VIAS DE SINALIZAÇÃO QUE CONTROLAM A EXPRESSÃO GÊNICA

SEMINÁRIO MARCIA

INTRODUÇÃO

Os sinais extracelulares podem ter efeitos tanto a curto quanto a longo prazo. Os efeitos a
curto prazo normalmente são acionados por modificações de proteínas ou enzimas existentes,
como mostrado pelo BOLIVAL. Entretanto, diversos sinais extracelulares também afetam a
expressão genica e, assim, podem induzir mudanças a longo prazo na função celular,
mudanças essas que incluem por exemplo a divisão e diferenciação celular. As mudanças na
expressão genica também possibilitam que células diferenciadas respondam as interações
ambientais, mudando sua forma, seu metabolismo ou seu movimento.
Nas células do sistema imune, diversos hormônios ativam um fator de transcrição (NF-kB)
que, por fim, afeta a expressão de mais de 150 geens envolvidos na resposta imune contra a
infecção. Tendo em vista o amplo papel da transcrição genica, não é surpreendente que
mutações nessas vias de sinalização ocasionem o desenvolvimento de doenças, como o
câncer, diabetes e os distúrbios imunes.
O processo de transcrição genética (formação do RNA a partir da cadeia molde de DNA –
informa a ordem correta dos aminoácidos a serem sintetizados), é influenciado pela estrutura
da cromatina (o complexo proteína-DNA no qual o DNA nuclear ocorre nas células
eucarióticas), por modificações epigeneticas em histonas (funcionam como a matriz na qual o
DNA se enrola. Tem um importante papel na regulação dos genes. Ao compactarem o DNA,
permitem que os genomas eucarióticos de grande dimensão caibam dentro do núcleo das
células. Podem sofrer modificações pos-traducionais, por sua vez, estas modificações podem
desempenhar um importante papel na regulação dos genes, de maneira epigenetica – todas as
mudanças reversíveis e herdáveis no genoma funcional que não alteram a sequencia de
nucleotídeos do DNA – padrão de expressão que herdamos de nossos antepassados), e outras
proteínas nucleares e pela complementação celular de fatores de transcricaoe outras proteínas.
Essas propriedades determinam quais genes a célula pode transcrever a qualquer momento,
uma proprodedade de memoria celular, determinado pela sua historia e pela sua resposta a
sinais prévios. Sobretudo, diversos fatores de transcrição regulatórios são mantidos em estado
inativo no citosol ou no nuclo e se tornam ativos apenas em respota a sinais externos,
induzindo a expressão de um conjunto de genes especifcos para esse tipo celular.
Em eucariotos existem 12 classes de receptores de superfície celular, altamente conservadas,
que ativam diversos tipos de vias de transdução de sinal ( processo pelo qual uma molécula
sinalizante extracelular ativa um receptor de membrana, que, por sua vez, altera moléculas
intracelulares para gerar uma resposta. Muitas dessas vias são formadas por múltiplas
proteínas, pequenas moléculas intracelulares e ions como o Ca, que juntos, forma m uma
cascata complexa. Dada essa complexidade, muitas vezes nos assustamos com os mulhares de
nomes, abreviações que temos que aprender.
Para simplificar, as vias de transdução podem ser agrupadas em diversos tiposbasicos, com
base na sequencia de eventos intracelulares.

1. Cinase associada ao receptor: a ligação do ligante ao receptor desencadeia a ativação

de um receptor associado a cinase. Por sua vez, essa cinase pode uma parte intrínseca
de um receptor proteico, ou ainda estar ligado fortemente ao seu receptor.
Frequentemente, essas cinases fosforilam e ativam diretamente uma variedade de
proteínas transdutoras de sinal, incluindo fatores de transcrição no citosol. No entanto,
algumas cinases receptoras ativam também pequenas proteínas ligadoras de GTP
“comutadoras” como a Ras.
2. Cinase citosolica: nesse caso, os receptores atravessam a membrana sete vezes, ativam
proteínas Galfa ligadoras de GTP. Ambos os tipos de proteínas ligadoras de GTP
podem ativar proteínas-cinases que fosforilam múltiplas proteínas-alvo, incluindo
fatores de transcrição. Muitas vias de transdução, como as ativadas pela Ras,
envolvem diversas cinases nas quais uma cinase fosforila e assim ativa ou inibe a
atividade de outras cinases.
3. Dissociacao da subunidade proteica: nesse exemplo, a ligação de um ligante a um
receptor desencadeia a desmontagem de um complexo proteico no citosol, liberando
um fator de transcrição que é translocado para o núcleo.
4. Clivagem proteica: a clivagem proteolítica de um inibidor ou do receptor libera um
fator de transcrição ativo, que é conduzido para o núcleo.

Quase todas as vias de sinalização podem ser agrupadas em um desses tipos básicos.
QUAL A IMPORTANCIA DE SE ESTUDAR VIAS DE SINALIZAÇÃO?
È a de compreender não só os processos naturais que conduzem a diferenciação ou ativação
de um gene, mas também perceber que uma ativação anormal pode conduzir a uma patologia
como o câncer.
Nenhuma via de sinalização age sozinha. Diversas células respondem a múltiplos hormônios e
outras moléculas sinalizadoras, algumas células de mamíferos apresentam mais de 100
diferentes tipos e não classes de receptores na superfície celular, e cada um se liga a um
ligante diferente.
Dessa forma, o objetivo deste capitulo é ver como múltiplas vias de sinalização interagem na
regulação de aspectos cruciais no metabolismo, como o nível de glicose sanguínea e a
formação de adipócitos.

16.1 OS RECEPTORES QUE ATIVAM PROTEINAS TIROSINA-CINASES.

Proteinas tirosina-cinases, são proteinas que fosforilam resíduos de tirosina específicos em

proteinas-alvo.
Duas categorias principais de receptores ativam tirosina-cinases: 1) aqueles em que a enzima
tirosina-cinase é uma parte intrínseca da cadeia polipeptídica do receptor (codificada pelo
mesmo gene), chamados de receptores tirosina tirosina-cinase (RTKs) e 2) aqueles, como
receptores de CITOCINAS, a cinase ligada fortemente é conhecida como JAK cinase. Ambas
as classes de receptores ativam vias intracelulares de transdução de sinal. Em todos os casos, a
ligação da proteína de sinalização ao domínio de interação com o ligante na face extracelular
do receptor ativa o domínio tirosina-cinase na face citosolica. Isso leva a fosforilação das
cadeias laterais da tirosina na parte citosolica do receptor, criando sítios de ancoragem pra
varias proteinas de sinalização intracelular que transmitem o sinal.

FATORES QUE REGULAM A DIVISAO CELULAR E O METABOLISMO SÃO

LIGANTES DE RECEPTORES TIROSINA-QUINASE
Os receptores de tirosinaquinases (RTK) constituem o segundo maior tipo de receptores
celulares de superfície, entre os que se incluem o fator de crescimento neural (NGF), o fator
de crescimento de fibroblastos (FGF) e o fator de crescimento epidermal ou epidermico
(EGF), que estimulam a proliferação e a diferencicao de tipos celulares específicos. Outros,
como a insulina, regulam a expressão de múltiplos genes que controlam o metabolismo de
açúcar e lipídeos no fígado, nos músculos e nos adipócitos. Muitos desses receptores foram
identificados em estudos de canceres humanos associados com formas mutantes de fatores de
crescimento. A mutação “engana” o receptor se comportando como um ligante que permanece
em constante estado ativo.
Dimerização: união de dois monômeros

ESTRUTURA GERAL E ATIVAÇÃO DOS RKT

Existem 60 RKTs humanos, que podem ser subclassificados em 20 subfamilias estruturais,
cada uma delas destinada a sua família complementar de ligantes proteicos.
Todos os RKTs tem três componentes essenciais: um domínio extracelular que funciona como
um local para o ligante especifico; uma a-helice transmembrana hidrofóbica, e um domínio
tirosina-quinase citoplasmático. A maioria das RKTs é monomérica, e aligacao de um ligante
ao domínio extracelular induz a formação de receptores dimericos. A formação de dímeros
funcionais é uma etapa necessária na ativação de todos os RKTs. Esse processo é chamado de
união de dois ou mais receptores de ativação por oligomerizacao do receptor.

DE QUE FORMA A INTERACAO COM UM LIGANTE EXTRACELULAR ATIVA O

DOMINIO DE CINASE, DO OUTRO LADO DA MEMBRANA PLASMATICA?
No estado não-estimulado (sem ligação do ligante), a atividade intrínseca de cinase de um
RTK é muito baixa, estando estes na forma de monômeros, nos quais o domínio cinase
interno esta inativo. Como muitas outras cinases, RTKs contem um domínio flexível
denominado de borda de ativação. No estado de repouso, a borda de ativação é desfosforilada
e assume uma conformação que bloqueia a atividade de cinase. Em alguns receptores (como
no receptor de insulina), ela previne a ligação do ATP. Em outros (como no receptor de FGF),
ela previne a ligação do substrato.
A ligação do ligante causa uma mudança conformacional que provoca a dimerização dos
receptores, unindo os dois domínios citoplasmáticos da cinase. Em muitos casos, como no do
receptor de insulina, a dimerização simplesmente aproxima os domínios cinase em uma
orientação que permite que fosforilem um ao outro em tirosinas especificas nos sitidos ativos
da cinase, promovendo, desse modo, mudanças conformacionais que ativm ambos os
domínios da cinase. Em outros casis, como no do receptor do fator de crescimento epidérmico
(EGF), a cinase não é ativada por fosforilação, mas por mudanças conformacionais resultantes
de interações entre os dois dominuos cinase fora dos seus sítios ativos. Essa fosforilação leva
a mudança conformacional na borda de ativação que desbloqueia e, assim, aciona a atividade
da cinase para o ATP ou o substrato a ser fosforilado.

Quando os domínios cinase de um dímero RTK são ativados, eles fosforilam múltiplos sítios
adicionais nas partes citosolicas dos receptores. Essa fosforilcao cria sítios de ancoragem de
alta afinidade para proteinas de sinalização intracelular. Cada uma delas se liga a um sitio
fosforilado especifico nos receptores ativados. Uma vez ligada ao RTK ativado, a proteína
sinalizadora pode ser fosforilada em algumas tirosinas, tornando-se ativa. Em muitos casos,
contudo, a ligação por si só é suficiente para ativar a proteína sinalizadora, tanto por induzir
uma mudança na conformação da proteína, como simplesmente por aproxima-la da proteína
seguinte na via de sinalização. Assim, a fosforilação do receptor serve como um comutador
para deflagrar a associação de um complexo de sinalização intracelular, que pode transmitir o
sinal adiante, frequentemente ao longo de múltiplas vias, para vários destinos nas células.
Diferentes RTKs desencadeiam diferentes respostas, pois se ligam a diferentes combinações
de proteinas sinalizadoras.
Alguns RTKs usam proteínas de ancoragem adicionais para aumentar o complexo de
sinalização em receptores ativados. A sinalização do receptor de insulina e de IGF1,
dependende de uma proteína de ancoragem especializada chamada substrato 1 do receptor da
insulina (IRS1). Essa proteína se associa as tirosinas fosforiladas no receptor ativado sendo
então fosforilada em múltiplos sítios, criando, dessa forma, mais sititios de ancoragem dos
que poderiam ser acomodados somente no receptor.

FAMILIA DOS RECEPTORES DE SUPERFICIE CELULAR HER/ErbB

O fator de crescimento epidérmico (EGF) foi descoberto nos anos 60 por Levi-Montacini e
Stanley Cohen, e foi um dos primeiros peptídeos de fatores de crescimento a ser descoberto.
Em meados dos anos 70, uma proteína da membrana plasmática que liga EGF foi reportada e
nomeada como receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR).
EGFR é um membro da família denominada HER ou ErbB composta, além do EGFR
(HER1), por HER2, HER3 e HER4. Todos possuem uma região de ligação extracelular, uma
região transmembranica e um domínio citoplasmático contendo sitio tirosinaquianse, exceto o
HER3 que não possui este ultimo domínio ativo, mas quando se dimeriza com outro membro
da família, torna-se fosforilado e capaz de provocar sinalização intracelular.
As proteinas que pertencem a essa família são caracterizdas pela presença de pontes dissulfeto
que conferem especificidade por domínios de imunoglobulinas, por sítios de ligação com
heparina e por sítios de glicosilaccao. Dessa maneira, a afinidade dos fatores de crescimento
com um ou mais receptores, permite divido-los em três grupos.
O primeiro grupos inclui o fator de crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento a
derivado de tmores (TGF-a) e anfiregulina (AR), que se ligam especificamente ao EGR (HB-
EGF). O segundo grupo inclui B-celulina (BTC), heparina EGF e epiregulina, que apresentam
ligação com EGFR e ErbB4. O terceiro grupo é composto pelas neuregulinas e podem ser
divididas em dois subgrupos baseados na afinidade de ligação ao ErbB-3 e ErbB-4 (NGR-1 e
2) ou somente ao ErbB-4 (NGR3 e 4). Nenhum dos peptídeos da família EGF ligam-se a o
ErbB-2, devido a conformação do seu domínio extracelular.

ATIVAÇAO DO ErbB
Em condições fisiológicas normais, a ativação dos receptores de ErbB é controlado pela
expressão espacial e temporal de seus ligantes. No momento em que um ligante especifico do
fator de crescimento se acopla ao domínio extracelular do EGFR, este se dimereiza com outro
EGFR (homodimerizacao) ou com outro membro da família ErbB (heterodimerizacao),
induzindo a formação de diferentes homo e heterodimeros e, como consequência, o domínio
intrínseco de quinase é ativado, resultando na autofosforilacao, e sendo finalizado pela quebra
da proteína no lisossomo com a parada da sinalização.

APLICAÇÃO CLINICA DO HERs

O conhecimento sobre os HERs tem auxiliado a explicar por que uma forma de câncer de
mama é tao perigoso e tem levado a uma importante terapia com fármacos. O câncer de mama
pode envolver o crescimento anormal de células epiteliais da mama. Células epiteliais
normais expressam uma pequena quantidade de proteína HER2 nas suas membranas
plasmáticas em padrões tecido-especifico, e elas não crescem inapropriadamente. Nas células
tumorais, erros de replicaco do DNA muitas vezes resultam na formação de múltiplas copias
de um dado gene de um único cromossomo, alteração conhecida como amplificação do gene.
A amplificação do gene HER2 ocorre em aproxidamente 25% dos canceres de mama,
resultando na superexpressao da proteinas HER2 nas células tumorais. Pacientes que possuem
essa superexpressao apresentam um prognostico pior, incluindo a diminunicao da
sobrevivência, comparado com aqueles pacientes sem essa anormalidade.
MECANISMO: A superexpressao de HER2 torna as células tumorais sensíveis ao estimulo de
crescimento por níveis baixos de qualquer membro da família dos fatores de crescimento
EGF, níveis esses que não deveriam estimular a proliferação das células com níveis normais
de HER2. A descoberta do papel da superexpressao de HER2 em certos canceres levou ao
desenvolvimento de anticorpos monoclonais específicos para a proteína HER2. Isso tem se
mostrado uma terapia efetiva para esses tipos de pacientes com câncer de mama no qual a
HER2 é superexpressa, reduzindo o reapareceimtno em torno de 50%.
CITOCINAS
São proteinas de baixo peso molecular que, em principio, são coadjuvantes da regulação da
resposta imune, seja de forma direta ou indireta, autocrina ou paracrina e em alguns casos,
endócrina. São diversos os tipo de citocinas e com diversas funções. Seu mecanismo de acao
consiste na ligacaoaos receptores específicos na membrana celular da célula alvo e, assim,
deflagra vias de transdução de sinal, em muitas células promovem alteração da expresso
genica. Algumas da citocinas mais conhecidas são as interleucinas que são produzidas
principalmente pelos leucócitos (linfócitos T, macrófagos e eosinófilos), mas também pelo
tecido adiposo branco, muitas vezes denominadas de adipocinas, destacando a IL-6 uma
citocina pro-inflamatoria.

MECANISMO DE ACAO VIA JAK TIROSINA-CINASE

Todos os receptores de citosina tem estruturas semelhantes. Os receptores de citocina não tem
atividade enzimática intrínseca. Em vez disso, a JAK cinase (just another kinase) é fortemente
ligada ao domínio citosolico de todos os receptores de citosina. Os quatros membros da
família JAK de cinases contem um domínio de ligação ao receptor no N-terminal, um
domínio de cinase no C-terminal normalmente pouco ativo catalicamente e um domínio
intermediário que regula a atividade de cinase por mecanismo desconhecido (por isso o nome
apenas outra cinase). Assim como nas RTK, essa cinase se torna ativa após a ligação do
ligante e da dimerização do receptor.
Como resultado da dimerização do receptor, as JAKs associadas são trazdias perto o
suficiente para uma conseguir fosforilar a outra em uma tirosina importante na borda de
ativação. Assim como em diversas outras cinases, a fosforilação da borda de ativação leva a
uma mudança conformacional que aumenta a afinidade pelo ATP ou substrato a ser
fosforilado, elevando, assim, a atividade de cinase.

RESIDUOS DE FOSFOTIROSINA – DOMINIO SH2

As mais diferentes proteinas de sinalização intracelular podem se ligar as fosfotirosinas dos
RTKs ativados, ou proteinas de ancoragem como a IRS-1). Elas participam da transmissão de
sinal por meio de cadeias de interações proteinas-proteinas, mediadas por domínio de
interação modulare. Algumas das proteinas de ancoragem são enzimas, como a fosfolipase C-
y, que ativa a via de sinalização do fosfolipideo de inositol. E através dessa via que os RTKs
podem aumentar os níveis citosolicos de Ca e ativam PKC. Outra enzima é a PI3-cinase
(fosfatidilinositideo 3-cinase), que fosforila lipodeos em vez de proteinas.
Uma vez que os RTKs de cinases ou as JAK cinases se tornam ativas, elas fosforilam
primeiro diversos resíduos de tirosina no domínio citosolico do receptor. Esses dominidos
podem ser SH2 ou, menos comumente, os domínios PTB.

VIA DA SINALIZAÇÃO JAK/STAT

A via de sinalização da Janus Kinase/Transdutores de Sinal e Ativadores de Transcricao
(JAK/STAT) atua na transdução do sinal iniciado na membrana celular, para os genes do
nucelo. Hoje sabe-se que a via JAK/STAT é ativada por mais de 50 citocinas e fatores de
crescimento, estando associada a diversas funções celulares nos sistemas imune,
hematopoiético, neurológico e no fígado.
A família das proteína-tirosina-kinase (PTKs) Janus Kinase (JAK) tem quatro membros nos
mamíferos: JAK1, JAK2, JAK3 e Tyk2. STATs são proteinas únicas entre os fatores de
transcrição por possuierem um domínio SH2, para ligação de fosfotirosinas. Todas as
proteinas STAT contem um domínio N-terminal de ligação ao DNA, um domínio SH2 que se
liga a uma ou mais fosfotirosina no domínio citosolico do receptor de citocina e um domínio
C-terminal com um resíduo de tirosina crucial.
A sinalização por JAK/STAT se inicia quando o ligante conecta-se ao seu receptor na
membrana da célula. No caso das citocinas, seus receptores formam homo ou hetero-dimeros
após a ligação, iniciando a sinalização. Como as JAKs são associadas aos receptores com a
dimerização destes, elas se transfosforilam e fosforilam resíduos de tirosina na porcao
citoplasmática do receptor, criando ancoradouros para a porcao homologa-2 Src das STATs e
para outras moléculas sinalizantes. Uma vez ligadas aos receptores, STATs são fosforiladas
pelas JAKs em único resido de tirosina. Asism ativadas, STATS se dissociam do receptor,
dimerizam-se, sofrem translocação para o núcleo, onde se ligam ao DNA e regulam a
expressão genica. A via de sinalização JAK/STAT pode ser ativada por diferentes ligantes,
assim como por stress celular induzido por IR, EROs, endotoxina, ou hiperosmolaridade.