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Índice

1. Introdução..................................................................................................................1

2. Objectivos..................................................................................................................2

2.1. Objectivo geral....................................................................................................2

2.2. Objectivos específicos........................................................................................2

3. Materiais.....................................................................................................................3

3.1. Materiais.............................................................................................................3

3.1.1. Reagentes........................................................................................................3

4. Métodos......................................................................................................................4

4.1. Preparação do esfregaço.....................................................................................4

4.2. Coloração de Gram.............................................................................................4

5. Resultados..................................................................................................................5

6. Discussão....................................................................................................................6

7. Conclusão...................................................................................................................7

8. Anexos........................................................................................................................8

9. Referências bibliográficas..........................................................................................9
1. Introdução
As bactérias são microorganismos procariotas, unicelulares, sem cílios, sem
membrana nuclear, mitocôndrias, aparelho de Golgi, nem retículo endoplasmático e que
se reproduzem assexuadamente (Murray et al., 2009). Basicamente a parede celular
bacteriana é constituída por um peptideoglicano, um polímero misto de açúcares
hexoses (N-acetilglicosamina e o ácido N-acetilmuramínico) e aminoácidos (Mims et
al., 1998).
A parede celular que rodeia as bactérias é complexa, e existem duas formas
básicas: uma parede celular gram-positiva com uma grossa camada de peptideoglicano e
uma parede celular gram-negativa com uma delgada camada de peptideoglicano, assim
como uma membrana externa. Para realizar-se uma classificação preliminar das
bactérias utiliza-se seu tamanho, forma (cocos, bacilos, espirilos) e disposição espacial
(células isoladas, em cadeias ou formando cúmulos) (Murray et al., 2009).
A coloração de Gram foi desenvolvida em 1884 pelo bacteriologista
dinamarquês Hans Christian Gram, sendo um dos procedimentos de coloração mais
úteis, pois classifica as bactérias em dois grandes grupos: gram-positivas e gram-
negativas. O método consiste em tratar sucessivamente um esfregaço bacteriano, fixado
pelo calor, com os reagentes cristal violeta, iodo, álcool-acetona e safranina (Tortora et
al., 2012).
As bactérias que adquirem a coloração azul violeta são chamadas de gram-
positivas e aquelas que adquirem a coloração vermelha são chamadas de gram-
negativas. Os diferentes tipos de bactérias reagem de modo distinto a coloração de
Gram, pois diferenças estruturais em suas paredes celulares afectam a retenção ou a
liberação de uma combinação de cristal violeta e iodo, denominada complexo cristal
violeta-iodo (CV-I) (Tortora et al., 2012).
Entre outras diferenças, as bactérias gram-positivas possuem uma parede celular
de peptideoglicano mais espessa (dissacarídeos e aminoácidos) que as bactérias gram-
negativas. Além disso, as bactérias gram-negativas contém uma camada de
lipopolissacarídeo (lipídos e polissacarídeos) como parte de sua parede celular (Tortora
et al., 2012).
O método de Gram é uma das mais importantes técnicas de coloração na
microbiologia médica. Porém, os resultados da coloração de Gram não são
universalmente aplicáveis, pois algumas células bacterianas coram-se fracamente ou não

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adquirem cor. A reacção de Gram é mais consistente quando utilizada em bactérias
jovens, em crescimento (Tortora et al., 2012).

2. Objectivos
2.1. Objectivo geral
 Conhecer o método de coloração de Gram.

2.2. Objectivos específicos


 Preparar um esfregaço;
 Aplicar o método de coloração de Gram;
 Identificar as bactérias consoante a coloração apresentada (gram-positivas ou
gram-negativas);
 Diferenciar bactérias gram-positivas das gram-negativas.

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3. Materiais
3.1. Materiais
 1 Lâmina microscópica;
 1 Ansa bacteriológica;
 1 Lamparina;
 1 Fosforo;
 Cultura bacteriana;
 1 Microscópio óptico.

3.1.1. Reagentes
 Cristal violeta;
 Iodo;
 Álcool-acetona;
 Safranina
 Água (solvente).

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4. Métodos
4.1. Preparação do esfregaço
 Pegou-se numa lâmina microscópica e preparou-se um esfregaço;
 Colocou-se uma gota de água com um palito sobre a parte central da lâmina de
vidro e com a ansa bacteriológica colocou-se uma porção da cultura bacteriana e
emulsionou-se na gota de água de modo a não formar um esfregaço espesso;
 Secou-se e fixou-se o esfregaço junto a uma lamparina acesa.

4.2. Coloração de Gram


 Cobriu-se o esfregaço seco com cristal violeta por 1 minuto e retirou-se o
excesso do corante em água corrente por alguns segundos;
 Após cobrir-se o esfregaço com cristal violeta e retirado o excesso do mesmo,
cobriu-se novamente com iodo e deixou-se aproximadamente 1 minuto e lavou-
se com água corrente na posição obliqua;
 Retirou-se o complexo cristal violeta-iodo com álcool-acetona gota a gota por
alguns segundos e lavou-se o esfregaço com água corrente;
 E por fim cobriu-se a lâmina com safranina aproximadamente 1 minuto, lavou-
se a lâmina com água corrente na posição obliqua e secou-se à temperatura
ambiente;
 Observou-se o esfregaço no microscópio óptico com a objectiva de imersão
(objectiva de 100X).

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5. Resultados
No final da execução da técnica de coloração de Gram e observação do
esfregaço ao microscópio óptico, foi possível constatar que as bactérias da cultura usada
na aula prática, após a coloração de Gram, apresentavam uma coloração azul violeta e
essa coloração nos remete às gram-positivas. E quanto a forma as bactérias eram
esféricas e tecnicamente falando cocos e apresentavam-se em cúmulos ou grupos
(estafilos).
A forma e a disposição das bactérias observadas ao microscópio óptico nos
remetem ao género staphylococcus (esférica = cocos + cachos/cúmulos = estafilo) e a
identificação precisa da espécie necessitaria de testes bioquímicos como o teste da
coagulase, “teste da novobiocina” e observação do tipo de hemólise em Agar sangue.
Os resultados da coloração de Gram foram satisfatórios, e com isso podemos
assumir que a cultura bacteriana usada para a aula prática, era uma cultura jovem “em
crescimento” e uma vez que apresentava indícios de β-hemólise é mais provável que a
bactéria cultivada seja um Staphylococcus aureus.

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6. Discussão
No experimento foi possível constatar que as bactérias da cultura usada na aula
prática, após a coloração de Gram, apresentavam uma coloração azul violeta e essa
coloração nos remete às gram-positivas. E esses resultados vão de acordo com o
pensamento de Murray et al. (2009), que sustentam que a técnica de coloração de Gram
é uma técnica amplamente usada no laboratório de microbiologia e constitui um critério
básico para separar as bactérias em gram-positivas e gram-negativas, sendo que as
gram-positivas retém o complexo cristal violeta-iodo na sua parede celular e as gram-
negativas o perdem durante o processo de descoloração com álcool-acetona e estes
últimos (gram-negativos) acabam retendo a safranina (daí a coloração vermelha).
A forma e a disposição das bactérias observadas ao microscópio óptico nos
remetem ao género staphylococcus (esférica = cocos + cachos/cúmulos = estafilo) e a
cultura bacteriana usada para a aula prática apresentava indícios de β-hemólise, assim
sendo a mais provável bactéria usada é Staphylococcus aureus. O Staphylococcus
aureus é uma bactéria esférica, do grupo dos cocos gram-positivos, frequentemente
encontrada na pele e nas fossas nasais de pessoas saudáveis (Santos et al., 2007).
Essa bactéria pode apresentar-se em diversas formas, que vão desde isolados,
aos pares, em cadeias curtas, ou agrupados irregularmente (com aspecto semelhante a
um cacho de uvas), devido a sua divisão celular, que ocorre em três planos
perpendiculares. Em placas de agar sangue, um halo de hemólise desenvolve-se em
torno das colonias formadas (Santos et al., 2007).
Os resultados da coloração de Gram foram satisfatórios, e com isso podemos
assumir que a cultura bacteriana usada para a aula prática, era uma cultura jovem “em
crescimento”, pois Tortora et al. (2012), subsidiam que a técnica de coloração de Gram
é de grande importância na microbiologia médica até um certo ponto, porque os

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resultados da coloração de Gram não são universalmente aplicáveis, pois algumas
células bacterianas coram-se fracamente ou não adquirem cor e esta técnica é mais
consistente quando utilizada em bactérias jovens, em crescimento.
O grau de retenção dos corantes depende do organismo, das condições de cultivo
e da habilidade de coloração do técnico (Murray et al., 2009).

7. Conclusão
No final do experimento foi possível concluir que:
 A técnica de coloração de Gram baseia-se na estrutura da parede celular que as
bactérias apresentam;
 Na técnica de coloração de Gram as bactérias que apresentam uma coloração
azul violeta ou púrpura são gram-positivas e as que apresentarem uma coloração
vermelha são gram-negativas;
 A diferença existente entre as gram-positivas e gram-negativas está na
composição das suas paredes celulares, sendo que as gram-positivas apresentam
uma parede com uma camada de peptideoglicano espessa diferentemente das
gram-negativas, e as gram-negativas na sua parede celular apresentam
lipopolissacarídeos.

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8. Anexos

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9. Referências bibliográficas
 Mims, C., J. Playfair, I. Roitt, D. Wakelin e R. Williams (1998). Microbiologia
Médica, 2ª edição, 602pp., Espanha, Harcourt edições.
 Murray, P. R. M., K. S. Rosenthal e M. A. Pfauer (2009). Microbiologia
Médica, 5ª edição, 472pp., Espanha, ELSEVIER.
 Santos, A. L., D. O. Santos, C. C. Freitas, B. L. A. Ferreira, I. F. Afonso, C. R.
Rodrigues e H. C. Castro (2007). Staphylococcus aureus: visitando uma cepa de
importância hospitalar, Jornal Brasileiro de Patologia e Medicina Laboratorial,
43(6): 413-423pp.
 Tortora, G. J., B. R. Funke e C. L. Case (2012). Microbiologia, 10ª edição,
967pp., Porto Alegre, Artmed.

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