9. Referências bibliográficas..........................................................................................9 1. Introdução As bactérias são microorganismos procariotas, unicelulares, sem cílios, sem membrana nuclear, mitocôndrias, aparelho de Golgi, nem retículo endoplasmático e que se reproduzem assexuadamente (Murray et al., 2009). Basicamente a parede celular bacteriana é constituída por um peptideoglicano, um polímero misto de açúcares hexoses (N-acetilglicosamina e o ácido N-acetilmuramínico) e aminoácidos (Mims et al., 1998). A parede celular que rodeia as bactérias é complexa, e existem duas formas básicas: uma parede celular gram-positiva com uma grossa camada de peptideoglicano e uma parede celular gram-negativa com uma delgada camada de peptideoglicano, assim como uma membrana externa. Para realizar-se uma classificação preliminar das bactérias utiliza-se seu tamanho, forma (cocos, bacilos, espirilos) e disposição espacial (células isoladas, em cadeias ou formando cúmulos) (Murray et al., 2009). A coloração de Gram foi desenvolvida em 1884 pelo bacteriologista dinamarquês Hans Christian Gram, sendo um dos procedimentos de coloração mais úteis, pois classifica as bactérias em dois grandes grupos: gram-positivas e gram- negativas. O método consiste em tratar sucessivamente um esfregaço bacteriano, fixado pelo calor, com os reagentes cristal violeta, iodo, álcool-acetona e safranina (Tortora et al., 2012). As bactérias que adquirem a coloração azul violeta são chamadas de gram- positivas e aquelas que adquirem a coloração vermelha são chamadas de gram- negativas. Os diferentes tipos de bactérias reagem de modo distinto a coloração de Gram, pois diferenças estruturais em suas paredes celulares afectam a retenção ou a liberação de uma combinação de cristal violeta e iodo, denominada complexo cristal violeta-iodo (CV-I) (Tortora et al., 2012). Entre outras diferenças, as bactérias gram-positivas possuem uma parede celular de peptideoglicano mais espessa (dissacarídeos e aminoácidos) que as bactérias gram- negativas. Além disso, as bactérias gram-negativas contém uma camada de lipopolissacarídeo (lipídos e polissacarídeos) como parte de sua parede celular (Tortora et al., 2012). O método de Gram é uma das mais importantes técnicas de coloração na microbiologia médica. Porém, os resultados da coloração de Gram não são universalmente aplicáveis, pois algumas células bacterianas coram-se fracamente ou não
1 adquirem cor. A reacção de Gram é mais consistente quando utilizada em bactérias jovens, em crescimento (Tortora et al., 2012).
2. Objectivos 2.1. Objectivo geral Conhecer o método de coloração de Gram.
2.2. Objectivos específicos
Preparar um esfregaço; Aplicar o método de coloração de Gram; Identificar as bactérias consoante a coloração apresentada (gram-positivas ou gram-negativas); Diferenciar bactérias gram-positivas das gram-negativas.
3 4. Métodos 4.1. Preparação do esfregaço Pegou-se numa lâmina microscópica e preparou-se um esfregaço; Colocou-se uma gota de água com um palito sobre a parte central da lâmina de vidro e com a ansa bacteriológica colocou-se uma porção da cultura bacteriana e emulsionou-se na gota de água de modo a não formar um esfregaço espesso; Secou-se e fixou-se o esfregaço junto a uma lamparina acesa.
4.2. Coloração de Gram
Cobriu-se o esfregaço seco com cristal violeta por 1 minuto e retirou-se o excesso do corante em água corrente por alguns segundos; Após cobrir-se o esfregaço com cristal violeta e retirado o excesso do mesmo, cobriu-se novamente com iodo e deixou-se aproximadamente 1 minuto e lavou- se com água corrente na posição obliqua; Retirou-se o complexo cristal violeta-iodo com álcool-acetona gota a gota por alguns segundos e lavou-se o esfregaço com água corrente; E por fim cobriu-se a lâmina com safranina aproximadamente 1 minuto, lavou- se a lâmina com água corrente na posição obliqua e secou-se à temperatura ambiente; Observou-se o esfregaço no microscópio óptico com a objectiva de imersão (objectiva de 100X).
4 5. Resultados No final da execução da técnica de coloração de Gram e observação do esfregaço ao microscópio óptico, foi possível constatar que as bactérias da cultura usada na aula prática, após a coloração de Gram, apresentavam uma coloração azul violeta e essa coloração nos remete às gram-positivas. E quanto a forma as bactérias eram esféricas e tecnicamente falando cocos e apresentavam-se em cúmulos ou grupos (estafilos). A forma e a disposição das bactérias observadas ao microscópio óptico nos remetem ao género staphylococcus (esférica = cocos + cachos/cúmulos = estafilo) e a identificação precisa da espécie necessitaria de testes bioquímicos como o teste da coagulase, “teste da novobiocina” e observação do tipo de hemólise em Agar sangue. Os resultados da coloração de Gram foram satisfatórios, e com isso podemos assumir que a cultura bacteriana usada para a aula prática, era uma cultura jovem “em crescimento” e uma vez que apresentava indícios de β-hemólise é mais provável que a bactéria cultivada seja um Staphylococcus aureus.
5 6. Discussão No experimento foi possível constatar que as bactérias da cultura usada na aula prática, após a coloração de Gram, apresentavam uma coloração azul violeta e essa coloração nos remete às gram-positivas. E esses resultados vão de acordo com o pensamento de Murray et al. (2009), que sustentam que a técnica de coloração de Gram é uma técnica amplamente usada no laboratório de microbiologia e constitui um critério básico para separar as bactérias em gram-positivas e gram-negativas, sendo que as gram-positivas retém o complexo cristal violeta-iodo na sua parede celular e as gram- negativas o perdem durante o processo de descoloração com álcool-acetona e estes últimos (gram-negativos) acabam retendo a safranina (daí a coloração vermelha). A forma e a disposição das bactérias observadas ao microscópio óptico nos remetem ao género staphylococcus (esférica = cocos + cachos/cúmulos = estafilo) e a cultura bacteriana usada para a aula prática apresentava indícios de β-hemólise, assim sendo a mais provável bactéria usada é Staphylococcus aureus. O Staphylococcus aureus é uma bactéria esférica, do grupo dos cocos gram-positivos, frequentemente encontrada na pele e nas fossas nasais de pessoas saudáveis (Santos et al., 2007). Essa bactéria pode apresentar-se em diversas formas, que vão desde isolados, aos pares, em cadeias curtas, ou agrupados irregularmente (com aspecto semelhante a um cacho de uvas), devido a sua divisão celular, que ocorre em três planos perpendiculares. Em placas de agar sangue, um halo de hemólise desenvolve-se em torno das colonias formadas (Santos et al., 2007). Os resultados da coloração de Gram foram satisfatórios, e com isso podemos assumir que a cultura bacteriana usada para a aula prática, era uma cultura jovem “em crescimento”, pois Tortora et al. (2012), subsidiam que a técnica de coloração de Gram é de grande importância na microbiologia médica até um certo ponto, porque os
6 resultados da coloração de Gram não são universalmente aplicáveis, pois algumas células bacterianas coram-se fracamente ou não adquirem cor e esta técnica é mais consistente quando utilizada em bactérias jovens, em crescimento. O grau de retenção dos corantes depende do organismo, das condições de cultivo e da habilidade de coloração do técnico (Murray et al., 2009).
7. Conclusão No final do experimento foi possível concluir que: A técnica de coloração de Gram baseia-se na estrutura da parede celular que as bactérias apresentam; Na técnica de coloração de Gram as bactérias que apresentam uma coloração azul violeta ou púrpura são gram-positivas e as que apresentarem uma coloração vermelha são gram-negativas; A diferença existente entre as gram-positivas e gram-negativas está na composição das suas paredes celulares, sendo que as gram-positivas apresentam uma parede com uma camada de peptideoglicano espessa diferentemente das gram-negativas, e as gram-negativas na sua parede celular apresentam lipopolissacarídeos.
7 8. Anexos
8 9. Referências bibliográficas Mims, C., J. Playfair, I. Roitt, D. Wakelin e R. Williams (1998). Microbiologia Médica, 2ª edição, 602pp., Espanha, Harcourt edições. Murray, P. R. M., K. S. Rosenthal e M. A. Pfauer (2009). Microbiologia Médica, 5ª edição, 472pp., Espanha, ELSEVIER. Santos, A. L., D. O. Santos, C. C. Freitas, B. L. A. Ferreira, I. F. Afonso, C. R. Rodrigues e H. C. Castro (2007). Staphylococcus aureus: visitando uma cepa de importância hospitalar, Jornal Brasileiro de Patologia e Medicina Laboratorial, 43(6): 413-423pp. Tortora, G. J., B. R. Funke e C. L. Case (2012). Microbiologia, 10ª edição, 967pp., Porto Alegre, Artmed.
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