PRAKTIKUM TEKNIK ANALISA DNA

PENENTUAN GMO (GENETIC MODIFIED ORGANISM)

KP : A

OLEH

Kelompok 6
1. Maya P.G 7081013
2. Christy E 7081022
3. Tedo H 7081814
HARI / TANGGAL : Kamis, 14 Oktober 2010
NAMA DOSEN : 1. Ibu Lucia
2. Ibu Ruth Chrisnasari, STP., MP.
ASISTEN DOSEN : 1. Andrew
2. Evelyn

FAKULTAS TEKNOBIOLOGI
UNIVERSITAS SURABAYA
2010
I. Tujuan percobaan

1. Mahasiswa dapat melakukan isolasi DNA kromosom tanaman

2. Mahasiswa dapat merancang metode PCR sehubungan dengan diperlukannya
kontrol pada proses PCR
3. Mahasiswa dapat menentukan kandungan GMO dalam makanan
menggunakan metode PCR

II. Dasar teori

Pangan hasil rekayasa genetika atau GMO adalah pangan atau produk pangan
yang diturunkan dari tanaman dan hewan yang dihasilkan melalui proses rekayasa
genetika. Yang termasuk pangan hasil rekayasa genetika antara lain : hewan
transgenik, bahan asal hewan transgenik dan hasil olahannya, ikan transgenik, bahan
asal ikan transgenik dan hasil olahannya, tanaman transgenik, bagian-bagiannya dan
hasil olahannya, serta jasad renik transgenik.
Dalam pengembangannya GMO disamping memiliki keuntungan, juga memiliki
resiko yang harus diperhatikan. Keuntungan pangan hasil rekayasa genetika antara
lain meningkatkan efisiensi dan produktivitas, nilai ekonomi produk, memperbaiki
nutrisi, nilai palatabilitas dan meningkatkan masa simpan produk. Sedangkan resiko
yang perlu diperhatikan dari pengembangan GMO antara lain : kemungkinan
terjadinya gangguan pada keseimbangan ekologi, terbentuknya resistensi terhadap
antibiotik, dikuatirkan dapat terbentuknya senyawa toksik, allergen atau terjadinya
perubahan nilai gizi.
Dewasa ini telah tersedia beberapa metode untuk mendeteksi pangan
hasil rekayasa genetika. Deteksi pangan hasil rekayasa genetika dilakukan dengan
dua pendekatan, yaitu :
1. Deteksi produk-produk yang dihasilkan oleh gen yang disisipkan, antara lain
dengan mendeteksi protein, lemak, pati dan zat-zat metabolit lain yang
dihasilkan oleh gen sisipan
2. Deteksi keberadaan gen sisipan itu sendiri. Cara ini dilakukan dengan teknik
PCR dan Elektroforesis DNA, dan merupakan metode yang resmi dilakukan
oleh negara-negara Eropa untuk membuktikan pangan hasil rekayasa genetika
secara kualitatif.
Jika pendekatan (2) ini dikombinasikan dengan teknik analisis lain, misalnya
teknik ELISA, maka keberadaan pangan hasil rekayasa genetika dapat ditentukan
secara kuantitatif.
Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan prosedur cepat untuk
menggandakan atau memperbanyak urutan basa DNA spesifik secara in vitro
sehingga dengan teknik ini memungkinkan analisis sampel dalam jumlah banyak
dengan waktu relatif singkat untuk mengetahui keberadaan gen yang di
introduksi. Selain itu, test PCR terhadap tanaman transgenik dapat dilakukan
secara dini, yaitu pada tahap kalus atau planlet dan merupakan metode yang
sangat sensitive sehingga dengan hanya satu molekul DNA dapat memperbanyak
DNA jutaan kali lipat setelah 30-an siklus PCR. Tahap-tahap dalam PCR
diantaranya:
1. Denaturasi
Tahap ini dilakukan untuk memutuskan ikatan hidrogen antar DNA. DNA
untai ganda akan menjadi untai tunggal pada tahap ini karena ikatan hidrogen
yang menghubungkan untai DNA itu putus. Tahap denaturasi ini terjadi pada
suhu 94-96 0C. Tahap denaturasi ini dilakukan selama lima menit untuk
memastikan seluruh DNA berada dalam keadaan single stranded. Untai DNA
tunggal ini digunakan sebagai template penempelan primer.
2. Penempelan
Tahap selanjutnya adalah tahap penempelan primer pada template DNA untai
tunggal. Tahap ini terjadi pada suhu 45-60 0C selama 1-2 menit. Penggunaan
suhu yang tidak tepat menyebabkan primer tidak menempel pada posisi yang
seharusnya.
3. Pemanjangan
Tahap terakhir dalam PCR adalah tahap penempelan. Tahap ini terjadi
pemanjangan DNA dengan bantuan DNA Taq Polimerase. Tahap ini terjadi
pada suhu 76 0C selama satu menit. Setelah tahap ini siklus DNA berulang
kembali ke tahap sebelumnya untuk menghasilkan jumlah DNA yang
berlimpah.
 Jenis tanaman yang telah banyak direkayasa adalah kedelai dan jagung. Pada
umumnya, rekayasa dilakukan agar tanaman bertahan pada lingkungan yang
buruk, tahan hama, tahan herbisida dan sebagainya. Pada proses rekayasa
genetika, fragmen DNA yang diinsertkan ke dalam suatu sel akan mengandung,
promoter, gen interest dan terminator.
Promoter berperan untuk memulai transkripsi dan terminator berperan dalam
mengakhiri transkripsi. Tipe promoter yang dipilih, umumnya adalah promoter
yang memiliki tingkat ekspresi gen yang tinggi. Selain itu, promoter tersebut juga
harus dapat dikenali oleh properti ekspresi gen pada sel tanaman yang
bersangkutan. Promoter yang memenuhi kedua kriteria ini bisa berasal dari
tanaman itu sendiri atau dari virus yang menyerang tanaman (viral promoter).
Promotor 35S, berasal dari virus tanaman biasa, virus mosaik kembang kol
(CaMV), adalah komponen konstruksi transgenik di lebih dari 80% dari tanaman
rekayasa genetika (GM). promotor 35S memiliki beberapa domain dengan
kekhususan jaringan yang berbeda dan bahwa 35S promotor sangat efisien dan
dapat berfungsi dalam berbagai organisme, tidak hanya tanaman tapi juga bakteri
dan hewan. Promotor 35s memiliki tingkat ekspreksi yang tinggi dan karena
memiliki kekhususan jaringan yang berbeda, maka promotor ini sulit dipengaruhi
oleh kondisi lingkungan maupun mekanisme regulasi tanaman itu sendiri.
Sehingga promotor ini sering digunakan pada tanaman GMO. Jadi promotor ini
seringkali digunakan sebagai indikator tanaman tsb GMO atau bukan.
Terminator yang sering digunakan dalam rekayasa genetika adalah terminator
NOS. Terminator NOS awalnya diekstraksi dari bakteri spesies Agrobacterium
tumefaciens. Kelebihan dari NOS terminator adalah selain mengandung sequence
yang berperan sebagai sinyal terminasi, terminator ini juga mengandung sinyal
untuk polyadenylation dari mRNA yang dihasilkan. Singkatan NOS singkatan
sintase nopaline.NOS ini juga mengandung sinyal untuk polyaneylation dari
mRNA yang dihasilkan.
Dalam proses pendeteksian GMO, selain dilakukan deteksi promotor dan
terminator, digunakan juga kontrol positif untuk menyatakan bahwa isolasi DNA
kromosom sudah berhasil. Pada biji kedelai, kontrol positif yang digunakan dapat
berasal dari gen lectin yang berperan pada saat perkecambahan. Dengan adanya
keberadaan gen lectin pada hasil analisa, maka isolasi DNA dapat dinyatakan
berhasil.
Elektroforesis adalah suatu cara analisis kimiawi yang didasarkan pada
pergerakan molekul-molekul bermuatan di dalam medan listrik (titik isoelektrik).
Pergerakan molekul dalam medan listrik dipengaruhi oleh bentuk, ukuran, besar
muatan, dan sifat kimia dari molekul (Titrawani 1996). Dengan demikian
elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul seperti protein dan
asam nukleat.
Elektroforesis gel merupakan suatu metode pemisahan berdasarkan berat
dan strukturnya menggunakan arus listrik dalam matriks gel. Media penunjang
yang biasa dipakai adalah gel agarose, gel pati, gel poliakrilamida, dan kertas
selulose poliasetat. Namun dalam separasi DNA, gel agarosa dan gel
poliakrilamida sering digunakan (Sargent dan George, 1975).
Dalam proses injeksi sampel DNA ke dalam gel, loading dye memiliki
peranan penting dalam mempertajam band-band DNA. Loading dye memiliki 3
fungsi utama, yaitu untuk menghilangkan reaksi enzimatis sebelum elektroforesis
(oleh EDTA), menyediakan densitas untuk loading sampel ke dalam well ( oleh
gliserol atau sukrosa), dan juga menyediakan cara untuk memonitor proses dari
elektroforesis.
 Marker merupakan satu set fragment DNA yang telah diketahui ukuran
molekularnya dan digunakan sebagai standar untuk menentukan ukuran fragment
yang belum diketahui. Selain itu, dapat juga digunakan untuk memperkirakan
berat dari band dengan membandingkannya ke marker. DNA ladder (marker)
sering diproduksi dari plasmid yang telah dipotong dengan enzim restriksi.
Dalam pembuatan gel agarosa, selain digunakan larutan buffer untuk
melarutkan bubuk gel, ditambahkan juga Ethidium bromideor EtBr. EtBr
merupakan dye yang paling umum digunakan untuk membuat band DNA atau
RNA terlihat pada gel agarosa. EtBr akan berfluoresensi dibawah sinar UV ketika
EtBr berikatan dengan DNA (atau RNA), dimana akan menurunkan mobilitas
DNA hingga 15%. Dengan melakukan running DNA pada gel ber-EtBr dan
mem-visualisasinya dengan sinar UV, band yang mengandung lebih dari 20 ng
DNA akan terlihat dengan jelas. EtBr diketahui sebagai mutagen, namun
alternatif yang lebih aman juga telah tersedia seperti SYBR Green I dan SYBR
Safe.

III.Alat dan bahan

ALAT BAHAN
1. Sampel kacang kedelai
1. Blender
2. Taq DNA polimerase
2. Tabung eppendorf
3. Stok dNTP
3. Tabung PCR
4. Buffer PCR 10x (tanpa
4. Parafilm
MgCl2)
5. Tip putih
5. Stok MgCl2 25 mM
6. Satu set peralatan
6. Primer untuk kontrol positif
elektroforesis horisontal
dan penentuan GMO
7. Mikropipet 1-10 µL

8. Satu set peralatan pembuatan gel agarosa

9. Erlenmeyer

10. Isolasi
 11. PCR

IV. Cara kerja

1. Isolasi kromosom

a. Hasil blender sampel di ambil sebanyak 4 eppendorf masing-masing 500

µL, kemudian ditambahkan 1 ml buffer lisis

b. Meng-inkubasi pada suhu 65°C selama 30 menit

c. Meng-sentrifuge pada 1000 rpm selama 10 menit

d. Mengambil supernatant sebanyak 500 µL dari keempat tabung tersebut

dan memindahkannya ke tabung eppendorf steril yang lain. menambahkan
500 µL larutan PCI kedalam tabung eppendorf baru, lalu dibolak balik
sebentar dan meng-sentrifuge dengan kecepatan 10000 rpm selama 10
menit

e. Dari hasil sentrifuge, mengambil larutan bagian atas tabung sebanyak 200
µL dan dipindahkan ke tabung eppendorf steril.

f. Menambahkan etanol absolut dingin kedalam tabung eppendorf baru

sebanyak 400 µL (2x volume larutan), kemudian didiamkan didalam
freezer selama 30 menit.

g. Meng-sentrifuge dengan kecepatan 10000 rpm selama 10 menit

h. Membuang supernatan dan meresuspensi pellet dengan etanol 70%, lalu di

bolak-balik dan meng-sentrifuge dengan kecepatan 10000 rpm selama 10
menit

i. Membuang supernatant dan mengeringkan pellet. Pellet diresuspensi

dengan ddH2O sebanyak 20 µL.

2. PCR

a. Membuat campuran PCR dalam 3 tabung eppendorf dengan komposisi:

 • Master mix 8 µL

• Sampel 2 µL

• ddH2O 6 µL

b. masing-masing tabung di isi dengan primer dengan ketentuan :

• tabung 1 : primer F dan R untuk kontrol positif (Lectin)

• tabung kedua : primer F dan R 35S

• tabung ketiga : primer F dan R terminator NOS

c. melakukan PCR dengan kondisi suhu denaturing 95°C, suhu annealing

60°C dan suhu polimerisasi 72°C dengan siklus sebanyak 40x

3. Elektroforesis

Melakukan seperti pada modul penentuan ukuran DNA

V. Hasil percobaan

Sumur / well

Marker DNA

Kontrol positif
(35S, NOS)

Sampel
(35S, NOS,
Lectin)

VI. Perhitungan
Berikut data hasil percobaan yang didapatkan :

Jarak migrasi (cm) Ukuran DNA marker (bp) Log (bp)

1,4 1500 3,176091
1,8 1000 3
1,9 900 2,954243
2 800 2,90309
2,2 700 2,845098
2,4 600 2,778151
2,6 500 2,69897
2,8 400 2,60206
3,1 300 2,477121
3,5 200 2,30103
4 100 2

Berdasarkan data hasil percobaan tersebut, dengan jarak migrasi marker DNA
sebagai sumbu x dan log (bp) sebagai sumbu y, maka dapat didapatkan hasil
grafik dan regresi linier dari marker sebagai berikut :
Dengan regresi linier :

A = 3,7951

B = -0,4336

R2 = 0,9929

Didapatkan persamaan garis linier :

Log (bp) = -0,4336 (jarak migrasi DNA) + 3,7951

Dengan demikian, ukuran DNA plasmid pada masing-masing band dapat

ditentukan :

• Kontrol positif promotor 35S

Jarak migrasi : 3,4 cm

Log (bp) = -0,4336 (jarak migrasi DNA) + 3,7951 basepair ≈ 209 bp

• Kontrol positif terminator NOS

Jarak migrasi : 3,5 cm

Log (bp) = -0,4336 (jarak migrasi DNA) + 3,7951 basepair ≈ 189 bp

VII. Pembahasan
Pada percobaan ini dilakukan penentuan GMO dari sampel kacang kedelai
dengan metode PCR dengan mengamplifikasi promotor 35S dan terminator NOS.
Kemudian dilakukan elektroforesis untuk analisanya.
Dalam penentuan ukuran DNA pada masing-masing band, dapat dilakukan
dengan mengetahui jarak migrasi DNA marker, yang kemudian dapat
dihubungkan dengan log dari ukuran DNA untuk membuat persamaan regresi
linear. Pada percobaan ini marker yang digunakan membentuk 11 band ketika di
elektroforesis, yang masing-masing berukuran 1500 bp, 1000 bp, 900 bp, 800 bp,
700 bp, 600 bp, 500 bp, 400 bp, 300 bp, 200 bp, 100 bp, dan secara berurutan
letaknya menjauhi sumur. Jarak migrasi plasmid DNA sebagai sumbu x dan
logaritma dari ukuran DNA sebagai sumbu y. Didapatkan persamaan regresi
linear :

Log (bp) = -0,4336 (jarak migrasi DNA) + 3,7951

Dengan R2 : 0,9929 yang mendekati 1, sehingga cukup valid digunakan untuk

analisa selanjutnya.
Dari hasil elektroforesis yang dilakukan, didapatkan hasil elektroforesis
amplifikasi promotor 35S, gen lectin dan terminator NOS berupa smear tanpa
adanya band-band lain. Namun hasil elektroforesis dari kontrol positif promotor
35S dan terminator NOS dapat tervisualisasi dengan baik. Dengan demikian,
analisa lebih lanjut hanya dapat dilakukan untuk kontrol positif promotor 35S dan
terminator NOS, sedangkan untuk pengukuran sampel tidak memungkinkan
dilakukan.
Dengan melihat hasil yang ada, maka keberhasilan isolasi kromosom pada
percobaan ini juga tidak dapat ditentukan. Hal ini dikarenakan hasil elektroforesis
dari hasil PCR gen Lectin hanya didapatkan berupa smear tanpa adanya band
lain. Selain itu, memungkinkan juga pada hasil Lectin ini terdapat band, namun
letaknya sejajar dengan smear yang terbentuk sehingga tidak terlihat.
Dalam penentuan GMO pada percobaan ini, dilakukan dengan
membandingkan band dari hasil elektroforesis 35S dan NOS dengan kontrol
positifnya. Namun, penentuan tersebut cukup sulit dilakukan. Hal ini dikarenakan
dengan hasil elektroforesis dari 35S dan NOS hanya berupa smear tanpa adanya
 band lain. Dengan demikian, hasil elektroforesis 35S dan NOS tidak dapat
dibandingkan dengan kontrol positif dari 35S dan NOS.
Namun, pada percobaan ini juga tidak menutup kemungkinan adanya band
dari hasil PCR 35S dan NOS. Dimana memungkinkan band yang terbentuk
sangat tipis dan sejajar dengan smear yang terbentuk, sehingga band tersebut
menjadi sulit tervisualisasi. Maka dari itu, dengan melihat perbandingkan letak
smear yang terbentuk dengan kontrol positifnya yang sejajar, maka sulit untuk
menentukan apakah sampel merupakan GMO.
Smear yang terbentuk pada percobaan ini merupakan pertanda dari adanya
kontaminan selain gen Lectin atau promotor 35S atau termianator NOS.
Kontaminan tersebut kemungkinan besar berupa RNA, karena hasil smear
tersebut memiliki ciri yang sama dengan hasil elektroforesis dari RNA dimana
berupa smear dan hasil yang kurang jelas.
Adapun beberapa faktor yang dapat mempengaruhi hasil percobaan di
antaranya adalah :
1. Adanya kontaminasi berupa RNA dan menyebabkan terbentuknya smear
2. Isolasi kromosom yang kurang baik

VIII. Kesimpulan

Isolasi DNA kromosom tanaman (kacang kedelai) dapat dilakukan

dengan memblender terlebih dahulu sampel tersebut dan diberi larutan buffer
lysis untuk dapat memecah dinding sel dan membran sel sehingga organel-
organel dalam sel dapat keluar. Selanjutnya dipisahkan DNA dari organel-
organel yang lain dengan pemberian beberapa senyawa seperti PCl dan etanol
yang kemudian disentrifugasi sehingga akan terbentuk supernatant dan pellet.
DNA yang berhasil diisolasi siap untuk di-PCR.

PCR dilakukan untuk mendeteksi keberadaan gen lectin yang

ditemukan pada setiap kacang kedelai dan keberadaan gen 35S dan NOS yang
ditemukan khusus pada produk GMO. Untuk itu digunakan 3 primer, masing-
masing untuk ketiga gen tersebut. Masing-masing primer terdiri dari dua jenis
primer yaitu forward dan reverse. Apabila pada elektroforesis uji lectin
menunjukkan hasil positif berarti isolasi DNA kromosom kacang kedelai
berhasil dilakukan, dan juga sebaliknya. Bila uji 35S dan NOS positif berarti
sampel merupakan GMO, jika tidak berarti sampel bukan produk GMO.

Dalam sampel kacang kedelai yang kita dapatkan tidak dapat

ditentukan apakah produk merupakan produk GMO atau bukan karena pada
band hasil elektroforesis menunjukkan hasil smear.
DAFTAR PUSTAKA