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COLORIMETRIA E ESPECTROFOTOMETRIA

1. OBJETIVOS

Dosagens de espécies químicas mediante a absorção de luz.

2. FUNDAMENTOS

A Colorimetria e a Espectrofotometria podem ser conceituadas como um procedimento


analítico através do qual se determina a concentração de espécies químicas mediante a absorção de
energia radiante (luz).

A luz pode ser entendida como uma forma de energia, de natureza ondulatória, caracterizada
pelos diversos comprimentos de onda (l, expressos em mm ou nm) e que apresenta a propriedade de
interagir com a matéria, sendo que parte de sua energia é absorvida por elétrons da eletrosfera dos
átomos constituintes das moléculas.

Comprimento de Onda: O comprimento de onda da luz é a distância entre duas cristas de


onda, medida em direção à progressão da onda, usualmente expressa pelo símbolo λ. A unidade
usada no UV e Visível é o nanômetro (nm) equivalente a 10-9 metro.

A luz comum é uma mistura de radiações de diferentes comprimentos de onda e pode ser
dispersa por um monocromador em feixes de luz monocromática; cada um deles com estreita faixa
de comprimento de onda.

Cor: A luz visível é uma mistura de cores com vários comprimentos de onda entre 400 a 700
nm, idênticas às cores do arco-íris. Luzes com o comprimento de onda inferior a 400 nm
(ultravioleta) ou superior a 700 nm (infravermelho) não podem ser observadas pelo olho humano.
Energia de Luz

A equação abaixo expressa as relações entre a energia (E) da luz e o seu comprimento de
onda λ:
ch
E = ———
λ
onde (c) é a velocidade da luz e (h) a constante de Planck (6.624 x 10 -27 erg.s) Isto mostra que quanto
mais curto for o comprimento de onda, maior será a energia de luz.
Portanto, a radiação ultravioleta possui maior energia que a visível e esta, maior energia que
a infravermelho.

Quando a luz incide sobre uma substância, uma parte é absorvida seletivamente pela
substância conforme a sua estrutura molecular.
Todas as substâncias possuem um nível de energia que é uma característica específica
relacionada aos átomos que a constituem.
Um espectro de absorção é obtido quando testamos diferentes luzes monocromáticas a
golpearem sucessivamente uma substância e medimos o grau de absorção de cada um.
Os comprimentos de onda (nm) são plotados no eixo das abscissas e os graus de absorção
(transmitância ou absorbância), no eixo das ordenadas.

O objetivo da análise qualitativa é identificar uma substância ou encontrar os elementos que a


compõem. A análise quantitativa é usada para determinar a quantidade (concentração) de um
componente específico da amostra.
A análise colorimétrica é uma técnica de determinação quantitativa, que compara a
densidade de cor de uma amostra com a de uma solução padrão.
A amostra colorida tem características especiais de absorção e desta forma sua cor
complementar é absorvida na região do visível.

Análises Colorimétricas

A quantidade ou concentração de uma substância pode ser determinada pela medição do


quantum de cor complementar absorvido. Este é o princípio das análises colorimétricas.
Se a amostra for incolor e transparente, adiciona-se reagentes que, através de reações
químicas produzem a cor.
As substâncias assim coloridas podem ser medidas pela análise colorimétrica, ou se a
amostra tiver características de absorção nas regiões do ultravioleta e infravermelho próximos, usa-
se essa absorção em análises quantitativas.
Em sentido amplo, essa técnica também é chamada de método colorimétrico.

Uma solução quando iluminada por luz branca, apresenta uma cor que é resultante da
absorção relativa dos vários comprimentos de onda que a compõem. Esta absorção, em cada
comprimento de onda, depende da natureza da substância, de usa concentração e da espessura da
mesma que é atravessada pela luz.

Transmitância e Absorbância
A Lei de Lambert-Beer:

Para se obter a concentração através da transmitância ou da porcentagem de transmitância é


necessário fazer incômodos cálculos logarítmicos. Por isso, recorre-se a determinação da
absorbância (A), expressa por:

A = log 100 – log T A = 2 - log T

Isto significa que a absorbância (A) é proporcional a concentração (C) do espécime químico
absorvente, desde que sejam constantes o comprimento de onda, a espessura atravessada pelo feixe
luminoso e demais fatores. Verifica-se uma relação linear entre absorbância ou densidade ótica e
concentração, e de uma relação logarítmica entre transmitância e concentração.

Portanto, nas análises quantitativas, onde desejamos obter a concentração da substância, é


mais conveniente medir a absorbância do que a transmitância.
Curva de Calibração

A figura mostra a curva de absorção do permanganato de potássio em solução aquosa em


cinco concentrações diferentes, registrados de 470 a 600 nm.
A amostra (1) tem 66mg/L de concentração. As demais (2),(3),(4) e (5) foram diluídas para
4/5 (0.8), 3/5 (0.6), 2/5 (0.4) e 1/5 (0.2) da concentração da primeira amostra,
respectivamente.

Concentração X Absorbância

A relação entre a concentração e a absorbância das cinco amostras a 525 nm é dada na figura
acima. O resultado desse estudo é uma linha reta que passa pela origem , onde também se
pode verificar que as absorbâncias são linearmente proporcionais às concentrações. Esta é
uma curva de calibração.
Linearidade

Geralmente, as curvas de calibração em altas concentrações são lineares, caso em que são
dadas altas absorbâncias. Entretanto, as curvas de calibração apresentam um desvio para baixo,
como mostra a figura. Esse desvio é provocado pela radiação extraviada (luz espúria), causada por
pequenas porções de luz de outros comprimentos de onda, contidas na luz monocromática

Análises quantitativas

Para determinar a concentração de uma amostra desconhecida, deverá ser construída uma
curva de calibração, usando soluções padrões com concentrações conhecidas.

Deverá ser selecionado o comprimento de onda que apresentar o máximo de absorção que,
no caso da figura, é o de 525 nm. Assim, o valor de absorbância da amostra é lido no
espectrofotômetro e a sua concentração é obtida na curva de calibração através do ponto de
intersecção.
Entretanto, quase sempre não é assegurada a linearidade das curvas de calibração quando
trabalhamos com altas concentrações, devido ao efeito da luz espúria.

O nome colorimetria originou-se da comparação das densidades de cores. O instrumento


usado em colorimetria é o ”Colorímetro”, mas atualmente estes instrumentos apenas são usados
para medições na região visível. Para as regiões ultravioleta e visível, usa-se espectrofotômetros.

Esquema Básico de um Instrumento para Medir a Absorção


Na análise química por absorção nunca se mede a intensidade absoluta do feixe de radiação.
Ao invés disso, sempre é feita a comparação entre dois feixes, sendo um proveniente da passagem
através do solvente puro e o outro através da solução-amostra.

TÉCNICAS EMPREGADAS NO ESTUDO DAS ENZIMAS

1) Análise da Velocidade da reação catalítica


São duas as formas essenciais para o estudo da cinética de uma enzima.
Primeiramente é necessário fazer medições sob condições nas quais se mantenha o estado
de equilíbrio, depois observar a aplicabilidade da equação de Michaelis-Menten e ainda, determinar
a velocidade de reação pela concentração do substrato e da enzima.

2) Análise do Equilíbrio da Reação


O equilíbrio de uma reação enzimática é estabelecido em segundos ou poucos minutos.

As enzimas podem ser utilizadas nas Análises Clínicas de 2 formas


principais:

Como reagentes altamente específicos e sensíveis em reações colorimétricas quantitativas


Como indicadoras de lesão celular e tecidual - o extravasamento de enzimas do meio intra
para o meio extracelular leva a um aumento da atividade destas enzimas no sangue;
Esta atividade pode ser medida e fornece importante informação diagnóstica e de evolução
de um quadro clínico.
A distribuição órgão-específica de algumas destas enzimas permite a localização da lesão
com bastante precisão.

Análise quantitativa da atividade de uma enzima

Para obtenção de uma análise quantitativa é necessário saber:


Toda estequiometria de uma reação catalítica;
Se a enzima requer adição de cofatores como um íon ou coenzima;
A dependência da enzima sob a concentração do cofator ou substrato;
O pH ótimo;
A temperatura na qual a enzima está estável e apresenta alta atividade;
O procedimento para determinação do aparecimento do produto ou desaparecimento do
substrato de reação.

A análise quantitativa é confirmada quando o substrato ou o produto é colorido e absorve a


luz.
O valor de aparecimento do produto ou do desaparecimento do substrato pode ser
mensurado pelo espectrofotômetro.
Além do produto ou substrato, pode-se analisar o intermediário (aquele que serve como ponte
para o desencadeamento de outra reação).

Unidade de atividade enzimática


Unidade Internacional/vol.

É definida pela quantidade da enzima que causa a transformação de 1 mmol de substrato por
minuto a 25°C sob condições ótimas.
A nova unidade internacional da atividade enzimática determinada pela "Comissão da
Enzima" é o "katal", o qual é definido como a transformação do substrato em 1 mol por segundo.

Exemplos de doenças que podem ser diagnosticadas e acompanhadas enzimaticamente:

O Infarto Agudo do Miocárdio


CPK, DHL, AST

As Hepatites
ALT, AST, GGT, FA

A Pancreatite
Amilase, Lipase

Doenças Ósseas, etc.


Fosfatase ácida
AULA PRÁTICA

1. MATERIAIS E MÉTODO

1.1. Equipamentos e Vidrarias


- Espectrofotômetro com cubetas
- Pipetas graduadas de 5 mL
- Pipetas automáticas
- Estante com tubos de ensaio

1.2. Reagentes
- Reagente 1: Concentração: ______
- Reagente 2 : Concentração: ______
- Reagente 3 : Concentração: ______

1.3. Procedimento:

A. Coleta de dados para a construção do espectro de absorção dos corantes 1,


2 e 3 (um composto para cada grupo).

Preparar as reações conforme a tabela 2 de seu grupo.


Usando água destilada como referência, efetuar as leituras de Absorbância (ou D.O.) do conteúdo do
tubo em destaque na tabela 2, nos seguintes comprimentos de onda: 420, 440, 460, 480, 500, 520,
550, 580, 600, 620, 650 e 700 nm

Preencher os dados da tabela abaixo, de acordo com o reagente escolhido pelo grupo:

l (nM) Leitura Absorbância


T(%)
420
440
460
480
500
520
550
580
600
620
650
700
Utilizando os dados da tabela acima preparar um gráfico ( x = comprimento de onda
nm ) e (y = leitura em absorbância), encontrando qual o comprimento de onda refere-
se ao pico de absorção do corante usado em aula.

Abs


Qual o comprimento de onda correspondente ao Pico de absorção da luz? ____________

B. Demonstração da Lei de Lambert-Beer:

Preparar os tubos de ensaio conforme o quadro que se segue; o último tubo contém
solução do reagente com concentração desconhecida, a qual deverá ser determinada
através da Lei de Lambert-Beer.

Tabela 2:

GRUPO 1 (GLICOSE)
TUBO REAGENTE 1 REAGENTE 2 CONCENTRAÇÃO TRANSMITÂNCIA ABSORBÂNCIA
(No) mL uL OBTIDA (mg/dL) (T%)* (Abs ou D.O.)
1 2,0 00
2 2,0 10
3 2,0 15
4 2,0 20 100
5 2,0 30
6 2,0 40
7 2,0 Encontrar no gráfico
Homogeneizar bem e colocar em banho-maria a 37ºC por 10 mim.
GRUPO 2 (ALBUMINA)
TUBO REAGENTE 1 REAGENTE 2 CONCENTRAÇÃO TRANSMITÂNCIA ABSORBÂNCIA
(No) mL uL OBTIDA (g/dL) (T%)* (Abs ou D.O.)
1 2,5 00
2 2,5 05
3 2,5 10 3,8
4 2,5 15
5 2,5 20
6 Encontrar no gráfico
Homogeneizar bem e deixar em repouso por 5 min.

GRUPO 3 (PROTEINAS TOTAIS)


TUBO REAGENTE 1 REAGENTE 2 CONCENTRAÇÃO TRANSMITÂNCIA ABSORBÂNCIA
(No) mL uL OBTIDA (g/dL) (T%)* (Abs ou D.O.)
1 2,5 00
2 2,5 25
3 2,5 50 4,0
4 2,5 75
5 2,5 100
6 Encontrar no gráfico

Homogeneizar bem e deixar em repouso por 10 min.

* Leituras efetuadas no comprimento de onda que corresponde ao pico de absorção do composto (l


max).

2. RESULTADOS A SEREM APRESENTADOS NO RELATÓRIO:

2.1. Tabela de leitura do corante completando os valores de absorbância através de


tabela ou cálculo.

2.2. Construir um gráfico da Absorbância (Abs) em função do comprimento de onda


(l) e determinar o pico de absorção (lmax) do composto estudado.

2.3. Completar a tabela 2 calculando as concentrações do reagente nos diversos tubos

2.4. Construir um segundo gráfico apresentando as variações de Densidade Ótica


(D.O.) ou Absorbância (Abs) em função da concentração da espécie química
absorvente e um terceiro gráfico apresentando as variações de Transmitância em
função da concentração.
4.5. Apresentar o valor da concentração do corante no tubo 6 mediante interpolação da
leitura de Absorbância no gráfico (Abs x concentração).

Abs Transmitância

Concentração Concentração

3. ANÁLISES DOS RESULTADOS E CONCLUSÕES

Discutir os resultados e listar as conclusões obtidas durante os experimentos


realizados em grupo.