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MAPA/SDA/CGAL

Código: MET POA/SLAV/52/02/01


Laboratório Nacional Agropecuário - LANAGRO/RS
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Laboratório de Produtos de Origem Animal/SLAV
Emissão: 18/09/2014
Método de Ensaio - MET
Determinação de nitrato e nitrito em produtos cárneos
por eletroforese capilar de zona
1 Escopo
Este método tem por objetivo determinar a concentração de nitrito e nitrato em produtos cárneos
utilizando a técnica de eletroforese capilar.

2 Fundamentos
Grandes quantidades de sais de nitrito e nitrato são utilizadas como conservantes em alimentos
como salsicha, linguiça, bacon, salame, entre outros, com objetivo de impedir o crescimento de
espécies de bactérias, além de conferir cor e sabor aos embutidos. O excesso desses íons pode
causar sérios danos à saúde, pois o nitrito é convertido em nitrosaminas, compostos com ação
carcinogênica após a digestão. O nitrato é reduzido a nitrito por ação de bactérias,
consequentemente também torna-se um risco sua utilização em alimentos. O presente método
baseia-se na extração do nitrito e nitrato em produtos cárneos e sua determinação por
eletroforese capilar (EC), que tem o potencial de permitir a seleção de condições apropriadas
para o método de separação, visando uma alta frequência analítica, com tempo de separação
dos analitos inferior a um minuto, simples preparo de amostra e mínima geração de resíduos e
consumo de reagentes.
Os limites de detecção (LOD) e quantificação (LOQ), limite de decisão (CCα) e a capacidade de
detecção (CCβ), definidos em procedimentos de validação intralaboratorial, bem como o Limite
Máximo de Resíduo (LMR), estão listados na tabela 1.

Tabela 1. Limites de detecção (LOD), Limite de quantificação (LOQ), Limite máximo de resíduo
(LMR) e valores de CCe CCdefinidos nos procedimentos de validação intralaboratorial do método
“determinação de nitrato e nitrito em produtos cárneos por EC”.
LMR (mg kg-1) LOD (mg kg-1) LOQ (mg kg-1) CCα (mg kg-1) CCβ (mg kg-1)
Nitrato 300,0 1,8 5,0 330,9 361,8
Nitrito 150,0 1,8 5,0 164,1 178,2

3 Reagentes, padrões e materiais


Todos os reagentes são de grau analítico (p.a.), exceto quando especificado. Toda a água
utilizada nos procedimentos deve ser de grau ultra-puro.
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3.1 Reagentes
Ácido perclórico 70% (HClO4);
β-alanina;
Acetonitrila (grau HPLC);
Tetraborato de sódio (TBS).

3.2 Padrões
Nitrato de sódio (NaNO3);
Nitrito de sódio (NaNO2);
Tiocianato de potássio (KSCN).

3.3 Materiais
- Capilares de sílica fundida, com 75 µm de D.I. e 48,5 cm de comprimento total;
- Estantes para tubos tipo “falcon”;
- Filtros qualitativo ou quantitativo;
- Micropipeta e ponteiras para faixa de volume de 1000-5000 µL;
- Micropipeta e ponteiras para faixa de volume de 100-1000 µL;
- Micropipeta e ponteiras para faixa de volume de 10-200 µL;
- Microtubos de capacidade 1,5 mL;
- Pipetador de repetição ou similar;
- Tubos tipo “falcon” de 50 mL;
- Vials para eletroforese capilar.

4 Equipamentos
- Agitador orbital;
- Balança analítica, com precisão mínima de quatro casas decimais;
- Banho- Maria;
- Centrifuga de microtubos com refrigeração;
- Sistema de eletroforese capilar;
- Ultra Turrax.
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5 Precauções analíticas
Este método emprega substâncias químicas nocivas e procedimentos que podem representar
risco ao operador. Todos os procedimentos devem ser realizados com uso de equipamentos de
proteção individual e uniforme apropriado. O preparo das soluções reagentes deve ser feito em
capela de exaustão. Amostras de alimentos em geral devem ser consideradas como de risco
biológico, evitando-se o contato direto com pele e mucosas.

6 Procedimentos
Todos os procedimentos analíticos devem ser registrados no formulário “Dados brutos", Anexo A
do POP POA/SLAV/15.

6.1 Preparo de soluções

6.1.1 Solução de hidróxido de sódio 1,0 mol L-1


Pesar 4,0 g de NaOH em um balão volumétrico de 100 mL e diluir em água ultra-pura, em
quantidade suficiente para (q.s.p.) preparar 100 mL de solução. Identificar e armazená-lo em
temperatura ambiente. O prazo de validade dessa solução é de seis meses, prevalecendo a
validade do padrão sólido caso a mesma seja menor.

6.1.2 Solução de tetraborato de sódio 5%


Pesar 2,5 g de TBS em um balão de 50 mL, diluir em água ultra-pura, em q.s.p. preparar 50 mL
de solução. Identificar e armazená-lo em refrigerador. O prazo de validade dessa solução é de
um ano, prevalecendo a validade do padrão sólido caso a mesma seja menor.

6.1.3 Solução de β-alanina 100 mmol L-1


Pesar 0,444 g de β-alanina em um balão volumétrico de 50 mL, diluir em água ultra-pura, em
q.s.p. preparar 50 mL de solução. Identificar e armazená-lo em refrigerador. O prazo de validade
dessa solução é de um ano, prevalecendo a validade do padrão sólido caso a mesma seja
menor.
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6.1.4 Solução de ácido perclórico 100 mmol L-1
Pesar 0,717 g de ácido perclórico 70% em um balão volumétrico de 50 mL e diluir em água ultra-
pura, em q.s.p. preparar 50 mL de solução. Identificar e armazená-lo em refrigerador. O prazo de
validade dessa solução é de um ano, prevalecendo a validade do padrão sólido caso a mesma
seja menor.

6.1.5 Eletrólito de corrida


No momento do uso, tomar uma alíquota de 2600 L de uma solução-estoque de β-alanina 100
mmol L-1, 1000 L de uma solução-estoque de 100 mmol L-1 de ácido perclórico e 400 L de
água ultra-pura, obtendo-se assim a solução tampão de uso diário.

6.1.6 Solução-estoque de KSCN 10000 mg L-1


Pesar 407 mg de padrão de KSCN em um balão volumétrico de 25 mL, adicionar água em q.s.p
preparar 25 mL de padrão. Armazenar em frasco identificado e manter em refrigerador. O prazo
de validade dessa solução é de um ano, prevalecendo a validade do padrão sólido caso a
mesma seja menor.

6.1.7 Solução-fortificação de KSCN 100 mg L-1


Pegar uma alíquota de 100 µL de solução-estoque de KSCN 10000 mg L-1 em um balão
volumétrico de 10 mL, adicionar água em q.s.p preparar 10 mL de padrão. Armazenar em frasco
identificado e manter em refrigerador. O prazo de validade dessa solução é de um ano,
prevalecendo a validade do padrão sólido caso a mesma seja menor.

6.1.8 Solução-estoque de NaNO3 1000 mg L-1


Pesar 13,71 mg de padrão de NaNO3 em balão volumétrico de 10 mL, adicionar água em q.s.p
preparar 10 mL de padrão. Armazenar em frasco identificado e manter em refrigerador. O prazo
de validade dessa solução é de seis meses, prevalecendo a validade do padrão sólido caso a
mesma seja menor.

6.1.9 Solução-fortificação de NaNO3 100 mg L-1


Pegar uma alíquota de 1000 µL de solução-estoque de NaNO3 1000 mg L-1 em balão
volumétrico de 10 mL, adicionar água em q.s.p preparar 10 mL de padrão. Armazenar em frasco
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identificado e manter em refrigerador. O prazo de validade dessa solução é de seis meses,
prevalecendo a validade do padrão sólido caso a mesma seja menor.

6.1.10 Solução-estoque de NaNO2 1000 mg L-1


Pesar 15,0 mg de padrão de NaNO2 em balão volumétrico de 10 mL, adicionar água em q.s.p
preparar 10 mL de padrão. Armazenar em frasco identificado e manter em refrigerador. O prazo
de validade dessa solução é de seis meses, prevalecendo a validade do padrão sólido caso a
mesma seja menor.

6.1.11 Solução-fortificação de NaNO2 100 mg L-1


Pegar uma alíquota de 1000 µL de solução-estoque de NaNO2 1000 mg L-1 em balão
volumétrico de 10 mL, adicionar água em q.s.p preparar 10 mL de padrão. Identificar e
armazená-lo em refrigerador. O prazo de validade dessa solução é de seis meses, prevalecendo
a validade do padrão sólido caso a mesma seja menor.

6.2 Preparo das amostras de produtos cárneos


Homogeneizar e processar as amostras em processador e pesar 2,0 ± 0,1 g de amostra em tubo
tipo "falcon" de 50 mL e submeter à extração.

6.2.1 Preparo da curva de calibração


Adicionar os volumes de solução-estoque de NaNO3, NaNO2 e KSCN (padrão interno), conforme
tabela 2 em microtubos e depois transferir 500 µL de cada para os vials.

Tabela 2. Volumes (em L) de solução-fortificação de NaNO3 e NaNO2 100 mg L-1 e padrão interno 100
mg L-1 para preparo da curva de calibração para determinação de nitrito e nitrato em produtos cárneos.

Pontos Concentração Concentração Volume de Volume de Volume de solução- Volume de água


NaNO3 NaNO2 solução-fortificação solução-fortificação de fortificação de KSCN ultra-pura
(mg kg-1) (mg kg-1) de NaNO3 (L) NaNO2 (L) (PI) (L) (µL)

C0 0 0 0 0 300 700
C1 75 37,5 30 15 300 655
C2 150 75 60 30 300 610
C3 300 150 120 60 300 520
C4 450 225 180 90 300 430
C5 600 300 240 120 300 340
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6.2.3 Controle de recuperação
Preparar três pontos do LMR adicionando os volumes de solução-estoque de NaNO3 e NaNO2 e
KSCN, conforme tabela 2.

6.3 Extração
- Fortificar as amostras com 150 µL de uma solução-estoque de 10000 mg L-1 de padrão interno;
- Adicionar 1 mL de TBS 5% em cada tubo,
- Adicionar 9 mL de água ultra-pura em cada tubo,
- Homogeneizar as amostras por aproximadamente 1 minuto em Turrax;
- Colocar em banho-maria a 65°C por 20 min sob agitação;
- Agitar em agitador orbital por 20 minutos;
- Filtrar com papel filtro qualitativo;
- Pegar 100 µL do sobrenadante e adicionar 200 µL de acetonitrila e 200 µL de água ultra-pura
em um microtubo;
- Agitar manualmente e centrifugar por 10 minutos a 4ºC a 13000 rpm;
- Transferir 450 µL do sobrenadante para os vials.

6.4 Condições instrumentais


As amostras são analisadas em sistema de EC sob as condições especificadas na Tabela 3.

Tabela 3. Condições instrumentais para determinação de nitrato e nitrito em produtos cárneos por EC.
Sistema de EC Detector de arranjo de diodos, com
controlador de temperatura. Software de
controle e aquisição de dados.
Capilar 48,5 cm (Ltot) x 8,5 cm (Ldet) x 75 m
Condicionamento capilar NaOH – 20 min/ H2O – 20 min/ Eletrólito –
20 min
Comprimento de onda () 210 nm
Injeção amostra -50 mbar/ 3s
Voltagem separação 20 kV
Temperatura 20°C
Pré-condicionamento 40 s
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7 Resultados
A concentração do analito nas amostras é calculada conforme a seguinte equação, obtida pela
equação da curva de calibração:

Onde:
y = concentração do analito em mg kg-1;
x = razão da área do analito/PI;
a = coeficiente angular;
b = coeficiente linear.

As amostras devem ser extraídas em triplicata. As amostras com concentrações inferiores ao


limite de quantificação do método, não são quantificadas e seus resultados são expressos como
"N.Q.”. Já as amostras com concentrações maiores que o limite de quantificação do método, são
quantificadas e os resultados será a média da triplicata expressa em mg kg-1. Para nitrato, a
concentração deverá ser multiplicada por um fator de correção de 1,37; para nitrito, a
concentração deverá ser multiplicada por um fator de correção de 1,5, para que a concentração
seja expressa em nitrato de sódio e nitrito de sódio, respectivamente.

7.1 Critérios de aceitabilidade dos resultados


Os resultados são aceitos quando o coeficiente de correlação (r) da curva de calibração é
≥ 0,99. Caso contrário, a curva deve ser repetida A recuperação somente é aceita quando o
valor estiver entre -20 a +10%.

8 Arquivamento dos registros


Os formulários de dados brutos serão arquivados conforme descrito no POP POA/SLAV/15
"Procedimentos de rotina na análise físico-química de produtos de origem animal”. Os
eletroferogramas gerados serão mantidos protegidos na pasta eletrônica "Resultados" da
unidade. Os eletroferogramas das amostras que violarem o limite regulatório são impressos e
arquivados junto do formulário de dados brutos correspondente.
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9 Referências
BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Ofício circular
nº15/2009/GAB/DIPOA. Uso de conservantes/aditivos em produtos cárneos-
procedimentos de registro e fiscalização. Brasília: Diário Oficial da União, 08 de maio de
2009.
BETTA, D. F.; VITALI, L.; FETT, R.; COSTA, A.C.O. Development and validation of a sub-
minute capillary zone electrophoresis method for determination of nitrate and nitrite in
baby foods. Talanta, v. 122, p. 23-29, 2014.

10 Anexos
Não aplicável.

11 Alterações
Tabela 1: substituído o valor de LOQ (mg kg-1) de "75,0" e "37,5" por "5,0";
Subitem 6.1.10 passa a ser 6.1.11;
Subitem 6.1.10 incluído "Solução-estoque de NaNO2 1000 mg L-1”

Devido as alterações no MET há a necessidade de complemento de Relatório de


Validação.

12 Responsabilidades
A Responsável pelo POA/SLAV deve garantir a elaboração, aprovação, emissão, distribuição de
cópias, implementação, treinamento do pessoal para utilização, gerenciamento de não
conformidades, análise crítica e revisão deste MET.
A UGQ é responsável pela verificação deste MET.

Elaboração/Revisão: Aprovação: Verificação:


Andressa C. Valese – POA/SLAV Cristhiane Cattani – POA/SLAV Rosane Carlessi – UGQ
Data: 16/09/2014 Data: 16/09/2014 Data: 18/09/2014