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PALESTRA

Noções básicas de cromatografia. 227

NOÇÕES BÁSICAS DE CROMATOGRAFIA

Terezinha Bonanho Peres


Centro de Pesquisa e Desenvolvimento de Proteção Ambiental-Instituto
Biológico
São Paulo - SP
E-mail: peres@biologico.sp.gov.br

RESUMO

Cromatografia é uma técnica utilizada para a separação dos


componentes de uma mistura. A separação cromatográfica é ba-
seada na distribuição dos componentes entre uma fase estacioná-
ria e uma fase móvel. Esta separação resulta das diferenças de
velocidade dos componentes arrastados pela fase móvel devido
às diferentes interações com a fase estacionária. Os principais
métodos cromatográficos são: cromatografia em papel (CP),
cromatografia de camada delgada (CCD), cromatografia gasosa (CG) e cromatografia líqui-
da de alta eficiência (CLAE). A seleção do método a ser empregado depende do material a
ser utilizado.

PALAVRAS-CHAVE: Cromatografia em papel, cromatografia em camada delgada, cromatografia


gasosa e cromatografia líquida de alta eficiência.

ABSTRACT

BASIC NOTIONS OF CHROMATOGRAPHY. Chromatography is an analytical method


for the separation of mixture components. The cromatographic separation is based on the
different partition of the components to be separeted between the mobile phase and the
stationary phase. The principal chromatographic forms are: paper chromatography (PC),
thin layer chromatography (TLC), gas liquid chromatography (GC) and high performance
liquid chromatography (HPLC). The chromatographic form is selected in accordance to the
material to be analysed

KEY WORD: Paper chromatography, thin layer chromatography, gas liquid chromatography
and higt performance liquid chromatography.

Cromatografia é um processo físico de separação, Cromatografia em papel


no qual os componentes a serem separados distribu-
em-se em duas fases: fase estacionária e fase móvel. A A cromatografia em papel (CP) é uma das técnicas
fase estacionária pode ser um sólido ou um líquido mais simples e que requer menos instrumentos para
dispostos sobre um suporte sólido com grande área sua realização, porém é a que apresenta as maiores
superficial. A fase móvel, que pode ser gasosa, líquida restrições para sua utilização em termos analíticos.
ou ainda um fluido supercrítico, passa sobre a fase Neste tipo de cromatografia, uma amostra líquida
estacionária, arrastando consigo os diversos compo- flui por uma tira de papel adsorvente disposto ver-
nentes da mistura. ticalmente. O papel é composto por moléculas de
Existem quatro tipos principais de celulose que possuem uma forte afinidade pela água
cromatografia: cromatografia em papel, presente na mistura de solvente, mas muito pouca
cromatografia de camada delgada, cromatografia afinidade pela fase orgânica, atuando como supor-
gasosa e cromatografia líquida de alta eficiuência. te inerte contendo a fase estacionária aquosa (po-
A seleção do tipo de cromatografia adequada de- lar). A medida que o solvente contendo o soluto
pende do material a ser isolado e, freqüentemente, flui através do papel, uma partição deste compos-
diversos métodos cromatográficos podem ser usa- to ocorre entre entre a fase móvel orgânica (pouco
dos seqüencialmente para que seja obtido um com- polar) e a fase estacionária aquosa. Desta forma, parte
posto na forma pura. do soluto deixa o papel e entra na fase móvel. Quan-

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do a fase móvel alcança uma seção do papel que acusando impurezas na ordem de partes por milhão
não contém soluto, o fenômeno de partição ocorre (ppm) ou partes por bilhão (ppb).
novamente, só que agora o soluto é transferido da As colunas cromatográficas utilizadas podem ser
fase móvel para a fase estacionária. Com o fluxo de níquel, aço inox ou de vidro. De acordo com o
contínuo de solvente, o efeito desta partição entre aparelho, as colunas variam de formato, mas na
a fases móvel e estacionária possibilita a transfe- maioria das vezes elas são espirais. O comprimento e
rência do soluto do seu ponto de aplicação no pa- o diâmetro da coluna a ser usada irá depender do
pel, para um outro ponto localizado a alguma distân- material a ser analisado.
cia do local de aplicação no sentido do fluxo de solvente. As colunas recheadas analíticas possuem diâmetro
interno (d.i.) de cerca de 1,0 a 4,0 mm e comprimento
CAMADA DELGADA de 1,0 a 3,0 m, enquanto que as colunas recheadas
preparativas apresentam d.i. de 5,0 a 100,0 mm,
Na cromatografia em camada delgada (TLC), a possibilitando a injeção de maior volume de amostra.
fase estacionária é uma camada fina formada por um Já, as colunas capilares têm d.i. variando de 0,15 a
sólido granulado (sílica, alumina, poliamida, etc.) 0,75 mm e comprimento de 10,0 a 100,0 m, sendo as
depositado sobre uma placa de vidro, alumínio ou mais utilizadas as de sílica fundida, pois esta é alta-
outro suporte inerte. mente inerte e flexível.
Pequenas gotas de solução das amostras a se- Os detectores são dispositivos que transformam
rem analisadas são aplicadas em um ponto próxi- as variações na composição do gás de arraste em
mo ao extremo inferior da placa. Deixa-se a placa sinais elétricos. Existe diferentes tipos de detectores:
secar e, então coloca-se a mesma em um recepiente 1) detector de condutividade térmica (DCT), usado
contendo a fase móvel (solvente ou mistura de para compostos orgânicos, inorgânicos, derivados
solventes). A polaridade do solvente deverá ser de de petróleo etc. Os DCT possuem dois ou quatro
acordo com a substância que se deseja separar. filamentos de platina (Pt), tungstênio (W), níquel
Como somente a base da placa fica submersa, o (Ni) ou Pt - W, os quais são aquecidos por corrente
solvente começa a molhar a fase estacionária e sob elétrica. Conforme o gás passa pelos filamentos há
por capilaridade. transferência de calor e, o tempo da passagem do
Deixa-se secar a placa após o deslocamento da gás, juntamente com a condutividade térmica são
fase móvel sobre ela. A revelação da placa é feita com registrados, efetuan do-se assim, a análise. Esta
a aplicação de um reativo que de cor às substâncias análise é feita comparando-se o gás de arraste puro
de interesse. (que passa por um conjunto de filamentos) com o
gás de arraste com a amostra (que passa por outro
CROMATOGRAFIA GASOSA conjunto de filamentos). 2) detector de ionização
de chama (DIC), utilizados apenas para compos-
A cromatografia gasosa (CG) é uma técnica com tos orgâniocos com baixa sensibilidade para
poder de resolução excelente, possibilitando a análise formaldeído e ácido fórmico, consiste de um cam-
de várias substâncias em uma mesma amostra. po elétrico (200 - 300 v) e uma chama onde a amos-
Dependendo do tipo de substância a ser analisada e tra é queimada. A combustão resulta em radicais
do detector empregado, consegue-se detectar cerca de livres que são ionizados pelo campo elétrico, au-
10 -12g do composto mL -1 de solução. Essa sensibilida- mentando a corrente nos eletrodos. 3) detector de
de permite que pequenas quantidades de amostra captura de elétrons (DCE), usado principalmente
possam ser analisadas. na detecção de pesticidas e drogas. Neste detector
A fase estacionária da cromatografia gasosa é um há uma fonte de radiação beta em corrente cons-
material, líquido ou sólido, que propicia a separação da tante. O gás de arraste passa com uma amostra
mistura através de processos físicos e químicos. A fase onde há substituição de um elétron por um íon ne-
estacionária líquida é um líquido pouco volátil que re- gativo, o que diminui a corrente elétrica. O gás de
cobre um suporte sólido, separando as substancias pre- arraste com a amostra é comparado com o gás de
sentes na amostra através das diferenças de solubili- arraste puro (corrente de fundo), que quanto maior
dade e volatilidade. Como fase móvel é utilizado um seu valor maior é a sensibilidade do detector. A di-
gás, denominado gás de arraste, que transporta a amos- minuição do valor da corrente de fundo é sinal de
tra através da coluna de separação até o detector, onde impureza, vazamento da fonte, sujeira ou coluna
os compostos separados são detectados. mal condicionada. O gás de arraste usado é o N2
Os gases mais utilizados são o hélio (He), hidro- livre de H2 e O2, isto é, gás N2 ultra puro. 5) detector
gênio (H), nitrogênio (N) e argônio (Ar). Como o He é fotométrico de chama (DFC) apresenta alta estabi-
de difícil obtenção e alto custo é pouco utilizado no lidade para compostos sulfurados e fosforados. Há
Brasil. A pureza do gás de arraste interfere no resultado, uma combustão no campo elétrico com emissão de

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luz de diversos comprimentos de ondas. Filtros eli- da. A capacidade da coluna é determinada pelo com-
minam as radiações desneces-sárias, selecionan- primento, diâmetro e pelo material de recheio. As colu-
do as de interesse, em especial as que tenham en- nas geralmente utilizada são: octadecil (C18, RP18,
xofre (S) e fósforo (P). O gás de arraste é o N2 e da ODS), octil (C8, RP8), CN (cianopropil) e NH2 (amina).
chama é o H2 com ar ultra puro e seco.A pureza Quanto aos detectores, não existe um que apre-
dos reagentes deve ser na ordem de partes por trilhão sente todas as propriedades para que ele seja ideal
(ppt). para CLAE. Não são versáteis, ou universais, mas
Cromatografia líquida de alta eficiência existem detectores que apresentam ampla faixa de
aplicações. A sensibilidade de um detector é deter-
A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência minada a partir da relação entre o sinal produzido
(CLAE) se desenvolveu muito nos últimos anos, rece- e a quantidade de amostra que gera este sinal. A
bendo o nome de cromatografia líquida por que a sua linearidade é a faixa linear do sistema, onde o si-
fase móvel é um solvente. nal do detector é diretamente proporcional à con-
Os componentes de um cromatógrafo líquido são: centração do soluto.
bomba, coluna cromatográfica, detector e o registra- Os detectores mais usadas na CLAE são os
dor. É um método utilizado para separação de espéci- fotométricos, baseados na absorvância no ultra-vio-
es iônicas ou macromoléculas e compostos leta e no visível. Os detectors de fluorescência, utili-
termolábeis. zados como método de detecção específica, são sen-
A fase móvel da CLAE deve ser um solvente que síveis para substâncias que fluorescem. Este tipo de
respeite algumas características impostas por esse detector pode detectar quantidades de ordem
método analítico. A principal característica é que a picograma. Também são utilizados detectores por ín-
fase móvel dissolva a amostra sem qualquer interação dice de refração, os quais acompanham continuamente
química entre ambas. Esta fase deve ter alto grau de a diferença no índice de refração entre a fase móvel
pureza ou ser de fácil purificação, para que se possa pura e o efluente que sai da coluna contendo os com-
fazer análises de alta sensibilidade, pois as impurezas ponentes da amostra. A resposta deste detector é mo-
podem interferir na detecção do analito por ultra- derada, geralmente de ordem micrograma.
violeta (UV). A fase móvel deve ser compatível com o
detector empregado e, também possuir polaridade
adequada para permitir uma separação conveniente
BIBLIOGRAFIA C ONSULTADA
dos componentes da amostra. Embora existam vários
solventes, três deles são mais utilizados: água, metanol
C OLLINS, C.H.; BRAGA, G.L.; BONATO, P.S. Introdução a métodos
e acetonitrila.
cromatográficos. 6. Ed. Canpinas: Editora UNICANP,
Como fase estacionária utiliza-se sólidos ou semi-
1995.
rígidos, cujas partículas porosas esféricas ou irregu- C IOLA, R. Introdução à cromatografia em fase gasosa. São Paulo:
lares apresentam diferentes diâmetros e suportam Edgard Bülcher, 1973.
pressão até 350 bar. C IOLA R. Fundamentos da cromatografia a líquido de alto
A coluna cromatográfica é feita de um material inerte desempenho HPLC. 1. Ed. São Paulo: Edgard Bülcher,
que resiste a todas as pressões em que ela vai ser usa- 1998.

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