr!2'n~E!S· pl~sl:iLliideos, h.ilb rldos, Cada I.Hl'fI dieS'ses con.ti.i.'IJili':ii 'I,),!! m OOU mais P' 'dil~!l)$ dQ '0' A !2'sh",il'Inge-i [:0' Jnsertdea no s.itio de Ec~iRJ dQ pl~smrdeo .redf.CI,JI,adz:~dQ if S!2' mcstrare m capazes die transJ'O.il'.ilt'I.<I.t 1,11[1":iII Ii nhagem $i2lll<ilgem d!1!J baeterta E:. (.".1'}. senswel <ilQ ;;'Ii:n ~·iib]6tiro. ~'lium;;1J HnhiagC[;n .1i''Csis:t~l'l'te ao f!ln~'ibb6hc·o.,

A partlr dos p,li!lIsm:id<e-u:5- naturals de ~< c:Ml"i~ s, 101l:'< m a .~egil..-i:t" derrvades novos p.la·srniG!l)'o'$, 'll1'I,alis ade(,l]uados parn servfr como verores de elenag:e'm. 0 matis, eonhec'id'iJ desses p·:last!lt!l;o,e(}s a.rti,i'kiais e '0 p]3,.R.J.l2['I-) um Foeq'uel:lIo .P~.;lI'$ll'tLd~Q ,m~]'~ttic::dp:i<lis'l d~ 4L 363bp. OOrtSh-1l.J Ido. 8 pa rti F" de' b.ililt'" mentes p'ro~ enientes de vartcs plasmidieos. [li<ti!.ir~is. de .E. coli (Fig- 4,,4). $11.13 o'i".ig:~m dtll' 'I"~phca~~;O p,n;)'iI~m do p~;i)Sllfi.fd, e CQllE]" ;tI,;LjO numero de copias :NH"' cell~la ~, normalmeme l5. mas q]tUi{!! pede ;j)'ur:iid!a ser .~ mplif:iieadQ • ~e ;3.,{il00 c6pi!ilJs I celula, a.,~r:I!!Ves dJa 3i(H.~:<-.ii) d,e- d,o:t'8:n.fJl}fil'~("<O] ~ euh ura, O'(i[)l' qjl!.llE! ;;t ... e:pliea:~lI(li dle~!i~' H[po die plasmldeo esh\ sob tC!ili]i[t.r,o]e dtto :r'e·.~.;ii5l;.!Hi,i)~ de

t",l modo que, emboe ma .. q_uitilada ,e r,e'Pl'iea~'lo de DNA e d.~ s:irilteSE! pI '

tei,c~ da (:.r!hd~ he .pe-dt"i ra s~ji;ll irljibida p~.~o dQ!I"l;!:o£enicoL a rie-pH('a~ihJ dO' .plaSiitlME!{l ~ind;i) CQifHin·i).I,tJ por '!,1'·,a.rias horas ii!JpOS a a!dJ~;jo da droga. Ai!~ da odg~m. de :fCl:pHear;.i,o, do plasm:id(l(li CoiEl. ,0 plasmJd,e.o pB,.It3.2:2 C:O.fII'~ :2 iITI..a C!i!JdOf@S dl~ se] ·~aOl. AmrJ,A ~ TeJ'~ c.~:e:!:'!es de K!Si:s.t..e-Iitda ' iii.m.p'idlil!l~ e - t['addi!tlOll. ,~ ap!roesenta 39 sMios ul'!!icos de recenheciraentc pil:lla dif,ereiQ~ enzlmas ,d.1ii! restrie;a!o •. f1Jlg.!IHt$ dos qtlill:US. .s~.tlil~d¢.$· i:n,dt.us.:iv!2' dentrc des .l!IliThll:'c·ad·CHJ"'e~,

Fa;F.l:r:~41,.oi!· - F1li~noo p~ro.ll. MoI~)f.;!i c:jrru~ dc· DlNA.dI!:d.J~ fiLa. <OIT1:endo I,I'Tl;II ~flII d.:: ~,1ct(Qf1};::' ~ f1'Ia;.'"GlWt;:;, Amp'- e r ~lJ:_ que roi'(:rEfn rM~.N$ ~~ a.ri1p<Ma e 1;¢11i'J~. ~\YY"II!!,>~ i!'PiliG!:dol; ;;J~n$ dbs !;,,,~ ~ de Ife'CO'll'.OOmcn11;' p;1r.'I .... 'liefi!!' .. ~ i(!rq;!YJ.M de ~~ As ~~

~ 00. UilIllSl:::ril;ikl- do:: ~ ~.

CO:r1ilQ ~e' pede observer peb Fig. 4..4. se u~iliZ~j'ri!1~(]{i. Q :siHo P:;:H pa V'oiI! '" un.~· -, r~o do 'DNA. ·E!Stii'.ilIl.lg.ei:ro, 00 g-ene- Am;l :fleiIlli'ft i[kHV~d(l!ll!r ·CQ11l ct}!l.tenJeme1ltll2',

-a bach~'ria hansFOIi'J"I:1iad.a per este pl;;lismfdJ~ reeomblnente fi.til!l.'a re.sistentE afi .....

iii.;;;$. a 'tet~a.cklin~\" po ... ~i'ii.'L ,con':irLIJ.l.a'[',~" sell "~'lftU:1 ii'i iU:flipic'lhna (feili!Dtip.o' Amp ~ !f!tlll:) .. . om.oO as ,ceJJlJI~ 5 n~o han:sJOt'~tli!Lda ~ern ~:e1l6Hpo Amp" et~. Sieja posshr'Ii!'l distmgl!dr de imed i.;IJt,o, num le$h~ em placa de f'tE!tr.,~ ~bast;iL semear .~:S c,~h.~~as, so.b:r:e

1.0 eempleto adi.dofl..3do do .ali1l't.ibi6tioc), • S ceJ.ui~s n:~,O trans iorJ:nad a , das eel~.I, s traa.lsf·o':fI1'l;,:l!d.;;IJ!i pelt) r~a:unl.£deo rec:q.I!1i.h~trlai'lil!e if, aind a. mats im.poftalllte,. daquelas trait~:d,o:rm!iLd as pOi!" III 1lf'I, plasmmdeo 'tlI.ii:o' '['e>LO:f:~bimLl:Lre. tl~ ~4;'!,~ilI., ~]ll que (1.;10 OC(H:te1J :irI,S'fl"~8JO do fr.!lgm nto estrange: ro: E~s. ol:thnas 'ertl?o resistentes < os ,dotS ~n.Ubi6Ikos ('i\rnpli "]'oe~Ji;). A .pas.sibHid.;lide- dr:!' itVl.~ .~M'tivl:I~Q h'll!:i@'l'dmtal, aa.ll're~;atlido, Ilj:tn {len6tipo t~dlmefl:te r.ccO'L'Ilhei,Y'~I .. que· re.sli.!l~ta da pre~~:'l>t;a die (i!ois, gea,e ,d:e- r.csis.,:en:cia co':o.telt'ldo sia i06 de C](im'l!ii'lg~m dit'ele'l:irtest :r.'ez do. pm022 '1.m1 h'llstt'lUmento e~ trem;;lill1i'"frt~ tHd em Eta~~'I!h..ai'u Genetica .. Posteri .. ()irnt'12Hter fQnm. construjdos :pi:il!smi.deus ,VI and!:!. 1l1i;;l.!:5- .. per.fci.;o~dlO$ 'pan'll dliIl!· etlilpeI'lJ~~'r o pi!rpe~ de veto es de iE. e.rJH. A;ss.~[],,,. po:r ~}iil!!mpmo .• 0 pl~!iir.nifdeo pUCU3. C'ort~rn urn grande mlrnero de sit los (n.iil::'Q:ii pa ['~~ di,fer-€r.lIte'S en z'iln, s de

[',~td~'1IoJ todos reunidcs nama tlJllim.C8i regiao, ql!l~' {oi denomin.ada de' polyllnker, COImo 00 polyli n k~r ~'S-~1i sit1,..!.F.i!d{~· d(! ltit'O do gene Il1cZ, uma il:1ls~r.~t(li de DN,A. !t$t~,a_ng:eiro em qualquer 'Urn. dos siti>os do, .po.:iyUn.ke:r i.r~" i;lica1'l'etar :ill inathf,~!~;lij!l) insereiena I do g'f'l'u:~ JntZ. :S~lnil1!~I'Ldlo~se as celulas e.m m_,@'.~o OO~'ii~@M.[) 0' indicedor X-Gal". ,as (:oWiliim~:5 'r,ransfurmii!Jdias, pe D plasmtdeo :~oomibrn2!]\'re .PO>-' dem Sea- facllmente reconhecidas uma vez qm~ passam da C,OlOI,ilic;aO azul !p·a:r. 'jb"r:anca .. Uma '''',;):t'!I~.,a$ n;'i adli~i-o·p.~lr :prQp.or<::i.QI:1i!ilidl111 pele po,~yHiiJ!1A;!J;. conslste Om! rO$Sibi'~~do;Jidle de se ][lsf'ri:r d:~lI.'e~'a:me.n:1:e- urn. fr.ilJ~:mA;!trt(l! co-m extremldades g,eradas POl[' duas difll!'re'.l:'UiIl!s ef.l2:i.fn. S' de t,~str.ii~'ao (desde que exista ~'Ii sJUO$ :Pi!l1r.a elasnc polyJinke.r),. se'llil·te~E" que recerrera manl . pulaeees ,,fHd@a:!J::;;,

Por outro lade, foram taJ]ij.b~m. desenvolvidos si:s:ltem..as de dona;gelll par~ b.ader..ias, ... ;e'.m.,pf.le,gfilildlifli 'N!l:tri!'ru6f,a,go.$ ;;Ii!)} hwe.s de p.~aSljlL~d(!il)$.. E:sses sis~mas .pooPQr(i(lnarn maio;!; iaocmdadle de .isolam~riI:to das mo[eculas h ihrid.as .• pOi:!;, permltindo-se ao fago cOlJ.1du:~r o S~l1! dclo litico,. ser~ 0 libeeadas p~tH(:I1- Jas Mgicas ecneendo e DNA r ~[(m'IP'~n:;Jlllite (ol;i·i-em""'se f.n:·ihneliJle- l,nn~ ampl i:£i-(,al~~!!) de Hr vezes no ltsado), [nl:u:tanto .. h<t'lle-:r~ um i'~il]t~te de tauma.rnhio para 0' DNA qlU@ Sill! dcseja c.io;l:'iI.!i·It, ia ql,U;l! 56 pod.'era s-e:r empaeotada i'I.\~ ,c~b~;i!J do f!i!JgQ uma mol«UlLa de' DNA de um detemunado comprhrnentQ, Os ba.cterjM,ag.o.s te-m :ilp:mi.lll:udi8JllC'.tTl'till! de 10 a 50 $r?ItiE!s. e PQdeRlJ s,e,Ii" .I1.1Ji?lJiliiplil,a(l(!s pai!:',;t tl';iIlI1lSPO(uitlt Ql,lItr,O$. .S-eiO~5 em s'k.bs'til;ui~,ao, a 8JJ.g.Lms des seus, A5\5:irn r puderam ser co.nsti:ru:kllos '~rli2tO,Ii"~S'1 consistlndo do gie<ti!.(~ma do ib8icn:ni6fago- bmbda" do quail 00' removeu wm,3 ·res;i..lQ ]l.J.(:l essenclal r~r. ,0' deS@i1i\f·[}:h"imento do. ciclo litico, que pode portanto ser sub.stl.rllJlda palo DNA estrangeiro. ,Es.a ~botdafrm 3p'r~s!g'D'I.l.2l. a u~:'Id~ ~ ,,'a,ntag:e.Jlii. de que 00 DNA do f<'l!g:o. Se!f'1l'l ~ j I1Sii:r~,a,o, s.eJ.'8J pequeno d!E:rn.a:~s para ser empacotado iC:1 .cQ.i"I~e:q:ijemlteItUmt'er 50 :se.rao g~r.2l,d~$ p~i'H· culas (agic.a:s; (:·o,;ot€!rlldo 0 DNA recomblnanje, oofUal'lito CJiUiS! esre eontenha um fragmli:rdQ heterelogo die tfilm~:mho adequado :?~!'ra compensar a :I!''€!giil'io a.!.llsente do genoma f.<'bgioo. Pcsterlermente, tarnbem foram dles~n.'Vo~'\!' Id!a5· 'N:1!l:'J'Licas 'q.lII.E' pe-.rmihl!lI'Ll ,0' empacota mento irJ' v·Uro do DN A reeem hi fii:l rtl~. ObM;,~1f1-Se dess. maneiea UJ~.1J ·\ri.!llcS :inf!2'·cdO$o' portad,oJ:' do D .. A reeombinante, '0' que auments si.gI!'fJjfk~tivameITl.te a e-.fidef.llda do p,mc~SSOt 4;!i:TI" tel.a~S!Jo a transfo nlil.~~o illt,ii]izendo plasmjdeos,

Vmsan.do CO:~lbilfj<li!t' va ntagens dQS dols S~;S~:of;rn .. as diill! c·iQ:Iti~,gem., 0 des plasmideos. e' 4) dQS bi.!lJclel['i6fagos, JOt d~S!l!'.flLvoh·i-d.~ uma nova classe de OJ! t·o-res ~ ,~ lif1dais, os ehama do co rn6deos .. Tratam-se de p·]asJl!1I~deos nos quais foram lnserldas pequenas seq(~enciiil.s do DNA. do 'bact.e-.ri6fago Iambda (os s.titi.os, cO'S). :l1Ieeess,i,)f.ias p~ rn '0.' empaC(iiI~ln!!!!I'lih;J< do !DNA do .fag,a na (<"I;b>e~a. da 'P,~rI .'ell] I~, Tats ve~ore5, cO';nS(!J:'V[HiLl a caracterlstica de' sersm mantldos IiI;::) ibaC~l'~21 :$()!b a rOfftli?IJ de- pias.mrdoost. m,a$. :POt e .\ ~'IJ ];iJjdo.. podem S!2",1i" empecotados in v.ifro. oi"ugh,~'u:'1l!d(~ p~rH(;!.1!La..:S die rago,. capazes de :ir1lf,oct~r o;Ji b~tcter,ia, a (]Ull?, como j'a vim 0 5.' •. COJITIstu'tui IJJnl pr,.o~S80 altafnil!fillr;i: efude.n.te. Os OOS:r'I'iI ideoo continuam

iJj,~eitoo .. ~, I]mi~a~aQ de t:stoo;;!'riho imposta p~'~;;JJ ~ab<I;;!';.a tb'l. pi1l,r.Heililla! ,~;U'.LS penniU:iU {pJC seja eIl11r~cl[ii~'ada uma qjtJ)~fnHd ade nTI!,l ~to :rnahit d¢ DNA ~str.m;~g'('~.Ii''O (at~ 45 kbj, 'lJ]'m2I "leo.!. q Ill€ tmverm]rl [lefmo'!,i'id~, p'ratk~'~!E!nt,e- ;;i l,nttb~'ud~.d~ do ge.n,o~ fi1I<il U;g~!co. Em re~.a,~j,o aos plasmldeos, 05. cosm !~~(l::::;, ~,P~$$m.:t~~n a vaf'i.ra~e~m, dE! que i[j; ,[)N A pode ser acondiclonado em p.,;lii!'~·fCil,']i!l5 die ffagQ'. qt.u~ rsm.o multo lIiJ:ililS ,!';!s;t<1\~I2:LS. tper.rn ~~h"ldlo ,q,'!J~ e DNA seja ciiJ'.!i1Ise[''i!:;'Iidio POil" 'pe<dit'lid.os d@- '~~mlPo mais b:).ljjgOS. iExis!ertll ail,lIdtll va,riGS cutros vetores, d~'.ri:v;ilJd 05, do;) '~;;I,.n~(b) ~ dill' diktl~ntii;.'$ 'b~;;:-t~r.,UO(r';)gos. porem a sum. descrl.;@o foge ~O' escopo d.'es'~ Ctjpiilli'~o,. Stiio' d~gf'l:OS rJ,~ i.ilQttli os ViI!t-O['(!S e~li'tl1,!ados de f,::!Igos. de 'DoN A de fit~ ~:;jlitllplll;!~,. rom.iO'~ (l caso ,a,o b.,g,Q 'M~~3 -a.'r! E. coli'. porque fm,dlit:aJm grmJllIdemente' ~i!:t£!:::;. da:~ ]'::Jj5 di~ ro~ltiiPul£l~~(:i ~nr§:~:~Cil_ Asslm! [piiJ\Ii" exemple 0' Sieqjt.iJend!:l'm;e<.o~(} d!l;:' DNA. iIi 'm:l,l!t~'.8;j}ItfIf!!!ie: i:i'J' ;r:;itto iI!! ~ItWS m.~I'o~oo de :prnpar.a~ao de scndas :r;eqll,l!e.~ liIe-rn DNA de tH.,'Ii :[i;itrii,'P'~e-s." (".()m~) 'W'e-:r!1;!(rnOS ,~.d.i'lin~G.".

:~io case d1i!: o·r'g~l.lislnos euca r"u6tm.'cos, eonhecem-se .i'lI'~gil,llt~S POii.:i!eoos, [p,~<lis:.' [[]IIld~M ,rull.tl~:r.fIi~ Sll!,),. ,WI1:10, por exemplo, Q plasmfdeo d~ 2~Lir'l:'li dI';) :~iI!'/lM,ii.iJ:r.<'ii Si!'l',c,c,I,r,i1,rorlJ'yrif'~ rif'roif1.l'r'8i~t'. do qlL~~i se obteve :;I, origem de '~ep'~l(:~1.~1'I:[} para ~ !l:o)):ll8h'i..j~~.'O da ,rn.a:~O(rl,a dos v,@·tmes da leved IU ra. Para eutrcs {It,S~"'II~.'Ii5S:r:TiID$ • emp[1;!i!;<ilI'iiI,~8e vi:r;tls eemo veeores de clonagem, como e {11 CoiI!5Q ,g ~ v:il"l;l::i- ,d:~ m~,mi~ ~e<.ro(S, e d.e' hi!S~~'DS.

'F.8.mh~rn f'olrilLlII] c:u.L'1Is.tI,tuidQS v'etme.&-p'Ol1t,e gilt 'b:i.fI,i'l1iI(iQ:tiliils .. 'q1.m e{jiJiI,t~nll {lr.'i;g_'e!tlS de ,~e,p.lioCfi,~ao e mercadoees de ;:;e!!!;!~.f!o ,cum.p\:jl't:iv~i$ ~O(rn ,d"oj}s S~Slmn1i!JS hospcdelros di ff:e!p.e'J1tes. No'll verdade, a mJ:f~o.riii! d05, ' .... et.(ll[\l;!~, construtdos :p<l:m ,dHl;l!rui~Iif!S, e~~II.I~aS, .e!!JC'a.r~,6ticas cOl.lIsi:st~ de vetores bifl,,!iI:'H;j,O~i!a,USi U1,:ra2ii!.S de b~n~5fD!i"~ti1l r tanto .8, ce~.~ ~aJ eueartotlca em qi!Je~ta9 .q~;;',IiJ:Q ,ill ibi:ll(~:ri,.a E. coli. ~ iIl!s;tt.(I,lEgi~ ~ ~:riI:t(':roSS<'iii1I:e', porque 'peTn1i~;e que' se]~m aprOv.e:i.liildas as '!tan- 1';9g.ens dos, dio:i::; :!l;is.ti2:ln~S :hios,PQ{ljeit'oo. Ass~,~l, ,p;or. exemplo, embora ;;'II 1E!\H~d!ut.a I,(tll'lbr.rl'ii! sejl~, 'i,.n:'DII ttIiI:[.cr.,or.g(jji~isID.o, -ill ~ficb. e r!m;~~,t'{li mais ..;::o:rnodj,o ~;;JJ8'u:t.:~[" ~Igl;u"'!.ij; d05 paSS(i~ di<'ll m<'lll)ipula~J,o Il'nrL E . .oo~i eomo, por exemp~{1I" ;;I '!:I'~'1tp'Hfic ... ~,ao e' extriill.;:~to, do, DNA pl.!Ji~tlfijidi"':iilt II;) qt:~!2' gil' pode ir.oefl~ ~zar. com g!fand!e fadHd~de: quando S€' l[qmaz(II t~m vetor 'bihl'l;i!('~OLn~~,

QiUM .... dose tll:'alnlllllla c;n:nl g:eIlJOI]JHllS de eucarlctos sl',il:p~I'i(JIoos. ~ il'tees.sar.,io C'~~l~ii' f'r.a:gnll~rrrt08 grandes doe DNA. FSlJlI"ot! acomodar {,1l$ ftagme':t!ltos, (led de;5en;vQ\~v,u~~ iL:im~ hpo. '!J1spec~a ~ de p:~asmi,deo de le,-redl;l'l;'~; dll~m;}tI!iO Y.A.C CLIMS! A~:tifid~l Ch:wmQSom~) ... (~[i)~ e- 'LtliP<,!,2; die aceirar irL~1'~OO5 de ~3(lO' :kb ... Q'!!.i $~jaj ],0 vezes mais 'ON A do g:L,Ui! a,c~it!'l.In cs rl.asulddoos bseterianos. 0 YAC (".QDi:lfi!m todos Q5 ,elellJlili!ni(i$, ~~ !!.i'm, v,~td;i"ildleil'o eromossomo {orig;ern de :ri!f.p;nl(:a,~5:ol ,r:;~n,~, ;tlf.lomeror 2: te'~6(1iilE!1I"{:i!;;i; tliMiI1:i des g~n.es. marcadores) e ~ lPoid:;l:n:oo rnHot.io;-atLliien,ile' ~~I:avel apes a :in.se'.r~Jiio de frasm..en~,(js, gii'~fl.dQg.

:Em I~$!,]!m(j,. $~{) as $[tgi'i!~ilt~,s as e~'Ii'1i!JteJis.;h:i!i5 ql!.~e die'l8E! ~!t !O pbS:Hll'~doo. 1P~['a ser il,!t:iIl.;,r~,adQ como \-~@,~:6r die donagern.:

r1i) T~t ~:b~o. peso mcleeulae,

P.!2't:mit~ que '0 veto,r seja J'aei1I;rIie:rrfh~ i~Q~ado i[lt~t;:lto,

'Ib,) AiPretl(:~:1it<'l.1' pelo menos UHlI, .si.'t:lo (~llii(IQ :pi:lI'(Ij uma d,€'tell".minada '~zim~ .d~ te.std~t.il) {s~ti(li d:~ ,,::'iil)'nag@':m),.

r;t;frJ:'lil'~tl? q i1lii~' o vetor 8.€jfl elivedo [1 IJJ m s6 ponte, onde :5ie[',i\i insertdo Q DNA estea n:g~hQ. E'Ill.d,e-:tilt~irli~fLl:e-1 iii poos~n~tIi dl'! vtiJ[',iOcs iSitios ~li!''I:i;;;'(iis :p;II.i!",'l dii~~,reri.h:!s, ertz;urnas, de 're5tiri~a,o ,e aUa:m.,en.te d'e!'SejgtVEL

c) S~I' ,PDl'till.'d:o(f die m:na o,r.iJg;£lJl1i. doe, ]"e'pi:b;;a~'ao ,cO'm:paHy,el eom 0 Si5~ 'hii!ma !hosped~l.m"

Pe:t'mill£' que '0' \l\e~)iJr. se peepetue entre ~ dJe:$cer!ide-.!:1Id~ dI~ ct!lvJa ITricialmente tlraD:5:f'(u:.rrJ,ai[bi" (fiitiginando um clone molecule r"

d) Center ~elo 'me<,tiio$ "rm g~l'l:~ mareador.

Permite a ~l~o dQS elones t["IlI:NlsJUi[',n:lIm.n.cJes. dell,d!f.l!1:' !iln:~ gr.:nlldi! I.l(]~ m.e'fO de 'ceh.J! ~~5 su:IbITi.eHcttl.$ ao 'proc"C!ss;o. de ti'£Iii1s;fQ[".ff'I,i1I~a.'D'_

e} Ter controle rE!laxa"do, dliI! ruiPliea~J!O.

Perl'liire' qUE! (II DNA do pl<'l.sfnldeo sej,'t ~mpH'fucadlo" pos:£;ibili,ta]j~{li iil o'litl2,t1I_;;!o de ~uarLl:idl:i!ldes a iJ.ldJ~ mSi~s $:i:pltk,a'!·~'J,f,~S do gene est:t ~ 1i(~,iIli~'Oo.,

f) N~o ~~r 1n11l. plasrnfdeo '!Jonjluga'~·1,rQ.

'[':~!li~a·$~ de !jl~:1a medida de seguratrl,!;iI r visaadc evjt~[' a di~Inun:~'t;..lQ do, DNA :r'eC~J\I!TI.bin,a:tii't~ f,o,tn do ~a~o!mt6:~~,o,

,4~4 - ColrniS'tiru-:;ao dia II!l11ulffiec!JI,I3J. de! DNA, reoombWnam,el: diferentes, ,estrategiu

fJa cases em que ~~~o' e' possfvel .emp,rega,!!' enztmas de restr~~lli,o P';l[',f!i. ;Ii elonagem, 0 pri1lcupOilii pit{lbl~in~ advi§n:lJ do ,fa to dill! qll.li~ pede haver s:llios SIl:5r" ot,~~:~",€is ~ a~a,o da ,e'112im!:1, dlentn;)l da &e9lu:i?!ITi('U;;iJ Jg'~m1'~~,iI qil,l~ 5E! q!,1;e<~' dQn.i!l't; SiIlI1i..g{;i pi1):tta~:'IItQ' ~r.'ljjdill! a probeblltdade de se lncorrer '1:1I0ilI ina Hva\,iio dlo gene. F'a.f.& iQO(J)tO]!!l~1r esse p!r.t)b.iii;l!mal proeede-se a. lr-';lgme.t1l.'ta~aD ,1T.i:lieca,nuea do DNA .. ql.ll~ :gera (.llt:IJi~,bi!,"'iiJ.s ao ~ca.~Oj g.m I"lil:1itindo que pe:~o 1:l1I,C[lOO al;g,umas das miOM!cu:~rus :n~ sej~un qln~:bil.',a,d~s dentre do ,gene die lnteresse. ~ 'C()]~ao, de' fta,g,me"@tos .. !iJj~6:~iQ5 e mais 'ttp[\es~i'lit~.liv.i1I, do, g!]-'tlo.n:lJfl 'il" essa aJhor.d,i1I;g,~rn fo:~ [pil),ttfiii;lJto, 'ti!!lnte utilisada para a CQIi'I$~fi,Jr;.iIl(fi d.'~ b~b.bo~~fi$ g~n~in],e<'l!$ dos In~lS d:l ,~'€ o,rg~J'I:~s[:nos. ]flll'tl;"e-~'a:t"t'Or n:~i;o e II;!vidll;!lIi!t'l?liltIil?;nte pO:SiSiVie-'~ obter ,e-:olJrem1d fillcles· ~$~¥<'Ii$ ;a t:t'Mr{iS' desse proeedlmento. AIt1rn disso, Q eIl11F.':J:Ie,gOr seja de g;{:[l~S ' 't'eti';:;'O$, sej.a de ,cDN A. (v~ir ,luha,nll@}, 'h"111I'L'lpO'uco fo.rl'u!ce extremtdades CO!2-sJ:'If'ilS-

Ntif&~li!s· eases, uma ,al:t'4:'r,t1I3H va consiste no ,e:nlpreg'o da enzima tea ",,,,Ih;;U'_ 5~ ter:n-1'6na:i. DH~~nt!2m'!l".t1I,te diflls demais DNA~:po~.i~;-ner.a:ses'l· a 't:r,!Ulsf!2rase I

=.::i"'il.il t >el'~t~ltl:i"a,da ell:'!! Hmo d!ri1! 'v~'~lm., tern ,~ ~'.!Iip~l.t,id:a~ijJ' de {iJdiicim'l!@.ii" nucleoti.;.;:..;,~~ as. extlre-rwdd.adll;)s :::l"'OH das ca dei.-Is· de DN A. 5~n:Ji neeessltar '~,r! uma m:a ":0::1- 'DNA·nrL1.')~de, E5~.r. '~i:'iI2:i,mfl ,foi p'o:rt~iOH.i' muito utillzada ,c-n'li 'E.r!gerJ'~l~ rim Ge:,,, L:i.C.C{' 1_ POi" esse PIJ'IO![(!- d'iiri:'ii~~I'lii'(')1 ehamadc d~ :lTIli!!todo, das E!::o::t~ljs~es, homopo:: :;:1~~.i.'(:ii!J5, pOd!~I}'I! scr ;ilJdj.dQni;l,d(J~ 'Li¥:[COL die t 00 'rit!'$ld jJ,QS de '11,]'11,1 dc~~rminadQ :-·':.~deoIHde.o (per exe~'lfifP,lQ'i dA1P) ills e)l:t~el'lIl~d.ades do vetor e, por 'OtH,W lado, .;~ r..:a de 1. 00 resld UCk5 do, nucleondeo c{);n~plej]1J{:J:ltaI (n(ll (:~'Hl-1.1, dTTP,) as ~~,t·,r'€~ ':: : ... ~~ltie5. dio DN l\, a ser !inseddu neste ve tor, d~ lal ~'Orm);L 'q,U>f!'., CUl~a:rujQ 'e'St.M ..::: ;o;:;~],il't'eS moleculas Iorcm co,iOC.,'IIda'$; ,Il!Ul pl'\i;l'se'!.1i~~1.; lPoss:rJJrn. E!t!iil'P.tliPi?U:lillr-se ,~~'~,rn,"eS de suas ed['~ID~,d,n~c$. compleraentases (fig. 4.ll)1

.---------,13"

1

~---

.5"

3'

3'---

!DNA, IIg:;l5Ei :s~ Q!J'i',a!~rner.men1e 00 'fr@grTiiEilittl~

:S'_!!!!!!!I!!!__ AAA~ 1L.._~ _ _Jllt 3' liTCf1,.;rIi' I :J $'

,F gur.a ~_5 - ~t9;!(I. d.;'!s. e;.;ter.r;6B homqp¢1 ~r'ia&. Pm .r:~ C:). ~1'i.<Jri',J. ~i"iIl"rirl ... ,,_t~ ~i!'/;-tl ~aJ, :.;J.Q ~~~Iol'i'.~da5_ " ... ,,~.~. ~e:'1~~ oo!,~,~ ·r,<og;'ll';!!<'iID ~ po -dT'~!l 'V!!!I0r'_ t-SW &ITmiQ<!.de-; corr.pI~I'T"Pr.rr;~t~! flo 'i!tT.jc. ~l4<I' a.-~ 1.;:, per ~Q-C~ DJ\!,\ I ~ 1!D ~~reri',;,3. :'Qrmar-:;¢ ~ ... ;""I"Ia h,gjl:;.W ~ ~I.'ef I!1Ylfe g. .... ~iJt C' cdiJ.gJ'l'~. ~ i"i 'IfCZ'9I:: ~>:<~~:l, 00 -~-(lT, ;!9C1I!rt'I ~~'"'lbt!('f'!!:,{tr ~~,'i ~rlI:!~~ pcli ,.tC'pOh·{lG se Q!i p'$:u"'iQ~. L\! ;;:;J-

(lli fCrE"M dert.' e oG.TP.

Um . a vantagem desse :il'!t'I,~todQ .::> que nao htt poss,.~bm lldade de 0 'V: ~O![' ,"'o,n-a,II" a forma or.igiJ'b£lil.; so. ,~r~o reci rco.kriZiilIt-5€· os plasmfdeos eontendo ,ill il1l5e~.lio e, cnnsequenrcmenee, todas £1;$ 'C~h.1Ili;!i5· transformedas t:o[ltet50 0< DNA reeomblnanee, J~ .m'b~.IU ~ preelse eO(i!'fIsiaer.a.i[ que,. quando :S!2 tii'aiba:~h;!ii ~o.m extremidades coesivas ge['adas por 'WI rna ~n7.ima doe :re5,tr.ic;,ao .. a lelllil. de out!, s rea~6e5 parasltas, dlferentes fragmenea do D .' ,'~ a ser clonado podem lig~I-5e entre si, dle mode que teremas r.!:!'p.rl~~,i;1I:~.ada., no plasmideo reeombtnante, uma sitmll.;;'a,o dUe[lenre daq uela do g~l'l .. oma OIIrigilllal: seqfuend.as qJUI~ n~o er~ III COIll~ig:I,li:IS no genoma o.r:ig;inal poderao fic(J" c{liOti,g:IJ..as no plasmjcl~o .. A ap]j,cac;"ao do nH~,todQ das ex ten;s,Cies ho nop6HlllermC~$ e v Ha esse tipo de .a.rt.e.~21 ~" _' :tltretii! nto .. ~ desvantagem e que esse procedimente 'i.nh'·odt!lz Iongas regw!s d,e pares r(t!i:~(dA)-roli(dl) nas j un~oes entre £I'. d'i!Jl,jll' e pec]es de DNA, 0 (p.a~ pede ..lfetar a h,u;u;.ao geni'Ca. Outra diesva t1rl:a .. ge-m ~ q;!':~!!il! havE!ra d i.Jieuldad. $ (!oM S'~ r. mever QO vetor 0' bagmen.to de interesse, e·m eUtpas subsequentes da c- onagem, Hoje dispo.em:-se de outros metodos, que c·Qfils·ks:ltem €'il'fl. 51!!' racorrer a .... Ugadl(i!re~/" /.' si ntetizadcs qll imicamente, eO,n'lsti h,Jddlo5 de 0111- g,om;~deoHdeoo eonjendo a seq ~.'ertc::·,ua de reOOlnhlJi!!Ci:mentll) doe urna dei~'fTmm nada enzi ma de restri~io. Tals Hg.adorcs siiJo achc:ion;ados,. por ,a,~ao da enzima DN A ligase de'T41· as extremidades do DN A ~lll!e 00' qu~r dOitiil r " • tratando-se "'m s.egU!id~ e~te DN A com a 'iii: /lL,U:lT1£t de [-.e-sl:r.u~ao ern questso, ~et~to< odginRdj:a5 as ~)l~:i;'eln:i~ades eorrespondentes. Um.a. das vanta ', gens dessa e:s~ralegmJiSI. e' que 0. DNA :if1lserBdo pode de.poJ$. ser removido do veror, ~U\''iJ·~ do t·;.'!Jt~me:nt'O rom. iI.'qlj.'!2la det\'!rm:i.nadio!l·r'Ii;;;;ima de r:e.sll'mi;io" Heje @I'IOOilltr,arn-se dlspouiveis no, mercado I ig. diol'tl;! '~i:J:ltetic!Ds desse tipo, para ·qua lqucr enzlma de res~·ric;ao. de modo que (Ii poo:.sf'Vel inserir ,q_·I"iI..alqil.U:1I fragn:lien~o, es,trai.lIs:,~i:i;'!l) e-IJ'! q~a~.qlu~T s.iti.o. do vetor, A leCfidea da peR (ver a'ba:1xo) hmd)e.m permite que se criem as extrenudados de~.ad.aSi rl:O rI'agmen'to de D . A.it. ser 3J:npBi£i ado.

Quand« se reallza !.li:nl£l i'\E!.a~~(~ dle li.gaot;,!liio entre IUQle,ctd:1iis de DNA. dlge1t'l(~a:s por UIl'U~ mesma enzl rna d e: ~$.t.ri~~o, iiIJ i.rLse:r,~ao do fJ:~gment.o hete.rolo_go pede o C"Qne[' em qua lquer II,I:m,a. d as d uas o:r~e.tlt,<I.;;t"\i~~ em r,e.la~@jo ;30 vetor. Em certos casas •. isso f'ld'iiQ '~Iil\ "import,and3, mas. ern outros, necessita-se d <_ ,ttti[,adia do [1l':!lJgm,e'n !:o ,pe-:i:"lIas t! u ma determinada od.ell1tac;ao, Pa ra 00 t:er a :ll:ls-e'r~t€to lila orient;!)~.io correta, pode-se la rt~a.rr mao do iJ.t50 de dU3S, dife:r'!:!'I'lItil)!s· en :t.:i'!-n:i!:;ls. de :r:es.l:ri~ao. qUi!" produ..;t.i!I III dife[~ent~s ~-;: tremidades eoe siva s (!2:!d re~midades .A 'eo IB ), Como Si;iim~itl'~' d U"';5, exJre'Jui.dade-s A ou duas exti·.re~mkiad,e:01 iB v50 _p(}cl- r se ligar, a entrada do fragmente itt) "\f,erol[ 'tam'belTl:li aberto PQr ~S Inesrma . duas enzi rflliil£ de' re$trj~'ao.r- vai oeorrer . emente nujna das or.iel1ii:.2I~ei€!S_ Essa ,iit'bord_.agerJ.l !·.'unhl!:m .ap'M~e<J;ij.ta a ·'lfalll~aJ.g"(fYU1l de q u-,e '0 vetcr na.o, PQde1i'fl S!! .rnc-:i.i"(ulktdlar sem iJ:1lse[\,:ilo,

o .fl'l!atl!iI"ial .gel eHco a ser ctonado p'Qde ser obt~do. ' ejaJ di["€'tam~.fih~ aJ parfir do g'~IDIoffla de' outre ,oif~a ni IUO .. s~ja pOor meio de si:i:'I'E"e~e ilf wii ro. Ale-In d isso.. quando S~ ·t:: .. lfihJe-c~ iii! seqiit'ndiill de' aUli I1'IJO~(;id.05· da P]iUil.le'ifla (Co;Jj:!iIOS pou- 00 fr{!\q'~'£lt~S) s e p'Oss,~v'!2'1 ded 1!l2iit a sequencia d(l: DNA que ,R codifica iI4 (libt.e'.r !))

zene atraves de ;5,iD'tC'S~ q ulmica .. Essa lilJUma. ,ab@rd~g,e:n1 s6 ~ vi.!·'!,1~'] no ea $00 de po.'Jmpe1Ptideos !2' (oj empr@gadla fa: a a c1(tln~ g·e:m do .ge'fie.· da somil.t.oot,C1.ti.n81· um ,f!q]uen:o, hQrm6l1t~o de apenas 14 aJnl~noiicid,(1<Sr lii:m,do· ¢(Hl$titlLni.do. 'I!.Un dog primeims s'UeS5OS da E!f'Iis·eriheir.ia G Ii:~Hiel!l~')"

Bn:~.r€!:tant!!J. urn dos c~tm:tf1!hos mals d.h'!';!'lIos F.(tra .0. mso·.lametrro de um d "'rerminade gen:e consiste na d(lii'l:as·em do qlii~ :::i'e c:hal1l]ai d~ DNA c.or:r;rplcme.t:r~.I7.r ~('DNA)_ Sabe-se que 06 g(\l'I't1?$ de eU(,£1,riolOs :sao, na sU.a gra nde .M!'Ill(l:ria", too'g.e_ nes iP-aJHdos", isto e., .apr es enla m <Ii $e;q-(~.e:rrtcia ood ificard'e i:n1I.b;l·ttompidla pela !P'r:ese[Ji~a de hltra.rrts" Os introns s.1iCJi .. eg·u.endas :i""a,Q c'Qdificad(fit~ 5, qllle .rt. o iirao· resultar [em 5.eq(~~llcias da p!J:'{ltema qt'L!I." ,0 ~'ene eodl:Lf~(~_ Em !l::o!J.l't.rapartida" 'I) RN A mem:aJ.gil;! iro rnaduro ~ o rnolde ~iI,.IIe se,ra lI.J t.u~ i:z,)(io p!illl"i!lI a. S~i'llte5e. cia protelrlla. AsS.~:r"iliT quando. rt pos.:si'ye~ iSQI~J:' 0 mRN.A. d,,,: uma dada. proteiue, a d{~rt.agem f'i(aJ :g" ndeme'J;1l'~~ t'fl·d.Htada. A patHI'" desse m.R:. ,-A pode-se Qb.te:r 0. ."DNA i,t:~ uil.'ro., per ;;t'!;ao dill enzima ir;3itJ$(tHas8' Jnversa: eS5a enzirna e' capaz de sintetizar um DNA do dJup!!iII Ht~ ~ par~il' de q:Uill.Uq,!,:Eer molecula de RJ\I'A. S(illlido 00 p![,oC'oed im~~,~.o· muHo SEil'Jil:p.Hfk~do. quaado 0 RN A for porti'3!cl.Of de iU.m~ .s:-quend,a. poliaA no seu t·"'r.mhtaI3V ... cemo e.o caso des mRNAs (!\.iCari6ti7 ees. A f~,g" 4·,6 .moo~ra os passes neces$.h-,i:os p~ra.~. (lbt."'~~ao do eDNA_

Qu~tn..do' !f'i~~) se ~o.d!2 di:5PQI" do g:iI2'ne lsolado. a .@'s~:r~tE!igl~t oCons:i~~·~ na co 'liStmc;lio d!2' ti.m co!e~f:iJo de' plf.lsli1I:lii.doo$. (011 :fago$.), eentendo i.llaos 00 genes, de urn dd!2'r:m.inado oeganismo, Para obteJ' uma hi hf:Wi()te"I1' gerl'ilmi('t1" Ou bl'mc-o gtmi)mi. ,(I', .oil gefwl.OCflI d"e-ve-se p.r'oc:oo"·e:r i\ fragment !i;io do ON.' ~Qtal e)(tran'~o do oeganis:rl!1oJ. de modo a (jifijgin~[' !ill'il-~£il ,co~~~o de f!('.ag;mj~t[rt05 alea W~ioo. Isso pode ser cO'!lIse,g;lddo por meio da .. frn.g.~tii.;;,a..o .1'iI:v~_lniea clio DNAj Q'g;I. fo,r n1l!2'~uo ·de IllITt .. a digE!stao 3iP.If1Ai$· parcial po:r uma ou .ifir'Il~I'ii.$ enZ;Urt.'1l£il$ de ~·.es.tir.ic;iOi, f:.n geral, utiliza-se U!f'l!1a Ertzi llli1 d.e restru.~!(ji qu recenheoe I);Ima seqtre'1lcta curta, como' a enzhna c$rl/IJAr ql!l'€ .rec~nhece uma :5leq]u.ea.lcia de -4 nucleondees, sob cO:l:1Id:i.~:5es i2iil, ,que :lf1ao C'o.UlS":U.s:a dige-rir 0 DNA 'por eempieto, ". essas OOrt"dj~Oes. d·~ !f~igJ;ts~ao p~ iI'(']ali, nern todas as lIl1!Ioloct!!l;as de DNA mao co.l"itadirl''': ~rn tr.:ild~oo os ,sitioo SVJ5C€'" ItiV€~5.~ e.n:z:hl'!l~1o e ;ilJlea[l~~I~* port3['111iO ·l.u;'fllit dm· 'Jt['~bui~~ D· qua se r-aflld!6n'l.m'a de fr.agmentos, Com esse <:ullli:~.iio de fr~gment\os~ pOd.- -se en hlO ci'11;;'lt uma OOnii2~. 0 de p~5midle-o-s. hiibddJoo, .t'·I2'.p.il"esentaJi·\1a dQ geno[]1la ·ini'c1.Ii.O do. orgardsmo .. a !"!ilime.ro de clones i'l.eces:saJii.os raf~ cobrir todo 0 lflllOl1l8J S~l'~1 diferente, .cm:'ifr)tme Q tamaMO do g.enonuli do {)[g~.nismo .. A$liim, po.r i€!x~MpioF. utiiiz.alldo la.:obdlll C01I:l'1.O vetor, s·er.iio l"lee~tios 1.501Ji dQ!.!;1Jl:S recombine i1,teS pAlra construir u m~ geI'loroca de E, coli .. 4,,6.001 clones para S., .certl#s.rac e 0600[-000 clones pO'll[~ nlarn~fe'l'os.. iEvider!;~'eU'I.€fllt£1 !l) numero de clones I.'t~s$~dos val ta l'iI.\b~m depender do UI'ID·iiI'MO .mMIC!, doo fr.agmeutos: cp .. lall1to maior Q taman "liO' do fragmen tOI m~E"U)$ clones s@'ri'lio ne,c"'ssa:rios, Cons qi~en~:elnen:~'e.r f~[~a. a rt¢!1s~ru~.fIo de OO:nOJ;S. genetirosi preferern-se \!\G"i:ll)i,res qt:lie flfC@lt,i";!'ffi £-r.ag[;'fllei"l!~'OS grandes,. tamS como cosmidws ou YACs,. Uma @lll;th'liIJ aibQ(l'd~,gem consiste em se eonseuir UlOOi;llVihJioJ.fftl de.' e.DNA. a. p-an~r. .. lo mRNA t(lit~f de uma d terminaJdlac~lu]~.. l\. bibHot,I1l'(.<1I [die dJi .A.,. €:ntrel.ardo" represenra .a,pe las os gen.es q.u~ ~·t~r)o se expressando naquele delt!ltm]lirtado meI'il'1:Q'!I}~() da vida da iC~elula, Ten·do em lIJilaos uma ibiblioliecoill ge-u!2hea .... pode-se emp':r.'~ndler iiIJ busea dlo gel:le. dese:j;jldor como. VI2Ii' E;!'[[J;OG· no' item ·4.'7.

srni:e!se. ea pnimalra

1ita dEl QONA

pi'ii!T!tir ~(dT}

ir~I1I~~OO(l Il'l\fer~

+ dN'iiPs,

mfiNA~' ~ cOWA g; [

fJ;AAAA.~ $' TITffI S'

rrmll

SdIClI:e~ 4i:i segtmld:;l 1fi~1 de eDNiA

0'.'4J!. pi1IllfIei'i;)~ . .. di TPs

Df'tA. ~iga:SE!

[I upla I'inI d'e., (i1!)MA

'Tl1Tf II

Fi;£~·",,,'6 - Olx~d¢ .:ONA UInOos ~~ ~ se OOteI ,£Ii"tA '- partir do fl'IP.J'-.II;. C1.~o. QlJt!! (~ 1~"r:nonte'lilrliI ~1"4J19 ~~ na sua ~ 3', C~~ ~ inQOOaf.o 1fIi"I~ ~ oI~ toi;6o ;fidT) qll!e lri'ig. 1:"I;;ridar-ie aotPOlQ!.~ ~ como pri.'t"IeI'$ p.iI:1l a'~ ~.as.e- i~'S<I ci-il,'etiz.af iii. ," fila do eDNA. Pata. r~r.a ta de ~43, rrdto::J.ta h~, h40 ..-;'ilia:> ~~ .. IJIlTL3i di!1a!i.~ <:m utlfzar a e.'lZI- 1"i'Ii!I~~ HOe E. fjijJr.~Ir;i.irqodiJ;yifl~N·!Q.ade FUo\!Aq;~~~~13i~. TaIs.II"I!~ 90d ~o 1Jij1~ C(ImQ ~,de' i~ ~11! .a 'Cf"Iz,iroo DNA·~ rr..c~ I do! E. W, q.re ir::! 'siroU!bl!1lr ~ ii'fiIiI ' cDl\lA, ~ r;tQI'" mclde a I.~ f~.1I. Ol1.t -mo~ (Of$it ·I"IOl:<J!:W,lo.ck! D.NA~_ qoo i~ ~W I;I~ inbe~ "!;JD~~k:,

Re 'filllite.n"l:e.t1I'f~, foi d!es.~obt:.li'ta U:rn~ nova t.e(til'k;a de s.lii"l!t~ de 'ON A ifm {liE lJ",Q', (pll'e' permite 21 mpliflcae diretamente uma deter.mi.n. d~ !!:Ie-giao do ~en(;lrn~Trata-se da te.cnkae peR (Polyme.rase- Cfldi:,~ .R~,H.lm) I, qtue (Ie'VE! cum imp-.H(,~"@ t;ol'lnid~.'V~'l em Bio~os:r.al Mo]ecuhtit. Para ,apiicOlr a peR. e entretanto neeesssrie

~' .~ c<)~'!!he<'l;'am.,~ , seqO~ii:ci~s. (-.ZObp sa!o sUlttd:ent~s.). ~ue l~CI!~ialin a :5>eqiH1!Il~ .::~ DNA die intl!l'f{.'$S:· E pill.r~ poder pdm;f'~l'fjl~t'iiil;;!;nb;:! proeed r a sf'iflee-e qll.:li:t:rtm.::::I i~...,tes oHgfm.ude.oHdeos, qil;l.e iraQ. e ]tao servir como h;'il~da.d{:.~e.:.;; do ;tt":..:eSSO de pohrn~rJza~iilo (p:rim~ts)_ 0' pr.i mer e 't1IiI;;:ce,s,'SGlJr.io porque a ~,-4.-:pol:il"blet'. Se requeruma pequena regia(;! de DNA de dupla fila p1:lr~1 IrJid.. .:!. "fn~s' d&!l nta~f~Jl1a.:' <1! ;SI"l1Ide v(I"!:'!tage!l:m11 .,j, que, qU~'r.1(h;i se uti.~uzam. dois ~,~ers. s6 sera sinreti2:~ a p~ll~ DNA~po'IJme:r.ms~ t. regHio d DNA comprer:"'''::~Ja : lih:," eles, Em m.l!tr.:;,; ,pahnl:riiSF os p'rE~1!'iI T i,If.80 ~jmit~'f ,ill si:i:"flre$e' a l.HJ1i<li ~;~a'!.1 es.pe.r.:lfka. diD DNA. 0 qu le''l,~at'i~ a i!i';nrHt,k~a~;ftIo apers : de5,fl~ sl2'qu:;"J:i!da.

~;~ . .1_7), a prccedimento e b~st~1iMe 5h;tliP~ s: uma p.,i:'ep~ rac;;'ao d@ DNA, ''ill "" ~""::,e- consistir do gC1'llO!l1l;.;JJ 1i1te-iro do ol'~;.a'l;'tLm("j, It,!' 9rimei 'fl.i1f.i1ent desnaturads ~"; t'roillt'1lJmerl:!lt!l1i '~~'J;'rni(lo~ oe-liTIJ :pr-eSel~,a dos dols primers complementa ',e; • s se:-..;; • :\·d.a:s Ill~le' ~!id!Cj.Dlll1 o1Il scqli"'nda di!:':! mnrel'E'sse. -!!li! a f1J:libill·· <;:; fi tas diGs:na-rl..~ ra-

I .,:.;:~. Com .aJ presenea des quatro dN1P's, precucsores da ])NA~polirncr."se

I ~~..: ~~.ri.il:t'ila no sisrema, ocor,lI'"era a shi.t! lie da fila, simples . ernplem. FHa r aID 'J'NA-:molde, a !paTti r (13 ~:.;.tf'ii!'IIl'lm".1a.de ~rlaH de ,;;ad. 'p'rhli\€:t·, As irns cada dc'IQ Ja PeR ,e,n'l,~o~.'j,,!I;;'! 0 s.egu:i.i~t(~~

1) D'E!·iIlatm"a~.;l\·(l te:rrni.l"iJ da dHpla flt;;il do DNf\-alv-o"

2} .Res,fri •. mente, .p •. r~! perrnin r 0 empa lieJha mente doo pri mers corn as !I""',gjoes compiementares nas dUldS· fitas desnaturadas do DNA,

3.) :E:dl2',ns~,o des prj mers, po!:' 21~~Q da DN A~ pu~j mera Sil!'.

A. grande" • i'1tag m da rl(R 'COll1S1Sf na f~j_bilJd''ide de se ,liTp~fii r CJ! ciclo :..."'!~elro por voiirias VCZ~S" bastando p,artIJ lseo d ~nati"'["j;llf as TIlCf~. mo']',eruta. de ~;.: A dt!p~a IHa qjt:rle "'II' ao· se if:ll,:r'm;;l ndo, r2'm ·';;OJ;lId]~.Q€'!!: d[~ excesso de primers, 0 rs~:J] ~~lIdo, ~ l,IlT! crescimento e~po1'ile:t'lC"tlll da .rl2'gmJo de illite1~'5S "defu'lmd~ IP 100 (lois

, . .. d ' I 2 ~ I\. I'''' '-_.l

;-onrJlle'(s: assi m, repetln .. o()~S!2' r) cic 0 pot' ::;. ' .. -ezes, obt (!!mi'1i-:~e u rna • 11'1 p~a'I,~IC~\! 0 UiI:!

J:"-J ~)(U]6 doa ~-egmao d!~ il'~e-.t'esse. C(~m a descoberta de :i:J'NA.p.t)Ghn"'rase te1'n'U)"Ir:'\t:?-:i:srertJ(',s •. a r'CR pede ser ;;ilut,omati2adia e. hoJe !2'il'li dia, :!§ posslvel ~mi[ilp']ifcar S!!~ c";, uendas doe DNA de at,f, 30 kh s !Ii!~l'l1 ~lilaqtl:i!1~S pouco oncrosas.

A h~ci'l.ica d~ PC R 'VE!lQ revojueienar toda [l a rea d,a '·ngell!l'hilH~I.il Ge.:rttHka ;"'~"'rqWli!' per,mm !If' q lui: se prcduza 111 m.ll mil~adas ,.;6pj as de U:n"I. ~~gme[lto e;;;pf!djit;.() ~.,::; DN'Ar sem I:el!" que :rml!'r€ r a dor~;;Iig,e.m. Como l1'iI1enciol'll.ado .adnll;;li. li.una 'V ~'Z. ..; ie· s~o os ,d ois pr,br'i'le'rS que d;ffjil1i~i'l1 (II segment.r.t q 1Je- se quer <'11mI'I i: :i car. nao e :-:xcess.l,r.i.o i::;(:i~~ r este s.cg~'Ui!ell!l!l) p3.t'[~ PQder !llplioCfII!f'. ,PCH- A~eJj:l d IS$O· • .til qll.l,('.j rli~ ~;.~ad de' 0',",1\. necessaria pa:r~ comecar .:) processo eo ~i!'iIl!Ji~j pe~lIJilH'II~li. ~tfldo

~ufic~e:nte5· "'1'tla i1J'iatide ' da ordem de 111.g die DN.A gi1l'n.orn leo, Tam _pOtIU'(O E!' ne.:tt:;;,,·;;i.r,~o urn (.1 ~t()! g_r.l u d'e ,Pt! reza dio ON A. podeudo set 'mprega do di:i.i'If!tilll!l1lll'al~'i' DNA obt.id,:l1o a P •. tir d~ lise celular. A bkni.ca cl<1l peR e extremamente ·'.·er.5~· '~ e V em, Ql;.ln5eqlmCI'llt 1111 nte, eneonrrandc inlflll:leif~a.:s apj'ka~oe d~rHre ~~," q uajs se destacnm ' 1, d iagn6st.ico de di'~ ersas dO~iIi<;as in fe{lci,os.il-\ bern como

OPill:A ~~

G.1Gto 11

:

<t primer, oifNliP\S - DNA. P-O'~5B.

:!io"---il ~-~

11--~~--------~--c=?~·

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5'" L , F.~~(i!

~ra 1,,1 - Ai'eb:""i'il)~a<lc;:a da p:l!ti'!eras.e (F'CR). 0. DNAcoo~ ,.~~~ <I.~,I!iJ ~l;<1da (bam :sOida) e primef.:it!'iP!i'i~ ~rui'iido p ~~ 030 ~.aii.Ji'a .. ~ !ai ~~;!.o !~L :2 fitas ,00 DNA. MIle, Ofo.M.:poImc~ I~ si'i~~ ~ ~~ Iltas. (nas.d~~~pr;:!.3i:i~). a.~r1i.rOrl cada Llfifl ~ ~(ItwrY r4.o !ii6I~) e ~~(.::rno ~ ~ 'w~~J;,", 0 cicio de aq~nto-resf~Q;;!i ~,ate q~ se-ob·tcrJ,a a. ~I)~.da do f~Mel'iIO de DNA.. DI!v~::le' ~..¥qR". ~ ~ a ll"m~ Iii! ~Jgui'tio'1~~. oru~ ~i\IU:I: ~ 00 qt.~ a ~ ,~, c:rtas: ir'.ktGiuir.~ ~ brrgo o:m ~ ~.I! ,i'jo p;iI'Iar~ predomi~r """ ~ijio ~ finm 1!PCf"LlG ~ SlI!(j~@~ 00 s.eja. da ~~ndii ·ooo6:la i!fI~ CG :2:~_

de: doencas ,g'4:!1:'b§tkiil,S. AI.el:l1I. d'l$$Or- a ~U 8-enS\~hmdad' da PCR iPer!f'tlij~i-.:t Q desenvolvimente dl@ '-'DNA fm:tiIgl!!'fpdll1tirilg'\' (imp:ress€i@ d~.git@J~. de •. DNA)., uma tecnk de a:~to p{lde''!; de ,ecsolUi~liQ~ q]tl~ep(iBS.ibi.Ui.MI . a idel:ltifi<:!i!J.;io die 1;ii1div:£~h •• - es (det€,lj[ni[,II~.;;]J(~ de pa:tern:~dade', de't~mlirt.a,~~ ;0 die- S~J peltos ern ea so s !p-()Hd~]B) .. ~ :ptutUf de a mostras di.mi:rbutaJ5 do sen IT ' At. A S€'!ils:iJbUiclade da FCR ,t§; ta[ q[ltE! j\R iPe['mU~ III ~,' ,ampliJka~lo' ,IT!' o'lo,nagem de DNA. Q'bti·ch) de mumias hum;l!nas e' de p,tii1lli:lIttiJ$ ili!! ~liJi'!!nais ja. {!'.:..::E:hltOO. II; ~b.lka ~:tol:ig:~~lC~i;'II da PCR ~ a dic$.p.~ ibi-· lid de dos primers adequados; e precise S3Jbl}ii qua.i sao 8JS s.eq(jj~i'1:I::t§!t, vannhas a rngiJQ dJe i]il.rere.sse ~Ui!!! se desqa :iUl'l1ll:l.~Hiif'.iJlr, Ent.ret,~Jl~>O, qIlMlJ:'lIdo se dispo-e die U! n f.r. ,g~entQ de DNA qualquer .. ins!2'r.ido 1i.I!.l,m vetor conhecido, ,t! 6b'l,l']o que essa (H!ki!.dd;1!Jd€ des .. pareee, j!ill (j]l~J2' s!]' ,rod~m u~i_lizl'!Jr como :pl",L~'Eler$ as 5eil]f e-nci.as c .:il't~'s:uas do ]"roprio 'l.l'eto,r.

4 .. 5 ~ EX{pTeSsio, da in'QF\l1'uIPO' pnetka heter6lbgil

Com. OS die:llen"""QI.vimf!i'lit(l-s clI:il l'in.,gellhfll['ia Ge'ne'tica, ,e. hoje ,pOSS.U\fIl?:U expresser 'qiJ.a.lquer gene IJ!'In cp,lalql!.ler org8ni.s~no ho~pedej[Q, desde hil..::~ii'i~$, leveduras, fUi.'i(g<ls. J:u],a R1!enl)QS,Q$ e inseros, aJ.e· p,hmtas· e· mamU:e,r;os trm:'IIsS'@-til'~~ cos. VeE:or,!2's ,~~pe'dj! Hzados tivt;!ram en ret" .l'to de s~r. d.E!' .' nvolvidos .. par,ilI. nan 8JpenliiS t:r~ii"II$:fo:rmar eficiclf:n;;l!menter mas ~ml1lb~m fO;rl'llCE!r ~5 ,co:ndi~Q;f!s I'I~e"$'~ sarlas pa:i:'~ a ,et~pr;essa.o dio DNA elonado em. ea .. d, um desses 'r.iJpoo celu lares.

A sinfes!l!' d .. e -.:i.ma protefna fU!ild~i'I J a pa!l:tmlr do g.~.M· dQ:itiliido dle,pende de

v,a.!"h}s· P{!j5SOS m.e:t£liIb61:ko.sw que d.evl(;!',r~Q' S!!I" r~Jizados pela CI~,Ul:il~.a hosp<edlem:riiIJ:

I) ra:tllS:Cf,i~ao clio :genel ori.g~'U'I,aI'f1J::kj· o mRNA.

2) P:n)CesSii!lffiel.lto (""pl·lcins .... ) do, m.RNA (i'!,ie' ira remover as :1' a gioes co:rr~pU\rild,E!n'~es 8JQS :~i'i!~I1'.()·nrfi,

3.) ·r,il.dl:u~~o dJo :mR ". A em ]>rtNteiill:r.,

4) Precessamen to :po&--tra(h,]J;;iQmll~.: 11.8. p,ro~ei~las· qu "'r U Ilia vez sin,~tLza·dfiJSI .Itt:(l;;1'ssitam ,f:j.~I,'IIda soffer modi fi('a.~a;es,~, para poo>t:'~'E!m tel' adv·j '. ade biolegica.

5) AM'ln.l disso Uma vex pronta, ei prectso que a plrot'e:i'.rt.a .ht!'t~!I:',6~o:gi) .rt.1B.o seja: degJ;iJldada. pela (~hda hespedeiea,

E""Ed~I.lIten~enter uma f8ilha. ern qualq u er tllrlIl desses passes r.esl!,lltaJ;~ 1U ,~usencia. do, pro-d uto do gen.ii!! elonadc.

11' ~J;~ g,aranH[' a ,e-xproeSSi!iQ do g'lf:nc elonado, JO!F,!;! m desenvol V~~d6S \l\E!'l.or,e5 ~spec~aisr chamados die vet,;;,re5 de exprfSSt}o, que sao. p(',jrtsJdiores, dos d!i:'W'(!'I:'sQ,S iil!~em~ntQ$ ,geneti.c(ls [1e,r;:e$S~hios ~s eta.pel's d!2~'~'l"anS(ri~ao 'iii' de 'tr8Jdu~I'o qi.:i!~ a c(i]uj~ hospedeira d ~era realizer. :E in:'Lpo.rtante resseltar que dH~r!2'.l!"I:~S sistemas, hospedei res €!xi\g:em elementos '~~.pe<:ifkO$, Vamos aqui nos I:i!fllit;a.r a des(:[!;'Ie''iler '05, :li'eq.!U~rime!"lJto~ 1!1:s.p.eeJfi.'coo da ,c~~'I!,l~b bacterlena. N8J Fig. 4_8 e$~~ :repr(:se:mtad.o, 1U!Ll1I. :mode]lo dE v,et.o:r dJ2 !12' .. pressao para E. ,,'Cu.

F~i13i 4",jI - Vctor.;l;:- ,~~ de £. .;:06, 0 ~ 00 ~or ;::QfI'I~,~ 02j,el"f'ii!!r~ ~ 1'JeCeS~ pa.ra a ~ri;;lo ~oret('rmimdQr} e p3/,o!J a uacU;lo (fibs, ~~ ill ~I.S.O e> o.of6o:1o;"I de i~) do ter'll!!' ~~i~. A seiJi irdica '" d~ oi! . flUII! 000IiY1i:!r.i illraI'!so:~,lo,OO g.::n:: pcI,I RNA.p(ii~ dl!I ooMiti q!J'(: hl;;iti~ eU ~I!O r!!(~n::I:'-

'P,a I"a qLt~ eeorra a I MJ;t'$(f'i¢O, ~ neeessa in que <0 gene clonado est'eja ~ ateecaladc ,e-'l!'1Ih'l!! 111 i'D''Ii promo.llol' e urn t~iI"minadoif.' de tr.iJjruS:C::if.'i~ao - ~q]t1euu;:i~:. de DNA ql1,U;l! ~;1iJo. recenhceidas pela RNA-pi;)~il1li,e.-roiiS~ da c·lH!jjlbl. hospedelea, Hoj(!~ ~a fora 111 mSQmad,os d if!!~ntes promotores baoCt,erianJC.J5, 'lUI ;;, .a riam i1.~t:l,tU'Lto a SlIJ.iii h'irt€!ns.~,d.i\!i,de e seu mcdo <3, a.;.Jo. Os prometores fOll"t..es. sao aq!.!l!!!le, 'i,'UiIl! Sill ~:ent.j!Jm lJ,uiila ;;'IJH:.m taxa die trans(,fi~aor e {()if~tiiI L clades de' genes -Cl~jOS F.eo~ dares sjo f€qt~eddJos ,""FrI, alras concentracoes para (J; 11),l_1i.iCiol''I,~lIl'l!''rrto fIl[)frDlal da ol!1lda" POil: sua '_Z, os iPWtM·otorcs fil.'.iil'Coo. .r q,ll-Je sao lBeo];;I(iV:;Ilment,,, ineJuC'i~[\l'!~s, [-(:~II'"~ Imi, j::.;.(~I.1IdC!s de gte:nes C'!Jj05 pil"lodu ~:QS S~o. 81i.l.fic~ertl:€s em pequenas ql1,l~!!iJU~ dades [pant 0 flllfl(:iQIi.flfttll'lm,o nom] [da c . .'lu ~_- 0 :pe'lldI1!J'lJdio da fi.t1IaNdad.e- dJ:Iii dOi1'l1!lgem, , s vezes pod' scr interessan te 'utiliza:t' u m promotor ftaw como, per ~X~liii.'IJplt11 no ("aSCI de' prot -it~;;'IJS, ti)}tl:J::< IS para a. ce~.ltla hospedelra, EIli~hr "'UI'I!'1Ito. a si'h,Jaa'll id.e'.Il ~ ~ pcder cultlvar a b~ "ielf'ia perradora do ~e:I:1I,e clonado ate· a cultu ra atingi I" a ·ma.~h}til densidede de e ·h;lla~.r para :s6 il!r'liH'i,<Q p!l.·o~po.ealr a exp'r@ss~o. nll.aciii;'a, do gene' clon'''Ido. 1:.i1ir.a, essa fill!flJl"Udade, sa 0' n~lJ.'i to ~!tj Ii .. .:ad.os vetor '" centendo 'lim p'rmnotor r~·,t:Htrr,;vtl.f que permlre urrt controle ,miilJis est r ito da 'xpl"~aQ_ iEmn E. coli .. O'!I rnguJaliiao &21 tr~n£cti~1ii() pDdt: ocorser .. seja per indXL'~o10~ seja pOlIi' l"l!!!plJ'\l;!sslo_ Um gene mduzfvel e aquele It'I!l"j.a tl".anS(:tL~!io. S'O oeorre em !p:re-Se:tl~a do in.d '!,IMr: ge~r8J1 men re, <00 indll.ti:or ronsi.s.~iI'a do 5ub~tl!'~.to da ~t'Lzim'tla codific dill pelo g~l1e 'e"m qUr.:!'st· c, Em. ~"Dntlrapfll'tidi1ll, urn gene represslvel e' o!iqUl~I(!! CU~<l ti.i?U"l:SC1t{,~,O delxa de ocorrer etiil pll"E!~en~<l1 d<li Sii.jbsUnd!i!J repressora, Urn dos P"'OIt'i()I!OI'!:!'s, mais frequentemente utilizados para a I~X·' P'i'c. s~o em E. ,~1i e {11 proliiiot!'):1!' Inc, qtL!:! eenrrola a 't :lnS<CII"i!;ao do ,g:e[le i'flC'Z.t

{'{lriHtfka·drlll"!(]a nztma ~,-g8Ji.a'Cto5:idii!5e- E Sr;!' promoeor ~ ilj{)-u::£ tdo por .h1-clt~ ou outros jl-~'~~i;to:':idcos, como 0 jsoiPJop,H-fogaJados1do (I'PTG)" de mode que, 8,0 se ad.kioiLla:r 1PTC ~ 0. .-n~IO de cl~I,t!JI'l"a~ 0' pmmotor lfifif: enh'.iu;i ern .a;;~,o

'iii' h~ver~_ tll",~'n:st:iri~~,o, do _g,'ene ql,;~e H "'ell" side clonadc 50b o Se'1!,] controle, Outro pmn;10to[' b.zisl:2iJ'i.i:e- !ntiH:z.a,a"o, e' 0 p~mfi1l0I:o:r Irp. que t: :rll!:pr.i:miG!O pOii:' tr~.:pt.ofiiulO,. podi!!nJdo '~~a:m.'b~i]1J, SlI:;i!' h'I(l.I;i!ZW,t) pOi!:" ,a"dcl.o 3'''~l~clQI:u~,a(~tioo~ V:n:'i! P!J:IOI[fI.'Qif:Q.f extre-

m,a]1lgJ:i!'~-e' fOlte 'e 0' ,pII."omQ'to,[ ~,Pl' 'lJ.Ulll dQ5 prQrL'HJ!t'O'I'e5 re.5r9ns.~"\I'e~5 pel'9' tir'i;lIi~(rl·~~o. dos ge:rru::s, do. b'-illc~@'r.iM~go ~£I.n'tbdm" E'S:s!2:' promotor e reeonheeide lPel21 RN A'-'po'hmiS(aS~ de E. . eou, quandc 0 tago ,estii, deSeni'i,lol:'i.I'ElifidCi @ e~do I ~~~,eo, Quando 0 f,ag~ ,e:.s.Ui no dckJ; :i~sogerLieo. esse PWIDO,'tQ[ e reprlmldo pelo p'.ro-

duro do. gene- Acel. ,Os, \f,~ro:r.~s d~ ~xprosdo qb:I:@' e)ont~~]l i[i; premotor ).Pl s{5o luh]iZiilidios CU'IT! uma linh:1llg,e<~ de' E. coli" por~adJora de 'i!J:m~ vE!;r,$3,!) ~'Il'i'~ta:t1Ite' do, gt!ne d (110 p:mpilio vel~OIr 'Ci'U. ;B[litiiio num [pIof,ago), que sinteti~~t Ii.:una forWl!~ ter,J'D'i~~S!:2'rJ8Iv~1 da p:~OI)l};hla r,!;!:pooSS'Ot.C'Il el, Assim", i2"llli 't:cm.,p-e,Ii'\!l'tu Il''!llIS, a.1:€' .3OO-C. essa

1F.'[~lt'e~'na m:ll!IJ'fI!'!iilJ'E' m..l[ltem !iii c~,p~ddladE de replht!:~ r 00 iPtO'mol)~t lP J em tertfl,~, lP!2'ra hrras mlillis elevadas, a pm~~imli € ~ n.aJiv iii! dmll e. ecnseq tle:n:~;rne:!:ifh~, ocorre a ~1f2frilse[',i~Jo do g~J'Le- elonado sob ~st~ p.rom,oto1f, Um outre sislema die expresS~JO multo efi.dente, 'q,'!.le t1:tm~~ um p,mmoto'I do. fi;i!~,o T,r e- ~ RNA'"'ll>oli:m~r.1~ clio poolP:d,o Tft fo.i desenvolvido mais rceentemente, QIU2I:n.do c ,f-ago Ii :~[!Jifect~ E. ((phi ;!i 'b~(M:'rl~ ~ss~, :II p:t'ud'l!i!!':ir ,;li, RN A~l?ol:~m'l!1~t.~~~ de, T7'1 tl!ll,!], [I~conh~ee ,a.P-e'.L1I!ls. 00 prometoees de 17~ de modo que ~J badi&.rLa ~:5l$ii1 [.Ii a triilfn:S:C;n;::'!I'~,tr p~f~[I~rlJ.1:hl~memt;l: os g~rtQ-S ,d~ ]7_ "nr,m.n.do prmr,e,u'to de-sse tate, JOI.'am eonstrufdos ve~o,n~H~ Q:Filde- -0- ,ge1i:r! clonado :fic~j Slob Q ,!:";il):~H:ro~e' do promotor de T7' if que eO[l.'tel1'l ao a.l1I.esJ:l"i.oO te:[b',1JPO 0 ge:rte q ue codiflca a RN A-polime:r,;;J.siil' do f,ago" sob '0 (i):Qtrole de U~ promotor t(!g!.1lUi\l'e~ de' f_ c(JU como, pm: €xe[:til,p,lo, 0 proraotor 10e;. Ql~,jrt1!dQ se ~'r .... nsforma a ~;i!lcteria ecm e5s~ vetorf a ;e~pI'i?.$s~o do 8,~~j~ elonado OC{1;fn!! ~,og\O' f1itp6.s se .~fIi(hJ:z.~l' a, ~'~'ans.('r,ue;ao dill RNA-po'lilllel[',a;S'el' de T7" CO;t'i"lJO essa !RNA'"'polit"i'\Ie"f.;l:S-e :r;eCQn.l'l$OO .a,r!~lnaS 0' ~ro~:"U1I,otor do Jago, OCOJ"l''ell'',a, hailsoi.;ikl! apenas do g:ene clonado e nao dos demals genies 021, :rnoSipe~~el ra,

~~O'r eutro lado, ('(H"fI.'[} as b.a,'I;,'t~r.i~]js, i'~1'ilO :!i~O capazes de realizae '0 1F.'1'ooessa:m'l2'.rll.'to do RNA pa:m se 'Obt@'1i expre$s~o. doe genes contendn :inti['i0[15 (.r. grande :ma,ior,~~ dos ge<!li,€S, dE:' OIl",g:a11i:iSIl'tQS e'utar,u6tioo5)" sei!:",a, ~,ec.gss~:riQ .r['i:m!liLii:',i1I,m~rt~ h~ remover estes lntrons .. 0 (;;J;rni!'l!ho' ~1iI,l~S, dI:i.t'lGto !~ $.il!!i'mll, d!CI '!,dda realiaar a do:n~g'!?mn do cDN A-

lPi;'I!ir'~, ql!;~e QCQr~'~ ,!:I, l.r,(!Iti,rlffi'''~ e ti!eCes$A'it:i.{j, ,q'i!j~ o m RNA conjenha 'IJ.Utl ;St'Ho de liga~-ao ao lriboss-orn.o (lrbs,)z que inelui (I; c-odQIi! de< iil1i;cl.ill~~o da ti!':ad'l!l~~O' (AUG, 0Il.1. GUG) e uma s~q'i1~ii,ld<1l .eo:mplm:nen'bal' ao 't~l!"minal 3' do ~"N'A !tiib!:)$~ ~Qn:ik!l) '16$ (5eq~;U~!!:i!da 'Shil1.1E!- D~'Ig.a,(,[;iI(Ii,; cu S-DJ, Co.a"-ls@:qH€'n.t:emient'C. veto res de' expressao devem oonl1er uma sequ,e~l:1I.cia rbs i,(:Jg'o' ,e:m :::1ieguid ~ ao pro~;"ftI{lJto,r', A seq ill,e-:~d~l &'0 p'()dI~ \l'a:lt:i,~,r ern oomp~i,iU¢i:'i!~O' (3-9' b~) e [pre-cedJe 0 c6dO'UTt de' ~.ri.id;jJj~ao em. 3-12 bp, 'ES501 dis~'a:l:"'id.a deve ser re$:re-:u~;;'I,~;;' 'pa,fa s~ oti.H:er boa efl!C,b~nd.a da tra,du91o. () p:mcesso da i:radu~ao te:rmi.n:1il ~~~~ii'I!m'lldlQ fn'f' ~i'l:eo.n1rado lU;'1'I c6d(i~:'Ii Sl,OP' I(UAA; UAG ij)1Jj, UGA) iL'L) l'll1lI~NA,

No que diz respeito ao p:mce55;;'JJmeiOtO:;1< ,p6-s~lr:.1d,ti;cionai ~ as bac.~~r~£ts s2j,Q ~]iI_Cii!ip;;.,Y-e-s de :re;;'li~'b.:~it ~ m;;'li~Oi!:"ia d~s, rnod i:fUC.1¢!i!S earaeteristicas das p]''Oteili~S euciut6HcaJs. Tal ~ Q case, por e~elIlr10'" da insu:I'u~i!~ hu:m~~,~.a'i g,il.t@' ,I? s~:t1I:t:e't:i.zm.d8!

na fmma de um preclLIll'sQi" • P:1i'6-UI'liSulinar eontendo, , Lem des cadcl as A e E, ilililla seq,'uencia ad:i:dol1!i11 dE! 35 a Rtinooeidlos (a cadeia C), iimpo:rtrult,'te p fa qt~e i;Ii rnO:!;kIl.:~~,a a.e' insulina adq!l;~i'rill <iii S:Y<iIi ~:(mf(lll;"m~a.(;! tticl-im@l'I$:u~aJ~, 'im:h II' mas que deve ser r>E!m'o,ddtlJ antes que IlL ,i[1l5tJJ~ru~," se lOJ:'Il.ie' buo]ogk<?!TlilJii!ir:lte f'Un~iono;JJl; A o4!lcteri." l:'I~O ii! ~:p,{j2 de remover a eadeta c: da pr6-ins:ulin...?!" de modo qjUe" pilra obteor ill it"l5'1,din~1J 'n:W1m~l'miia a partir de bacreil:'i~, foi necessano dOl1!ili1l." e exp~ssar separadamenee g_.'El[l:e',5. 5iitrrt'!!:'!tic.amel'lit,e ,c!l);!'fIst:ruidos; das ,c<,dieias A @ IB" pVJidfid,-I~~ ~ ~ ~11I.t,'iO ,!~gtiJ-~as IUU;1Jl p!i!JSSO h, v;I.f.O,~ij; .Ass]m, qlll~:I1!dQ S~ de@~j;i obter m'lIl~ pl'olei'noill euc<'lliJ'i6t~c<l! rt]ju.'~ preeisa :soire;.r esse I ~po' d,€ m,<odiJ]c;~~Oe;5", deve-se usar como hospede-til'"~ uma oHnla ~l1'Car,Doti:efll como, por 12'.."«:1: rplo uma levcdura,

Em cartes ,f" sos, como POI' exemp'lQ '0 da ,e-:o;,p:ressao d~ $(lImdl'l!'Osta ~i:tiI,a e ~llted'~l"orn :~,uinOi[:l{joS ern, E.. ,e,oUr !ill pl'Q.teitl,i;I, $of~~ degtadla~ilil) p~~,2J,S :P',il"Oh~~Sill!S d!0li C~IIil,I.a, hospedeira. Fa fa c'ontOI",l'Ia .. esse problema, pode-se rea Hz r a clol'I.age'ffi de hH"ma, a resuttar numa p],Dtei'~Ja diE fusaQ C"(H'n al~:U,liia p!['[)!~:~nili 'na tlll"a'~ cia 116siPcd!ei t'8, Q qJue 'pr-.otegE .iii prot'ri!~'II'Ii~ il!$h',IlI:ngil!i ra cia ,ilI,.r;, 0 das p:ro~ t!e-21~s., A.S.Sl.lltl, foi possivel !!'Jbter. ~!i).'m£l,ros,'tiilhfi,i1I, pir.<od'IJ:z-uda per ,E. C:QJ.J'r so,~ -ill

fOI]'m8 de UJilil}~" fu "~,]; eol'lffl a p-ga~, crosldase baeteriarta. Para Iiberar a somat,(J~:tatil'l!L biologicttf1 ente flU va, a. pl'"{ltef'mia dloe h.lsilo P:I:'!U:J'SOU s~r. d:L vada, <0 'qtA.e S(2' cOI .. segaiu mun fi.;iSW :s.u'lbseqa~J~l'!e~ :reilllizflIdo in oltr« .. consfsttndo de tr.a ~:a'tTj,'e'J:1j'h:I! com il)r.{l:r'll'ie!tll) de c:i.@.rtoge.:rruo"'. E:IfI:~Jeta!lJJto", nem :se<~Itpl!:'lii' e. p o.$,s:L'i,l~l reallzar ~ 'l~ J.uo,ri..a,lll'e'IilIJ:e esse IJ.Htimo' passo: como (J lb'lt!l)iiI"I:~I:Q ,d.!2 cia~:log@i.'1Ji.o d iVa,~ ca d~lia ,p{lP'~ tidlic~ <ill eada Ies:£.dui;). d.t!, merlomna 'it 1:.1, a bordag~[tll exper.,m,nlN'L~a.1 so. h,u'!:dopa para p~pHd,oos .que M,O eontenham metiorum!ls internas, como ,e {), 'C~:!lQ da son:J.atoo~.alifll1ili. Um!i'll outra mi1!n~d:ri;l de' ii1,Ir:miilila'!'" 0 fi~{llb~k!m,a di.fl degtadi?l,~f~.:} P,iI''OlIe:UC<8 consiste etlil se uHU::Giirur como hiO:sp~d.'!2',irflis ~,il,lhag~[ls mutantes, qu,,!2' 3 presente m u m C(lomplA;!":m!~l'jto ,r~d'LI:z,DdJ{jo de proteeses IntraeeIulases, Tanl'bem a ' ![I(;~;,~iz~'fil(~ celulae da ,P ,Oteoill;ili heter6~.og;a pode :h'!.fi"lJJir ~o;JJ sua e5t;;libiUd,a,d,e na 'LcHnla hospedelea. Asslm, nO casn da 'pro-i,i't$iulillc, de r.~.to. !l!xptl2'$sadfll e-r.n E. ,'OUr foi ve'ITHka.d,Q qu@ a. m~iil-"'i!id!1i d~ rroc:e1n;:'l, ,hete['o-' loga, era die ... 2 minutes no dt.,opl<l!sm:a~ mas de ~2iO n:lJh~ utos IJlO' periplasma ,d;:l, 'bade:ria hospedlei,t./lC!(I,.

Qtii1lJ'Ido 9'!? deseja obter <iii $ec~'I,1".'i'" da ptO.t\\:I!r'i<l! ,codUiet'!lda pelo ,g,en.oe don,ad<o, ,~ ainda nceessaric ~UJ~' ela sej.~ :5:i.nwti zad ... sob a formn ,d'8" um :p"r'e'i:li.n'SDirr tendo li:t) ·I;!U ter.iY.i~Jltal aminn um ,pept£de.o-iih;;JJI,. '0 pepUdeo-:sJn.a'~ eonsiste de uma curta se([u(!i'J:.t."ia die .ii'lnlino-,addlCl6. bicl_rof6bb:Q!>i" QI,Di2' ~ ~spo.tiI:!Ui\~b!':U pl2']ilI, p-as:sag,em da prote'i.na a.tt.a"\l~, ci" membrana oelular. 0 peptideo-$hll.!il e :l:'IatiliJralmente reraovidc for ~~~o eli!!: Uilll,' peptidase, a m€dida em q ue a pi!'t~~ei'n.'ilI 'j,raJ~, sendo secretada. P!lJodif;i!~::i~ pO:l'tanl:o anexar 1iIiO' vetor de 'e-~'I!;;.r,res5a,Q ~ ~eq:~.emilcia de' DN A que c'Odif1c;;l! 0 pe'l?~ud!i!lrJ-sinal. de c l.gull'llfjJ proitelll:lfll normalmente 9t.!CI!'~t.a,da, pela ceelul.a hospedei I"a, de' t~~ modo q'll~ 3i clonagem resulte numa f!lJ~itl ~L"ni,c'l, na quam deve Seer. ob",el"'l.radtIl, a f,~se d,~ .€!Hu'l!' cerreta, pa a ortgl'mar {l p.-ecu:ii'so:r rroilie:~c:o oontelJ]djQ (II pepHdeo.s.:ir'L2lt

4AS ,= Il'sOiamenlto do ge;ne, ,dvonado

Em 6JNm;;'l! ,a_]1["Uis;.e'. i) $\!('ESSQ de um ei(,per:i:m~ttll'O ,d.e- .c'U!l):I:ii'''iI~t'i''l, dA;l:p~I'Hil2' da p;Oss~;bi.lidade do€' se d:~SI:iiiigui:t' '@ ,~SO,~8Jr. ;0 clone que ,con'h~m o g'e'A'Iil die i~b:!resse, Entn:t,~'r'!,'to .. essa tiilil"EJ", e :m;~Jta5' 1,"'ez!!.$ c:o:m:piil iijV'~:~ a se achar u:m.a 1llgtl~ Jha no' pa1he]l[io\, Considerendo que (I; tamenho do geno:...ma d!~ iJ,l!m~ o~:UiJ,l!~a dot;!' 'ITti1l:mH~ro '& de apreximada ~.'t~rrrt~ 10';; ~,p, il.c1.i'b''Ii g,~M( -5,,(1(10 bp) l'e'p:~esen~'a ::!Jpenii!i5 O.m)05% db DN'A t.ot:;lJ" 'Mes.:mo urn ,o:!:',g:anismo ti!(!i ~dmp~A;lS, qiUJanlQ' (]I f. roU oortJb~:m milhares de genes, de mode que 1Jrn21 d:ig'e5.'tao P'(l!1[ eifJ!:;-=i'ma, de' t,'~h':i:~~;:) do UN A t@t,;;]'U :~d, pmdux.i,t 1il~,{1 .ilpelli!a,$ 0 fit~gt.aitei:Jit,o, portador do ge'.t1Ie que nos :~ru:er,e.ss.::!I ... mas uma 'pop:u~~a~ijjo de h:agment!05 eontendc O'IU.tro,S ~n@.$_ ]J'i,.ir~nll~ ~ ~itapa CUa ]DNA. ligm:s~ .. todes (\!',~~ ,dH'ell@'n.'t'@s fra,grn!Elntos ,eslariilo, SlUj.eit-o$, a se w_se:d I" 5epa ... .i!!Q.ijI'~te '1iI'l!iIm~, Q·~s '11r1:0'1t;k:lJ.la~, dQ '!t@tnt. '!?,r OOil:'iiS~~,u~i.'tt@,m,~n'te, sew :r,m.'o ,prodiuzl,dacs (Hfernill~!Cs I;M,oI.eC'IJ:~flS de' DN,A [-.e{lo'm;bm.rude.r (:,~d,~ ii,JI'Ii[-ili 'COrl:·' 't~njl;llo' UID ped~.;o d.i fE:~e-]il:~:e !1o :g~oo~a dQ or_g;m,lIl;SI[IIQ, ,A,:p6s !iii .:rans['{!!r~,\"ao, da celul~ hMpedeira oom essa ..;:ol~iltCi de plssmfdeos '1;ii'l.bddo-s,. ~r.~, ,o'b!:id,"l tiilimb~m, 'i!.l'mn<'!, c(,!,1,~5:D' die: d.oi't~~ :ii'@cOo:mt'L'b'[i'I..i1J:rrl.'t~s. QtUUlidio essa c'Qle~ao JOIr representa'~']~1'a . dO~'e~wrt,a ]~_~e<]~'O, ~o. o~~~n~$m,{)'. t~te~O$ .!~~ ,~t~:~s, u,~~ b!,~lioltecj) g:el1,lo.r[UCa, como diescru;[!! acuna, it: portamo, necesserse :rod!~ir ud~ilIh,f.uc<'ll[" no

mele d!e55o;JJ co'le~~(]; aquele ~lo~e ,e$pe6fko! qua nos, j,nt.@rl?&S~" [)i.fc["€'l!Ites estraMgi2i:B :podi@'n:li SI!."I" uttlizadas pa:rll essa lir.JiaHdl8JdJe.

4.6. I - M~todbs, ~@1ioos

eon$is:t~m .e:i:TfI, $!2 iOOii"L~~gijji'i' a OOltlpJ,e:'fi'lI.e!J:lta~ao de alguma fml:~ao dielid-, !ll'n.h:: na ,ceh.daJ hcepedelra, Fo~, a:s-s:~rn" p~JI[ ex.ernplo,. qii;i!e: p5dil!! s~r ,uso,~adio .0 S'E!l:'ti12' LEU2 da levedura s. ,r4:.',r:e~,#s~j"j,£,'~ que cod:i.fi,eiij, ii) enzlma isopJ;'(lipi]~m!;lla~O-dE!5idrQsen:;li5e~ilt_ T'r.,;li1ll5fOilrrnalOdlo-5~ 'I"nina, 'lin.'lm.ilg'i?W.'L lytJiijt<'l!i'I!~Q' de E. eoU, ,if'llC;,l~ paz de p,rudll.~zi:Ii" essa enaima, cam l]iJil:i!l b:ib.lkAeciiI.i ,g;eno(''I'ric.!iI da :~t;!:\!'ed!ijj!i:',tt, fQlij ioo~.ad(ii 0< F,:Ua$!i'I!'ii:lid~ diQ (lane- ~i1I,(t'l?"r:l<'!,i"LO qlll!!:' m.OS~~O:U 'ter :recupell:',gjgJo ~ eo""padd!aJdle de ,p,rodJuzi.r a enz;imol,: este plasmfdeo era port~,do,t' diU' .g~i'I!~ LiEU2, da le~ 'I,I-edli!..it,~,. E:mbota ~~j~ ~x.t[',e-:ii'I'I,a:i:llu~nt.e' d.i.'1N~t:O ~ €'ftde.n:te, esse JllU~k:idJO exig.e 'q_u~ OOOr.J:'!SL a e);r[-.e55~O' do gelfte clonado ~" ~Mm diSI:Q ... ·qu~ a 'Pil'ot~ifi]<li :tJJi1jil!~1i'6tog:a des~atpi!i:'I!hc uma .fm,l~~o, df:iI!ec~~v-el I'b::!l. ,ce:~tdiil hospede-1ra. UJiTI. '~iI!!mpH@ p~i!liU:aI' de ,delte(;~~O' d'i~tiili do .g;en.e' e$tr.u'li..g~ir,o' J"Q:i o da dOlJim,gem dJO' g,eJTtt1 d~ ]wd'f~Ir~~ d!!l': ''!,1)8ga:~ur.i:'lie 'e:I.11t ,E, ooU: RCS c:o:~oni.iils ]'ooollJ:lb:inantes pUde-:r<"Lil't! ser idien.t:if,uc11!Jdiars pOiL'q.ue se to["n.!il;",~m ]lI,1Im5:n~l?Ji~es iliO! ~lln)!

4 .'- . ." M-· ··IL ....... .cl - • '

.'0.,£ = .. ;~lWOS IrilUfloqUIMILo.$

QualldJo a pro te:una, e5.tE'!;!JrIg,eh·", iOao '~'E!iIll U:M,.<iI fjj.:m,~.lo fIIlPaJN'I:lte na celula hO:SF~d!~i:ro;li. ~, n..e(ll;!ssj:r~Q etllil:rr~,g~"l:r' 'il.ctm nl'lftodo, de detec~lo imiU!IiO~l;I!fl!itl'iOO_ A. apl ~ca~.~{i; die um ln€Hod.'o :lmiL-moqm~miro val dep~nd~r dIG!' se d iSp(u' do anticorpe contra <ii p!i:'(j~ll;:'lijfi cod ifi:e8!~a r@"~o gene em 'ql!Je5t~.o' e P'~5'$UPQi? :pO[l.anto,. q'Il[El' e:ste ge-mie e:Me-jl~ l'i~liId,o eX:F':r~-Sl~'1iI:3:o' 'p'i?:Utt oiHl1.1a hospedeira. AS6im. "~II,!alQdlo S!2' p!i:'m~i'I!diI." ut~ ~~.z.a:Ii" CSS1'lI .m.'~h)do,Logiiil" cestuma-sa :p~ rti,t d!i;i! iUma biblioteea de

'C[lN A ,CPl.ln struida em vetor de expressao .. Embora existam '!i,r~:d"a,·~ \!'iI;H1;.oe5 die rastreementc im'Uno~,ogi.co .. a, l'I.1Ii11is popular t!' aqi1,le~.aq,'IJ,U~' se eaJiza diretail'\~UL"f!" com ,<I.s. coU}rJ,i;as t!l;'t:ij}.;rrnbino'lnt(!$, como es uemafia do na F.~g. 4",9<'1!. ,A;)i co·:~blfri.!ls (01,]1 pl acas de lise, no case de se tel[' uti hz~.d!o ill il'I! hl!g,'O OOIli]'lQ '!,I'~to.r) s,[!jo p]ilille'il['amertre transferidas ~KH" "ea rin1Jbagl\!'iintr da placa-mae sobre '1..[11:1 fUtro de I'liHt~J(!I;!:~ilJl;:!;;;~., IE se 'pro-edimAr,n.'t'o ~Toi!J S 'ere Ulwa .m:'iflO'slta d~ ·i;ad.!i t;QIQnia s 1IL1iil ntendo a. mesma loea]iza~.J.o das colonia$. 'Dia P'I;;ll(;',a e 111(10 flltro, 0 ,m~1iO ,~ en~ao tratado para ~~S<lI r as. eiih.:l,las e I!;!');.po·)' as prctefnas de CiilldJ1ilI ooWnial @I (Ii segllil'~[", i:lliIcu:E;,'idO ',{l"m (mil.ill :5oh."iio. CQ~.t.eD.do. '0 :0 .nioo:rpo ecntra . a pl"t:ll'il"i'm'lla. die'se."jada. Ap6s, remover-se 0 anricorpo MD ~ i g.ilJ do; util:i,~·a,-se urn 2;, ,;;. aaticorpo ,DiU • prot'~B'i'lia A d!~ SMf.,.JI:~,#t)a}r:~,ris. Ituj"rr r iP~r~ locanz.:.ar a lPo:si;;;ao do 1.:0 ,antioorpo, A protetll:!:I A ]ig~-se 41l peeifica mente a imJJltilog;rOi'bul'Ena, e, utili zando-se protetna A marcada com I "II ,<I . .d~~'~c~ll.o da (:u'lo.n~ qt.ue esM eX,pr..lmind.,Q' ~ p['()~~h'll~1. dlf!s~j<'Ld,. se :fadi pOI" 2I1U,to-t,!!I,d iQ.g:raHa, N.a auto-l',@.d~Dg.li'an.m, ... ~);.prje-s '" unit fllme sensivel a raios X ao f:iiUro ... pa Ii'~ 'e'l1't~o revelar-se iIJi fil me: se houver fad iatividade el"lrll alguma OOIbI'li~.1, ~pa re .. -e(,~ !._rna mancha preta ,IITIO filme, 'llila p05i~.iiio cerrespondente a co.I6n 1!i!J. endo side ide~-UI ~iC.;ld<il ;;Jj colOnia", \fo.lti!ll~se a plaCol-mae d.e {!lri~~t'n, ,I' ara r.eejjpe'.r~lr a's L~~:Ill.l;:} vivas, qt~e estar.rio r:~a. pMu.;li4;~ OOr~· rosp Qttd.::.:nte_

4,,6.3, - Metodo5 de hibrid'a¢o de' add'os nudeicos

Ess.es i'rfli!Hotlos :~if.'.ij.o :ldffJlt5'f.l,cnr- npr6pr10 DNA clonade .. ~~~..o :lfIiI!;:::~ut~'l1i!do PQ'!'h;m to qll!!>e a oeh:Lla eS~e]iiII e prlmmdo Q' ,IHO.:hll'E'Q genko cO'rr-.espcmdent:c. Tals bll.erodos b •. s~iL m-se na propn>edade qlUJ~ moMcuJ.as de .ij,ddos l'I!ud~kos em fita shli!.plles, {D'·.A ou RNA.) aplie.seutam ... de s~ assodarem ~Jtra,res. de pontes de hidlll:'{li,gjl1.~o •. ~OImiitnclo :moMciJJlas, de d1lJP~a fita hJ'ibif.',mdl~'l.S;i de .. de q 1J.:te ,haj~ lJ.un gmtll stlJiici.enl:e' de 'Lofn.p,~,~rrJilant.a llid.<ilde ~llil'h:e a 5eqfienc,h'l, de bases c~a:s duas: fjtas Ml'lllrp:!es.. Esse· lip-o de molecu (II hw ,~dla pode ser fOtMaido entre duas fi:tas de DNAj duas fitas de RNA, (Jill ~n:tre uma flta de RNA e uma fita d· DNA-

'E~ propriedade pede ser tuilizillida pal'~ ;;Jj idoel,tHi(;,8\,a.o de urn drf!'i"lI!iI:'ali'I,j- 1~<'Ld:o' (i 0 !'!ie' n:cQmilr' mIJl~~, basta ndc pa,li'<li it'Oto q!l;~e se di.spolllha de uma :!:lamia 8emWrn~ consistindo de DNA ou R, A ,cou1pl.cIfNenl:ar au' ,gene desejado, l:Jio~ de-se ,e-:m,pr€!g,.'If Q' !i?b!" in~todQ de ,cletecv~tQ, diretamente (hi situ)c em Co]Ol1iaS. becterlanas 0,11. em. pl. cas de, ii~· OE!' b~,.c.ter-to.fag'os~, como i ~liIsh'21;d:u' na fig, 4,91;1- ,A, tnli'~:::;' de um procedi menm ,anJ ~Q;go ao descrlto acima, apes (I; 'Ci[\r:scimelikl! (las ooliifllias." estas s~o .... ca ril"J:lba,a.al " sobre um fiI tr 0, de 1I1",II'OC,~,lul,os~ ,ou membr.a~~a dlft lI'I,jmol'i_ Esse filtro e 1Ilidahne'n:t~ U' •. ,l. d,[_) p~ra 'e:"::polr" desua Uf.alr e n-

. II:' 0 DNA die -c. d" c ~oo,i a e li:Viltao JnCUbifl,do @'.il:ll presenca da sonda ;gill'.nbt~.ea marcada, Pa iHlI sc obtcr Oi ,$[)[iIdiiii rti.~,rca(fLi;I"r o metodo dassi.-co ,CJiJ\!:l!;s.jiste Ilia incerpOJf;;l}.;3iJO de m:n nueleottdee tad ~Mivo (~P) ... de modio qu@ ,~ deb:';;llfijQ da ,Mb:ritt~ao'. ao pas ;0 fina .~, C' f\~i!t1lL atra ij,roJ!S de' .lrll,a to-Ira.a i ogl'flfia, ~I oj~1t em dJ i;I r es t~'-se dando p,r~f~l"eli!cla a ounos metodes de m,a.I!.~a~iio r 'l'lLlE' nih) envolvem tadj~lti~ vidade, p..a,ii'cb C . iJar riscos desnecessaeles ao r ~s:qil,li$.a,d 0'"" e !:I.Q njjl~io ,- i'ltibie~:'I!I:e.

~,do~~ 11'

f-ora:alj] port~!!:lt"{ll deseavelvldos m:11I~1:(lidl(lt$ a'ilte['nali"l.pij}.$ de marc..'{~Qj dentre os qiI,Jads. 5e. d;e'SI'a.c£ll~ aqueles qu~ se ba sela Ill'li [li!l ],'E!a~ao er:itl!:',12' 'a"iotina e' a,v,klJii\'~", estaJ Htm:n1;~1 i!lc'QpJ~da a um ma:rca,a..o.J!' d:. nIli!QI"eS~Ciol. ' rna vee idef.1HfkadQ 10 : JiO!['n~ que 'COI1MllJi @I DNA desejado, vclta-so a placa ar]ginal da qua] fol obtide '!J liltro eanmbado, ~ roil se recupemr as celtd~;s vivas,

I ~I>DIIi!li1i;1'

'tp ,dti~

fliJ

r-.,.ffi.l!,.'9 -1OC~<)ain ~u~ ~~b~tt-.<ij;~~por~dt:a.~~o: o~m· ~ e ideNllfbdo F esW ~~~ a pro:ei'rla..::o:l~ .~ polo gE:!"II!' cJoo;ado. b, ~ per meio,de ~~. Q' dooe recom:bi'Jartc- ~ id Il~ IXl'I' oooOOf' 0 D~ oern..~~w li sonda.

E posstvel re,[' uma sonda g:ellleti,eaJ dlisponh·e[ :rr!os segt~i.rrlll".:.s (,~$OO~

a) QILi..21 n.do SIB isolou !l) RNA C'O[' r.§pu11 de'JI! ~ ,mJO g!l!'OO 12m 'i!u,'esl~o.!' 't'RNA l"RNA. {)\~ ml~NA, Asslm, por C!:xempJo." 0 1,~ gen.€! t@'1Li,(~'td6tico a se:r isoladlo fo!

..Jj I 'Ilo." d. ~'il.. • d . 'I d 'r:!'N' A 1I:t,I 0; I

o s,ene Ul3 ,g @1OJ'm~ _ -. e CQ@u 110. a pa:rt:ll' ' :0 iSO~~H'neihbo - - 0 S@11 ,mJ: .... - _';l', •• - _. 150, a~'

meillt'o do :ultliRNA diilJ glC11bi:M, a pa,lI'ti:r die IE:ri'a:i"6r;:et!l)S e il,t:d:rem:ilmi2m!i!! :~.ilIdlitadlo" t:IJI:na 'V~7~ ,q,lJJ1.e 'CiS !!2:r1U'6d'tos sao c61u las espe<ia.l:uzaJdias.,. qJti!e ;:;6 produaem ,g:'~!l)b~~· ttl. , usa !!laO ~, ~~b'eblJl:"to a ' itiJ",a\i~o q]tJe se 'eriJica, para aJ g[',i!I!llidi@ maj,(l;ria. etas p.mt!2iffl;as. Como, ,:ilJhe-niaU va, pcde-se ,obter 0 mRNA ati'a'l';,p~s d,a Sua. c:iI!pac_Ma,-

de de dh:ighr 21, sif:tII,Iese do p,~odll]to do @ene d,e~j~~Q m.lUm'llil, ;$i:S;!le'fi!J,i.l ,d!~ tl'flIdu~!,o h~ ;pilr,'t;I'" ,m8JS est~ :;lbo'l'dJ~Se<1!1Ji ,j6 ~ filt.ilds, soflstieada, HCI~e. em dla, gira~iIl5, aQ5 desenvo:hr.iml(..!f.i.too na a:t'e.a de s:intese e $eq:O,end~m~i'lit,o de o,lig,@;nJ,:L,clooHd,€os, cultura e lt2lH:s:r'()iii:'n]aJ~.i§.ii) g.enel'ica de c~[,1!,:! I~~ de' m_oilm.l:f~itiOS'i' abhn da rCRI torneu-se 'bem mi:!'![ii, $:i,mJ?':~'r:$ a ta:r~f.a d@ ,oibt.e:r c'D:NAs oom:pletos.z ,as:siro" COLIfJfI.iO iii! d!ill! clonar ([:IN As a pa rtir de IIllRN As poU!co abundantes :r1£1, 'c~hdaJ de' orlgem, U:11.t;ilJ vez teJ"l~Jo' ern. infioo 0 mRN A, ests PQdJe ev,ider.!ltemel1)te' :&e<r 'iUU1ixado come sonda :pa:ra i,de-]:!tjjfi;c~it 0 donill: ,gei-~6:n1i'co\.

b) Qm!Jncio Sit: t[~t~ dJe" urn g,~n.f!' CO([:l1I. altn g:mu de conservacao ... e :p-Ci:z;s:j'~l em,pr.eg.illr mna sonde .he'tiE:J:'6]og~, ou $eil~" o DNA de outro 'O~~g.ilIJlJ:USf.i1LO, ,8\lsshn" po[' exemple, (I; geli;~ da ,~H::tl na de $. e;e'rwisiag fO(L ~wLad.o, empregando-se oomo OOi:l!d!a UJ-n, eDNA. de i;lc;tln~J de D,i,ctyO$I,eUr,~~1l di'$cO'idC'w?~r':Jj"

,c) Q!J1:lllidQ j~~, se t~V'f;"!iJ'" ~l;iI,1Ir:Q;;"$ im'il':6flj'J;ll~S sob!!'!! a g(!q,U~LlIe]..a, de prol'<ein:;]J ood.it1c.;ld~ P~~Q' ~~1:l~ de :~n~:er{',sS€, e pOGi!iiv.e'l ,sU'1!tetiMl:f II) {llqS,Q:i:i1ud~01ifd~o' eorres]?O'J.'li.den.'te ... 1iep'.resen't~ndo !li:f!t'll2l, pet1uQ'.tllfl ~~~q]u,ertcifll do, gene, ,e e.ste o~igorn:Ldeot!dee :ser.a, ilZm.p1tlegalllo c'O:mo :JO'.L'1tdiill. A55i'fJil", '11.0 !Ca50' cliO dl()clt(lirno, t: da levedura, ,~a Si! d:i$p!l.i:riI.hdi 00' dados de 1ilIoo~lise da .seq]~tend~ cia prote-iIfl..a, dO'llde ttJi ded!iI,Izidl~ 'I,.lm~ seq\i~fl!l::hl d!~ DNA, de 44!bp, 'qUE: poo.e e:nJ'.lo ser '!J~iluzada como sonde ,P!1lJtI, 0; isolamento dlo, gf!1"I£' eyel ~I,~.

Ql'l!flIl.ldo se d:usPQe de uma sonde g.e<J"Ik~ka -r a'~e~ dis. hibdd~O:;~Jo' de CO;~Q~ 11i~'~,:ii O!e~¢l"ita "lci'Iiii.'I!~1 p6cli~.oo r~aH2a,r a hdbr,ida.'~~{!; do t'ipo 50J'IHp1lr~~. Nesse me t'OdJo hlbrlde-se ~ sonda com !l) DNA, ~xtii:',a.id:n, d21$ (!2hl las :!'~oor.n.'b:u~'l!(ljnt~s~ pl'~'i/la:m~.n.te id,etl~:iHead:ilis P€':~8J hib.r,udla~ao de .cOIOrliLi:t:S. Esse DNA e p:d mel[,amente d"~geddlo P{)C uma 0'i1i. mais enaimas dill: if.I!ii'stii:'i~<'lo, separam-se 00 h',ag~ memos II!?S(~~,t~ rites :po:r e~.e'~'foflOroes-i;l' em s:l!,rpO'J'~-e' die ge:~ e desnatur S.:tIil;-Se os f'!I;"~'$;il:'IJ~I~tO'$ h! ~UJ'.'I ,im:t'eS de t,b')lUlSf;e,r:Hos para lU1:1 Jilt:ro de uitrcoelalose, que sera incu bado cem ,a SQI'I!~i(i mareada, l"'or meio d1a ,fI.lllW.!i:',ffi.~:[ogr<li:tu<li do fUtro, pode-se PO(I!' tanto Jden t'uf]caI' o f:!,":,;IigmeiOt'O d,e DNA q ue correspende a.'q,'IJ,!I}e]~ determinada sO\F1ld!'li. A 'm~:;;l~.a ~~r:.tlt~rtal COIro. ligeiras modi f~,ca~o~sl pede ser :rea:~iz:sLdla tutiI:UZ:rU-uJ.'O' RNA fixado :so!];:n:t:. Q I.lUt(i e'", rll~:M"@ C~ so, (II p::roc~(HmJl::IiiI:~:Q ~, de:tlO[i .. t~l'il1:ld.o de .hib:ri,dii!J~.a.'o dio tlpo NOI thoe:L'IIl. lPt~1I" meio dJo NoOfU~t!J'~~z po-' de-se VE":fifi..ca~' se l,Hn d~~eitln'untl!dCi g~,niI£' ~ trm:lser.ito atpiJ!i'l![lis, n'lHtHl! detennl imli~ da sih;~8i~a,o ou Hpo c~']'u:~:I!ll". Para t~['!Jto ... extrai-se 10 RNA t(llt~~ da (.(HIJ1a" e-m, d i:f~;~~i:~~~S mo Hillf1!l:tlO S' do sell cielo die vida, OIJl 'e'm dlife:[le.nb~$ co.nd].'~oe.s de cI!,:IJ~ivQ.t QiI,I! d~ d:uf-e:r~I:i;t~Si Hp(~~ c~h.lla'ros" lPiil:~1:'1 a it~a~ iXi>i~a,o d!o N o.rtln,e:m,. s~ OCQ,V,',rer hib,r'id!;iIJ~o com 000 DNA dJo g:ene- clonado ... saberemos (]Iue e5,'t'a¥~ ha''!tElIndo t:i:'a,n.$cr~~~o' do gene naquelas ce,~II.]~,a8. Tambem as P~~Q'h!:!~:~las das c~:~lIJlas tir,;;U1;st:OirrnaIlite5 POd(!iliili ser Sifp.!ii:[~(hil$ pOl' (!l!g~.D"!l)r-.ot~.$e-1" P:;JJiI;",;;', ssrem if.l!m s.egl;ll~d~, id'e,n.t~fj,ciThdl~s~, ;fHfa.V'&,s, de r.eii)~a;[!! mill 10 ,s~~Ji('QI',PCl' especiflco e, neste CflISo;, .a ,dirll~,Ii!~if!: ~, de~"~):filtil:ll:ad2l, de' W~~tol?J"~~.

lIrr1t~ vez lsolado, (11 ,S,en!? pede ter a sua 'Sif!quend.a de t~'Ucleo,'t:[deo::; de~~['h"ade!r 5if:r $.llIIbiltil"~Mo a a]ter~¢!'!s di.r.,igidas~ q 1Li!G.' penn~t~r~Q cernpreender as iire'I.!I!c~s, entre estrutura if! h;m~lIJoF bem como ser tr.am:'is:fe idQ p',anf~ c~~ i'e:rente5, """'e:tlQre~" qt:Nl" ,i ,.1!j,.o tr,iri"ns-W!I't:Ii.·'ir outras {'>e.]iJ,I].m~ hospedeiras.

No. q_1J..'L,e se re-(.ere ae S'oI.~~Jii'ePlda:t1~e1\1~tl' ,it7 .DNA ... ,destaJC'al1l-se as con~'r.~bt:t[~5, de Fred] 5a11.ge!rr 'ql",J.e' dcsenvolven diversas me'~"(ridloJ,ogias .• ,d.~s, qil.lais a ~~js 'uWi.z. d •. ' 12 aqlil,eUa (jIUl' u.ti.l:Uztll, eomo fit .,!:,:U m-SOI·e$ pi;l!["~ a sil1l t~:5ie' de DNA .. _' ,j:' -d~ideso;.:;~ l!,l:d!2D,UdeO'~ ~cldNTr.~}i que 1n~ei!:"r(.'Itrrrp('m ~ ekiing<'l:f;.10 dla cadeia. de DNA pela DNA·pil)I:iJ!~eI';ijse"~'_ 0 dlideso~dl1!':~c:~~oUdeo p{IIdll;\! $e',!, eJidenooment# :LrLcor.'.porad,o n,;;', (.,dJ~ii\!l, nascente, I<odav:i~, [r.j bloque,ar ~ pr(}gressiio da sh~Jese' d!a ade':iflJ, porquif,;! n,i'j,[) ~ell '0' grl!JJpo, h~roxiJ!:I !f13 p08i,'I,;;:'o 3' do ,a,t;u~ ear. CO,MO essegrupo hidroxlla e n~ccss.tii,ri() p~I'<1 que (I; nucl~otklleo ,5e,gl!,lit'H~ .. eja act', scentado ~ (:a,d,eio:J., bo.d& a vez q ue urn ddNl'P fo:r lncorperado, ocor~i.fi ill t .rl'lidn£l'~ilo da cadela ncsee ponto. 0 p',ri[ll:?~fii) do. ,~:~et'od.,o 4!i s:lnlples: .quando SE! !l;;'o~,-rle<'l,nl" num tubo d,a- en .a 110. ~]';;'1ii'L do flf:'asm~nlo de' D 1,1 A. a ser seq-ti~ii1dadQ (em fiiEa, s~rt1ip~es), a DN.A.~poHrner~S~i am prhne:r marcado T •. ,;;:Di.lnmV«lm~tHeJ todos os quatro de;s,Q)d,rib.cmucie{l:t L('~COB l"1QT;miiii~ (dNTPs). ~ ]]'iO'1is .a,pena~ lLli'J:'iJ dele':" na f~)It~m,t'I, dldescxt, por exemplo, a l'i:nlLidh1o:l (ddTTP). toda ill vez em ql'l,I!iIi!: houver i[li«~tpor'a'C;Tho die lEl:"UlIa ddTTP 1:1;1'} fila (r~e' a ON A~fio~ imerese . 5't~ s.i!f;ne.~i za nd 0 ... ,oool'l'er,a a p.a t£l,d,f1. da 5,:int '"$Ii!: neste 'popto_ IS6,Q dem Oi]sU'a que, P reeisam co 11 fl'" 'l1aqu,-c:te POFi t,o da fi ~:a'-mQld<e- exisje 1U nl.!il ~d~llOgk!a. Na verdade ... utlllzam-se quatrc tubes em paralelo, caQ~ 'ilH~'iJ con~,ell1ldl() apenas um dlo.: NTPs I1.tj f'O,lI'lill.i1l didesoxi. No passe seguinte, ILlS fr.~gp ment'il)s ~fI t~ !',mzados, em . ada urn dos q i!.:Iil tro b.lbO'$ sJ,o sepaJ:'ii'lidos de acordo ("'QiI'I:'i 0. S;;;:'U tatnt:l,n]'1:O'1 PoOl[' m elc Oil;'! 'E!',I~tli!o'ro:re!Or! em, gel de' po~ iOlrt.r..il~miJda des:n~hU;;l!i!:lte- P •. i.fli a '~ei.h.J ra da s.eqi.ienC'~:III, ~ ?(j,~~se urn f[i:rn!@' de raios 'X ZiO g.,·l Na fig. 4.1.0 s esf.a e qucmatizado 0 - rccedimento, ~ ~1!I,lilPorta(lh~' ressruHar que a propor,~ao ddNTP:d, T.P deve ser CU~,r:llf d!llSamllnt@' (l'~tab~h?ddiL, pilfa permitir que ~ s~'ec:tlda die DNA seja dcrerrninada corretamente. De- fawt se 'I:l(H.wer excesso do did '. TP-j sQ. SlQ-,!"a possivel l e'f" ~) inleio da se<qiHin(:i~.

Ho]c dlsp O-e'IIlI-SI.'::! de mfi g Uh'WiilS fIIu,toma,tiza,d ~~r qu ~ permitem 0 $@= gii,~ndam,ento ,de gEl'nOin~1s lnteiros, como e c C,tlSO do .seqlJe.n.(,iamento' t'Q= tal de todes os cromcssemes da lcvedura S, ctre~i!J(J'I? qili(!' fIIcab!3J de ser c:o,mp,le ~i\!I,do em ~ hri I de 1996 pOI" 'I..lm~ r'l'de dl,~ ,~8 bora ~'6ri,o:s. ~ ssnciad 0(9, A Ie''' l!d ill ra {o_, iPorm~.nto 0. :pr~m,e~i['o or,g,arri m ], ~([~'a iI',L6Ueo. ter a S;IU~ sequencia g,e:ruH.lJ ',a i:r'ite~fain!!ntJ;.' d~t~r.mh'l.a.dill, mas est,' em eurse ~1iIilllb~~m (10 Projeto Cenoma H urnano, q]tI E." se pirO'P'oe ;;. ~~g i.iG",t1Id:J r todos os C'fOIDIiJS$O'1Iiri!1:)S 'h.ii manos, T~I'lido-~e em ~,!os. a Sc12q{ie.Ilc1;i1i do g,e1.'1le,. pode-:!iI~ d-e-,d.II.'u2ir a se-q iJ.~l'!lda da protei:o.a que ele <codific<l_ Ndi verdade, e rna!s. Hidl cbter <1i ~qtlj.cr:~da d.8i p:rotlei":na POf esse ,[I'lfni:r'ril:'flQ dO' qil,.i4~ p!i!'lo sequenciamento da p,r"6p!l:'~.a .p"r'o~~ina, que pede Ieva r meses ou ate anos.

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o DNA isolado '12' f!q]tiel'T1.ciado pede t~m'W'm ser mll,Jltage~~iZi?J.do i/r l1·1.1,O'", de m~!!Iileir~ m.~i tc! pil'oed~a .{! deliiber.ada .. sende e 11 segnide devolvido a celula \f.mlrBl1 onde '0 efeito te:rrl.otip'lco de dJif;e]'e[1l~~ ;ro·I~!!;taJ~o~s· poacra ser esradado, A. BJllg ",:rnharia G;ei'l:~tuC;ti l'na:iij.gur.p.iJj. 'iLj:~l~ .00 va era no carn.:po d1~ ml,.rtt~g·iil'I1"';i!se: ~rl;~ 'qU!l.7lJru:Q os agentes mu f·age.liric'Os n::ttv rais PlI:,(;IV(lCiJ'liI:'I! inut" ;;;U~S :l:'lI.08 1]1815 vartados .(;E!ne-s dentro da elilola € a.g.or-a. possf e~ p:r'Odt~zh· ~mIM~O"t!s: sfHo.dir,rgidas~ lambe-'m chamadas de' Qligon~,l;d~Hd~o·ch·f.ig.idlc s .. 0 .proc::edir:neliii to Wis.:ko cons]stl? E!iM Sii"LtetiZilI.r. urn. pcqueno oligonucleol ~dJeo em !H~ :s~mple:~t eonteudo a m:!Jl.~ai!;Ao pontual d ~sej::.da e· ooloc1i_ 110 'e"Im':'I! pr~c:-:['rn;a. do. gene que' se quer m·ll;tt..a.~, ~e:niza.r, elonado ~'!Jm V'fJ'tor de I.Eti!ll simples, Num passe S'f'8I:~iitll:~~, 1) ollgonue,leotid'eQ :5:ervh·~ de pdtnli,;!~!,' fJo;Jiil'a. a DNA-poUm~ ·8 eo .. que h..i 5inteti~r a 2_~ :Flt~ do vetor, inclusive 10 g,e:l'1le' - de :Iote["i;}'sse- Es~~ veto II:' d€ fmta dupla, ccntendo ag,o(f~ !,.1.jll;fj ;j~s f~.la.$ mutada num s.~Uo especfflco .• se'-r'a lntrcdu z,id·u' IU'J. Ib.<licm~, rta hospedejra, ortde se-r.a replieado ... o:rig~n:1l!fIldio m'~IHpl~s c6piBis . .A M.!:ureZ:i!l sem~¢l;.n;l:5·et\\,(jtl'i,.ilI dio 1'1'0«$$0 a(!· l"eplie.a . ..;iio do DNA f,(u;~' c,om 'i;iLj.~ 510% d!as m.o.lckl.das [\es'll.!! ltantes 5eJ4l pmt~'Oira da ti'I.lI..ilill.~~Q' em a mbas as .fi:t~5, H~ ihQje i~rLht'I!f!'~tiS 'Va.r..~, ~lli!l"'s desse proeedlmento b:ilsko ... 'que Iii~O Iremos deserever aqul, 'E precise eJlTlt.ret,aJl~ ressaltar que a !F:riI:L.a:~age.ne.ge si'tio~d'uriSid~,a, til!!l1~ um enorme rot ,n.(ia:~f ranto pa:r.a a pesquisa ba5·icaJ qJua.nto para . a a.phc8I'o.:e : a 110',. ~tra:ves ds aJ.1JUise de alteroil!~e$ in.trodiiIJ2Idas na sequ . .enC'i;i!J de ain1jl1!~cidlos d!a .mu'tQMCl]~a. dOl p.rol!~.hl!lii., pode-se "mapear' ... · a 'irl,'olkl:l!~a, descobrindo-se q'~i!fU$ ~o es Ie-sid.·Yo::.; qll,.llil;,'! OOll$t.i·h.i.em ,0, s i'ti 0, eata I:Ltioo', 05· dJff~lI:,e-:[irtes· diOIIliI ~·r'lii.os. de: Ii,g.a~.lo fIIO' substrate, etc, m B.~.ote-cn.o·l ogi,j'li" com(l D'ta .. ag.or.a. "!.r<i~:'i3S p]'oteil1s';s h11l.:portlmtes. sendo prod I..zidas POt m EcrQrgarllis:mo.s :recomb,' na nres .. pcdc-se ,apHca[' a mutagenese sil:io~dil'~gida p., ra obtell: tuna protetna mais .Uiva, mais 'e-5't'avel !Ii!! 'q.UE! n1io· "'lP-tl?S'e'tilt~ ·~i'@:it'os eelaeerats indesejados. :E 0 que ~e: ch~.maJ de ,Ellge~1harjllil de' Prolefru~'S, ·u.m It'am'po, novo e :;iha ~~n.m:€!· pmmissor, q~~e se MmQ!.i. rea I" dade' gr~l~,jlJS 1i :E'ng,e-:t1Iharia G@rt~m_ic::i)"

,4107' ~ TnnS'lol1i1i'hl{8.0 genetica cia celwhl vtY:a~ d;'erelltes siste~mu hospede.'iro$ do DNA roec;omJbiinart'e

As· ,afraC'te.rD·$·Nc.il! . ide,]$ ,q iL1!G!' urn. orga:rrt:as,mo de.vil! apre&e-tu'.a r pOl'a ser uti lizado (:011111 .. 0 hospedeieo de genes cIQ!l~ do.s :sJo~ capacidade die en .' ilH ~,m meios de cultura POtl),ii}i;:Q d i:spe-:ffild.i(lsos. t~r cresci menro rap'jdl~)j ser es.ta'lj,f·~1 em (:u~.l:iJlr.a ~ ['lillo, ser palloge-.t1Iko" Os hespedeiros ~'II'fI,j):ls uti lizados 't-eill1 pOl[t~I'Iii1:1tO sldo algru~·t~. j:'ltil'h:~rorg.a.fI.is:nl0SI bem caracteelaados de 1'<'1'11[0, de vista geri;et~ko r I:a ~s como a b.a.cter'ia ~ .. coli eo ;;Ii levedura S. c~ref}f,sitlt?

Atr.;!! h<'i. poaeo ·~m.pQ, existla iambem a tfjec~ss:ld<iJdi~ de se conhecer '1,iI'ffi 'fn~rodo qil..l~ .p'~i.l'[nutig,s.E!' a l;fans.f'Qrm;;JJ~&i!o g.e'liiu~Hca de eada Upo de hospecliJl:i rn • Assim, para pO$Sibilita:r a e!f:'ii~['a.dfl de' DNA elm E, ('(.lIl(,. :fQII".?H'J.'L .~I:'Iii.eia]rnerllte de. envolvldos protoeoles empregando dO'reto' de c. Icio €. cheque teffi1lj!1;'O. No c, so de 5. r;e.revisifM~ r 0 primelro ptocedi m~fUo de tr.an5JO[maJ~tu) requ~r.~BI .a p(1)top:l!i!Jsti~.a~c~ 0 ( fj·tr~udl~ ~II:' itlil!i.(ll dQ enzimas hidroliUCilIs c~a parede ,cehJ!h,u",). ..

:$~gl'~i,da de reg,ifnera~io dos prQ~O'p'l;;J_;5to$ ~!p6s ,0, '~'r~t~,rne-~tQ '~Q'm Q DNA.. '~e:proc~d,i:rnu~l'~to, rt.)(t.ro~:n(ljrn~rtl!e' laborioso rode s'!..d)seqt:je:r.I.tenlen~~ ser Sil.b.5titlJ:n-:do :P'Or. m:"t'ulj 'teCil.l~,C:;! q'ue emp':rega dot@t,o' .de- Imll) pa:.-a h .... Ig:il:i2o;11ir ~ iP<'IIr[I?d~'Ert~retfi:!!:~l't'9r tcdos e:s<~e$, 'pn)i;:~d.Ij':i1I.e~:n,os most~,i."!Ili'iilil:n ser ait-~n:11Iii1!i'i!llf!' tli':am'LlMi,Coos. P'i."!!'rn as .ce-,~l]~.aS.I' deb::a:ndo :P0i!J(;!!),5i $CilYr'e'!.l'i'l,l~iOtes,," da ordern die 10'~,

Foi re~el1ite'mei!lt,e de:5en'!.l'Qlvid21 'I,,[ln£! I'ii(f:v<li ~'rkni~~li ch~~iI'I!1a~~a (~~ iltl.it,r.t,i;J,pO'~ r;(j~~di:.!!'; q![li~ :p~itmi:t~ que S~ transforms g€ne.:ic-aJner:llle qluiiiJ,qll~er' tipo de ,cel'!J]a.,. P(I!''QCa.~.i6H.ef:IJ O~, eucarictica, delxando C'E!it(a de 50% die 50ibirE'ViVi;f(i!tes .. 'Para ;;'II e[etru[p9I"o!l'tJli¢r ;;'11$ ~h:i,l~s, ~.o eolocadas numa S1J~:~~~.'O oor:i!~'I:ldo 0, DINA e sub:i:1'1,~itl.da8 a tlllll b.reve I;:;ulso' eMtlrk'Q, q ue p':r~Jlv~X',a ~ ,aibe.-h,Il;", tlroi!in5i.l:6lri~ de o:dHd~ no< ~.l 't,I'~~Op~ oslulnr. per onde m:li~ra:r.Th '0 DNA

4./" I - Hosp@d~ij~o$ procaJrrotiii:;o-s.

0' oit'~,l;t!islil1!o maL'> 'I!;I,~~] ix~d,o ,It!§: :m.O'je' roD1,t~fi!("~, s.e~ildo a 'b,j"jjc~d,ii E .. LOS; .. ~m, l,f:ithH:l,~ da gi":"li~'lidl2' quanndade de conhectmeuee a!!:'ll.u[u.:Lladio sobre os seas meC.;1r1!iS'!fJiIiCi$ ge.-IliIEilioos ~ ibiQ'i,u u'~nicos., iEIH:rli!tiil.n:~)(]i, ~ss~ hos!p~d~uoo ap!~~~SJ;!:fit~ ~1~ glJlJrU!is dJes'!l!anti51-\g:f!rlIs. p':ti~i!ripoil!~ me'r:t!b;:! (]U!~:n.dIO' S(!' :passii! ~ P'],oo'IJ.!I"~~Jo' elm ~a:L'ga escala de' pr{:lte.'~n~s :(,ewrnbh:'ii~n,b:."S; OeQt.t'~ {j]jj~ ,~ 'b.;Jc.~iti~ ~, :ItiItJi[m;;lI:nileii!~ 'I?'tlW''irI:~\!){hi no tli'nto iJ1illesHnal humsno if: e rore[l;cia:~rneJ'i.~!e [pfttoge:t1I.LC<"ll. MesITI:o, ll n:hi.!i:!;,e-:Q!5, n~Q p~iltog'l?n leas 'P11!'~'!l,.i.Zem, ondo "O::-l~:IliI;l}S'1 ,qt"u~ :pQd!?~, 00 ri.~,a]tiiI'U lilti,t cs ,prod~tos~, 0 que e P,;;lJr.t lcularmente 'Pf9bleil1iij t·~co 1119 'C~ so' de ])1' 0 (h.1I ros tarme(le-ll,r~~~OO ] ItijeH~,'t,I'eh;; co.no,. PO!i:' cxemplo, a insuljnn .. ,1\ ~!§:frI, d'usso,. 'e-s..Si1I 'b..arC~!i:'i~ :t1IfiQ secreta efUc-.ie-:L'1I:teme:n,te as, pro~~~11ias pa:L'~" (10 meio, mas retem-nas :t1I!O ,es.,pa\D peJ:'ipb..s!T!.l~tioo, {'j q !!le' ~rni, Ce-~'h~ ca:So[)~ :nao ~, dI '!:>e-jjv,r:'L

Bli'·dn.rJ$: S",d;,I'd~;;:i I,UTI:;} ba:cMr.i:ili gira mn positiva .. '~cm '~·,al'm:b~iIi." sidlo 'Il,l,.:m ~a,cl~, CO]]!I,Q hospedeisa. Essa baderia nao e pa't-og,el.El:Lca" nao ,pmduz. e:ndoltt1l:dn.as e e bo-a seeretora, ~TI~$ .1p'~se~~t<'ll eertos ~.rtl!l:Otlv~.fI.i;ei'l!t~$ p~r(l. a ~:~rl):n~gll;.!m.. 0 principal p'rob:~l2m1l consiste na il,ls'tabomd;rudie. estrutueal if! seg:reg;m;ej,on~l d08 IPhtsrnideo\5. reeom birtaates, qj!':M~' !i~O :Sie- m:r..ntoE!m .ap65 repiques 51UCoesshr0i5 e sofrem j,n.~!!:',nsa ![Ieeo,m'b:il'lia~.1;j]. CO["5;eqUen~;.e:mofu.'te, '0' DN.A estr.angei.r-o aeaba se d~ luirido :na iP-O'p!l;~~,~~~(}.

E'1,id~.i:tE!tftU:~B'lit,e- .. IliIO caso de' ho,spedei'm"OO ,proe~iti6HC~:k~" ,dfw~m ser uti!~'uz~:~ das linhagens nnJ't;tlinh1l5" (.lit! eo n~o, p:rodl~zam enzirnas de :resi'r1~iiol'

,·t "l2 - Hospedeiros eUQrioncos

o ma),s lrtH],~~,cito d'05, hOap~d:e-~J;{l$ ifi!'l,Jca'd6tic05 'l'l' ~, levedura S, ,~~vi:1il'u,:, pi!iI.i!J a qlJJ:;JJ[ se desenvolveram '1'~'hio5' tlpos de vetores plasmidia is especia ~i.Z8- dos, Trata-se de lUll olr,g;jmismo tl_l1jce['u]l1!il[r n~o patog.ellli,co,! eo q 1tI,€!, apresenta <11 V1Thrtl:agem de ser 'C;i!JP@Z: de [leal iza:r a maioeia das moo.if.ieili.'r;,~s po..S-I:r. .. }{h~~.t1a -t]tLe' as :pr:Q;l:-einas de mamfferos solrem nas oeelul21s de or.igem" 1"<11 is, :m.od.~ fucti~e5 ,indtlem:' ,~em,~,ili.'o da r:neti.onilllaJ do t'f:["f'j:lIinaJ, -ill mino da :r~rO!:e1'ffila., ;!I(:E!H I~~~ao do t{!'t,fili~:iinl amine, ild~<1I~lii.o. ~'Osf'oll'~:~a~fiJC!, !'! g'liiCQSil<i.;3o_ A1~~n d iss 0'. ,~

!:e,:~dll~ra mostrou-se em,:p"4!l2 de !f.\eal i~r;Jiir corretillilegnJ:e it} ''''fQ'~dli ng" das 'p.-ot.ell1i,~S de :m,'n:n:r.~Q<.roi ,i~td is,:p~ri_Cj:i\l''il~1 p~:r,!;! 'q,UE! estas adqulram Oil 5U;ilJ eon ~orrn~!t~a,o tr.,h.ii~ mensi(m;;'Jjl c(u"re~'a I~" 'portf:!'I:1i'to r R S'!JiiII plena aH ",udad~ b.~oMgi;ta" Un'i. d6S l'?:r.;,i~tl1l,~' I?~O[ii ma is, m'''Iil:,C~:rl're:z; tl;! 1'~~'2: se-ja 0 da marrl'tagerrlJ iP@la levedura de paiUe~las do \~i'!:'U5i ,d a '~1Uii!p;,'l!m-e ~ .. A lP~u:,~ ~~ da clonagem do g'e-fili" d!2' iUJi'iIl dos ill'litige;.nOS de' su« perfide dle5se virus (H iB&f\:g), a ]!I?V~t'hlr.'} t'A[uo. ,i!lJoenM Sl'itil't~ti2<'i ~$~~ :l'i!iI'H~!!n(!ii mf!lS ainda n'!'!.),Wlt.:JJ 1!._I:I:l1Ia p;i!J:rh'c!Jla Hpop:rotr!i.ta ,nliii:~ti,nte:d(:~, cnmplexa, :i!ii'I,!j],ito se~elh~Hl!'te ,~,Q envelope viral, i'4!sol'i/·eri:['h} () ptCl!bI~mi:'IJ ,d,e- ::'II!prles~it~,a~,ao d{l r;JinU:&lfIlO, un, dos principals .P'mbll!~na$ 111.1$ "Li'~~:i:n.a!;> d r: :f);llb;J,llili!id,;jd~~ Pt(u;h~4j.~ o;J$ per D,NA :recoil11l[bhlm;~ll€:,IIl'), iEssas FH'I. r tLr;:;J,II~.ilI$ (de~ti,hlrd."is de DNA ,rIo, , .... itl,J$) SaO .altm m'eute :~m'I.U;"tOg;j}jjiei1l3 @ petrndthi;l,m (J de5e'l'lIvo] v:i meato da ] .. " vaclna recoen~j t111'IInl:e a ser lIhQ:r.ad~, para IUS() humane, Es:5a:s 'G;Mr,ad€'risticlIS" assceiadas ;i!lO fato de' qUI! a levcdura S .. a.u;i!.'tii~it1e vem sendo e;o;_p'lo['.;'Iid.;'li pelo home-rut h~ mals de ,8,000 anos, pi1l fa ptndillzh ~,Ii mentes (p~o.!" .;je1'\''ej~ ,e vilnho), sem nunea te,~' ~ iitlOO~ rado p.ill'r'(li8~ltiC.i'i, hi!m '~i!:v.,'li~o ,a escolha deste o:rg.ffL'lI:iSI:I:'IiOo J1iH;tIJ a expres:s~'iio' (~e ,prodrlt,os d.~ ' .... ert~'bT;;Ijd(li.5, de alto Y!5! lor agreg:ad;jJ,o princlpal mente _p,aJi'1iII apl:i,ca:~~,o tE![,ape!l;utk,gj, P'Ol' ourro lado. eonstdera ndo qne' 5" cl!'rt'1~i~~~e j8, ,~ un~ mg"uili:s:mo tradkio[utirn!frlll,e empregado ern p,ro.oossas biotecnologicos, '0 de- 5envo~· .... i IiTIll;!ntu, di;ll ~fI~e'!1Ih:1!Jlfi:1!J G;e~,t~Hc0i desta levedura t',:'lmib~m pil!!ii'~'I!itixl qii.i112' Se!' 1'"4;'!;;l~'uzaSS'e:1lii pas50s die UlJeJ.nD.ral'illill!iH:O g~i''I..ctie.o d~ _P,Mf,),i':LrJ oClil.:i.I~ ,HtoSpt'd,{!'lr'oilJ, As::;iJiJ'!" por exemplo, Jorarmll obridas litli'lii!l,g!ll'ns :rer.O:iTlbi:tiitil~:litI!!S (~e S .. r;~£€f,:esi.,ae, capezes de deglt.i!ldi<'lili:' am udo" pOt J'I!iu~dQ da dQlliIag.e-:m de genes q I,lJI;.'" rod~ fi.;;:~m e.n7.j'n~oilI~, a.tl~ U'(fIJ'ihc~s: em {lIutr0-5 Dl'gaa:l!i:s:.m,o:l'aJ" ,A p,rin:cY pill d,e8V<'llid.f.lg.il!'f,jl~ q ue 0 :s'h:'!:t.erna ,a 'pre5e:m!.'~a se refere aos ~~~ld i1'iml!I'l.h'liS, qtiiJ! s36 s:L.g~ji ~,u~ilHv~ln~r'I ~ u~'IIf~~ 'dQre~ ~Il.' :rel""\'i,1kl; h ba['t~l['iii!ls. lHtimaml!£litl?r outras l.e\II@'di.U',liS alQtlil, di? $. ceJ".it~ '{Jisr:~;g 'e~tio S-'E 111 d 0, 1ti1:1Jpoog2ld.ills Qr:ill,!l>. h'll'!>ped!eh .;1150 :1 ~ qoe ~p'll"e.5e'I"ti;llm melhores ui;1dim~m,os~ as l~vil!!chJ:ra:l'> metllotroflcas .. C1JII'.iliO Pid:ri~ 1 'ms,lvdf!, e Pid~:i'~' iiH8 f..rsl'Q ({!':;.:~Hrl.r,fst!~~ ~Ila itJo1ym:.or,jJ'~(j') :5Ji!o ~5 mals bern estudadas a'teo 00 momertto.

T.iJ:rn!bi!II1i, s.'il~J lI,~t~ ~~,~adas como hos,pedei.r:as diversas ,lhrJ]11:1igens de' ,ei~Jii.jli1l:S de :m~:~ni:fll;!i'"II;ii$ c;!t];l 'C~~ hilI.,'Ii .. 0 sistema de eel u ~@JS de mflm~Jeoos l'<!m sldo ,mu.ito 'lItH p.a:r<'l, ~$I:i!;idO$ de g,&hEHk'a biH:Il1i,jUlR, c$i~,lceJ:' .. deencas i:L1JJ-eC(',U06il1S if dol pr6~ rli:'i~ .f.lsl.6log:i.21 ~,&.!i:~'ol~, (;r:'~!,],ia::;, Como na'o se eonhecem p.taS[ifliidoeoo, ,p~~U";1 (leltLlas de- marnifero" es '~f~f'o:r~$ disj:){tii1:i~,r.t?is s.if()! semrre t;JnJis" () vili:'us .5 'If 40, qtml cau- 5;;Jj rumeres e'ID primatas, ~oi, 0. pri:mei'C"'Q ;;'II 5E!',J:" IU ,:~~ ixadc, pcrque '0 S'e1J,~ g€n')J.~a co:ns:ist..e- de UN A de dupla ,ff,~t~, L'l'rt"ill !~iI' 'J;i!" a saa 'sequ:GJ:i!d:.'ll !!i;uck!oHd~ca fed tllHUIJ ,cl,a~ pl"utLiiei:rss a Se'L' i:t1I:t'E'i,t'aml2r1:h! ~o:nhl!;:1clda. 1P(J;r.;Ji~tii c{jlis~ruido5' V'i;!'~'Ore5 dlei!'i'Il~dJ~ de SV40 que rt.aiO h,'IIdiuZI2:D'b'l. '~~I~lC~t, (]~~r: 'I;(mtl'tin'~:riii " ser mul ~v utllizades, p()1'" (]'l,rt;ro' • .,'Iidos ta rnbem s!o. ~~t~'~l,:£.ado.$ t~fro¥f[l,I!;i, '~t'.;Ji ,j'jj i~ilt.r(:idlJ,~~a~} de gQ'n~~ ~1Iri, ,c~hil,~'::;, de Flul'mifforo, 1U:n~ \"1]',6 que ,~s~es \'I:['l'ilS ~Ltl!ba:m &1::' irtt~g""'iiliidlo ~,lO'S Cf'G111l0SS;j),D'b''l:O$ ~~~ ~~au 1 a hospedeire. ra1:l1lJb~,m .e' dlgno de' Jn€!rt.;;;~o, (I; virus vacel nia, !JIU gr.1m;~dr; Vltl:U~ ail;!' DNA de dll]?~::!i f~t::!,o ql!;~e vem sendo urilizado PiiH",a, a don<lig~![:n d!;t, div'~~{ll:> :genes ... run is pilH'a a prod u.~ii,o de v;jJjc~:t1I.as" Para ce~'u]as de i1'liUHbl ((I~,ro.- ~Mi'iffI d~1 ~'~eh'9.rol!'"'!;!~~O, ,e:mpre,g:am,-!i€ ta:rr.ibent os prccedlmerii'tQ.5, de ~~d;j] de Il:p'OSSOimO:'; ~ ,de- til kmi,rtj/E!~,jQ., '0 DNA p>odie :5e'!1 h:iJct.'u"PQ r .;ld!Q :;Ii 'I ilP0;5~Ol:1ilOO - V,('S:r.o[::i1.~i,as. I:iprdk<i!$ ,fltli:fi:d,<ll'u$ - qiUle se :fii.~lIi!dJe:_mn ~

membrana celu I~it '~ IJ.b~r£i:[ftJ, o seu COXil'tetLdo, 110 d,t(i;,~,I;1SI1'Hli. for. sua v'e',Z- ... a miCIr{:dnj I;!~t) de' '[IN A pede ser ago,g',f} ,~e1J&uZii!JdJol oDm:n ~ In aparelho {lolnputa,do:dzado, qiJJiJ} ruilJill1lill!rli~<li em 3[pl'o:d'lm.adamen:Ille' 10 ''>!'e;::es o :Uin.:hnie'~'O de' 'c~h:!la:s. qUi~ podem ser injet~JdJ;;li5 num 'u!'~ht,;'O ,e-,:o:,pe-Itim~n.t.o_ A p:ri'nd~ll d~S,v.~,ILl~,,~,~m das e,~,D'jjlfls de' IIHIJI:bl:iJer-'{!! e q!Ule Q seu (11,1!] tiVi:) '& ~.!iitQ, • .:) q i!,1,e- di fkllU::i I'iii;uitt} {) esca:~o:na:m,en'b!]" ,~l.em de se Q'b:ljIe;r !l.lveiS de' ~xp!ti~~a(i ['ie-~UM~,v~I'i'fI,etiit~ b~'idx:t)S.,

UltimarnenJ,e', 0 1,1$0 ,d~ ,cfHilU~,<lI$ t'l:1} ,hlS~hJ @'rfi ,r_:ulhli'fiI V,!it,~, g,:1~:'iiltill:~.d6 muita im.:POIr.'1511C".ifl. A5 linhagens !l?e~'1!i! lares de :i,Ii$liI'tu :5i1o mal:::; fa~b d~ 'Cil;e~'H var 'eforam d{!sel'i!\iQlvid('~$ V'E!t~}:I!'~$ ~nijjil:O ~fieL~~.t€'s !Ii iPflJ!i:'a:i:r. de UiH vhii.~S de [IN,A,,, 0' ib.i1I(l~!{ji'i,l':Lrus" qlll€! ,Lnfi€!c.~'a ,especificarnent.e (ie.]i!JU!s, de inseto. Altos niveis de ,~:o;p:L'ec5-S~Q de' d!hl~~~, plr,[)t'I!!-U'lt~:s hii'C:e1'o,log.as eS~,(ji se{i;"iKlIO obtidos l'U2'SSIl" sislm:na, tH1.Ii.z:andJOi"'se' 0 _PWI1'LO'tOl' do gene da pt)'liedirill.;l. do billl(:!,:I,IQ'vin,jl:5-, Pll"{)te'~'n~ g,l!,lili!' e :~Q"'I!Ti.i1'ht'h~'r'I.'~:E! produzida l2'i'n grandes quantidades pelas oHl~~,as, lnfec tadas,

l~'ti!Ir.il a a:r~.lU'l!S~:orma~iiJo ge:notiti,('.[!! de p~;;mt.a.5 r Q vetor mais empregado e t~m P~~$'ni id~u ba(:t(!tial1iO" ehamado Ti, l'11atiHlr.'a ~ da b~c~'iI2[f.'ia A_g.!'.o/J.:1d't"J';"m.!'J ~ rJ~p,r4i1lld~ 1.;"':;:" ag;€J:l~e p!:ti:og~flJko" !tI.I!.lJ~ ,i$ n'.H;;po,:n$iiJ'I;"4;'!l priU~> ,i!I:p\!ifl:'~5'me!IiJt,tl dil;! 'I;'I!TI, ~!;I!m{l\r' J:ii;;JJ planta. DIJ.l_rm,l~~' 0 [pl'OC'E'550 de hI' .,'Ii!lJ$f'o;nnSlJ~ao' rril'iIJi~'Q;;Il ,g!:! !l;t!lu!.'II 'v~,8;ebl!. l!;~m~iI IPflr'C:e do. ,pltllsl:~dd,e;j] Tl, conhectda como' f-'[;iNA. ,e tl'<!ind"{:'.L'mda da b!~iJI;;MJ;L['.I, ,pal';:JJ 1;1, pl,~lIiil~ pOI[ urn p:I'~SSO :!W~:i!'i.e:Il~<lii'l!liJ} ao da co~~ugill~~.'o ib'1Ch1:[',i(jjiL.iil" :~, segHlie.n.tD do pl!:is.m.ideo", correspondente ii!i cet,C;;'Il d.e' 10% do :5Ie1!.l .geTi.ilJlJ:li1!l, pene<tr;;J. I'I!O ilueiA!!O e iI'iIt@'gii?,~:"'se enl ,n,~(ul,tIplas cOJ'JI~:;IJs no DNA cromossemico da celula 'h(~~p~DI!i;!l,[",a" C(}:I!iI:seq,!l..i.el:'lil:~m£ljWr inscrindo-ee 0' gCile eSI:r,u'iigeim 11iO ,[,-DN,A_. ,e5t~ gene aC;;i;baI'~, larnb~m inl:egr-,ldio no. genil)'J'tI,2!, d,'I pl.i'ii~ilt~,_IPQ't'~m CJibtido.s _p1!i!J5IIJrlLdeos iii mutantes, n05, ,q,l,.~h' ss pwp:ri,edo1lid!e.S tun'loriS~!l k'as, ,e:st~o ,5U~ :~,i"ltnM,a:s", ,qtJ~ ~iTI, sendo ii.Ui.Uiz1llIdioo [:"iii ra a ~nge:nh<1l[',i~ Ge,~tt~e.a de ,plf:iji'U:.i.'!l8~ num ,::i'istem~ ql!ile'~rtchil'u u rn '[~l,Itit{) pl"$'i1I:'IJdeo <ll'iil::d~'~a,lo!r'_ A 'P!dn(~p~~ !l.mit~'ia~) desee sistema e a especlflcldede do p~~;;IT,Iiiderl) 1i p~lI"a as, dl,(;oti!ed6neas" Si5.te~ mas alternattvos, lL~ti ~i;Zolndo 'v ~rl[!!s de pli;in't.,;li5, ~'ais eomo os gemiitli:'idrus\<, virus de, DNA. ,que ~@,"l um largo espeetro de lllos,p~d!eillos, ~ 0< vims do ~.'Los~i.l:,(i dourado ~otl t!!JLrrJ,~I'~:e '~.a'm 'b~iii'I, ~st~[)o ,~~rnd(li d~Si'?~lV~h~,~d!oo. :E!r.l~~t;;'lili:ro" eSSeiii ~~te:--' 1.11I.as, <'iJi:m.io1 ,naG ::lao nll.'1l~i~o, eticien:tes, T,f!!rn[)e-~n para as, plantas, ;j) m~EHooo de tr.,ilI n:d'1Ji£,ma~~,o ilt!i:',ilI:'l!~S de d{!'tlloIPQ,Iti'!J~i1io rnostrou-se m.!il ~to uJii" mas exige q itt,.;: s~jli1l,~t usados protoplasros. P,iII,r~ a transfo,Ii'~."(l~~'fiIo d ~['IG't~ d~ c,r}h;i,i.;)s, h·I'~~C~'.;lSI de5e'l'l!v(.d\l'e!,ll-5~ 'urn ~i:i~te'ma de 'b:i:obi!l'~blti:C:;iJ_ N4;'!$~e prooed'11J~en'~'Or E!5:f-eras, dil[lIil:lit1tms de ~:!<!I:n.gslt!{j,lIm,o s.=iJo' reeobeetas cum '0 DN.A, para em seguida serem projeradas pa:m d~I:H[lD da eelula, (II uma veloeidade de =430n~j SI pOl' 'ill fill :!,~'i,I'(~I\1\e':r ~sp~('~al,. E~,ii ~ik:rtI'~~a ,a:p~~~ItfI.f.ii «,indii'li a 'V<I!'i.G:.mg~l!TI, cle' pen:nHi:r ,;;I '~·rl;l:n:Sr"Oi!:~,~~~Q des eleroplastcs dentro .a~ ('{Hula 'vegetaL, eIilJJ'bllYr.r. isto ocoera C::OJr:iJ ~m.a, efid~[lda 100 vezes l:l'!I.enor do que a ~'t'@n:S(\o[,Ili,l:a''1;.ao, do ~euo:ma nuclear.

4,' ,_, Qu(:S'tues de :seg:ti rni1l~a (1:; pre5:ef"!i!'a~a'O almbientail

o desenvolvhnenm d!i!I! Enge.n:haria GI2'FiI~t~C.il f'Qi ~xtrei:n.;i['ltien te fwUifero para ~ Biot~rto.logia e um grande ,n;ume'fo de' ,olrg8JllJis:r:niG$ !OOoon;~b<jjfiillnt~s ou

(i'_E'M$ (do ingles" {~iflne'tie iEng~:rlel}.~!r1;t:t Mit::n":it1ti5~U"I!i!Sm!i') f[;J(f,;miJ ,cd~(hJ~' p~iI;'a diif;e['!er!!t~s, fin.alid!i'lldles, iE~.tr'Q'~1l:iif'lll:Ot <i! propr:La, .-.i[pldez CQ;Oii que ,E!S5:i1! ci.e'I:lc1~, se de~n;vo:~'!,i'e gll1'ra uma eQ:itilst~ntk!' :preoo:;upa!~~o", [pOT parte des pesquis~:u:h:m~.s C! da soeledade, OOin [\ft12l~Q ,aQ5 d5COS :iine',fle'nltes ,~ :ma:n:i:~lid;it,c.m.,o ~,{!i1~tiea ,~ a 'u:m,a

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:pOOS:t'i!@1 ;;::ll):ltiIt:'lmin;;li~~O' do, rneto ;j]jll~b'.ie-Tlite iPOJf ita ~s G:EMs.

De ,[:''lto" f!:fII'Ii ,;iJ'~~:Uilii$ .;as~,. fo; verifieado q,'ue 00 .c;,EMs, ~{ii 'C:i1!ip~_2leS de ir.t~ 'te~f~n I" ,e-m pOfi!;]~a,oes, mierebianas ~ S@'!lJS peocessoa f~8~o16gh;:~ no 801;0., 0 IPr,~.I'iJCip;jJj~, poato :~"fllnt.1dlo sobre ~$$<! q]1!J;est~u' i! (!i t,a:oo. dE!' ml,ll.11:Q 'P'I;)II,1!(;;!tI' se con;lme:ei£'.ii" s,.o'bt'E!" Q oom;pOlrtamenhJ desses (ii,rg.al'ti:s.m.Qs fo.li'!Th do laoor.'u6'ltQ e sobre (;I, tipo de in~e<If.e:re.nd:iu; amJbi.enJi.'llis qiU!} podeelam advtr dru reCiilrnh!:t1~~~O' g~. neti!l:'8 ou mesmo de ,m:!lHillI~-.!J,QS qu@ es C:EMs, vi~_'l1~Ji!l ;;'Ii ,~of!Di;!t {l!cm $~gil;~l~':' ~ ::;;~J~ IJb~[tI:~5.[} :n;;il liI~.!:w!'rl!~. Urn 'p,rob~,emaJ adieional que S~ apresents ,~ a, f.,dUt rll2 centrole do [LOSSm. ,P',i.Uil)~' sohoo (I, '~t~ns€-e~iIi;ciili (1(# 'm~'~dal geilii~t~C(J' de ~Hn" organismo pfl!I:'a outro f~n6m!eni;} ccrrlquelrc, prdfi!o::'ips Irne~l!'!'if! enJre 'billCM',riiilJS ... arrave~ ell!!' iPiI"OOi;!$S05 CO'~)JI co;njv41a~!o" U,@r.JSdJl]C:~O e tii:'a~;'i:dmii:'tl;i!;.:;:lo,. q!ll.e pod~rii.afi'i oronel[' eUll:t[~ os GEMs C GS mkil'o:(g~n;~$mt),:;; nMura'i.:;; do m!?:k) ambieltilte.

Na verdade • os p:rop"rios dJli!s()oi:Jtr:i.d.O:Il'I;::;; d .. 'iis, novas m~kjid!Q~Qgi~s reconhecera m ,d~,sd:fr :~o<gil) O~ d:S((:I~ potencis 15· que elas apresentavara, _~-ei!.lidJo !;om~rl.o ,a, hil'io:;;'ui;I!tiv:;IJ de' o rg;a:niZ;ii!! r. pili em 1975, a COJlIferflrtcia de ASnOil~U' :soi;;.,r(' Mo]!ikl1J:ilJS die DN A br.::o:tnbllj~'t~lfe, qt.l~ ~v,~ COmO, [ptll:ti;::l,:p',11 {;IiJ,li£!thl'!() dh,(IU,~'U[ as :m.aril~,iii:'as ,ell} $e tr:',a.ba.liha,.- Qum mkil'{;il[g~ rtU5!11l105, g'e'ru::th~.,;Iime]itte m:;lJniptlJlaillos e buscar d~fim~oes e e.s~Ii'<'ii~~ifils par •. a g~[,.i.'ttn~,r oil, ,s~ti,r,:m:r;fi, dlos ,PIlSq]ti,is<'tdo1t@S e da POPI(j12l!~~Dd'H_ De-:f:i'lilii'-,!iim-;iie s: :O.il!q'~ela Oil;;'a5:i.~{!I .. f'if!,g;r~_s, de ccnduta bastante :rigi(JJ~$ pi;1t.a, ql!llE! {l! '~'Iii!l;;i;!Jlho ,doenhtfioo J~s:se realizade co:m 0 mm:nmJri.'o de ,r1sCOS f:;J!.-a '0' 'Pl~sqJt:!,is~do['" a pOiPl~la~lo ~ (J; ;j!·eossJisl:eitl<li. B;aii:',r'Qt~L'IS, bio16gir.:fllS !'! f'[sne11ls adequadas d.e1,l'~ri<l!.Itr.'I, ser c~iada5 p~J:'a center '05 'ITI'IJV'OS mkrm-g!;l_;ojsID05i fOfrn!;tdoo· !i!: ~tllir do DNA r-.ecombina.l:lIt.e, iP@'.tizmenite, essa regU!li1I11il.i!~tlll~o fOl, ,posu,~ormenre f,ll~ffin.dad~. iPfiJi'tI, .'Iilo, fQJh~r ~m" ,ctE!m.aS~'i ,!Ii lUbili'rd~d~ 'O,('i,S; pe~I,l,~~do~~ '0'

'qlll'@' ptJd.eria vir a 'O'biZihv.;ur 0' prOSl:'-"esw den.tific:o" _

A m,€!ta rPr,~nei'JHlIl do, tt~s!'.?i:'iivo[)!l:v~'mA;!iliJt{) de :sio:;;E:ernM MIl'i;~,ogi!cus ,d'E!- (,t:.i~'lik!I'Ii. ~,~,o des GiEM~s oolUis,te" :n~ ~'~i'rfjid,ni!!~.liQ {m~. ao mJii!I'1J~. ern red'l!iI~o :S:I!iI_bst~_DCi;;Jil) de !tmls :PQPiI;I!l~$ mkrobianas :iirdr{!;!:hn:;~d.as [1;050 ,ecoosiSI:eJnas" uma vez que Sl';;!J fun.:;~o· hi te:ri.il.lii!! side completada, Dtil1ilS, d~f~.~~lI~'4l',S aooHiag;e.ng, SI11' ap:ltecS-{li'tJI:.a.m p:!l!ir~ !1J ,est.j!jb€~edDl,eJlto desses slst~marS de oonJ~rt...' m,€!llt.o: a) UJn ]:l1I~cfllrtismo F..'Ii5S~VO' beseadc I'U!I, d;ebibt.a~15iJ) da :~i:n~.'u1It@,H"I,. 1:6i'TIM'Ld!O"'il ,i~'tearaz de .so'b.Ii'e''lli:r V.elf nUIli.to l)(!mlPo, jo.ta di<'l!$ 'CO\lld!l9f~~s d,e ].aibo,r.~'~.-.bj,_ A$:;;hi,\, 'po.- ex~mr,I!O<., Joi ~'O.rils.tr.jj.ld!~ ~ l un.'hagern :rnut.9irLre Xli. 116 de E" f;:(Jl',fr que, para ill !l::u]lj5Htw!'~~ao, da

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'EvidJente-r:ne'l:''ib~t {Ii IPO,L'1I.t'O cli'Hic'Q p.ilr!:a'IJ fl (o'tlstrll~fiio de urn. sistema sulclda :r~si.d!l} na ,eg:ula.;ao dJ~ eXf':r~$.sao, do g..c:ne assassino. Primerram-enl '"/ e knpQ .... 't'~l!lb: q~e iOil~) ha.j\il1 "vazamento" da e:o;,~ss~o do g-~n.@, au se]a, q.ue :so. ccorra ezpressao apos a ind'~~~.o. Em segundo lugar, ~ l1;e.G~a d~} (o:nhOCQI:' as 00 ndl- 95·s .a,mlb(t~iII1a.ls '-'s 'quais fk'aI'<i\ IIl.j_it-o 01 GEM, para r .oeeder-se a escol!ha .0:0 p.~nlnot)j}r r-egt~~avel ma.is ~.d.'Q;qii.mdlo.. :Ell'tlBe di re;rEr!tr~$· aUegn~~~.vas; promoeores que d.{l hru::l.IJ.:tzido.s .po,!' ,ci'IJ[\~d~ fiuh·i;;;~O'tial vem mereeendo especial ~hl!~at;t!f. j4i qUier fora do ~~'IDQ[['<U6if.'io" esre tal '!fez 5. j ,a. oond!~~ao' m.a·is CQn.'amlllifnt,€, encontli'<licla pelo .l'tlli,-coorg,a[llSI'[to,,.

Refe.re'"di~ biblio,gr,afiicas

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COJJldiljO:FiZi~ s!llJi£idie ~)1'.51'4!1"L1. lor ,mn.ij;" inill\'t[1.: 'of b1!~berd... ,!,!!!;i_d 'p.l.;s[rn~dl><. '!ililolT.;r,;;:ihllJllol~~r :5~:UJHi-:U8J 1 ~'.

:22, rou !:.SiEN'. '!i..,K~ v..AiW.$~N, N.W.; :MOUN, 6..; AN l!)iITII!:S$(h"iJ, P_ li" r'';niJi,l.j oI)~ gr:r;;('!l. enoodJi~ .1. ('C~~~'kU~~ilri_g fll!rli~tioo I'!f!;)¥ IJ..!: 'C(ioI~S(!i'!i~ !fi ;[!III g~:lm,-,i:'i;j)~'I:i,i,'e I!,:.ftC!~ii~ .. M~g~"Mk~b! .. 0'~,~; 1,411~·lz... :1'9',;'9_

23. iLO~ilENZ." M',G.;. WAc~m!l::N'.AG'!;;L, w. ~t:tl?~Lill ,8,~rn;!' ,til',;"j'l'$f~~ 'by r~;"iJh.~i!4I.l ,gtn~t~' .ir<1in5l''01i1'l~~b~r:t ~n tn.!! oIflwiru!i'!!D'i!;;:O!l'!!t. M~c!!:o'b'b~t jt~'ii.~-~:563-60~. i99aa_,.

ILeiitiLUra II"HGmetmd.ada

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