1308-Tese CCD Coutinho Giovane 2006

GIOVANE COUTINHO
Fatores de virulência e resistência a antifúngicos

de amostras clínicas e ambientais de
Cryptococcus neoformans
Dissertação apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em
Ciências da Coordenadoria de
Controle de Doenças da Secretaria
de Estado da Saúde de São Paulo,
para obtenção do Título de Mestre
em Ciências.
Área de Concentração: Pesquisas
Laboratoriais em Saúde Pública
Orientador: Profa. Dra. Marcia de

Souza Carvalho Melhem
SÃO PAULO
2006
FICHA CATALOGRÁFICA
Preparada pelo Centro de Documentação – Coordenadoria de Controle de Doenças/SES
©reprodução autorizada pelo autor
Coutinho, Giovane
Fatores de virulência e resistência a antifúngicos de amostras clínicas e
ambientais de Cryptococcus neoformans / Giovane Coutinho – São Paulo,
2006.
Dissertação (mestrado) - Programa de Pós-Graduação em Ciências da
Coordenadoria de Controle de Doenças da Secretaria de Estado da Saúde
de São Paulo.
Área de concentração: Pesquisas Laboratoriais em Saúde Pública
Orientador: Dra. Marcia de Souza Carvalho Melhem
1. Cryptococcus neoformans 2. Criptococose 3. Fatores de virulência

4. Testes de sensibilidade microbiana 5. Fluconazol 6. Antimicóticos
SES/CCD/CD-127/06
“Não existem limites para os sonhos quando a vida é
pautada em trabalho, honestidade e dedicação”.
Dedicatória
A Deus
“Pai misericordioso, Amigo fiel e consolador!

Luz para meus passos, Força que me sustenta,
Apoio que me conforta!
Se fiz algo de bom, foi graças a Ti.
Se realizei algo de valor, foi graças a Ti.
Nada poderia ter feito, não fossem Seu amor
incondicional e Sua infinita misericórdia por mim,
perdoando meus erros e dando-me a oportunidade,
a cada dia, de tornar produtivos
os dons que o Senhor me deu.
Obrigado, meu Deus, meu Pai, meu Amigo...”
Aos meus pais, Coutinho e Zita,
que com muito amor, confiança e MUITA oração,
sempre se fizeram presentes, apoiando, incentivando e
lutando comigo durante todas as etapas de minha vida.
Aos meus irmãos, Júnior, Juliano e Janaina,

pela paciência, a amizade, o respeito e a união
durante todos estes anos.
Dedico e agradeço.
Agradecimentos
Ao Prof. Dr. Antônio Martins de Siqueira, por ter dado a oportunidade
inicial de ingresso no campo da pesquisa. Exemplo de dedicação,
trabalho e compromisso, por quem guardo grande respeito e
admiração.
Aos amigos da Seção de Micologia do Instituto Adolfo Lutz:

Walderez, Sandra, Marilena, Fumiko, Dulcilena, Andres e Maria, que
colaboraram direta e indiretamente para a realização deste trabalho.
Pelo carinho, apoio e incentivo, agradeço imensamente.
Aos bolsistas Fundap: Tamara, Elaine, Mariana, Sandra, Sônia e

Fred, pelos momentos de descontração, estudo e trabalho. Pelo
convívio de amizade, apoio e companheirismo. À Tamara, Mariana e
Sandra, muito obrigado pelo apoio direto na pesquisa, principalmente
em relação aos testes de sensibilidade.
À Profa. Dra. Marilia Caixeta Franco, pela disponibilidade e

contribuição direta na realização da análise molecular.
Ao Mateus, que executou os testes moleculares na Universidade
Federal de Alfenas.
Aos membros da banca examinadora de qualificação do mestrado,

Dra. Gisele M. D. de Almeida, Dra. Silvia F. Costa, Prof. Dra. Cecília
L. S. dos Santos e Dra. Lilian Del’Alamo. Pela disponibilidade e
sugestões que muito contribuiram para o trabalho.
Aos companheiros de pós-graduação: Hilda, Toninho, Beth, Fábio,

Daniel, Raquel, Melissa, e tantos outros que compartilharam vários
momentos: de alegria, preocupação, estresse, trabalho, viagens,
planos... Obrigado pela amizade, solidariedade e apoio mútuo.
Aos Professores da Pós-Graduação, pelo trabalho, a dedicação e a
contribuição na formação profissional e, muitas vezes, pessoal de
seus alunos.
À Dra. Maria de Fátima e às secretárias, Emiliana e Tirces, que

sempre me atenderam com presteza, atenção e paciência. Muito
obrigado.
Aos amigos, Amanda e Paulo, que me receberam na cidade grande.

Amanda, agora Dra., pela amizade, a acolhida e o forte exemplo de
dedicação à pesquisa, com muita garra, alegria e determinação,
qualidades que fazem dela uma pessoa vitoriosa. Ao Paulo, pela
amizade, a paciência e o companheirismo. Pelo exemplo de trabalho,
luta e amor à família.
Às amigas Patrícia e Karina, colegas de profissão e de convívio na

cidade grande, pelos momentos de alegria, viagens, comemorações,
filmes e planos... pelo carinho e amizade constantes.
À minha namorada, amiga e companheira, Mariana Leite Gomide.

Pelo carinho, paciência, dedicação, apoio e incentivo constantes, e
pela ajuda direta nas tabelas finais.
Aos meus amigos de Viçosa - MG, especialmente os familiares, que

sempre torceram e me apoiaram. Pelo convívio de amizade, respeito e
amor.
Agradeço.
E principalmente... à minha orientadora...
...Profa. Dra. Marcia de Souza Carvalho Melhem
Misto de professora, irmã e amiga...

Assim foi sua atuação em minha vida durante este tempo de mestrado.
Seu apoio e orientação me foram transmitidos de várias formas, seja
através de palavras ou pela escuta, ou ainda no acolhimento silencioso
e, por que não?, em forma de uma prece.
Recebeu de Deus muitos talentos e os faz frutificar em trabalho,
ação e vida, em beneficio das pessoas.
Por isso, esse agradecimento precisa ser especial, por toda a sua
dedicação, pois, com certeza, em muitas manhãs, tardes, noites e
madrugadas, ela desconheceu o descanso para dar sempre o melhor
de si em todo o trabalho que lhe foi confiado.
Nesta caminhada, para conclusão de mais uma etapa em minha
formação acadêmica, não foram poucas as dificuldades enfrentadas,
mas, pouco a pouco, como num cruzar de horizonte,
o sonho foi se transformando em realidade,
graças à orientação segura que me foi prestada.
Manter os pés firmes na caminhada é minha meta, rumo a novas
buscas e empreendimentos, agradecido a Deus pelos anjos que ele
colocou ao meu lado na terra, dentre os quais, a Dra. Marcia, cuja
gratuidade e doação vão muito além do profissional.
Me sinto extremamente honrado em trabalhar a seu lado,
conhecê-la foi uma benção e um privilégio.
“Que a suas forças e sabedoria, sejam renovadas a cada dia, para

que todos os que lhe forem confiados possam descobrir e
desenvolver o potencial que trazem dentro de si.
Muitíssimo obrigado por tudo!”
Este trabalho teve o apoio financeiro do Convênio 019/02 PROAP/CAPES.
Processo nº 0001/0700/000041/2005.
Resumo
Cryptococcus neoformans é causa importante de

meningoencefalite em indivíduos imunocomprometidos, tais como pacientes
com AIDS. No presente estudo, 133 isolados de Cryptococcus neoformans
foram analisados segundo características de virulência: síntese de cápsula
em meio de indução, produção de fosfolipases e proteinases; sensibilidade
aos antifúngicos: fluconazol, itraconazol, voriconazol e anfotericina B, por
microdiluição (CLSI e EUCAST); e potencial de resistência ao fluconazol,
avaliado em meio de cultura contendo 8 µg/mL da droga. Os isolados foram
divididos em três grupos: (i) isolados clínicos iniciais; (ii) isolados clínicos
não-iniciais, obtidos no início e durante o curso infeccioso, respectivamente;
e (iii) isolados ambientais. Os Isolados clínicos não-iniciais foram capazes de
maior produção de cápsula do que os isolados iniciais ou ambientais, no
meio de indução. Fosfolipase, por sua vez, foi produzida pela maioria das
amostras, com prevalência do perfil de atividade fortemente positiva em
isolados clínicos iniciais e ambientais. A produção de proteinase não foi
observada em nenhum dos isolados. Os testes de sensibilidade a
antifúngicos revelaram altas taxas de sensibilidade frente à anfotericina B,
itraconazol e voriconazol. Foi observada resistência para fluconazol, em
torno de 10 %, com predomínio em isolados clínicos. O potencial de
resistência ao fluconazol foi observado em 7 (54 %) de 13 isolados,
inicialmente incapazes de crescer no meio contendo a droga. Concluiu-se
pela diversidade no comportamento de Cryptococcus neoformans, indicada
pelos resultados dos diferentes grupos de origem estudados. Possivelmente,
existem mecanismos múltiplos de virulência e resistência que, associados ou
isolados, conferem adaptabilidade à levedura e contribuem para sua
patogenicidade e persistência no organismo hospedeiro.
Abstract
Cryptococcus neoformans is a common cause of life-threatening

meningitis in immunocompromised individuals, such as AIDS patients. In this
study, a hundred and thirty three Cryptococcus neoformans isolates were
analyzed according to characteristics of virulence: capsule synthesis in
induction medium, and phospholipases and proteinases production;
antifungal susceptibility profile by microdilution technique (CLSI and
EUCAST) to five antifungal drugs: Fluconazole, itraconazole, voriconazole
and amphotericin B; and the potential to develop resistance to fluconazole,
evaluated in culture medium containing 8 µg/mL of the drug. Yeast isolates
were divided in three groups: (i) first episode clinical isolates; (ii) relapse
clinical isolates, obtained at the beginning and during the infectious course,
respectively; and (iii) environmental isolates. Capsule synthesis was
significantly more induced in the group of relapse clinical isolates.
Phospholipase production was detected in most of the isolates, especially in
the groups of first episode clinical isolates and environmental isolates.
Proteinase production was observed in none of the samples. Antifungal
susceptibility testing revealed high susceptibility rates to amphotericin B,
itraconazole and voriconazole, regardless of the isolates’ group. Resistance
to fluconazole was observed, around 10 %, with prevalence in clinical
isolates. The potential to develop resistance to fluconazole, was observed in
7 (54 %) from 13 isolates, initially incapable to grow in the medium. In
conclusion, Cryptococcus neoformans showed great diversity in its behavior,
as indicated by the results from the different groups of isolates studied.
Possibly, there are multiple mechanisms of virulence and resistance that,
associated or not, grant adaptability to the yeast and contribute to its
pathogenicity and persistence in the host organism.
Lista de Abreviaturas
AB – Anfotericina B
ATCC – “American Type Culture Collection”
CGB – Canavanina-glicina-azul de bromotimol
CI – Isolados clínicos iniciais
CIM – Concentração inibitória mínima
CLSI – “Clinical and Laboratory Standards Institute”
CNI – Isolados clínicos não-iniciais
CS – Caldo Sabouraud
CSM – Caldo Sabouraud diluído em tampão MOPS
EUCAST – “European Committee on Antifungal Susceptibility Testing”
Fz – Fluconazol
GalXM – Galactoxilomanose
GXM – Glicuroxilomanose
HAART – “Highly Active Antiretroviral Therapy”
Iz – Itraconazol
MOPS – Tampão ácido morfolino propanosulfônico
NCCLS – “National Committee for Clinical Laboratory Standards”
RAPD – “Random Amplified Polymorphic DNA”
SDD – Sensibilidade dependente da dose
Vz – Voriconazol
YEPD – “Yeast extract peptone dextrose”

Lista de Tabelas
Tabela 1 – Variedades, grupos de isolados e material de origem de

133 isolados de C. neoformans.................................................................... 57
Tabela 2 – Resposta ao teste de indução de cápsula em 133 isolados de

C. neoformans. Espessura capsular de 32 isolados induzidos. ................... 58
Tabela 3 – Análise da atividade enzimática (Pz) de fosfolipase extracelular

em 133 isolados de C. neoformans de diferentes origens. .......................... 62
Tabela 4 – Resultado da seleção de fenótipos resistentes de 13 isolados de

C. neoformans, cultivados em ágar batata adicionado de fluconazol. ......... 64
Tabela 5 – Valores de CIM de fluconazol (μg/mL) para 11 fenótipos

resistentes e seus respectivos isolados de origem, segundo a metodologia
CLSI de microdiluição em caldo................................................................... 65
Tabela 6 – Intervalos de CIM (μg/mL) de 4 antifúngicos obtidos para

133 isolados de C. neofomans, de acordo com as metodologias CLSI e
EUCAST de microdiluição em caldo e o grupo de origem dos isolados. ..... 68
Tabela 7 – Valores de CIM50 e CIM90 (μg/mL) de fluconazol, itraconazol,

voriconazol e anfotericina B, para 133 isolados de C. neoformans,
submetidos ao teste de sensibilidade a antifúngicos segundo as
metodologias CLSI e EUCAST de microdiluição em caldo. ......................... 68

voriconazol e anfotericina B, para os diferentes grupos de origem de
133 isolados de C. neoformans e segundo as metodologias CLSI e EUCAST
de microdiluição em caldo............................................................................ 69
Tabela 9 – Comparação dos valores de CIM de fluconazol obtidos pelas
metodologias CLSI e EUCAST de microdiluição em caldo, para 133 isolados
de C. neoformans......................................................................................... 75
Tabela 10 – Comparação dos valores de CIM de itraconazol obtidos pelas

de C. neoformans......................................................................................... 75
Tabela 11 – Comparação dos valores de CIM de voriconazol obtidos pelas

de C. neoformans......................................................................................... 76
Tabela 12 – Comparação dos valores de CIM de anfotericina obtidos pelas

de C. neoformans......................................................................................... 76
Tabela 13 – Distribuição dos isolados por diferença de diluições entre os

valores de CIM, obtidos pelas metodologias CLSI e EUCAST, nos testes de
sensibilidade a antifúngicos por microdiluição em caldo.............................. 78
Lista de Figuras
Figura 1 – Blastoconídios de C. neoformans: cápsulas induzidas no meio de

cultura caldo Sabouraud diluído em tampão MOPS (1200 X)...................... 56
Figura 2 – Espessura da cápsula de 40 isolados clínicos iniciais de

C. neoformans, cultivados nos meios de cultura caldo Sabouraud e caldo
Sabouraud diluído em tampão MOPS.......................................................... 59
Figura 3 – Espessura da cápsula de 60 isolados clínicos não-iniciais de

Figura 4 – Espessura da cápsula de 33 isolados ambientais de

Figura 5 – Distribuição de 40 isolados clínicos iniciais de C. neoformans

segundo o perfil apresentado de atividade enzimática da fosfolipase. ........ 61
Figura 6 – Distribuição de 60 isolados clínicos não-iniciais de C. neoformans

Figura 7 – Distribuição de 33 isolados ambientais de C. neoformans

Figura 8 – Ilustração do resultado obtido no teste de produção de proteinase

extracelular. (A) Ausência de produção enzimática apresentada pelos
133 isolados de C. neoformans analisados. (B) Produção enzimática da
cepa-controle Candida albicans ICB 12A..................................................... 63
Figura 9 – Perfil de crescimento de C. neoformans em meio ágar batata

adicionado de fluconazol. Colônias pequenas (P) e colônias grandes (G). . 64
Figura 10 – Perfis obtidos por RAPD, em gel de agarose 2%, de 7 isolados
de C. neoformans e 11 fenótipos resistentes, utilizando os iniciadores OPA-3
(5’-AGT CAG CCA C-3’) e OPA-17 (5’-GAC CGC TTG T-3’)....................... 66
Figura 11 – Perfil de sensibilidade ao fluconazol de 133 isolados de

C. neoformans, submetidos aos testes de sensibilidade a antifúngicos,
segundo as metodologias CLSI e EUCAST de microdiluição em caldo....... 69

C. neoformans, segundo as metodologias CLSI e EUCAST de microdiluição
em caldo e o grupo de origem dos isolados................................................. 70
Figura 13 – Perfil de sensibilidade ao itraconazol, de 133 isolados de

C. neoformans, obtido segundo as metodologias CLSI e EUCAST de
microdiluição em caldo................................................................................. 71
Figura 14 – Perfil de sensibilidade a itraconazol de 133 isolados de

em caldo e o grupo de origem dos isolados. CI = isolados clínicos iniciais,
CNI = isolados clínicos não-iniciais e AMB = ambientais............................. 72
Figura 15 – Perfil de sensibilidade ao voriconazol de 126 isolados de

C. neoformans obtido segundo as metodologias CLSI e EUCAST de
Figura 16 – Perfil de sensibilidade à anfotericina B, de 133 isolados de

Figura 17 – Concordância geral dos resultados de CIM, obtidos pelas

de C. neoformans, segundo o critério de diferença de até duas diluições. .. 78
Índice
1. Introdução.............................................................................. 21
1.1. Cryptococcus neoformans ............................................................. 21

1.2. Fatores de Virulência ..................................................................... 24
1.2.1. Crescimento à Temperatura de 37 °C .................................... 25
1.2.2. Cápsula .................................................................................. 26
1.2.3. Melanina ................................................................................. 29
1.2.4. Fosfolipase e Proteinase Extracelular .................................... 30
1.2.5. Tipos Conjugantes α e a......................................................... 32
1.3. Criptococose.................................................................................. 32
1.3.1. Tratamento ............................................................................. 35
1.4. Sensibilidade a Antifúngicos .......................................................... 38
1.5. Mecanismos de Resistência a Antifúngicos em C. neoformans .... 41
1.6. Novas Formulações e Novas Drogas Antifúngicas ........................ 42
2. Objetivos.............................................................................. 44
3. Material e Métodos.............................................................. 45
3.1. Origem dos isolados de Cryptococcus neoformans....................... 45

3.2. Amostras Selecionadas ................................................................. 46
3.3. Estudo das Variedades de C. neoformans .................................... 46
3.4. Estudo de Fatores de Virulência de C. neoformans ...................... 47
3.4.1. Produção de Cápsula ............................................................. 47
3.4.2. Produção de Fosfolipases ...................................................... 48
3.4.3. Produção de Proteinases ....................................................... 49
3.4.4. Análise Estatística .................................................................. 49
3.5. Seleção de Fenótipos Resistentes ao Fluconazol ......................... 50
3.6. Perfil de Sensibilidade a Antifúngicos ............................................ 52
3.6.1. Antifúngicos ............................................................................ 52
3.6.2. Meio de Cultura ...................................................................... 53
3.6.3. Preparo das Placas de Microtitulação .................................... 53
3.6.4. Inóculos .................................................................................. 53
3.6.5. Inoculação nas Placas de Microtitulação................................ 54
3.6.6. Controle de Qualidade............................................................ 55
3.6.7. Leitura e Interpretação dos Resultados .................................. 55
4. Resultados........................................................................... 56
4.1. Amostras Selecionadas e Variedades ........................................... 56

4.2. Cápsula.......................................................................................... 56
4.3. Fosfolipases e Proteinases Extracelulares .................................... 60
4.3.1. Fosfolipases ........................................................................... 60
4.3.2. Proteinases............................................................................. 63
4.4. Seleção de Fenótipos Resistentes ao Fluconazol ......................... 63
4.5. Perfil de Sensibilidade a Antifúngicos ............................................ 66
4.5.1. Fluconazol .............................................................................. 67
4.5.2. Itraconazol .............................................................................. 70
4.5.3. Voriconazol ............................................................................. 72
4.5.4. Anfotericina B ......................................................................... 73
4.5.5. Concordância entre os Resultados CLSI e EUCAST ............. 74
5. Discussão ............................................................................ 79
6. Conclusôes.......................................................................... 99
7. Considerações Finais....................................................... 100
8. Referências Bibliográficas............................................... 101

1. Introdução
Cryptococcus neoformans, levedura encapsulada, é o principal

agente etiológico da criptococose, micose essencialmente oportunista, que
se manifesta principalmente sob a forma de meningoencefalite em indivíduos
imunocomprometidos, tais como aqueles com AIDS (Pappalardo e Melhem,
2003). Excrementos de pombos e solos contendo acúmulo de fezes de aves
são a mais importante fonte natural conhecida do fungo. As fezes
dessecadas possuem leveduras desidratadas passíveis de deposição
alveolar e, de outra forma, os basidiósporos produzidos na fase sexuada são
facilmente dispersos no ar e penetram no organismo pelo trato respiratório.
Após algum tempo no pulmão, a levedura pode invadir a corrente sanguínea
e atingir outros tecidos e órgãos do organismo. Como apresenta tropismo
pelo sistema nervoso central (SNC), os indivíduos com criptococose
geralmente evoluem para meningoencefalite, forma clínica potencialmente
fatal (Casadevall e Perfect, 1998; Casali et al., 2001).
1.1. Cryptococcus neoformans
Os primeiros isolados de Cryptococcus neoformans foram obtidos

em 1894. Busse e Buschke isolaram a levedura de lesão óssea de tíbia
semelhante ao sarcoma, em paciente do sexo feminino de 31 anos. No
mesmo ano, Sanfelice isolou a levedura em amostra de suco de pêssego
fermentado e demonstrou, posteriormente, sua patogenicidade pela
inoculação em animais. Busse denominou a levedura de Saccharomyces e a
doença de Saccharomycosis hominis. Sanfelice, por sua vez, denominou a
levedura de Saccharomyces neoformans. Em 1901, Vuillemin estabeleceu o
nome genérico Cryptococcus e denominou as leveduras isoladas por Busse
e Sanfelice de C. hominis e C. neoformans respectivamente, devido à
ausência de fermentação de fontes de carbono e ausência de produção de
21
ascósporos, características dos membros do gênero Saccharomyces (Kwon-
Chung e Benett, 1992).
Em 1935, Benham estudou, com base na morfologia,
patogenicidade e sorologia, diversas leveduras incluindo 22 isolados de
Cryptococcus. Em 1949, Evans encontrou diferenças sorológicas entre
isolados da levedura provenientes de pacientes com criptococose e
identificou 3 sorotipos: A, B e C. Em 1950, a denominação da levedura como
Cryptococcus neoformans foi estabelecida como “nomen conservadum”
(Kwon-Chung e Benett, 1992). Posteriormente, Wilson et al. (1968)
identificaram o quarto sorotipo da levedura: sorotipo D.
Em 1975, Kwon-Chung identificou a existência de 2 tipos
conjugantes, a e α, capazes de gerar, quando cruzados, o estado
teleomórfico da levedura. O microrganismo nesse estado foi denominado
Filobasidiella neoformans (Kwon-Chung,1975) e duas variedades foram
estabelecidas: F. neoformans var. neoformans, estado anamórfico
C. neoformans var. neoformans, sorotipos A e D; e F. neoformans var.
bacillispora, estado anamórfico C. neoformans var. gattii, sorotipos B e C
(Kwon-Chung,1976). Ikeda et al. (1982) caracterizaram antigenicamente os
sorotipos pela imunização de coelhos e testes de aglutinação em lâmina.
Além dos 4 sorotipos, foi também caracterizado o sorotipo AD, previamente
observado por outros autores (Wilson et al., 1968; Bennett et al., 1977;
Mishra et al.,1981)
Em 1985, Emmons demonstrou que existiam importantes fontes
ambientais de C. neoformans, isolando a levedura de solos da Virgínia, nos
Estados Unidos. O autor relatou também, que isolados virulentos da
levedura são comuns e abundantes em abrigos de pombos e nas suas
fezes. A partir de então, vários isolamentos de C. neoformans em solos
contaminados com fezes de aves, principalmente de pombos, foram
registrados em todo o mundo (Kwon-Chung e Bennett, 1992; Casadevall e
Perfect, 1998; Pappalardo e Melhem, 2003).
Lazéra et al. (2000) identificaram pela primeira vez no Brasil, um
possível “habitat” primário da variedade neoformans em material vegetal em
22
decomposição, no oco de árvores vivas. Em estudo anterior, verificou-se que
produtos de decomposição da lignina e xilano possibilitam o crescimento de
C. neoformans nesse substrato (Lazéra et al., 1996).
Ellis e Pfeiffer (1990) encontraram a fonte ambiental da variedade
gattii isolando cepas do sorotipo B de Eucalyptus camaldulensis na Austrália
e no ano seguinte em São Francisco (EUA). Posteriormente, verificou-se que
outras espécies de eucaliptos podem servir como “habitat” dessa variedade
(Pfeiffer e Ellis, 1992; Licea et al., 1996). O isolamento de C. neoformans
var. gattii de outras árvores, que não eucaliptos, sugere que diferentes
espécies de plantas podem ser reservatórios para o fungo (Lazéra et al.,
1998).
Kwon-Chung et al. (1982) descreveram um meio de cultura
contendo canavanina, glicina e indicador azul de bromotimol (CGB), capaz
de diferenciar as duas variedades. C. neoformans var. neoformans não
cresce no meio CGB, pois é sensível à canavanina e não é capaz de
assimilar glicina como única fonte de carbono e nitrogênio. Por outro lado,
C. neoformans var. gattii não é sensível à canavanina, assimila glicina e,
portanto, cresce e libera produtos que aumentam o pH do meio que, pela
presença do indicador, passa da cor original amarelo-esverdeado para a cor
azul.
Estudos moleculares dos padrões de “fingerprinting” do DNA,
utilizando a sonda CNRE-1 e a análise da seqüência de nucleotídeos do
gene URA-5 mostraram diferenças significativas entre os sorotipos A e D,
sugerindo a criação de uma nova variedade para isolados do sorotipo A:
Cryptococcus neoformans var. grubii, e limitando a denominação
Cryptococcus neoformans var. neoformans para o sorotipo D (Franzot et
al.,1999).
As variedades neoformans, gattii e grubii diferem entre si em
aspectos ecológicos, bioquímicos, epidemiológicos, fisiológicos e genéticos
(Ikeda et al., 1982; Kwon-Chung e Bennett, 1992; Boekhout et al., 1997;
Casadevall e Perfect, 1998; Franzot et al., 1999; Chun et al., 2000; Boekhout
23
et al., 2001; Latouche et al., 2003; Meyer et al., 2003; Trilles et al., 2003;
Oliveira et al., 2004; Trilles et al., 2004; Dias et al., 2006a).
Em um estudo multicêntrico, mais de 1.000 isolados de C.
neoformans, de diversas origens e regiões geográficas, foram caracterizados
genotipicamente pela técnica de PCR-fingerprintig seguida da análise por
“Amplified Fragment Lenght Plymorphism” (AFLP). Os resultados revelaram
a existência de 8 grupos distintos representativos das variedades:
VNI/AFLP1 e VNII/AFLP1A (variedade grubii, sorotipo A); VNIII/AFLP3
(híbrido entre as variedades grubii e neoformans, sorotipo AD); VNIV/AFLP2
(variedade neoformans, sorotipo D); VGI/AFLP4, VGII/AFLP6, VGIII/AFLP5 e
VGIV/AFLP7 (variedade gattii, sorotipos B e C) (Meyer et al., 2005).
Os resultados das análises moleculares, aliado às diferenças
anteriormente reconhecidas (Kwon-Chung e Bennett, 1992; Casadevall e
Perfect, 1998), sugerem que a variedade gattii é suficientemente distinta
para ser classificada como uma nova espécie: Cryptococcus gattii (Kwon-
Chung, 2005). Alguns autores consideram ainda, que as variedades
neoformans e grubii podem representar duas espécies distintas, baseado em
análise filogenética (Boekhout et al., 2005).
Atualmente, somente a classificação da variedade gattii como
espécie é reconhecida por número cada vez maior de autores.
Kwon-Chung e Varma (2006) atestaram a validade dessa classificação
frente aos três principais conceitos de epécie: o fenotípico (morfológico), o
biológico (reprodutivo) e o evolucionário (filogenético) (Kwon-Chung e
Varma, 2006).
1.2. Fatores de Virulência
No estudo de patógenos é importante a descrição dos fatores de

virulência que, em definição simples, podem ser entendidos como a
habilidade do microrganismo em superar as defesas naturais do hospedeiro
(Casadevall e Perfect, 1998). Tais defesas, no caso da criptococose, estão
24
diretamente relacionadas à capacidade do hospedeiro em desenvolver uma
resposta inflamatória granulomatosa ativa e à integridade da imunidade
celular envolvendo tanto linfócitos CD4 como CD8. Dependendo das
condições do sistema imune do hospedeiro, do tamanho do inóculo, ou da
virulência do isolado, a criptococose pode passar assintomática, sendo
contida logo no estágio pulmonar, ou pode ocorrer disseminação para outros
órgãos, acometimento do SNC, com risco de morte do hospedeiro (Bicanic e
Harrison, 2005).
Dentre os diversos fatores de virulência apresentados por
Cryptococcus neoformans, destacam-se: capacidade de crescer à
temperatura de 37 °C, presença de cápsula, produção de melanina,
ocorrência de tipo conjugante α e atividade enzimática extracelular de
fosfolipases e proteinases (Buchanan e Murphy, 1998; Ma e Mody, 2002).
1.2.1. Crescimento à Temperatura de 37 °C
Para causar infecção em humanos, C. neoformans precisa ser

capaz de crescer a 37 °C em atmosfera de aproximadamente 5 % de CO2 e
pH de 7,3 a 7,4. Tal crescimento é possível devido à presença de um gene
que codifica a subunidade catalítica da calcineurina A, uma fosfatase
envolvida na resposta ao estresse em leveduras (Odom et al., 1997).
Apesar de cepas mutantes para calcineurina serem capazes de
crescer à temperatura de 24 °C, elas não sobrevivem “in vitro” a 37 °C, em
atmosfera de 5 % de CO2, ou em pH alcalino. Testes em coelhos
imunossuprimidos mostraram que as cepas mutantes não são patogênicas
para os animais (Odom et al., 1997). Calcineurina A parece ser um requisito
básico para a sobrevivência de C. neoformans no organismo hospedeiro e,
consequentemente, é um fator necessário à patogenicidade da levedura
(Buchanan e Murphy, 1998).
25
1.2.2. Cápsula
Cryptococcus neoformans apresenta cápsula formada por um

polissacarídeo viscoso, do qual glicuronoxilomanose (GXM) é o principal
componente, seguido por galactoxilomanose (GalXM) e manoproteínas.
GXM consiste de uma cadeia principal linear de polímeros de manose,
substituídos com monossacarídeos de ácido glicurônico e xilose, com peso
molecular de aproximadamente 1.000.000 Da. GalXM é menor,
aproximadamente 100.000 Da, e consiste em um polímero constituído,
principalmente, por galactose na cadeia principal, com cadeias laterais
contendo galactose, manose e xilose (Mitchell e Perfect, 1995; Casadevall e
Perfect, 1998; Buchanan e Murphy, 1998; Ma e Mody, 2002).
Estudos recentes mostraram que a cápsula é matriz com grau
variável de porosidade, que aumenta com o distanciamento da parede
celular. A alta densidade da matriz no interior da cápsula impede a
penetração de moléculas grandes nas proximidades da parede celular. Em
contraste, na borda da cápsula, que é a interface de interação com fagócitos,
os polissacarídeos capsulares apresentam baixa densidade, conferindo
maior plasticidade e permeabilidade às macromoléculas (Gates et al., 2004).
Existem evidências de que a cápsula é um fator chave na
virulência de C. neoformans; mutantes sem cápsula são tipicamente não-
virulentos, sendo mais facilmente fagocitados por leucócitos do que as
células com cápsula (Kwon-Chung e Rhodes, 1986).
A primeira evidência molecular de que a cápsula era um fator de
virulência veio de estudos de inserção de DNA de cepas capsuladas em
mutantes não-capsulados. Um dos clones obtidos no estudo produziu
cápsula e tornou-se virulento em modelo animal. O DNA responsável pela
transformação continha um gene que foi denominado CAP59 (Chang e
Kwon-Chung, 1994). Estudos similares identificaram um segundo gene,
CAP64. Com a deleção de um desses genes, a cepa de C. neoformans era
incapaz de produzir cápsula e tornava-se não-virulenta (Chang et al., 1996;
Chang et al., 1997).
26
Posteriormente, 2 novos genes foram clonados: CAP10 e CAP60.
Esses 4 genes foram utilizados em testes de complementação de mutantes
não-capsulados e mostraram-se essenciais para a formação da cápsula. No
entanto, a função bioquímica deles, nos eventos da síntese capsular, é ainda
desconhecida (Ma e Mody, 2002).
Existem propriedades da cápsula que permitem ao hospedeiro
imunocompetente eliminar a levedura dos tecidos com grande eficiência. No
entanto, outras propriedades protegem o patógeno das defesas do
organismo hospedeiro (Buchanan e Murphy, 1998).
A fixação de proteínas do complemento (frações C3b e C3bi) na
superfície da levedura facilita a interação com receptores nos leucócitos.
Isso permite a eliminação da levedura ainda no meio extracelular ou após
fagocitose, sendo muito favorável ao hospedeiro. C. neoformans pode ainda
ser opsonizado por anticorpos contra os antígenos capsulares (Kozel e
Pfrommer, 1986). Porém, dependendo do tamanho da cápsula, tanto a
fração C3b quanto os anticorpos podem ser encobertos, impedindo a ligação
destes aos receptores das células do sistema fagocitário do hospedeiro,
mantendo a levedura protegida (Buchanan e Murphy, 1998; Gates et al.,
2004). Além disso, a cápsula confere carga negativa à superfície da
levedura, o que pode causar uma repulsão eletrostática em relação às
células efetoras do sistema imunológico do hospedeiro, também carregadas
negativamente (Nosanchuk e Casadevall, 1997).
Na criptococose disseminada, níveis mensuráveis de antígenos
capsulares (GXM principalmente) estão presentes nos fluidos corporais do
organismo hospedeiro (Kozel e Cazin, 1972). Foi demonstrado que tais
antígenos, presentes no sistema circulatório do hospedeiro, inibem a
migração de leucócitos do sangue para o sítio inflamatório. GXM estimula a
liberação de L-selectina, molécula de superfície necessária à primeira etapa
do movimento de migração dos neutrófilos para os tecidos. Sem a selectina
os neutrófilos não são atraídos para o tecido endotelial inflamado da parede
dos vasos sanguíneos (Dong e Murphy, 1996). Além disso, GXM e GalXM
podem se ligar ao CD18, cadeia beta da molécula de adesão LFA-1 dos
27
neutrófilos, impedindo a ligação desta ao seu receptor (ICAM-1) na
superfície das células endoteliais inflamadas. Dessa forma, o número de
neutrófilos nos tecidos infectados estaria bastante reduzido, prejudicando a
resposta inflamatória local (Buchanan e Murphy, 1998).
Antígenos capsulares de C. neoformans, injetados na corrente
sanguínea de animais de experimentação, podem induzir linfócitos T
regulatórios (T supressor) que deprimem ou bloqueiam tanto a resposta
imunológica humoral, como a celular (Murphy e Cozad, 1972). Ausência de
resposta imunológica específica foi observada em pacientes com história
pregressa de meningite por C. neoformans. Apesar de terem sido capazes
de produzir anticorpos contra um polissacarídeo pneumocócico no mesmo
nível que o grupo controle após vacinação, os pacientes com histórico de
criptococose foram incapazes de produzir anticorpos contra polissacarídeos
de C. neoformans quando vacinados com antígenos capsulares (Kwon-
Chung e Bennett, 1992; Buchanan e Murphy, 1998; Casadevall e Perfect,
1998).
Cryptococcus neoformans apresenta grande variabilidade no
tamanho da cápsula, dependendo das condições do ambiente ao qual está
exposto. Em condições de cultivo “in vitro” o tamanho da cápsula é
geralmente reduzido, podendo, no entanto, ser aumentado por diversos
fatores como: soro, alta concentração de CO2 e baixa concentração de ferro.
(Granger et al., 1985; Vartivarian et al., 1993; Zaragoza e Casadevall, 2003).
Recentemente, Zaragoza e Casadevall (2004) encontraram um
meio simples e eficiente de indução da síntese capsular. Com base na
observação de que a cepa H99 desenvolvia cápsula maior em meio ágar
Sabouraud diluído 1:10 em água, comparado ao meio não diluído, os
autores verificaram que a indução estava relacionada à taxa de crescimento
celular. Dentre os meios avaliados, ágar Sabouraud diluído 1:10 em tampão
de ácido morfolinopropanosulfônico (MOPS), em pH 7,3, apresentou o maior
potencial de indução.
28
1.2.3. Melanina
A produção de melanina é característica conferida pela presença

de uma enzima lacase, denominada fenoloxidase (Buchanan e Murphy,
1998). Em 1962, Staib descobriu que C. neoformans produzia colônias
marrons, devido à produção de pigmentos melanínicos, quando cultivado em
meios que continham extrato de sementes de Guizzotia abyssinica (“niger
seed”). Posteriormente, verificou-se que meios contendo difenóis,
aminofenóis ou compostos diaminobenzênicos, levavam a levedura à
produção de melanina. Análises bioquímicas sugeriram que a melanogênese
em C. neoformans ocorre pela conversão de diidroxifenóis à dopaquinona,
reação catalizada pela fenoloxidase, seguida de um rearranjo espontâneo
que, por oxidação, forma melanina (Polacheck e Kwon-Chung, 1988).
Kwon-Chung e Rhodes (1986) verificaram que a atividade da
enzima fenoloxidase tem um importante efeito na virulência de
C. neoformans. Camundongos que foram infectados com cepas mutantes
para produção de melanina sobreviveram por tempo significativamente
maior, do que aqueles infectados com cepas produtoras do pigmento. Além
disso, das colônias obtidas à partir do tecido cerebral dos camundongos
inoculados com cepas mutantes, 40 % reverteu à capacidade normal de
produção de melanina.
A fenoloxidase, responsável pela etapa inicial da síntese de
melanina em C. neoformans, é codificada pelo gene CNLAC1. Deleção
desse gene causa perda de virulência em modelo animal. Por outro lado,
complementação com CNLAC1 aumenta a virulência de cepas mutantes, por
restaurar a produção de melanina (Buchanan e Murphy, 1998).
A produção de melanina está associada à proteção da levedura
contra ataque de células do sistema imunológico do hospedeiro, substâncias
oxidantes, luz ultravioleta, temperaturas extremas e ação fungicida da
anfotericina B (Wang et al., 1995; Buchanan e Murphy, 1998; Doering et al.,
1999; Ikeda et al., 2003).
29
Doering et al. (1999) demonstraram a capacidade da melanina em
se ligar a peptídeos e proteínas microbicidas, reduzindo a sensibilidade da
levedura a essas substâncias. Dessa forma, C. neoformans seria capaz de
resistir ao ataque de células efetoras do sistema imune, como macrófagos,
que produzem proteínas microbicidas dotadas de alta carga negativa, e
neutrófilos, que produzem defensinas compostas por peptídeos carregados
positivamente, com efeito fungicida sobre a levedura.
Ikeda et al. (2003) verificaram que, embora o valor de
concentração inibitória mínima de anfotericina B para células melanizadas e
não-melanizadas de C. neoformans tenha se mantido o mesmo, foram
encontradas células viáveis somente nas placas que continham colônias
melanizadas. Além disso, essas amostras demonstraram, em estudo de
curva de morte, que número significativamente maior de células melanizadas
foi capaz de sobreviver nas primeiras horas de exposição à anfotericina B,
em comparação com células não-melanizadas.
Apesar de ser um fator importante na virulência de C. neoformans,
existem poucas evidências da produção desse pigmento “in vivo”. A
produção de melanina a 37 °C é bastante diminuída quando comparada à
atividade da enzima a 25 °C (Buchanan e Murphy, 1998). Além disso, a
quantidade de melanina produzida “in vivo” pode não ser tão elevada como a
produzida “in vitro”, provavelmente pela quantidade relativamente baixa de
catecolaminas livres (substrato para a enzima fenoloxidase) presentes no
tecido humano e de outros mamíferos. Dessa forma, pode não haver
melanina suficiente para desempenhar as funções que conferem proteção à
levedura e contribuem para sua virulência no organismo hospedeiro
(Jacobson, 2000).
1.2.4. Fosfolipase e Proteinase Extracelular
A produção de fosfolipases e proteinases extracelulares sugerem

a capacidade da levedura em degradar a membrana celular de células do
30
hospedeiro, permitindo sua penetração nos tecidos (Casadevall e Perfect,
1998; Santangelo et al., 2004).
Chen et al. (1997) sugerem a produção de fosfolipase como fator
de virulência, após verificarem que camundongos inoculados com cepas de
C. neoformans, classificadas como fortes produtoras dessa enzima,
apresentaram mortalidade mais elevada quando comparado ao grupo de
cepas classificadas como produtoras intermediárias ou não produtoras.
De acordo com Santangelo et al. (2004), a fosfolipase está
envolvida no início e desenvolvimento da criptococose pulmonar, sendo
essencial para a entrada da levedura no sistema linfático e no sangue,
porém, não parece ser importante para a infecção do sistema nervoso
central.
A atividade enzimática da fosfolipase foi caracterizada como
fosfolipase B, lisofosfolipase hidrolase e lisofosfolipase transacilase. O gene
que codifica a enzima, denominado PLB1 foi clonado e permitiu a criação de
mutantes por disrrupção gênica dirigida. Todas as atividades enzimáticas
foram drasticamente reduzidas nos mutantes, em comparação às cepas
originais. Testes “in vivo”, utilizando camundongos inoculados por inalação e
coelhos com meningite criptocóccica experimental, demonstraram que a
cepa mutante era significativamente menos virulenta que a cepa controle,
nos 2 modelos utilizados (Cox et al., 2001).
Muller e Sathi (1972), em um estudo imunoeletreoforético,
demonstraram que C. neoformans possui atividade proteolítica, pela
capacidade de degradar 2 de 13 proteínas plasmáticas humanas utilizadas
no teste (Muller e Sathi, 1972 apud Aoki et al., 1994). Salkowski e Balish
(1991) observaram a formação de lesões de pele em camundongos
deficientes de linfócitos T, inoculados com a cepa SLHA de C. neoformans.
Análise microscópica das lesões indicou que a levedura era responsável
pela degradação de colágeno na derme desses animais.
A atividade de proteinase extracelular pode ainda ser responsável
pela destruição de proteínas imunologicamente importantes, como
imunoglobulinas e proteínas do sistema complemento (Casadevall e Perfect,
31
1998). No entanto, apesar das indicações de que a proteinase serve como
fator de virulência, Buchanan e Murphy (1998) sugerem a necessidade de
estudos com cepas isogênicas para confirmar a importância dessa enzima
na patogenicidade de C. neoformans.
1.2.5. Tipos Conjugantes α e a
Em relação ao tipo conjugante, a grande maioria dos isolados de

Cryptococcus neoformans pertence ao tipo α. Estudos realizados com cepas
congênicas, diferentes quanto ao tipo conjugante, demonstraram que o tipo
α era significativamente mais virulento que o tipo a. Em teste de
sobrevivência de ratos inoculados com cepas de ambos os tipos (a e α),
verificou-se que 80 % dos ratos infectados com o tipo α morreram dentro de
36 dias, enquanto para o tipo a, somente após 93 dias, 80 % dos ratos
estavam mortos (Kwon-Chung et al., 1992).
1.3. Criptococose
A criptococose caracteriza-se por um primeiro estágio, em que a

infecção fica delimitada ao sistema respiratório, podendo assumir as formas
aguda, subaguda ou crônica (Casali et al., 2001). Em um segundo estágio,
pode apresentar-se como infecção secundária, resultante da disseminação,
através da corrente sanguínea, para o sistema nervoso central, acarretando
quadros de meningite, encefalite ou meningoencefalite. (Mitchell e Perfect,
1995; Casali et al., 2001).
O neurotropismo é parcialmente explicado pela presença de
catecolaminas no sistema nervoso central, como dopamina e norepinefrina.
Tais substâncias serviriam de substrato para a síntese de melanina pela
levedura, o que confere proteção contra o sistema oxidativo de defesa do
hospedeiro (Buchanan e Murphy, 1998). Cerca de 70 a 90 % dos pacientes
32
com criptococose apresentam sinais e sintomas de meningite subaguda ou
meningoencefalite, como dores de cabeça, febre, rigidez de nuca, letargia,
coma, alterações de personalidade e perda de memória (Mitchell e Perfect,
1995; Darzé et al., 2000).
Antes da década de 80, a criptococose era considerada como
micose de ocorrência esporádica, afetando tanto humanos quanto animais,
em todo o mundo. Pórem, sua importância clínica aumentou drasticamente
desde então, em virtude do surgimento da AIDS (Kwon-Chung e Bennett,
1992). A doença pode ocorrer em indivíduos aparentemente hígidos (Lacaz
et al., 2002), entretanto, a maioria dos pacientes apresenta alguma condição
pré-existente ou doença de base, tais como: AIDS, tratamentos longos com
corticosteróides, transplante de órgãos, leucemia e linfomas crônicos
(Mitchell e Perfect, 1995).
Em um estudo com 306 indivíduos HIV negativos com
criptococose nos Estados Unidos, 79 % tinham alguma condição de base,
sendo as principais: corticoterapia (28 %), transplante de órgão (18 %) e
câncer (18 %). A mortalidade geral nesses pacientes foi de 30 % e a
atribuída à criptococose de 12 %, monstrando que a doença continua a ser
importante, não somente em indivíduos com AIDS (Pappas et al., 2001). Wu
et al. (2002) verificaram taxa de 50 % de mortalidade relacionada à
ocorrência de meningite criptocóccica em 28 pacientes submetidos ao
transplante de órgãos.
Indivíduos com AIDS em estado avançado têm maior
probabilidade de desenvolver criptococose. Estudos clínicos demonstraram
que, com a diminuição na contagem de linfócitos CD4+, ocorre aumento no
risco de desenvolver meningite criptocóccica. Ainda nesses estudos, mais de
três quartos dos casos da doença ocorreram em pacientes com contagem
abaixo de 50 células/μL (Pinner et al., 1995). A mortalidade por meningite
criptocóccica associada à infecção pelo HIV continua elevada (10 a 30 %),
mesmo em países desenvolvidos, devido principalmente à inadequação da
terapia antifúngica atual e as complicações decorrentes da alta pressão
intracraniana nesses pacientes (Bicanic e Harrison, 2005).
33
Durante as décadas de 80 e 90, a criptococose foi a principal
infecção fúngica de morbidade e mortalidade entre pacientes com AIDS e,
em muitos casos, era a primeira indicação da síndrome. Sua incidência
variava entre 3 e 10 % nos Estados Unidos e Europa, e chegava a 30 % na
África, onde 30 a 60 % dos pacientes morriam no primeiro ano após início do
tratamento (Kwon-Chung e Bennett, 1992; Mitchell e Perfect, 1995).
No Brasil, a criptococose respondia por 4,5 % das doenças
associadas a pacientes com HIV, de acordo com dados do Ministério da
Saúde – Coordenação Nacional de DST/AIDS, no período entre 1980 e
2000. Considerando as infecções oportunistas que acometem esses
pacientes, a criptococose era a quarta causa mais frequente de infecção, no
momento da notificação do caso de AIDS (Casali et al., 2001; Ministério da
Saúde, 2003).
A introdução da terapia antiretroviral altamente potente (HAART)
no final da década de 90, proporcionou marcada diminuição nas taxas de
morbidade e mortalidade em pacientes com AIDS. Em um estudo com 1.255
pacientes atendidos em clínicas especializadas nos Estados Unidos, houve
redução na taxa anual de mortalidade no período de 1994 a 1997, de 29,4
para 8,8 em cada 100 indivíduos (Palella et al., 1998). Houve também
redução na prevalência de algumas doenças associadas à AIDS, tais como:
citomegaloviroses, micobacterioses, criptosporodioses e criptococose
(Manfredi e Chiodo, 2000). No Brasil, a taxa geral de mortalidade em
pacientes com criptococose, com ou sem doença de base, varia em torno de
45 a 65 %, conforme revisão de Pappalardo & Melhem (2003). Estes autores
verificaram ainda, que a taxa de criptococose em pacientes com AIDS
atendidos em um centro de referência, situada em 7,7 % em 1995, decaiu,
porém mantêve-se em cerca de 4 %, nos anos de 2000 a 2003.
Um importante fenômeno, observado em pacientes tratados com
HAART, é o surgimento de exacerbação da resposta inflamatória frente a
diversos patógenos, pela reconstituição do sistema imunológico do indivíduo.
Esses eventos de piora clínica paradoxal, conhecidos como síndrome da
reconstituição imunológica, ocorrem principalmente em indivíduos com
34
história de infecções oportunistas ou com contagens baixas (<100/μL) de
linfócitos CD4 no início do uso de HAART (Gardner e Connick, 2004).
Exacerbação da criptococose, após reconstituição do sistema imune, pode
se manifestar como meningite, pneumonia ou linfoadenite focal (Hage et al.,
2002).
1.3.1. Tratamento
Ao contrário do grande número de agentes antibacterianos

disponíveis, no combate às infecções causadas por leveduras patogênicas,
o número de agentes antifúngicos é limitado. Os mais importantes são:
polienos, azólicos e análogos de pirimidinas, sendo seus representantes
principais, respectivamente, anfotericina B, fluconazol e 5-fluorocitosina
(Powderly 1996; Graybill, 1996; Sanglard, 2002).
Anfotericina B é um composto natural produzido por Streptomyces
nodosus, descoberto no início da década de 50. Forma sais em meios
ácidos ou básicos, não é absorvida por via oral, nem intramuscular, e é
insolúvel em água. O modo de ação primário da droga é sua ligação ao
ergosterol presente na membrana dos organismos susceptíveis, resultando
na formação de poros, extravasamento de compostos vitais, como cátions
mono ou divalentes, e consequente morte da célula (Sanglard, 2002).
Anfotericina B apresenta forte ação fungicida contra a maioria das leveduras
patogênicas e foi usada com sucesso em todas as formas de criptococose,
de pneumonia à meningite (Mitchell e Perfect, 1995). No entanto, sua alta
nefrotoxicidade muitas vezes limita seu uso terapêutico (Graybill, 1996;
Sharkey et al., 1996).
Os azóis são substâncias sintéticas e foram descobertos no final
da década de 60. Podem ser divididos em imidazóis (cetoconazol,
miconazol, clotrimazol) e triazóis: fluconazol, itraconazol e voriconazol
(Sanglard, 2002; Greer, 2003). O mecanismo de ação dessas drogas
consiste no bloqueio da enzima citocromo P450, denominada lanosterol-
35
14α-demetilase, codificada pelo gene ERG11, e que está envolvida na
biossíntese de ergosterol da membrana celular fúngica. Sem a incorporação
do ergosterol, a fluidez e a estabilidade da membrana ficam comprometidas,
assim como o crescimento e a divisão celular. As drogas dessa classe, como
fluconazol e itraconazol, possuem efeito predominantemente fungistático nas
concentrações terapêuticas (Joseph-Horne e Hollom, 1997; Sanglard, 2002).
Fluconazol foi lançado em 1990 para o tratamento da criptococose
e candidíase. A droga mostrou-se eficiente para o tratamento da meninigite
criptocóccica aguda e, mais ainda, para a prevenção de recidivas em
pacientes com AIDS (Kauffman, 1996). Fluconazol é solúvel em água,
disponível em solução e cápsula para uso oral e em solução salina para
administração por via endovenosa. Quando administrado por via oral, é
rapidamente absorvido com picos plasmáticos alcançados cerca
de 1 a 3 horas após administração. A biodisponibilidade é elevada (~90 %)
com rápida e ampla distribuição para órgãos e tecidos, e sua excreção é
feita, predominantemente, pelos rins, sob a forma não metabolizada
(Graybill, 1996; Martin, 1999). A droga possui alta penetração no sistema
nervoso central, com concentrações no líquor correspondentes a 70 % da
concentração plasmática (Fica, 2004).
Itraconazol é a droga de segunda linha na terapia da criptococose
com azóis (Powderly, 1996). Apresenta resposta terapêutica similar ao
fluconazol, sendo, no entanto, mais ativo para outras espécies de fungos
como Aspergillus (Kauffman, 1996). No Brasil, a droga está disponível
somente em cápsulas para uso oral. Possui baixa biodisponibilidade, devido
à sua lipofilicidade e alta ligação às proteínas plasmáticas (Martin, 1999;
Fica, 2004). Apesar de atingir concentrações baixas no líquor, itraconazol foi
utilizado com êxito para tratamento de meningite criptocóccica, segundo
alguns autores (Mitchell e Perfect, 1995; Kauffman, 1996; Fica, 2004).
Voriconazol, o mais novo triazol disponível no mercado nacional, é
derivado da estrutura do fluconazol, obtido pela substituição de um grupo
triazólico por uma fluropirimidina e pela adição de um grupamento metil à
cadeia central de propanol. Essas mudanças estruturais resultaram em
36
atividade aumentada no alvo celular (citocromo P450) e aumento do
espectro de ação, incluindo ação contra fungos filamentosos. Voriconazol
pode ser administrado oralmente ou por via parenteral (Chiou et al., 2001;
Greer, 2003).
5-fluorocitosina pertence à classe dos análogos de pirimidinas e foi
desenvolvida na década de 50 como um possível agente antineoplásico.
Apesar de não ter demonstrado efeito contra tumores, a droga possuía boa
atividade antifúngica, “in vitro” e “in vivo” (Sanglard, 2002). 5-fluorocitosina
foi usada inicialmente para tratamento de meningite criptocóccica, devido à
sua alta penetração no sistema nervoso central. No entanto, o aparecimento
de resistência à droga é frequente quando usada em monoterapia (Mitchell e
Perfect, 1995). A droga é utilizada com sucesso em terapias combinadas,
principalmente com anfotericina B ou fluconazol e por isso, é recomendada
no tratamento da criptococose (Mitchell e Perfect, 1995; Powderly, 1996;
Graybill, 1996; Barchiesi et al., 2001; Sanglard, 2002; Hage et al., 2002;
Pappalardo e Melhem, 2003).
O tratamento da criptococose consiste em uma fase inicial
denominada fase de indução e uma fase seguinte de consolidação ou
manutenção. Na fase de indução é recomendável a utilização de anfotericina
B na dose de 0,7 a 1 mg/Kg/d por 2 semanas, seguido de fluconazol (400
mg/d) por, no mínimo, 10 semanas (Powderly, 1996; Hage et al., 2002). A
associação de 5-fluorocitosina nessa fase reduz o risco de recidivas
(Kauffman, 1996; Hage et al., 2002; Pappalardo e Melhem, 2003).
A terapia de manutenção é necessária para prevenir recaídas.
Fluconazol (200 mg/d) é a droga de escolha nesta fase, sendo mais eficiente
que anfotericina B ou itraconazol (Powderly, 1996). Antes da era HAART, a
terapia de manutenção era empregada por tempo indefinido (Mitchell e
Perfect, 1995; Pappalardo e Melhem, 2003), porém, alguns autores relatam
que o risco de recidiva é baixo em pacientes com boa resposta à terapia
antiretroviral, o que justificaria a interrupção da terapia de manutenção, após
6 a 12 semanas, naqueles com contagem de linfócitos CD4 acima de 150
células/mL (Hage et al., 2002; Mussini et al., 2004; Negroni et al., 2004). A
37
terapia deve ser retomada caso haja queda do número de linfócitos para
níveis abaixo de 100 células/mL (Hage et al., 2002).
1.4. Sensibilidade a Antifúngicos
A problemática da oferta reduzida de agentes antifúngicos é

agravada pela ocorrência de relatos de resistência ao tratamento (Kelly et
al., 1994; Alves et al., 1997; Marichal et al., 1999; FIMUA, 2002; Datta et al.,
2003; Rodero et al., 2003). Além disso, o uso de fluconazol por tempo
indeterminado na terapia de manutenção em criptococose, bem como em
tratamentos profiláticos de pacientes sob risco de infecção fúngica (por
exemplo: transplantados de medula), aumentou a possibilidade de
surgimento de resistência adquirida (Alves et al., 1997; Berg, 1998; Aller et
al., 2000; Brandit et al., 2001; Friese et al., 2001; Rodero et al., 2003).
Resistência microbiológica pode ser definida como decréscimo ou
diminuição na sensibilidade ao antifúngico, podendo ser medida “in vitro” por
métodos laboratoriais apropriados (Sanglard, 2002). Como o sucesso da
terapia depende não somente do perfil de sensibilidade ao antifúngico
empregado, mas de diversos fatores relacionados ao hospedeiro (tais como:
estágio da doença, interações do organismo com o patógeno, local da
infecção), não existe uma relação direta entre o perfil de sensibilidade “in
vitro” e sucesso ou falha terapêutica (Ghannoum, 1996). No entanto, com os
avanços obtidos na última década em relação aos testes de sensibilidade,
segundo o método de referência e para os microrganismos nele definidos,
pode-se dizer que apesar da sensibilidade “in vitro” não predizer sucesso
terapêutico, resistência “in vitro” frequentemente prediz falha terapêutica
(Rex e Pfaller, 2002). Sendo assim, os testes de sensibilidade a antifúngicos
têm hoje grande importância para monitorar o surgimento de microrganismos
resistentes e ainda, para orientar o tratamento e prevenir falha terapêutica
(Witt et al., 1996; Ghannoum, 1996; Aller et al., 2000; Rex e Pfaller, 2002).
38
Desde o início da década de 80, grupos norte-americanos e
europeus empenharam-se no desenvolvimento de métodos para
determinação do perfil de sensibilidade de diversos patógenos a diferentes
drogas antifúngicas. Em 1982 foi criado um sub-comitê dentro do “National
Committee for Clinical Laboratory Standards” – NCCLS (hoje denominado
“Clinical and Laboratory Standards Institute” – CLSI 1), com o objetivo de
desenvolver um método de referência com tal finalidade (Rex et al., 1997).
Em 1997, foi publicado o documento M27-A, que indica o método de diluição
em caldo, macrodiluição, como método de referência para testes com
leveduras do gênero Candida (NCCLS, 1997). Em 2002, o comitê publicou o
documento M27-A2, que incorporou melhorias relacionadas ao preparo da
solução antifúngica, interpretação do teste e implementação de
procedimentos para controle de qualidade. Incluiu-se também o método de
microdiluição e aumento do escopo do teste para incluir leveduras do gênero
Cryptococcus (NCCLS, 2002).
Pesquisadores do “European Committee on Antimicrobial
Susceptibility Testing” (EUCAST) estudaram parâmetros para realização do
teste de microdiluição para leveduras fermentativas e propuseram
modificações no protocolo M27-A2 do CLSI (antigo NCCLS), para melhoria
na reprodutibilidade e eficiência dos resultados (Pappalardo e Melhem,
2003). Dentre os itens propostos, destacam-se: aumento do inóculo e da
concentração de glicose no meio de cultura, no intuito de melhorar o
crescimento microbiano e antecipar a leitura; e leitura espectrofotométrica,
que proporciona aumento da objetividade e rastreabilidade dos resultados
(EUCAST, 2002; Cuenca-Estrella, 2003). A correlação entre o documento
EUCAST e o de referência CLSI, foi analisada por Chryssanthou e Cuenca-
Estrella (2002), Cuenca-Estrella et al. (2002), Espinel-Ingroff et al. (2005).
A concentração inibitória mínima (CIM) da droga contra o agente
etiológico é parâmetro amplamente utilizado na detecção de cepas
resistentes. Alguns estudos buscaram correlacionar os valores de CIM com
o resultado clínico da terapia com determinado antifúngico, na tentativa de
1
http://www.nccls.org
39
estabelecer pontos de corte (“breakpoints”) que possam separar cepas
sensíveis de resistentes (Ghannoum, 1996; Jessup et al., 1998; Aller et al.,
2000; Clancy et al., 2005).
Fluconazol foi o primeiro antifúngico a ter pontos de corte
estabelecidos para leveduras do gênero Candida. Resultados de correlação
entre a farmacocinética da droga e dados clínicos do tratamento de
pacientes com candidíase orofaríngea por Candida albicans, permitiram a
proposição dos pontos de corte para interpretação dos resultados de CIM
obtidos pelo método de referência. Foram incluídos poucos estudos com
infecção invasiva por Candida, para fins de interpretação dos resultados
(Rex et al., 1997). Dessa forma, CIM ≤ 8 μg/mL classifica a cepa como
sensível e ≥ 64 μg/mL classifica a cepa como resistente. Isolados inibidos
por concentração de fluconazol entre 16 e 32 μg/mL estão enquadrados em
um intervalo que responde a doses relativamente altas, correspondentes às
doses séricas da droga, e por isso, o CLSI propôs a criação de uma nova
categoria para esses isolados: Sensibilidade Dependente da Dose (SDD)
(Rex et al., 1997; NCCLS, 2002).
Para itraconazol, assim como fluconazol, os estudos se basearam
nos resultados clínicos da terapia de infecção de mucosa por Candida
albicans, sendo proposto que CIM menor ou igual a 0,125 μg/mL, classifica a
cepa como sensível e maior ou igual a 1 μg/mL como resistente. CIM de
0,25 ou 0,5 μg/mL classifica a cepa como SDD (Rex et al., 1997).
Para Cryptococcus neoformans não existem pontos de corte
definidos e são raros os trabalhos que correlacionam o valor de CIM e
resultado terapêutico da criptococose (Rex et al., 1997; Pappalardo e
Melhem, 2003). Aller et al. (2000), com base na metodologia de referência,
correlacionaram os valores de CIM com resposta clínica à terapia de
manutenção com fluconazol em 25 pacientes com criptococose e AIDS. Os
autores observaram falha terapêutica em 5 casos e exatamente nestes, os
isolados da levedura apresentaram os maiores valores de CIM verificados no
estudo, todos maiores ou iguais a 16 μg/mL.
40
1.5. Mecanismos de Resistência a Antifúngicos em C. neoformans
Nos últimos anos, vários estudos foram realizados para esclarecer

os mecanismos moleculares de resistência aos antifúngicos (Kelly et al.,
1994; Horne e Hollom, 1997; White et al., 1998; Marichal et al., 1999;
Mellado et al., 2001; Sanglard, 2002; Song et al., 2004; Goldman et al.,
2004). Cryptococcus neoformans apresenta diferentes mecanismos de
resistência, sendo alguns ainda pouco estudados.
Lamb et al. (1995) verificaram o envolvimento da enzima
citocromo P450 (principal alvo dos antifúngicos azólicos) na resistência ao
fluconazol em isolados de C. neoformans de pacientes que apresentaram
falha terapêutica à droga. Os autores observaram que os isolados
resistentes necessitavam de concentrações maiores da droga para inibir a
enzima “in vitro”.
Pelo cultivo de C. neoformans em meio de cultura contendo
diferentes concentrações de fluconazol, Mondon et al. (1999) e Yamazumi et
al. (2003) demonstraram a existência de clones originados de uma mesma
cepa da levedura, com diferentes níveis de sensibilidade a este antifúngico.
No entanto, após sucessivas passagens em meio livre de fluconazol estes
fenótipos resistentes se reverteram ao fenótipo sensível inicial.
Utilizando metodologia semelhante, Xu et al. (2001) verificaram a
presença de clones mutantes, com menor sensibilidade ao fluconazol em
relação à cepa progenitora. Estes clones foram classificados como mutantes
por apresentarem estabilidade do fenótipo de resistência após cultivo em
meio de cultura livre do antifúngico.
Existem três principais mecanismos pelos quais um isolado de C.
neoformans (bem como de outros fungos) se torna resistente. Um deles
consiste na alteração da composição de esteróis da membrana celular do
fungo, sendo que a resistência adquirida à anfotericina B está associada a
esse mecanismo. Pela redução no conteúdo de ergosterol da membrana e
acúmulo de precursores como o ergostadienol e ergostaenol, a levedura
“elimina” o sítio de ação da anfotericina, tornando-se resistente à droga
41
(Sanglard, 2002). Kelly et al. (1994) relataram associação de um defeito na
Δ8-7 isomerase de um isolado clínico de C. neoformans e resistência à
anfotericina B em paciente com AIDS, por acúmulo e incorporação de
precursores do ergosterol na membrana celular da levedura.
Outro mecanismo de resistência consiste na super expressão de
bombas de efluxo, capazes de facilitar a retirada de drogas citotóxicas do
citoplasma para fora da célula fúngica. Thornewell et al. (1997) identificaram,
clonaram e caracterizaram o gene MDR1 do isolado M1-106 de C.
neoformans. Este gene codifica uma proteína transportadora–ABC,
relacionada à multiresistência a antifúngicos, que promove a retirada de
drogas do interior celular. Dados de Posteraro et al. (2003), confirmam que a
proteína AFR1 (“Antifungal Resistance 1” ou transportadora–ABC) está
envolvida na resistência de C. neoformans ao fluconazol. No Brasil, Silva et
al. (2003) verificaram a presença dos genes CNAFR1 e CneMDR1 em
isolados de C. neoformans var. gattii, armazenadas na micoteca do Centro
de Biotecnologia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul.
Um terceiro mecanismo, envolvendo alterações no alvo celular dos
azóis, foi verificado em espécies do gênero Candida (Kelly et al., 1999;
Marichal et al., 1999; Song et al., 2004) e mais recentemente em C.
neoformans (Rodero et al., 2003). Rodero et al. (2003) verificaram que a
substituição de um aminoácido na enzima citocromo P450 de um isolado de
C. neoformans var. grubii, causada por mutação do gene ERG11, foi
responsável pelo desenvolvimento de resistência secundária do isolado ao
fluconazol.
1.6. Novas Formulações e Novas Drogas Antifúngicas
A demanda contínua por antifúngicos mais seguros e eficientes,

com melhores propriedades farmacocinéticas e amplo espectro de ação,
levou ao desenvolvimento de novos triazóis: Ravuconazol (Bristol-Myers
Squibb); Posaconazol (Schering-Plough) (Chiou et al., 2000; Fica, 2004) e
42
Albaconazol (Uriach & Cia.) (Miller et al. 2004); e de novas formulações para
a anfotericina B.
Ravuconazol é também derivado estrutural do fluconazol, com
amplo espectro de atividade “in vitro” contra importantes patógenos como
Candida albicans, Aspergillus fumigatus, C. neoformans, hialo-hifomicetos e
alguns fungos demáceos. Pode ser administrado por via oral (Chiou et al.,
2000; Pfaller et al., 2002; Andes et al., 2003; Cuenca-Estrella et al., 2004).
Posaconazol é um análogo do itraconazol que possui potente
atividade antifúngica contra importantes pátogenos como Aspergillus sp
Trychosporon beigelli, Fusarium sp e alguns fungos demáceos, além de
Cryptococcus neoformans e espécies de Candida. Pode ser administrado
por via oral (Chiou et al., 2000; Pfaller et al., 2001; Andes et al., 2004).
Albaconazol é um novo triazol desenvolvido na Espanha que
possui amplo espectro de ação, potente atividade antifúngica, boa
farmacocinética e excelente biodisponibilidade por via oral (Miller et al.
2004). Tem previsão de chegada ao mercado em 2009/2010, em
apresentação para uso tópico e oral 2.
Esforços para modificar a estrutura da anfotericina B, visando
obter um composto menos tóxico, foram em geral, sem sucesso. No entanto,
o desenvolvimento de formulações lipídicas permitiu o uso de novas
abordagens, como o emprego de doses maiores da droga, direcionamento
para os sítios de infecção, com menos efeito sobre os rins e consequente
redução da nefrotoxicidade (Graybill, 1996). Anfotericina B complexo lipídico
(Amphotericin B Lipid Complex - ABLC; Abelcet, Liposome Company,
Princeton,NJ), Anfotericina B dispersão coloidal (Amphotericin B Colloidal
Dispersion – ABCD; Amphocil, Sequus Pharmaceuticals, Menlo Park, CA) e
AmBisome, fórmula de anfotericina B lipossomal (Nexstar, San Dimas, CA),
mostraram-se eficientes em estudos preliminares em modelo animal e
também em humanos, com vantagens em comparação à anfotericina B
convencional (Hiemenz e Walsh, 1996; Sharkey et al., 1996).
2
http:// www.pmfarma.com/noticias/noticias/noti.asp?ref=5032
43
2. Objetivos
Geral: Contribuir para o conhecimento do agente da criptococose,

Cryptococcus neoformans, em relação à sua virulência, sensibilidade a
antifúngicos e potencial de resistência ao fluconazol.
Específicos:
1. Analisar características de virulência: cápsula, fosfolipases e

proteinases extracelulares.
2. Promover a seleção “in vitro” de fenótipos resistentes ao

fluconazol.
3. Verificar o perfil de sensibilidade aos antifúngicos: fluconazol,

itraconazol, voriconazol e anfotericina B.
4. Analisar a concordância entre as metodologias CLSI e

EUCAST de microdiluição em caldo, nos testes de
sensibilidade a antifúngicos das amostras.
5. Correlacionar os fatores de virulência, sensibilidade aos

antifúngicos e resistência ao fluconazol, à origem das amostras
de C. neoformans.
44
3. Material e Métodos
3.1. Origem dos isolados de Cryptococcus neoformans
O Instituto Adolfo Lutz de São Paulo, como centro de referência

nacional pra infecções fúngicas oportunistas associadas à AIDS, possui um
banco de cepas de C. neoformans com mais de 2.000 isolados, obtidos nos
anos de 1994 a 2006. Para atender aos objetivos do presente trabalho e
permitir uma análise mais ampla e significativa dos resultados, as amostras
de C. neoformans foram selecionados partindo de 3 grupos distintos:
Isolados Clínicos Iniciais: isolados obtidos no momento do

diagnóstico da criptococose, sendo considerados como amostras sem
exposição conhecida a antifúngicos. As amostras deste grupo não
correspondem aos isolados iniciais do 2° grupo.
Isolados Clínicos Não-iniciais: isolados obtidos durante o curso

infeccioso da criptococose e, portanto, expostos à terapia antifúngica.
Excluíram-se isolados obtidos em período inferior a um mês em relação ao
isolado inicial. Os isolados iniciais deste grupo de cepas não foram incluídos
no trabalho.
Isolados Ambientais: amostras obtidas de diversas fontes como

árvores, fezes de morcego, fezes de pombos e outras aves. Tais amostras
foram cedidas pelo Laboratório de Microbiologia da Universidade Federal de
Alfenas (45,5 %) e pelo Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de
São Paulo (55,5 %).
45
3.2. Amostras Selecionadas
Foram estudados 133 isolados de C. neoformans dos anos de

1996 a 2004, sendo 40 isolados clínicos iniciais (CI), 60 isolados clínicos
não-iniciais (CNI) e 33 ambientais. Dos isolados clínicos, 79 % foram obtidos
de indivíduos com sorologia positiva para o HIV, 6 % com sorologia negativa
e 24 % não determinado. O tempo médio de isolamento para as amostras
CNI em relação ao seu respectivo isolado inicial (não utilizado neste
trabalho) foi de 3,8 meses, sendo o período mínimo de 1 mês e o máximo de
20 meses.
As amostras de origem clínica encontravam-se congeladas em
freezer à temperatura de - 20 °C (Nery et al., 1997) e foram repicadas por
duas vezes consecutivas em ágar Sabouraud dextrose, antes da realização
dos experimentos. Durante os experimentos, as amostras foram mantidas
nesse meio sob temperatura ambiente. Os isolados ambientais
encontravam-se cultivados em ágar Sabouraud à temperatura ambiente.
Todas as amostras foram repicadas e incubadas à temperatura de
35 °C (± 2 °C) por 48 h, antes da realização de cada experimento.
3.3. Estudo das Variedades de C. neoformans
As amostras foram repicadas em tubos contendo meio de cultura

canavanina-glicina-azul de bromotimol e incubadas a 35 °C por 72 horas
(Kwon-Chung et al., 1982). O aparecimento da cor azul intenso no tubo foi
indicativo da presença de C. neoformans variedade gattii.
A classificação tradicional da levedura em duas variedades:
C. neoformans var. neoformans e C. neoformans var. gattii foi utilizada no
presente trabalho.
46
3.4. Estudo de Fatores de Virulência de C. neoformans
3.4.1. Produção de Cápsula
As amostras foram avaliadas segundo sua capacidade de síntese

capsular, medida pela diferença da espessura da cápsula após cultivo em
ágar Sabouraud e em ágar Sabouraud diluído 1:10 com tampão ácido
morfolino propanosulfônico (MOPS) 50 mM, pH 7.3, conforme Zaragoza e
Casadevall (2004). O teste foi realizado em 2 fases:
Fase 1 – Padronização das condições do teste

Nesta fase foram utilizadas 12 amostras clínicas e 3 ambientais,
cultivadas no meio padrão caldo Sabouraud (CS) e no meio de indução
caldo Sabouraud diluído em MOPS (CSM), para determinar os parâmetros
favoráveis à execução do teste.
Variáveis analisadas:
a) Temperatura: as amostras foram inoculadas (inóculo da ordem
6
de 10 ufc/mL, por comparação à escala de McFarland) em 4 tubos, 2 deles
contendo 3 mL de CS e outros 2 tubos, 3 mL de CSM. Os tubos (um de cada
meio) foram incubados às temperaturas de 35 °C e 37 °C por até 72 horas,
com retirada de pequenas alíquotas a cada 24 h, para medir a espessura da
cápsula.
b) Agitação: os isolados foram inoculadas em duplicata em CS e
CSM e incubadas a 37 °C com e sem agitação por até 72 horas.
c) Tempo de incubação: Analisando-se os resultados dos testes
descritos em 1 e 2, definiu-se o tempo ideal de leitura dos resultados.
Fase 2 – Execução do teste

As amostras de C. neoformans foram inoculadas em tubos
contendo 3 mL de CS e CSM (inóculo da ordem de 106 ufc/mL) e mantidas
sob as condições estabelecidas na fase de padronização: incubação à
47
temperatura de 37 °C por 48 h, sem agitação. Após esse período de
incubação, uma alíquota da amostra (± 10 µL) foi colocada na superfície de
uma lâmina de microscopia, adicionada de uma gota de nigrosina (Merck,
Alemanha) e recoberta com uma lamínula de vidro. As lâminas foram
observadas ao microscópio óptico, sob aumento de 400 vezes, e
fotografadas com câmera digital, sob aumento adicional de 03 vezes. A
leitura foi feita com auxílio de uma ocular com régua graduada e do
programa Adobe Photoshop (versão 7.0, “Adobe Systems Incorporated”,
EUA).
A indução foi avaliada de modo qualitativo, segundo a capacidade
do isolado, quando cultivado no meio de indução CSM, em superar a
espessura de 1,0 micra: valor capsular máximo apresentado por 99 % dos
isolados cultivados no meio controle CS.
O potencial de resposta à indução foi definido como a intensidade
de síntese capsular no meio de indução, avaliado quantitativamente pela
medida da espessura da cápsula.
3.4.2. Produção de Fosfolipases
As amostras foram repicadas em placas de Petri contendo ágar

fosfolipase e incubadas a 35 °C por 5 dias (Price et al., 1982). O teste
positivo foi caracterizado pela presença de halo esbranquiçado ao redor da
colônia, resultante da formação de complexo entre fosfolipídios degradados
pela enzima e o cálcio presente no meio. No teste negativo, não há
formação do halo.
O diâmetro do halo foi medido com régua milimetrada para cálculo
de Pz segundo a fórmula:
Pz = dc/dcp
dc = o diâmetro da colônia (mm)
dcp = o diâmetro da colônia mais a zona de precipitação (mm)
48
Os resultados foram apresentados em código: valor 01 quando Pz
= 1,0, significa ausência de atividade enzimática; valor 02 quando 0,63 < Pz
< 1,0, significa presença de atividade e valor 03 quando Pz < 0,62, significa
atividade enzimática fortemente positiva. Quanto menor o Pz, maior a
atividade enzimática da amostra.
Utilizou-se como controle positivo a cepa-padrão Candida albicans
ICB 12A, gentilmente cedida pelo Laboratório de Leveduras Patogênicas do
Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, ICB-USP.
3.4.3. Produção de Proteinases
As amostras foram repicadas em placas de Petri contendo ágar

soroalbumina bovina, e incubadas a 35 °C por 5 dias (Ruchell et al., 1982).
O teste positivo foi caracterizado pela presença de halo transparente ao
redor da colônia, resultante da desnaturação da albumina do meio pela
proteinase. No teste negativo, não há formação do halo. O diâmetro do halo
foi medido para cálculo de Pz conforme descrito no item 3.4.2. Utilizou-se
como controle positivo a cepa-padrão Candida albicans ICB 12A.
3.4.4. Análise Estatística
Aplicou-se o teste T de Student e o teste exato de Fisher para

comparar as origens: clínica inicial, clínica não-inicial e ambiental, em
relação à produção de cápsula e à atividade enzimática extracelular. Os
testes foram realizados no programa Microsoft Excel edição 2003 (“Microsoft
Corporation”, EUA).
Considerou-se p<0,05 como o nível descritivo para indicar
diferença significativa entre os grupos estudados.
49
3.5. Seleção de Fenótipos Resistentes ao Fluconazol
O teste foi realizado com base na metodologia empregada por Xu

et al. (2001). A capacidade de crescimento na presença de fluconazol foi
avaliada em três fases: (i) triagem; (ii) seleção de fenótipos resistentes à
droga; (iii) verifcação da estabilidade e comparação genética do DNA dos
fenótipos resistentes com seus respectivos isolados de origem. O meio de
cultura utilizado nas duas primeiras fases foi o ágar batata (Remel, EUA),
contendo 8 µg/mL de fluconazol (Fz). Esta concentração foi escolhida por
ser aproximadamente igual aos níveis alcançáveis da droga no sistema
nervoso central (Brammer et al., 1990 apud Xu et al., 2001).
Fase de Triagem:
As 133 amostras de C. neoformans foram inoculadas em solução
salina com ajuste para turbidez equivalente à suspensão do tubo 0,5 da
escala de McFarland. A suspensão foi então diluída 1:100 em solução salina
estéril, para obter inóculo da ordem de 104 UFC/mL. Com auxílio de “swab”
estéril inoculou-se a suspensão salina da levedura por toda a superfície da
placa de ágar batata adicionado de Fz. Incubou-se por 72 horas. Cepa-
padrão de Candida parapsilosis (ATCC 22019) e Candida krusei (ATCC
6258) foram utilizadas, respectivamente, como controle de sensibilidade e de
resistência ao fluconazol.
Foram utilizadas na fase seguinte, somente as amostras que não
apresentaram crescimento visível no meio, ou seja, aquelas
presumivelmente sensíveis ao fluconazol.
Fase de Seleção de Fenótipos Resistentes:

As amostras selecionadas para esta fase foram repicadas em ágar
Sabouraud por 72 h. Com auxílio de alça descartável estéril, inoculou-se as
leveduras em tubos contendo 3 mL de caldo “Yeast Extract Peptone
Dextrose” - YEPD (Difco, EUA) e incubou-se em agitação (120 rpm) à
temperatura de 37 °C. Após 72 h, centrifugou-se (5.000 g por 5 minutos) e
50
lavou-se duas vezes com solução salina estéril. Ressuspendeu-se as células
em solução salina, ajustando a turbidez para o tubo 0,5 da escala de
McFarland. Em seguida, diluiu-se a suspensão na proporção de 1:100 em
solução salina, obtendo inóculo da ordem de 104 células/mL. Com auxílio de
“swab” estéril, as suspensões dos isolados da levedura foram inoculados por
toda a superfície de placas de ágar batata adicionado de Fz (8 µg/mL).
Incubou-se por até 7 dias. As amostras que apresentaram crescimento
visível a olho nú foram repicadas em YEPD a 37 °C por 48 horas e, em
seguida, foram submetidas ao teste de determinação da concentração
inibitória mínima (CIM) para o fluconazol, por microdiluição (NCCLS, 2002),
conforme descrito no item 3.6.
Fase de verificação da estabilidade e comparação genotípica dos

fenótipos de resistência ao fluconazol e os respectivos isolados de origem:
Após 1 e 2 meses da realização dos testes da fase anterior, nova
determinação da CIM das amostras foi realizada para verificar a estabilidade
do fenótipo resistente. Nesse período, as amostras foram mantidas em ágar
Sabouraud sem antifúngico, à temperatura de 35 °C.
A comparação do DNA dos fenótipos de resistência e seus
respectivos isolados de origem foi feita por RAPD utilizando 2 nucleotídeos
como iniciadores da reação de PCR, OPA-3 oligonucleotídeo 5’-AGT CAG
CCA C-3’ e OPA-17 oligonucleotídeo 5’-GAC CGC TTG T-3’. Esta etapa do
projeto foi realizada no Laboratório de Biologia Molecular da Universidade
Federal de Alfenas, sob a coordenação da Prof. Dr. Marília Caixeta Franco.
O DNA genômico dos isolados foi extraído conforme metodologia
descrita por Bolano et al. (2001). Os iniciadores OPA-3 e OPA-17 foram
sintetizados pela InvitrogenTM Life Technologies (InvitrogenTM, EUA).
A amplificação foi realizada em volumes de 25 µL contendo 25 ng
de DNA genômico, Tris-HCl (pH 8.3) 10 mM, 50 mM de KCl, 3,5 mM de
MgCl, 10 mM de cada base (dATP, dCTP, dTTP, e dGTP), 6 ng do iniciador
OPA-03, 24 ng do OPA-017 e 1 U de Taq DNA polimerase (InvitrogenTM,
EUA). As reações de PCR foram realizadas em termociclador Applied
51
Biosystems modelo 9700 (Applied Biosystems, EUA) com desnaturação
inicial em 97 °C por 3 min, seguida de 45 ciclos de 60 s a 93 °C, 60 s a 36
°C e 120 s a 72 °C. Para finalizar, ciclo de 5 minutos a 72 °C. Os produtos
de amplificação foram separados por eletroforese em gel de agarose a 2 %,
em tampão Tris-HCl-EDTA por 90 min a 100 V, e, em seguida, corados com
brometo de etídeo (0,1 µg/mL) para observação sob luz ultravioleta. Os géis
foram fotografados com sistema digital Kodak (modelo EDAS-290).
3.6. Perfil de Sensibilidade a Antifúngicos
O perfil de sensibilidade ao fluconazol, itraconazol (Iz), voriconazol

(vz) e anfotericina B (AB), de todos os isolados clínicos e ambientais de C.
neoformans, foi avaliado por microdiluição segundo 2 documentos:
referência M27-A2 (NCCLS, 2002) e documento E. Dis. 2.1 (EUCAST,
2002).
3.6.1. Antifúngicos
Fluconazol (Pfizer), voriconazol (Pfizer) e itraconazol (Janssen-

Cilag do Brasil) foram cedidos pelas empresas fabricantes. Anfotericina B foi
adquirida comercialmente (Sigma, EUA). Todos os antifúngicos foram
obtidos na forma de pó e, para execução do teste, soluções-estoque das
drogas foram preparadas conforme recomendado no documento M27A-2 do
CLSI (NCCLS, 2002).
Fluconazol foi dissolvido em água destilada estéril, obtendo-se
solução estoque na concentração de 5120 μg/mL. Voriconazol, itraconazol e
anfotericina B foram dissolvidos em dimetilsulfóxido para obtenção de
solução-estoque na concentração de 1600 μg/mL. Os antifúngicos em
solução foram mantidos em freezer à temperatura de -70 °C, em alíquotas
de 2 mL.
52
3.6.2. Meio de Cultura
Foi utilizado o meio sintético RPMI-1640 (Sigma, EUA) com

L-glutamina, sem bicarbonato de sódio e com indicador de pH vermelho de
fenol. O meio foi tamponado com ácido morfolino propanosulfônico - MOPS
(Sigma, EUA) em concentração final de 0,165 mol/L, pH 7,0 à temperatura
de 25 °C. Para o teste segundo as recomendações EUCAST, o meio foi
suplementado com glicose (2 %).
A esterilização do meio foi feita por filtração em membrana com
poros de 0,22 μm.
3.6.3. Preparo das Placas de Microtitulação
As soluções-estoque foram diluídas em série, de modo que as

concentrações finais dos antifúngicos variassem de 128 μg/mL a 0,3 μg/mL
para Fz e 16 μg/mL a 0,06 μg/mL para Vz, Iz e AB, em meio RPMI (CLSI) e
RPMI suplementado de glicose (EUCAST).
Foram utilizadas placas de microtitulação (Evergreen Scientific,
EUA) com 96 pocinhos e fundo plano. Cem microlitros de cada concentração
da droga a ser avaliada foram distribuídos em ordem decrescente nos
orifícios das colunas 2 a 11, com pipeta multicanal e ponteiras descartáveis
estéreis. As placas foram cobertas com películas plásticas aderentes
(Axygen Scientific, EUA), tampadas, acondicionadas em saco plástico e
congeladas à temperatura de -70 °C, até o momento do uso. As placas
contendo anfotericina B foram envolvidas em papel alumínio.
3.6.4. Inóculos
As 133 amostras de C. neoformans foram cultivadas em ágar

Sabouraud sem cloranfenicol e incubadas a 35 °C por 24 horas, para
preparo do inóculo. Com uma alça descartável, 1 a 5 colônias de cada
53
isolado da levedura foram suspensas em 5 mL de solução salina estéril. A
suspensão foi homogeneizada e a turbidez foi ajustada em
espectrofotômetro (530 nm), equivalente à do tubo 0,5 da escala de
McFarland.
Para o documento do CLSI, a suspensão foi diluída 1:50 em
solução salina estéril e em seguida diluída 1:20 em RPMI, para obtenção do
inóculo contendo 1 a 5 x 103 ufc/mL.
Pelo documento do EUCAST, a suspensão foi diluída 1:10 em
RPMI suplementado de glicose, obtendo-se inóculo com 1 a 5 x 105 ufc/mL.
3.6.5. Inoculação nas Placas de Microtitulação
Alíquotas de 100 µL de inóculo foram distribuídas nos pocinhos

das colunas de 2 a 11 das 8 fileiras da placa de microtitulação. Cada fileira
de A a F correspondeu a um isolado de C. neoformans (6 isolados por
placa). As fileiras G e H foram reservadas às cepas-padrão. Após a adição
do inóculo, o intervalo de concentrações finais das drogas nas placas foi de:
0,12 µg/mL a 64µg/mL para Fz e de 0,015 µg/mL a 8 µg/mL para Vz, Iz e
AB. A concentração final do inóculo foi de 0,5 a 2,5 x 103 ufc/mL para o CLSI
e 0,5 a 2,5 x 105 ufc/mL para o EUCAST.
A coluna 1 foi preenchida com 200 µL de RPMI em cada pocinho
(sendo o RPMI do mesmo lote utilizado para preparo do inóculo) e serviu
como controle negativo ou de esterilidade do meio. Essa coluna foi também
utilizada como “branco” do espectrofotômetro na leitura automatizada.
A coluna 12, utilizada como controle positivo ou de crescimento,
conteve 100 µL de meio RPMI e 100 µL de inóculo em cada pocinho. Essa
coluna permitiu a avaliação quantitativa do crescimento de cada isolado
durante o teste.
As placas foram homogenizadas por rotação em agitador de Klime
(Barnstead-Thermolyne, EUA), por 15 minutos a 60 rpm, e incubadas à
temperatura de 35 °C, sem agitação, por 48 horas (EUCAST) e 72 horas
(CLSI).
54
3.6.6. Controle de Qualidade
Utilizou-se em todos os testes e em todas as placas, as cepas-

padrão: Candida parapsilosis, ATCC 22019 e Candida krusei, ATCC 6258,
cujo perfil de sensibilidade é conhecido, com valores de CIM menores que 8
μg/mL e acima de 16 μg/mL para fluconazol, respectivamente.
3.6.7. Leitura e Interpretação dos Resultados
A leitura da turbidez resultante do crescimento dos inóculos, em

cada pocinho das placas foi realizada em espectrofotômetro (Titertek
Multiscan, Suécia) em comprimento de onda de 492 nm. Os resultados
foram impressos para análise e determinação da CIM.
O ponto final de leitura para obtenção do valor de CIM foi definido
para Fz, Iz e Vz, como a menor concentração na qual ocorreram 50 % de
inibição do crescimento do inóculo, em comparação com o pocinho da
coluna 12 (controle positivo). Para AB, o ponto final foi definido no pocinho
onde ocorreu inibição de pelo menos 95 % do crescimento, com a mesma
referência.
O ponto de corte considerado para separar isolados sensíveis de
resistentes foi de 16 μg/mL para o fluconazol (Aller et al., 2000), 1 μg/mL
para Iz (NCCLS, 1997) e 2 μg/mL para AB (Nolte et al., 1997). Para
voriconazol, os isolados com valores de CIM menores ou iguais a 1 μg/mL
foram classificados como sensíveis à droga (Espinel-Ingroff et al., 2005).
Ainda para Iz, isolados com CIM de 0,25 ou 0,5 μg/mL foram
classificados como SDD (NCCLS, 1997).
Os resultados obtidos segundo os documentos CLSI e EUCAST
foram considerados equivalentes quando apresentaram variação de, no
máximo, 2 diluições (Cuenca-Estrella et al., 2002).
55
4. Resultados
4.1. Amostras Selecionadas e Variedades
Na Tabela 1 encontra-se o resultado da análise das variedades

dos 133 isolados utilizados, segundo o grupo e procedência. Dentre os
isolados clínicos iniciais, foram encontrados 2 (5 %) isolados da variedade
gattii e 38 (95 %) da variedade neoformans. Os isolados clínicos não-iniciais
apresentaram 5 (8,3 %) isolados da variedade gattii e 55 (91,7 %) da
variedade neoformans. Para os isolados ambientais, foram encontrados 4
(12 %) e 29 (88 %) isolados das variedades gattii e neoformans,
respectivamente.
4.2. Cápsula
A Figura 1 exemplifica como foi realizado o registro da espessura

capsular das amostras.
Figura 1 – Blastoconídios de C. neoformans: cápsulas induzidas no meio de

cultura caldo Sabouraud diluído em tampão MOPS (1200 X).
56
Tabela 1 – Variedades, grupos de isolados e material de origem de 133
isolados de C. neoformans.
Isolado Origem Var. Isolado Origem Var. Isolado Origem Var.

Clínicas Iniciais
L44/96 Líquor N L76/99 Líquor N L68/02 Líquor N
L53/96 Líquor N L112/99 Líquor N L74/02 Líquor G
L02/97 Líquor N L207/00 Líquor N 84L/03 Líquor N
L108/98 Líquor N L174/01 Líquor G 86L/04 Líquor N
L39/99 Líquor N
Clínicas Não-iniciais
L15/96 Líquor N L148/98 Líquor N L91/01 Líquor G
1281/96 Líquor N L22/99 Líquor N L208/01 Líquor N
1592/96 Líquor N L42/99 Líquor N L293/01 Líquor G
1805/96 Líquor N L51/99 Líquor N L300/01 Líquor N
L46/97 Líquor G L83/99 Líquor N L49/02 Líquor N
89/97 Líquor N L144/99 Líquor N Afg299 Líquor N
579/97 Líquor N L251/99 Líquor N Afg302 Líquor N
1150/97 Líquor N L09/00 Líquor N 59L/03 Líquor G
1172/97 Líquor N L10/00 Líquor N 150L/03 Líquor N
1524/97 Líquor N L21/00 Líquor N 176L/03 Líquor G
Ambientais
A01 Fezes/pombo N A12 Ração/aves N A23 Fezes/pombo N
A04 Fezes/pombo N A15 Fezes/morcego N A26 Fezes/pombo N
A05 Fezes/pombo N A16 Fezes/pombo N A27 Fezes/pombo N
A06 Fezes/canário N A17 Fezes/pombo N A28 Fezes/pombo N
A07 Fezes/canário N A18 Fezes/pombo N A29 Fezes/pombo N
A08 Fezes/canário N A19 Fezes/pombo N A30 Eucalipto G
Legenda: Var.= Variedade, N = neoformans e G= gattii
57
Para os 40 isolados clínicos iniciais, os valores de espessura da
cápsula variaram de 0,5 a 0,8 µm no meio controle, caldo Sabouraud, e de
0,5 a 2,0 µm no meio de indução, caldo Sabouraud diluído em MOPS
(Anexo 1). Para os 60 isolados clínicos não-iniciais, os valores encontrados
variaram de 0,5 a 2,0 µm no meio controle e de 0,5 a 4,8 µm no meio de
indução (Anexo 2). Para os 33 isolados ambientais, os valores encontrados
variaram de 0,5 a 1,0 µm e de 0,5 a 2,5 µm nos meios controle e de indução,
respectivamente (Anexo 3).
Considerando a resposta à indução de cápsula, 28,3 % dos
isolados clínicos não-iniciais e 5 % dos clínicos iniciais responderam ao
teste. Dentre os isolados ambientais, 39,4 % foram induzidos (Tabela 2). Do
total de 133 amostras, 32 responderam ao teste. As Figuras 2, 3 e 4 ilustram
esses dados. Os valores, máximo e médio, de espessura da cápsula dos 32
isolados que responderam à indução constam da Tabela 2.
Tabela 2 – Resposta ao teste de indução de cápsula em 133 isolados de

C. neoformans. Espessura capsular de 32 isolados induzidos.
Espessura da cápsula (µm)

Grupo de origem n/N (%)
média máximo
Clínicos iniciais 02/40 (5,0) 2 2
Clínicos não-iniciais 17/60 (28,3) 2,14 4,8
Ambientais 13/33 (39,4) 1,2 2,5
Legenda: n = número de isolados com resposta positiva; N = número total de isolados.
De acordo com os resultados dos testes estatísticos, não houve

diferença significativa entre a intensidade de produção de cápsula no meio
de indução para os isolados clínicos iniciais e os ambientais. Diferença
significativa (p < 0,05) foi verificada entre a intensidade de produção de
cápsula dos isolados clínicos não-iniciais em relação aos outros grupos
estudados (Anexo 4).
58
5
4
Espessura capsular (µm)
0
1 Número 40
Núm erode
deisolados
cepas
Sabouraud + MOPS Sabouraud
Figura 2 – Espessura da cápsula de 40 isolados clínicos iniciais de

Sabouraud diluído em tampão MOPS.
4
0
1 Número de isolados 60
Núm ero de cepas
Figura 3 – Espessura da cápsula de 60 isolados clínicos não-iniciais de

59
5

4
0
1 30
Número de de
Núm ero isolados
cepas
Figura 4 – Espessura da cápsula de 33 isolados ambientais de

4.3. Fosfolipases e Proteinases Extracelulares
4.3.1. Fosfolipases
Todas as 133 amostras foram analisadas quanto à atividade

enzimática de fosfolipase extracelular (Anexo 5). No grupo dos isolados
clínicos iniciais, 17,5 % (7/40) não apresentaram atividade enzimática, 65 %
(26/40) apresentaram atividade positiva e 17,5 % apresentaram atividade
fortemente positiva (Figura 5). No grupo dos isolados clínicos não-iniciais,
16,7 % (10/60) não apresentaram atividade enzimática, 8 % (47/60)
apresentaram atividade positiva e 5 % (3/60) apresentaram atividade
fortemente positiva (Figura 6). Dentre os isolados ambientais, 21,2 % (7/33)
não apresentaram atividade enzimática, 60,7 % (20/33) mostraram atividade
positiva e 18,1 % (6/33) mostraram atividade fortemente positiva (Figura 7).
60
18% 18%
64%
Ausência de atividade
Atividade positiva
Atividade fortemente positiva
Figura 5 – Distribuição de 40 isolados clínicos iniciais de C. neoformans

segundo o perfil apresentado de atividade enzimática da fosfolipase.
5% 17%
78%
Atividade positiva
Figura 6 – Distribuição de 60 isolados clínicos não-iniciais de C. neoformans

61
18% 21%
61%
Atividade positiva
Figura 7 – Distribuição de 33 isolados ambientais de C. neoformans

O valor médio, desvio padrão e intervalo de Pz apresentado pelos

133 isolados de C. neoformans, segundo sua origem, constam da Tabela 3.
Tabela 3 – Análise da atividade enzimática (Pz) de fosfolipase extracelular

em 133 isolados de C. neoformans de diferentes origens.
Grupo de origem Média e desvio padrão Intervalo

Clínicos iniciais 0,77 ± 0,13 0,54 a 1,00
Clínicos não-iniciais 0,81 ± 0,11 0,57 a 1,00
Ambientais 0,77 ± 0,15 0,46 a 1,00
Não houve diferença significativa, pelo teste estatístico T de

Student, entre a atividade enzimática de fosfolipase para os grupos de
amostras estudados. O teste exato de Fisher revelou diferença significativa
entre o grupo de isolados ambientais e o de isolados clínicos não-iniciais
(Anexo 6).
62
4.3.2. Proteinases
Todas as 133 amostras de C. neoformans apresentaram resultado

negativo (Pz=1, código 1) no teste de avaliação da atividade de proteinase
extracelular (Figura 8).
A B
Figura 8 – Ilustração do resultado obtido no teste de produção de proteinase
extracelular. (A) Ausência de produção enzimática apresentada pelos 133
isolados de C. neoformans analisados. (B) Produção enzimática da cepa-
controle Candida albicans ICB 12A.
4.4. Seleção de Fenótipos Resistentes ao Fluconazol
Na fase inicial de triagem, do total de 133 isolados de C.

neoformans, 91,2 % deles foram capazes de crescer em ágar batata
adicionado de fluconazol (8 μg/mL). Somente 13 isolados (L15/96, L02/97,
L51/99, L10/00, L09/00, L208/01, L08/02, 184L/03, A02, A24, A25, A26, A29)
não apresentaram crescimento visível no período de incubação de 72 h,
sendo, portanto, utilizadas na fase seguinte do teste de seleção de fenótipos
resistentes.
Na fase de seleção, 7 (53,8 %) das 13 amostras triadas
mostraram-se capazes de crescer no meio contendo fluconazol e, por isso,
foram consideradas fenótipos de resistência à droga (Tabela 4). As amostras
que cresceram nessa fase apresentaram 2 perfis de crescimento: colônias
heterogêneas, ou seja, colônias grandes (> 3 mm) intercaladas com
63
pequenas; e colônias homogêneas, ou seja, de tamanho uniforme. Para as
amostras que apresentaram o perfil heterogêneo (Figura 9), 2 colônias foram
selecionadas, uma grande (G) e outra pequena (P), para o teste de
sensibilidade ao fluconazol por microdiluição (NCCLS, 2002). O mesmo
procedimento foi executado para as amostras com perfil homogêneo de
crescimento.
G
P
Figura 9 – Perfil de crescimento de C. neoformans em meio ágar batata

adicionado de fluconazol. Colônias pequenas (P) e colônias grandes (G).
Tabela 4 – Resultado da seleção de fenótipos resistentes de 13 isolados de

C. neoformans, cultivados em ágar batata adicionado de fluconazol.
Isolados Resultado Perfil de crescimento

Ident. Grupo
L15/96 Clínico não-inicial Positivo Heterogêneo
L02/97 Clínico inicial Positivo Heterogêneo
L51/99 Clínico não-inicial Positivo Heterogêneo
L09/00 Clínico não-inicial Negativo -
L08/02 Clínico inicial Positivo Heterogêneo
184L/03 Clínico não-inicial Negativo -
A02 Ambiental Positivo Homogêneo
A24 Ambiental Negativo -
A25 Ambiental Negativo -
Legenda: Ident. = Identificação.
64
Os resultados dos valores de CIM de fluconazol para os 7
fenótipos de resistência, antes e após a fase de seleção, estão apresentados
na Tabela 5. A estabilidade do fenótipo de resistência, pela manutenção do
valor de CIM, foi observada para 14 % (1/7) das amostras analisadas.
Tabela 5 – Valores de CIM de fluconazol (μg/mL) para 11 fenótipos

resistentes e seus respectivos isolados de origem, segundo a metodologia
CLSI de microdiluição em caldo.
Isolados de Fenótipos CIM CIM CIM

CIM inicial
origem resistentes (0) (1 mês) (2 meses)
1 (G) 16 8 1
L15/96 1
2 (P) 8 4 1
3 (G) 16 16 16
L02/97 2
4 (P) 4 8 8
5 (G) 8 16 1
L51/99 2
6 (P) 16 8 0,5
7 (G) 16 1 0,5
L08/02 0,5
8 (P) 64 2 2
A02 0,25 9 2 2 1
A26 0,12 10 4 2 0,5
A29 0,5 11 1 1 0,25

Legenda: (0), (1 mês) e (2 meses) = tempo decorrido desde a seleção dos fenótipos resistentes.
(G) e (P) = Isolados obtidos de colônias grandes (G) ou pequenas (P), apresentadas pelo isolado de origim
na fase de seleção de fenótipos resistentes. CIM = Concentração inibitória mínima da droga.
A análise genotípica por RAPD, dos 7 isolados originais e dos 11

fenótipos resistentes, está representada na Figura 10. Não houve
discrepância entre os padrões de bandas dos fenótipos resistentes e seus
respectivos isolados de origem. Além disso, o resultado também indicou
ausência de contaminação cruzada entre as amostras utilizadas no teste.
65
L15/96 L02/97 L51/99 L08/02 A02 A29 A26
OPA - 17
OPA - 3 1Kb O P G O P G O P G O P G O FR O FR O FR
Figura 10 – Perfis obtidos por RAPD, em gel de agarose 2%, de 7 isolados

de C. neoformans e 11 fenótipos resistentes, utilizando os iniciadores OPA-3
(5’-AGT CAG CCA C-3’) e OPA-17 (5’-GAC CGC TTG T-3’). O = isolado
original; P = fenótipo resistente de colônia pequena e G = fenótipo resistente
de colônia grande obtidos na placa de ágar batata adicionado de fluconazol;
FR = fenótipo resistente.
4.5. Perfil de Sensibilidade a Antifúngicos
O perfil de sensibilidade foi expresso em valores de CIM dos

antifúngicos frente aos 133 isolados de C. neoformans (Anexos 7, 8 e 9). As
cepas controle Candida parapsilosis ATCC 22019 e Candida krusei ATCC
6258 apresentaram valores de CIM dentro dos limites esperados.
66
4.5.1. Fluconazol
Os valores de CIM de fluconazol (Fz) variaram de 0,125 a 32

μg/mL para CLSI e entre 0,125 a 64 μg/mL para EUCAST, para o total de
133 amostras de C. neoformans. Para o grupo de isolados clínicos iniciais,
clínicos não-iniciais e ambientais, os dados estão apresentados na Tabela 6.
Os valores de CIM50 e CIM90 para Fz foram respectivamente, 2 μg/mL e 8
μg/mL com o documento do CLSI e 4 μg/mL e 16 μg/mL com EUCAST
(Tabela 7). Os valores para os diferentes grupos de isolados estão
apresentados na Tabela 8.
Do total de 133 amostras, os resultados obtidos segundo o
documento do CLSI, classificam 122 (91,7 %) como sensíveis e 11 (8,3 %)
como resistentes ao Fz. Segundo EUCAST, 118 (88,7 %) foram sensíveis e
15 (11,3 %) foram resistentes à droga (Figura 11). O perfil de sensibilidade
frente ao Fz de cada grupo de amostra está representado na Figura 12.
Segundo o documento do CLSI, os isolados clínicos iniciais foram
classificados como 87,5 % (35/40) sensíveis e 12,5 % resistentes, os
isolados clínicos não-iniciais foram 90 % (54/60) sensíveis e 10% resistentes
e os isolados ambientais foram 100 % (33/33) sensíveis. Para EUCAST, os
isolados clínicos iniciais foram 92,5 % (37/40) sensíveis e 7,5 % resistentes,
os isolados clínicos não-iniciais foram 83,3 % (50/60) sensíveis e 16,7 %
resistentes, e os isolados ambientais foram 94 % (31/33) sensíveis e 6 %
resistentes.
67
Tabela 6 – Intervalos de CIM (μg/mL) de 4 antifúngicos obtidos para 133
isolados de C. neofomans, de acordo com as metodologias CLSI e EUCAST
de microdiluição em caldo e o grupo de origem dos isolados.
Grupos\Antifúngicos Fluconazol Itraconazol Voriconazol Anfotericina B

Clínicos iniciais
CLSI 0,125 a 32 0,015 a 0,25 0,015 a 0,125 0,015 a 1
EUCAST 0,25 a 16 0,015 a 0,5 0,015 a 0,25 0,03 a 1
Clínicos não-iniciais
CLSI 0,125 a 32 0,015 a 0,25 0,015 a 0,25 0,015 a 1
EUCAST 0,125 a 64 0,015 a 0,5 0,015 a 0,25 0,015 a 0,5
Ambientais
CLSI 0,125 a 8 0,015 a 0,125 0,015 a 0,06 0,015 a 1
EUCAST 0,25 a 16 0,015 a 0,25 0,015 a 0,06 0,015 a 0,5

voriconazol e anfotericina B, para 133 isolados de C. neoformans,
submetidos ao teste de sensibilidade a antifúngicos segundo as
metodologias CLSI e EUCAST de microdiluição em caldo.
Fluconazol Itraconazol Voriconazol Anfotericina B

Metodologia
CIM50 CIM90 CIM50 CIM90 CIM50 CIM90 CIM50 CIM90
CLSI 2 8 0,015 0,125 0,03 0,125 0,25 0,5
EUCAST 4 16 0,03 0,25 0,03 0,125 0,125 0,25
68
voriconazol e anfotericina B, para os diferentes grupos de origem de 133
isolados de C. neoformans e segundo as metodologias CLSI e EUCAST de
microdiluição em caldo.
Fluconazol Itraconazol Voriconazol Anfotericina B

Metodologia
CIM50 CIM90 CIM50 CIM90 CIM50 CIM90 CIM50 CIM90
Clínicos iniciais
CLSI 4 16 0,03 0,25 0,06 0,125 0,25 0,5
EUCAST 4 8 0,06 0,25 0,03 0,06 0,25 0,5
C. não-iniciais
CLSI 4 8 0,015 0,125 0,03 0,125 0,5 1
EUCAST 4 16 0,03 0,25 0,03 0,125 0,125 0,5
Ambientais
CLSI 2 4 0,015 0,125 0,015 0,03 0,125 0,25
EUCAST 4 8 0,03 0,125 0,015 0,06 0,125 0,25
100% 8,30% 11,30%
75%
91,7% 88,70%
50%
25%
0%
CLSI EUCAST
Sensível Resistente

C. neoformans, submetidos aos testes de sensibilidade a antifúngicos,
segundo as metodologias CLSI e EUCAST de microdiluição em caldo.
69
100%
75%
50%
25%
0%
CI CNI A CI CNI A
NCCLS
CLSI EUCAST

CNI = clínicos não-iniciais e A = ambientais.
4.5.2. Itraconazol
Os valores de CIM de itraconazol (Iz) variaram de 0,015 a 0,25

μg/mL nos testes segundo o CLSI e de 0,015 a 0,5 μg/mL nos testes
segundo EUCAST, para o total de 133 amostras de C. neoformans. Para os
grupos de isolados estudados, os dados estão apresentados na Tabela 6.
Os valores de CIM50 e CIM90 para a droga foram, respectivamente,
0,015 μg/mL e 0,12 μg/mL segundo o CLSI e 0,03 μg/mL e 0,25 μg/mL
segundo EUCAST (Tabela 7). Os valores para os diferentes grupos de
isolados estão apresentados na Tabela 8.
Do total de amostras, segundo o documento do CLSI, 122
(91,7 %) foram sensíveis e 11 (8,3 %) foram sensíveis dependentes da dose
(SDD) ao Iz. Para EUCAST, 109 (82 %) foram classificadas como sensíveis
e 24 (18 %) foram classificadas como SDD (Figura 13).
70
92%
100% 82%
75%
50%
18%
25%
8%
0% 0%
0%
NCCLS
CLSI EUCAST
Sensível SDD Resistente
Figura 13 – Perfil de sensibilidade ao itraconazol, de 133 isolados de

A Figura 14 apresenta os perfis de sensibilidade frente ao Iz de

cada grupo de isolados. Segundo o documento do CLSI, os isolados clínicos
iniciais foram classificados como 87,5 % (35/40) sensíveis e 12,5 % SDD, os
isolados clínicos não-iniciais foram 90 % (54/60) sensíveis e 10 % SDD e os
isolados ambientais foram 100 % (33/33) sensíveis.
No protocolo EUCAST, as isolados clínicos iniciais foram
classificadas como 77,5 % (31/40) sensíveis e 22,5 % SDD, as isolados
clínicos não-iniciais foram 76,7 % (46/60) sensíveis e 23,3 % SDD e as
isolados ambientais foram 96,9 % (31/33) sensíveis e 3,1 % SDD.
71
Sensível SDD
100%
75%
50%
25%
0%
CI CNI AMB CI CNI AMB
NCCLS
CLSI EUCAST
Figura 14 – Perfil de sensibilidade a itraconazol de 133 isolados de

CNI = isolados clínicos não-iniciais e AMB = ambientais.
4.5.3. Voriconazol
Os valores de CIM de Voriconazol (Vz) variaram de 0,015 a 0,25

μg/mL para o total de 126 3 isolados de C. neoformans, segundo os
documentos CLSI e EUCAST. Para o grupo de isolados clínicos iniciais,
clínicos não-iniciais e ambientais, os dados estão apresentados na Tabela 6.
Os valores de CIM50 e CIM90 para Vz foram respectivamente, 0,03 μg/mL e
0,125 μg/mL tanto para o documento do CLSI, como para o EUCAST
(Tabela 7). Os valores para os diferentes grupos de isolados estão
apresentados na Tabela 8.
Todas as amostras foram sensíveis ao voriconazol, segundo
ambos os documentos (Figura 15).
3
Do total de 133 isolados, 07 perderam a viabilidade conforme discriminado nos anexos 7 e 8.
72
100% 100%
100%
75%
50%
25%
0% 0%
0%
NCCLS
CLSI EUCAST
EUCAST
Figura 15 – Perfil de sensibilidade ao voriconazol de 126 isolados de

4.5.4. Anfotericina B
Os valores de CIM para anfotericina B (AB) variaram de 0,015 a 1

μg/mL segundo ambas as metodologias, para as 133 amostras de C.
neoformans. Para o grupo de isolados clínicos iniciais, clínicos não-iniciais e
ambientais, os dados estão apresentados na Tabela 6.
Os valores de CIM50 e CIM90 para a droga foram respectivamente,
0,25 μg/mL e 0,5 μg/mL segundo o documento do CLSI e 0,12 μg/mL e 0,25
μg/mL segundo EUCAST (Tabela 7). Os valores para os diferentes grupos
de cepas estão apresentados na Tabela 8.
Todas as amostras foram sensíveis à AB, por ambas as
metodologias (Figura 16).
73
100% 100%
100%
75%
50%
25%
0% 0%
0%
NCCLS
CLSI EUCAST
EUCAST
Figura 16 – Perfil de sensibilidade à anfotericina B de 133 isolados de

4.5.5. Concordância entre os Resultados CLSI e EUCAST
A concordância entre os dois documentos, avaliada pelos

resultados de CIM para as amostras de C. neoformans, está apresentada na
Tabela 9 para fluconazol, Tabela 10 para itraconazol, Tabela 11 para
voriconazol e Tabela 12 para anfotericina B.
74
Tabela 9 – Comparação dos valores de CIM de fluconazol obtidos pelas
de C. neoformans.
Concordância CLSI – EUCAST

Grupo de isolados Exata Diferença de Diferença de
[n] uma diluição duas diluições
n(%) n(%) n(%)
Clínicos iniciais 09(22,5)a 16(40,0)a 08(20,0)a
[40] 25(62,5)b 33(82,5)b
Clínicos não-iniciais 22(36,7) 24(40,0) 08(13,3)
[60] 46(76,6) 54(90,0)
Ambientais 08(24,2) 15(45,5) 03(09,1)
[33] 23(69,7) 26(78,8)
Total 39(29,3) 55(41,4) 19(14,3)
[133] 94(70,7) 103(85,0)
Legenda: n= número de isolados. (a) = frequência isolada, (b) = frequência acumulada dentro de cada grupo de
isolados.
Tabela 10 – Comparação dos valores de CIM de itraconazol obtidos pelas

de C. neoformans.
Concordância CLSI – EUCAST

Grupo de isolados Exata Diferença de Diferença de
n(%) n(%) n(%)
[40] 17(42,5)b 29(72,5)b
[60] 40(66,7) 51(85,0)
Ambientais 14(42,4) 09(27,3) 05(15,2)
[33] 23(69,7) 28(84,8)
Total 40(30,1) 41(30,8) 28(21,1)
[133] 81(60,9) 109(82,0)
Legenda: n= número de isolados, (a) = frequência isolada, (b) = frequência acumulada dentro de cada grupo de
isolados.
75
Tabela 11 – Comparação dos valores de CIM de voriconazol obtidos pelas
de C. neoformans.
Concordância CLSI - EUCAST

Grupos de isolados Exata Diferença de Diferença de
n(%) n(%) n(%)
[36] 32(88,8)b 36(100)b
[57] 54(94,8) 57(100)
Ambientais 18(54,5) 12(36,4) 03(9,1)
[33] 30(90,9) 33(100)
Total 70(55,6) 46(36,5) 10(7,9)
[126] 116(92,1) 126(100)
Legenda: n=número de isolados, (a) = frequência isolada, (b) = frequência acumulada dentro de cada grupo de
isolados.
Tabela 12 – Comparação dos valores de CIM de anfotericina obtidos pelas

de C. neoformans.
Concordância CLSI - EUCAST

Grupos de isolados Exata Diferença de Diferença de
n(%) n(%) n(%)
[40] 33(82,5)b 37(92,5)b
[60] 33(55,0) 53(88,3)
Ambientais 13(39,4) 13(39,4) 05(15,1)
[33] 26(78,8) 31(93,9)
Total 34(25,6) 59(44,4) 29(21,8)
[133] 93(69,9) 122(91,7)
Legenda: n=número de isolados, (a) = frequência isolada, (b) = frequência acumulada dentro de cada grupo de
isolados.
Dentro do critério de diferença de até duas diluições, a

concordância de resultados de CIM de fluconazol, para o total de 133
76
isolados, foi de 85 %, sendo para o grupo de isolados clínicos iniciais,
não-iniciais e ambientais, respectivamente, de 82,5 %, 90 % e 78,8 %
(Figura 17). No geral, não houve concordância entre os documentos para
15 % dos isolados. Para itraconazol, esse valor foi de 18 %, sendo que a
concordância entre as metodologias para os isolados clínicos iniciais, não-
iniciais e ambientais, respectivamente, foi de 72,5 %; 85 % e 84,8 %.
Para voriconazol, a concordância geral, assim como a dos grupos
de isolados, foi de 100 %.
Para anfotericina B, a concordância geral foi de 99,3 %. Entre os
grupos de isolados, a concordância foi de 92,5 % para os isolados clínicos
iniciais, 88,3 % para clínicos não-iniciais e 93,9 % para o grupo dos
ambientais.
A Tabela 13 apresenta detalhadamente a variação entre os
valores de CIM, obtidos pelas duas metodologias, para os antifúngicos
utilizados. É possível observar o número exato e a porcentagem de isolados
para os quais os valores de CIM do CLSI e EUCAST foram iguais, mais
elevados pelo CLSI ou mais elevados pelo EUCAST.
100%
92%
100% 85% 82%
80%
Concordância
60%
40%
20%
0%
Fluconazol Itraconazol Voriconazol Anfotericina
Antifúngicos
77
Figura 17 – Concordância geral dos resultados de CIM, obtidos pelas
de C. neoformans, segundo o critério de diferença de até duas diluições.
Tabela 13 – Distribuição dos isolados por diferença de diluições entre os

valores de CIM, obtidos pelas metodologias CLSI e EUCAST, nos testes de
sensibilidade a antifúngicos por microdiluição em caldo.

Metodologia ≠CIM
n(%) n(%) n(%) n(%)
EUCAST 3 13(09,8) 18(13,5) - 01(00,8)

> 2 12(09,0) 18(13,5) 03(02,4) 03(02,2)
CLSI
1 31(23,3) 27(20,3) 12(09,5) 18(13,5)
CLSI =
EUCAST 0 39(29,3) 40(30,1) 70(55,6) 34(25,6)
CLSI 1 24(18,0) 14(10,5) 34(27,0) 41(30,8)

> 2 09(06,8) 10(07,5) 07(05,5) 26(19,5)
EUCAST
3 05(03,8) 06(04,5) - 10(07,5)
Total 133(100) 133(100) 126(100) 133(100)
Nota: ≠CIM – diferença em diluições dos resultados de CIM; n = número de isolados.
78
5. Discussão
Embora sua frequência tenha diminuído nos últimos anos,

principalmente nos Estados Unidos e Europa, a criptococose continua a ser
infecção humana importante, associada a taxas substanciais de mortalidade,
geral e atribuída, em indivíduos imunocomprometidos, com ou mesmo sem
AIDS (Darzé et al., 2000; Pappas et al., 2001; Pappalardo e Melhem, 2003;
Bicanic e Harrison, 2005).
A evolução clínica da doença depende de diversos fatores que
podem ser divididos em clínicos e microbiológicos, para efeito de
entendimento e estudo (Witt et al., 1996; Pappas et al., 2001; Sanglard,
2002). Os fatores clínicos são os principais e focam o próprio hospedeiro,
como estado imunológico, por exemplo. Haja vista que o comprometimento
da imunidade celular é o principal fator predisponente para infecção por C.
neoformans, com aumento importante dos casos da doença após o advento
da AIDS e a utilização de drogas imunossupressoras (Mitchell e Perfect,
1995; Bicanic e Harrison, 2005). No entanto, fatores microbiológicos, como
resistência ao antifúngico e virulência do agente etiológico, podem
desempenhar importante papel na doença, podendo representar a diferença
entre sucesso e falha terapêutica em muitos casos (Kelly et al., 1994; Alves
et al., 1997; Berg, 1998; Buchanan e Murphy, 1998; Fries e Casadevall,
1998; Aller et al., 2000; Sukroongreung et al., 2001; Friese et al., 2001;
Sanglard, 2002; Rodero et al., 2003).
No presente estudo, com foco nos apectos microbiológicos,
diferentes grupos de isolados foram selecionados com o objetivo de
caracterizar a virulência e resistência, particularmente ao fluconazol, de 133
amostras de C. neoformans. O grupo de isolados clínicos iniciais permitiu a
avaliação de tais parâmetros microbiológicos antes do tratamento e sua
comparação ao grupo de isolados clínicos não-iniciais, expostos à terapia
antifúngica e obtidos durante o curso infeccioso da doença. Como estudos
moleculares demonstraram que a maioria dos casos de recorrência, durante
a terapia de manutenção para criptococose, ocorre por persistência da cepa
79
inicial e não por re-infecção com uma nova cepa de C. neoformans (Mitchell
e Perfect, 1995; Brandt et al., 1996; Casadevall e Perfect, 1998; FIMUA,
2002; Rodero et al., 2003), optou-se por utilizar isolados oriundos de
pacientes distintos, de modo que, os isolados clínicos iniciais são,
teoricamente, diferentes dos isolados não-iniciais. Dessa forma, foi possível
descrever as características de virulência e resistência em um grupo maior
de isolados.
O grupo de isolados ambientais indicou o que seriam,
teoricamente, os parâmetros inatos da levedura, ampliando-se assim a
possibilidade de comparação e discussão dos resultados.
Em relação às variedades da levedura deste estudo, a grande

maioria dos isolados foi identificada como pertencente à variedade
neoformans, tanto no grupo de isolados clínicos (93 %), como ambientais
(88 %). C. neoformans var. neoformans é agente cosmopolita, sendo
encontrado em todas as regiões do mundo, enquanto C. neoformans var
gattii encontra-se limitado às áreas tropicais e subtropicais (Kwon-Chung e
Bennet, 1992; Casadevall e Perfect, 1998). No Brasil, ocorre predomínio de
C. neoformans var. neoformans (sorotipo A), seja em amostras clínicas ou
ambientais (Ohkusu et al., 2002; Nishikawa et al., 2003; Pappalardo e
Melhem, 2003).
Na grande maioria dos casos, a criptococose em pacientes com
AIDS, é causada pela variedade neoformans mesmo em regiões endêmicas
para a variedade gattii (Mitchell e Perfect, 1995; Lin e Heitman, 2006).
C. neoformans var. gattii geralmente infecta indivíduos imunocompetentes,
agindo como patógeno primário (Casadevall e Perfect, 1998; Lin e Heitman,
2006). Entretanto, criptococose em pacientes com AIDS, causada por essa
variedade, também pode ocorrer (Fernandes et al., 2000; Nishikawa et al.,
2003; Vivaldini, 2003).
Em relação aos isolados ambientais, os achados aqui
apresentados estão de acordo com dados da literatura, que mostram forte
associação da variedade neoformans e fezes de pombos e outras aves
80
(Kwon-Chung e Bennet, 1992; Casali et al., 2001), além de fezes de
morcegos (Montagna et al., 2003); e da variedade gattii e folhas de eucalipto
(Ellis e Pfeiffer, 1990). Dados semelhantes foram encontrados por outros
pesquisadores brasileiros (Montenegro e Paula, 2000; Filiú et al., 2002;
Horta et al., 2002; Resende, 2002; Cruz, 2004; Soares et al., 2005).
Alguns autores buscaram relacionar o tamanho da cápsula, em

cultura, e virulência de C. neoformans. No entanto, observou-se que em
condições de cultivo tradicional, a levedura apresenta tamanho de cápsula
reduzido (Zaragoza e Casadevall, 2004). Além disso, foi levantada a
hipótese de que C. neoformans tende a apresentar cápsula pequena,
quando isolado de pacientes com AIDS (Bottone et al., 1986a),
provavelmente, devido à baixa resposta imunológica nesses hospedeiros
(Bottone e Wormser, 1986). De outro modo, o agente quando isolado de
pacientes com a imunidade preservada, pode apresentar-se fortemente
capsulado (Love et al., 1985; Bottone et al., 1986b).
Neste trabalho, foi utilizado meio de indução, ágar Sabouraud
diluído em tampão MOPS (Zaragoza e Casadevall, 2004), buscando avaliar
o potencial virulento dos isolados, em comparação ao cultivo em ágar
Sabouraud, meio de cultura tradicionalmente utilizado na rotina laboratorial.
A fase de triagem do teste mostrou que a indução da cápsula
ocorre nas células do inóculo e não nas gerações seguintes. Além disso, não
houve diferença significativa no tamanho da cápsula considerando
temperatura (35 °C ou 37 °C) e agitação. Dessa forma, optou-se pelos
parâmetros nos quais a proliferação de células é mais lenta. Sabendo-se
ainda, que o aumento de CO2 no meio favorece o crescimento capsular,
estabeleceu-se temperatura de 37 °C sem agitação, como parâmetros
favoráveis para o teste.
Em relação ao tempo de incubação, observou-se que entre 24 h e
48 h ainda há aumento da cápsula para alguns isolados. No entanto, ocorre
também aumento do número de células filhas. Em 72 h, existe um número
81
elevado de células filhas, o que dificulta a visualização das células induzidas.
Definiu-se então, 48 h como tempo ideal para leitura dos resultados.
O meio de indução permitiu a identificação de isolados com alto
potencial para síntese capsular, verificado pelo aumento de até 5,6 vezes no
tamanho da cápsula, comparado com o meio ágar Sabouraud.
Fries e Casadevall (1998) estudaram a virulência de cepas
seriadas de C. neoformans isoladas de pacientes com AIDS. Foram
observadas diferenças quanto a habilidade de persistir “in vivo”, virulência
em camundongos, taxa de crescimento “in vitro” a 37 °C e produção de
cápsula. Verificou-se, entre outros resultados, que a produção de cápsula foi
ligeiramente maior na cepa denominada J33b (diâmetro da cápsula ±1,3
µm), isolada 8 dias após a cepa J33a (± 0,9 µm). Os autores concluíram pela
ocorrência de microevolução em C. neoformans durante a infecção em
humanos que, possibilitando o escape à erradicação pelo sistema
imunológico, é uma das causas possíveis da persistência do agente em
casos de criptococose.
No presente estudo, verificou-se maior potencial de resposta no
grupo de isolados clínicos não-iniciais (cápsula de até 4,8 µm), seguido do
grupo de isolados ambientais (cápsula de até 2,5 µm) e isolados clínicos
iniciais, com cápsulas menores (diâmetro máximo de 2,0 µm). Estes
resultados sugerem maior virulência, segundo esse fator, em isolados
persistentes durante a progressão da doença.
O percentual de resposta para produção de cápsula foi maior
para as isolados ambientais (39 %) e clínicos não-iniciais (28 %), enquanto
somente 5 % das isolados clínicos iniciais responderam à indução. Esse
percentual poderia refletir maior capacidade de síntese capsular dos
isolados ambientais e clínicos não-iniciais, decorrentes da seleção de cepas
melhor adaptadas às condições adversas presentes no meio ambiente, tais
como competição microbiana de bactérias e ação de amebas de vida livre
(isolados ambientais), ou mecanismos de defesa do hospedeiro durante o
curso da infecção (isolados clínicos). Steenberg et al. (2001) estudaram a
interação entre C. neoformans e ameba de vida livre (Acanthamoeba
82
castellanii). Segundo os autores, os resultados sugeriram que a virulência da
levedura, para células de hospedeiros mamíferos, é consequência de
adaptações que surgiram para proteção contra predadores no meio
ambiente, tais como as amebas.
Garcia-Hermoso et al. (2004) estudaram variações na estrutura
da cápsula de C. neoformans durante infecção induzida em camundongo e
cultivo prolongado “in vitro”. Os autores observaram que, durante o cultivo “in
vitro”, a diversidade entre a estrutura capsular dos clones da cepa C45 era
maior após 35 dias de incubação, sugerindo ausência de seleção no cultivo.
Em contraste, no modelo animal, a diversidade entre os clones tendeu a
diminuir com a progressão da doença, sugerindo que a seleção de
organismos mais adaptados havia ocorrido. Além disso, após 35 dias de
infecção, cepas isoladas do baço e pulmão apresentavam fenótipos
diferentes das cepas isoladas do cérebro do mesmo animal. Os autores
concluíram que os diferentes fenótipos teriam resultado da pressão seletiva
exercida pelo organismo hospedeiro, que varia dependendo do órgão
infectado.
Rivera et al. (1998) verificaram que a espessura capsular é órgão-
dependente em modelo animal, sendo maior em tecidos do que em cultivo
“in vitro” em caldo Sabouraud. Trabalhando com a cepa de C. neoformans
ATCC 24067, eles observaram que a espessura capsular “in vitro” das
células utilizadas para inocular os animais era de 2,8 ± 1,4 µm e, de modo
distinto, os isolados obtidos de cérebro e pulmão dos animais possuíam
espessura capsular muito maior (8,4 ± 3,9 µm e 20,0 ± 6,1 µm),
respectivamente.
Baroni (2001) estudou amostras ambientais de C. neoformans em
meio ágar Sabouraud. O autor atribuiu às amostras códigos de 0 a 3, de
acordo com a produção de cápsula estimada por observação sob
microscopia óptica. Apesar de não ser possível análise quantitativa dos
valores de espessura da cápsula obtidos pelo autor, pode-se concluir pela
diversidade no tamanho capsular apresentado pelas isolados ambientais,
assim como foi observado na presente pesquisa.
83
Chen et al. (1996) foram os primeiros pesquisadores a verificar a
associação entre produção de fosfolipase e virulência em C. neoformans,
pela quantificação da levedura no cérebro e pulmão de camundongos
inoculados com cepas de diferentes perfis de produção enzimática. Estudos
moleculares, incluindo cepas mutantes não produtoras de fosfolipase,
confirmaram a associação da enzima e virulência de C. neoformans (Cox et
al., 2001).
A produção de fosfolipase, no presente trabalho, foi observada
em 82 % das amostras analisadas, sendo que atividade fortemente positiva
foi observada em apenas 12 % do total. Vidotto et al. (1996) avaliaram a
produção de fosfolipase em 23 isolados clínicos de C. neoformans,
encontrando alto valor (97 %) de positividade, com quase metade (48 %) dos
isolados apresentando perfil de atividade enzimática fortemente positiva.
Estes autores utilizaram período de incubação de 6 dias, período
semelhante ao utilizado no presente trabalho. Cruz (2004) encontrou
porcentagem geral de positividade (85 %) semelhante, porém, com grande
diferença na capacidade das cepas, sendo todas classificadas no perfil
fortemente positivo. No entanto, essa disparidade de resultados pode ser
explicada porque, diferentemente do presente trabalho, a pesquisadora
utilizou período maior de incubação (15 dias), favorecendo a produção da
enzima.
Vidotto et al. (2005) avaliaram a atividade enzimática extracelular
e os sorotipos de 151 amostras brasileiras de C. neoformans isoladas de
pacientes portadores de AIDS. Os autores verificaram produção de
fosfolipase após 4, 6 e 8 dias de incubação. No quarto dia de incubação,
31 % das cepas possuíam valor de Pz entre 0,699 – 0,400 e no oitavo dia, o
percentual de cepas, com valor de Pz nesse intervalo, aumentou para 80 %.
A título de comparação de resultados, considerando esse mesmo intervalo
de valores de Pz e após 5 dias de incubação, na presente pesquisa,
somente 19 % dos isolados clínicos conseguiram atingir esses valores.
84
Considerando os grupos de isolados clínicos estudados, a
positividade da enzima foi igual nos 2 grupos (82 % para CI e 83 % para
CNI). No entanto, o perfil fortemente positivo foi encontrado em 18 % dos
isolados clínicos iniciais e em apenas 5 % dos isolados clínicos não-iniciais.
Essa diferença poderia refletir a importância da enzima na fase inicial de
infecção, como observado por Santangelo et al. (2004), no estudo do
envolvimento da fosfolipase extracelular na disseminação da criptococose
em modelo animal.
Em relação à origem das cepas, Vidotto et al. (2000) observaram
maior produção da enzima em cepas clínicas (Pz = 0,65 ± 0,21) do que em
ambientais (Pz = 0,90 ± 0,15). No presente trabalho, não houve diferença
significativa considerando a produção enzimática dos isolados clínicos,
iniciais e não-iniciais, (Pz = 0,79 ± 012) e ambientais (Pz = 0,77 ± 015) de
C. neoformans.
As amostras ambientais apresentaram 79 % de positividade de
fosfolipase, com 18 % do total apresentando atividade fortemente positiva.
Baroni (2001) encontrou 91 % de positividade para esta enzima em 87
amostras de C. neoformans isoladas de fezes de pombos e 46 % delas
apresentaram atividade fortemente positiva. Entretanto, o período de
incubação utilizado por esse autor, foi maior (10 dias). Silva (2002),
utilizando 62 das 87 cepas isoladas por Baroni, inoculou camundongos e
comparou a produção enzimática após passagem “in vivo”. A positividade
foi de 83 %, dentre as cepas isoladas dos animais que foram a óbito, sendo
observada atividade fortemente positiva em 80 % dos isolados. Tal fato
sugere a importância da enzima na infecção pela levedura.
Em relação à proteinase, Aoki et al. (1994) analisaram sua

produção em 8 cepas clínicas de C. neoformans isoladas de pacientes com
AIDS. Os autores cultivaram a levedura, em meio sólido e líquido de “Yeast
Carbon Base”, contendo soroalbumina bovina e polipeptona, verificando que
todas as cepas eram capazes de utilizar a proteína como fonte de nitrogênio,
mas, o acréscimo de polipeptona favorecia o crescimento das leveduras e a
85
expressão da atividade proteolítica. Em 2000, Vidotto et al. observaram que
a produção em cepas clínicas (Pz = 0,76 ± 0,19) e ambientais (Pz = 0,72 ±
0,22) de C. neoformans era semelhante, quando cultivadas em meio sólido
contendo soroalbumina bovina, conforme método de Aoki et al. (1994).
Dentre as 19 cepas clínicas analisadas, 79 % apresentou atividade
proteolítica, e dentre as 16 isolados ambientais o percentual também foi alto
(81 %).
No Brasil, Resende (2002), trabalhando com amostras obtidas de
fezes de pombos e pássaros cativos, observou a produção da enzima em
40 % das amostras estudadas. Resultado semelhante foi encontrado por
Cruz (2004), que observou 37 % de amostras ambientais produtoras da
enzima. O mesmo autor (Cruz, 2004) estudou também cepas clínicas e
verificou produção enzimática em 31 % das amostras, sendo que todas
foram classificadas como fortemente produtoras, após período prolongado
de incubação (14 dias).
No presente estudo, não foi detectada atividade proteolítica em
nenhuma das 133 amostras de C. neoformans analisadas. Este resultado
está em concordância com o observado por Baroni (2001), que também não
encontrou atividade de proteinase em 87 isolados ambientais da levedura.
Silva (2002) estudando 62 das 87 cepas isoladas por Baroni, verificou que
apenas 20 % (de 62) tornaram-se produtoras, após passagem em animais
de experimentação.
Diferente dos resultados encontrados no presente trabalho,
Vidotto et al. (2005), trabalhando com 151 amostras brasileiras de C.
neoformans, isoladas de pacientes portadores de AIDS, verificaram atividade
proteolítica em 100 % das amostras, logo no terceiro dia de incubação. Após
o oitavo dia, mais de 80 % das cepas possuía atividade fortemente positiva
(Pz médio de 0,33). Esses pesquisadores ressaltam a importância dessas
análises em estudos epidemiológicos e avaliação de virulência entre cepas
de diferentes origens geográficas, quando associadas ao estudo de outras
enzimas. No entanto, é difícil definir a real importância da produção de
proteinase, haja vista a discrepância entre os resultados obtidos por
86
diferentes autores, que podem ter ocorrido por variações metodológicas, ou
mesmo por alta variação na produção dessa enzima por C. neoformans.
Chen e Casadevall (1999) estudaram a virulência de isolados da
cepa de C. neoformans ATCC 24067, com alta e baixa atividade proteolítica
extracelular, por inoculação em camundongos. Os isolados possuíam
virulência equivalente para diversos outros fatores, como produção de
cápsula, melanina e taxa de crescimento à temperatura de 37 °C. No
entanto, os resultados não revelaram relação consistente entre alta
produção da enzima e maior virulência no modelo animal estudado.
Essas diferenças no perfil enzimático “in vitro”, bem como as
implicações da produção de proteinase “in vivo”, apontam para a
necessidade de novos estudos em relação à produção dessa enzima por
C. neoformans, conforme anteriormente reconhecido (Aoki et al., 1994;
Buchanan e Murphy, 1998; Chen e Casadevall, 1999; Vidotto et al., 2005).
Os procedimentos relacionados à seleção de clones resistentes a

fluconazol são particularmente úteis na avaliação do potencial das cepas de
C. neoformans, ambientais ou clínicas, em desenvolver um ou mais
mecanismos de resistência, após cultivo na presença da droga.
Mondon et al. (1999) investigaram a ocorrência de resistência a
fluconazol e voriconazol, por cultivo em meio contendo diversas
concentrações dos antifúngicos, em subpopulações clonais de 7 cepas
clínicas de C. neoformas, sendo 6 destas, isolados seriados de um mesmo
paciente. Os autores verificaram que cada isolado produzia culturas com
composição heterogênea, nas quais a maioria das células era sensível às
drogas, porém, foi possível isolar leveduras altamente resistentes ao
fluconazol (CIM = 100 µg/mL) e moderadamente resistentes ao voriconazol
(CIM = 1 µg/mL). No entanto, após cultivo em meio isento de droga, estes
isolados reverteram ao fenótipo sensível inicial. Os pesquisadores sugeriram
que o fenômeno, denominado heterorresistência, parece ser inato, ou seja,
independente de exposição prévia à droga, uma vez que uma das cepas
87
resistentes foi isolada de paciente não-portador de AIDS e nunca tratado
com fluconazol.
No presente estudo, tanto os isolados clínicos como os
ambientais, após crescimento em meio contendo fluconazol, apresentaram
subpopulações com sensibilidade antifúngica diferente do isolado original.
No entanto, uma única passagem no meio adicionado de fluconazol, foi
suficiente para que a CIM do antifúngico frente aos isolados clínicos
alcançasse valores de até 64 µg/mL, muito maiores do que os obtidos para
os isolados ambientais (até 4 µg/mL). Este dado sugere que a exposição
prévia à droga é um fator importante na seleção de subpopulações
resistentes.
Na placa de ágar batata contendo fluconazol, todos os isolados
clínicos apresentaram padrão heterogêneo de crescimento, mesclando na
superfície do ágar, colônias grandes (G) e colônias pequenas (P). O teste de
microdiluição revelou diferença, de até 3 diluições, nos valores de CIM de
fluconazol frente às colônias G e P, originadas de um único isolado. No
entanto, não houve correlação entre os tamanhos das colônias e
sensibilidade, maior ou menor, à droga.
A avaliação do genótipo dos isolados por RAPD revelou que não
haviam diferenças entre os padrões obtidos pelos fenótipos resistentes e os
isolados de origem, confirmando a identidade dos mesmos, bem como das
colônias G e P. Além disso, excluiu-se a possibilidade de contaminação
cruzada entre as amostras do teste, pelas diferenças entre os perfis de
bandas dos diferentes isolados.
Yamazumi et al. (2003) verificaram a ocorrência de
heterorresistência em 107 cepas clínicas de C. neoformans. Do total,
4 (3,7 %) cepas foram capazes de crescer no meio de cultura contendo
concentrações de fluconazol, 4 a 8 vezes maiores que a CIM do antifúngico
para a amostra. Uma quinta cepa, que possuía CIM de 32 µg/mL, foi capaz
de crescer no meio contendo 64 µg/mL da droga. Passagens subsequentes
em meio de cultura com concentrações crescentes de fluconazol (até 128
µg/mL), resultou na seleção de clones com CIM >64 µg/mL para as cinco
88
cepas analisadas. Os pesquisadores, frente a esses resultados, ressaltaram
que a resistência antifúngica ao fluconazol em C. neoformans pode ocorrer
por seleção em populações heterorresistentes e indução por exposição ao
azol. Os dados desta dissertação confirmam os achados desses autores.
Assim como todos os isolados analisados por Mondon et al.
(1999) e Yamazumi et al. (2003), 86 % dos isolados aqui analisados
reverteram ao fenótipo sensível inicial, após passagem em meio de cultura
sem fluconazol. Somente uma amostra (L02/97) apresentou estabilidade do
fenótipo resistente.
Xu et al., (2001) analisaram 101 amostras de C. neoformans,
conforme metodologia que foi base para o presente trabalho. Na fase de
triagem, 20,7 % (21/101) das amostras não apresentaram crescimento no
meio de cultura “Yeast Morphology Agar” contendo 8 µg/mL de fluconazol.
Em comparação, no presente trabalho, 9,8 % (13/133) das amostras não
foram capazes de crescer no meio adicionado do antifúngico. Na fase
seguinte, a grande maioria das amostras (18/21 amostras; 85,7 %)
selecionadas por aqueles autores desenvolveram colônias no meio,
resultado superior ao obtido na presente pesquisa (7/13 amostras; 53,8 %).
Todos os clones selecionados naquele trabalho apresentaram estabilidade
do fenótipo resistente e foram por isso, classificados como mutantes. Os
autores concluíram que a alteração que determina o fenótipo de resistência
ao fluconazol, “in vitro”, é decorrente de um processo dinâmico e
heterogêneo e que, possivelmente, existem múltiplos mecanismos
envolvidos.
Apesar de que, no presente trabalho, clones dos isolados
ambientais tenham crescido no meio adicionado de 8 µg/mL de fluconazol,
os valores de CIM obtidos para esses clones foram relativamente baixos,
sendo inferiores a 8 µg/mL. Xu et al. (2001) também encontraram 2 isolados,
após a fase de seleção, para os quais os valores de CIM de fluconazol foram
baixos (0,5 e 1 µg/mL). Estes achados poderiam ser explicados pela
capacidade de algumas cepas em produzir adaptações fisiológicas
89
temporárias ou tolerância transiente ao fluconazol, conforme alertado pelos
próprios autores.
Ocorre grande diversidade no comportamento de isolados de
C. neoformans quando expostos ao fluconazol, não só pela possibilidade do
surgimento ou seleção de cepas resistentes, mas também pela habilidade de
crescer em ágar contendo o antifúngico em concentrações superiores à CIM
da droga. Os múltiplos mecanismos que podem estar envolvidos merecem
ainda muito estudo, até serem esclarecidos, como salientado anteriormente
por diversos autores (White et al., 1998; Mondon et al., 1999; Xu et al., 2001;
Sanglard et al., 2002; Yamazumi et al., 2003).
O amplo interesse no conhecimento da sensibilidade aos

antifúngicos, do agente da criptococose, pode ser avaliado pela razoável
produção científica a esse respeito. No entanto, pode-se notar que, no
Brasil, a informação ainda é limitada e, além disso, a avaliação acurada dos
resultados publicados pelos diversos autores, incluindo internacionais, é
prejudicada pela diversidade das metodologias empregadas, como métodos
comerciais ou alternativos não validados (Franzot e Handam, 1996;
Brummer et al., 1998; Nakamura et al., 1998; Burgess et al., 2000; Rodero et
al., 2000; Calvo et al., 2001; Pfaller et al., 2001; Horta et al., 2002; Roling et
al., 2002; Cuenca-Estrella et al., 2003; Fernandes et al., 2003; Moraes et al.
2003; Archibald et al., 2004; Chandenier et al., 2004; Cuenca-Estrella et al.,
2004; Miller et al., 2004; Pfaller et al., 2004; Trilles et al., 2004; Kobayashi et
al. 2005; Larsen et al., 2005; Nooney et al., 2005; Pfaller et al., 2005; Soares
et al., 2005).
Soma-se a essas dificuldades, o fato de serem raros os trabalhos
que correlacionam valores de CIM e resultados da terapia em pacientes com
criptococose. Witt et al. (1996) avaliaram a relação entre a sensibilidade de
C. neoformans ao fluconazol, associada a diferentes variáveis clínicas, e
risco de falha terapêutica em pacientes com meningite criptocóccica aguda e
AIDS. A probabilidade de falha terapêutica em paciente com hemocultura
positiva e CIM para fluconazol acima 8 µg/mL foi superior a 80 %, no
90
entanto, a administração de 5-fluorocitosina combinada ao azol, reduz o
risco pela metade.
Aller et al. (2000) correlacionaram os valores de CIM para
fluconazol, frente a 28 cepas de C. neoformans, com a resposta clínica de
25 pacientes com criptococose e AIDS, à terapia de manutenção. Os autores
concluíram que a probabilidade de sucesso terapêutico na fase de
manutenção é maior quando o valor de CIM de fluconazol, frente ao agente
etiológico, é menor que 16 µg/mL. Do total de pacientes, 20 % apresentaram
falha terapêutica e, em todos esses casos, as cepas isoladas apresentaram
CIM maior ou igual a 16 µg/mL.
Berg et al. (1998) avaliaram 2 casos de criptococose em pacientes
com AIDS, sob profilaxia com fluconazol durante 4 anos. Todas as cepas
isoladas após esse período apresentaram CIM para o antifúngico de
16 µg/mL ou 32 µg/mL. Os autores alertam para a possibilidade do
surgimento de resistência pelo uso prolongado do fluconazol. Essa hipótese
também foi sugerida por outros autores (Brandt et al, 1996; Alves et al.,
1997; Friese et al., 2001; Momoff e Parrish, 2003; Rodero et al., 2003; Sar et
al., 2004).
No presente estudo, a maioria das amostras foi classificada como
sensível ao fluconazol, por ambos os métodos empregados. Foi encontrada
resistência, tomando-se como critério valores de CIM ≥16 µg/mL, em apenas
8,3 % dos isolados, analisadas pelo documento do CLSI, e em taxa similar,
de 11,3 %, quando avaliadas pelo documento EUCAST.
No Brasil, vários pesquisadores estudaram a sensibilidade de C.
neoformans, proveniente de diversas origens, frente a vários antifúngicos e
por diferentes métodos (Franzot e Handam, 1996; Baroni, 2001; Calvo et al.,
2001; Silva, 2002; Pappalardo, 2002; Fernandes et al., 2003; Moraes et al.
2003; Vivaldini, 2003; Soares, 2004; Trilles et al., 2004; Kobayashi et al.
2005; Soares et al., 2005; Souza et al., 2005; Dias et al., 2006b). Em vários
estudos, a maioria dos isolados clínicos apresenta sensibilidade “in vitro” a
fluconazol, itraconazol e anfotericina B. Em contrapartida, resistência à 5-
fluorocitosina chega a 50 % dos isolados, quando a droga é utilizada em
91
monoterapia. Em isolados ambientais, anfotericina B e itraconazol são os
antifúngicos mais efetivos. Para fluconazol, cerca de 25 % dos isolados
apresentam baixa sensibilidade à droga, conforme revisão de Pappalardo e
Melhem (2003). Para voriconazol, ainda pouco avaliado em isolados
brasileiros de C.neoformans, foi observado alta sensibilidade da levedura
(Trilles et al., 2004; Soares et al., 2005; Souza et al., 2005), com achado de
somente um isolado resistente (CIM = 4 µg/mL) dentre os 100 isolados
clínicos estudados por Dias et al. (2006b).
Alves et al. (2001) estudaram o perfil de sensibilidade a
antifúngicos de 69 amostras clínicas e 13 amostras ambientais de
C. neoformans com base na metodologia CLSI M27-A. Os intervalos de
CIMs em relação à origem dos isolados foram iguais, tanto para fluconazol,
quanto itraconazol e anfotericina B, sendo respectivamente, 1 a 16 µg/mL;
0,03 a 0,25 µg/mL e 0,06 a 0,5 µg/mL. Resultado diferente do observado no
presente trabalho, em que, somente para anfotericina B, o intervalo de CIM
(0,015 a 1 µg/mL) foi igual para isolados clínicos e ambientais. Frente a
fluconazol os isolados clínicos apresentaram intervalo superior (0,12 a
32 µg/mL), em comparação aos isolados ambientais (até 8 µg/mL).
Entretanto, tomando-se como ferramenta de análise o valor de CIM
necessária para inibir 50 % dos isolados, ou CIM50, para Alves et al. (2001),
fluconazol foi mais ativo contra isolados ambientais (CIM50= 0,5 µg/mL) do
que frente a isolados clínicos (CIM50= 2 µg/mL). A análise de sensibilidade
ao fluconazol, pelo critério de CIM50, permite a mesma conclusão para os
dados encontrados neste trabalho.
Moraes et al. (2003) avaliaram 49 amostras de C. neoformans pela
metodologia CLSI M27-A. Os autores encontraram os seguintes intervalos
de CIM: para fluconazol, 0,12 a 16 µg/mL; itraconazol, 0,03 a 2 μg/mL e
anfotericina B, 0,03 a 1 μg/mL. Esses resultados são semelhantes, para
fluconazol e anfotericina B, aos obtidos no presente trabalho, quais sejam,
intervalos de CIM de 0,12 a 32 µg/mL e 0,015 a 1 µg/mL, respectivamente,
para cada droga. Para itraconazol, por sua vez, os valores de CIM (0,015 a
0,25 μg/mL) foram menores do que os relatados para Moraes et al. (2003).
92
Trilles et al. (2004) avaliaram a sensibilidade de 87 amostras de
C. neoformans frente a 9 antifúngicos pelo documento M27-A2 do CLSI. O
intervalo de CIM encontrado para fluconazol foi de 1 a 64 µg/mL, para
itraconazol de 0,03 a 0,5 µg/mL, para voriconazol de 0,03 a 1 µg/mL e para
anfotericina B foi de 0,25 a 2 µg/mL. Todos os valores foram mais elevados,
independentes da droga avaliada, se comparados aos encontrados no
presente trabalho. Uma possível razão, da menor sensibilidade verificada
por aqueles autores, pode ser a alta proporção de isolados da variedade
gattii (65,5 %), presente naquele estudo. De fato, Chen et al. (2000)
estudaram diferenças na infecção e perfil de sensibilidade das variedades de
C. neoformans e verificaram que a variedade gattii apresenta sensibilidade
reduzida à terapia antifúngica, quando comparada à variedade neoformans.
Soares (2004), pelo documento CLSI M27-A2, também encontrou
sensibilidade reduzida para fluconazol (8 a 64 µg/mL) em 40 cepas clínicas e
ambientais de C. neoformans var. gattii. Para itraconazol e anfotericina B, as
cepas foram sensíveis, com valores de CIM entre 0,015 e 0,12 µg/mL e 0,12
e 0,25 µg/mL, respectivamente.
O maior estudo sobre sensibilidade de isolados ambientais, foi
realizado por Kobayashi et al. (2005), que analisaram 209 amostras de
C. neoformans, pelo documento CLSI M27-A2, frente ao fluconazol,
itraconazol e anfotericina B. Os intervalos de CIM foram, respectivamente,
de 0,12 a 2 µg/mL; 0,007 a 0,12 µg/mL e 0,015 a 0,12 µg/mL; indicando alta
sensibilidade dos isolados. No presente trabalho, as amostras ambientais
mostraram-se, ligeiramente, menos sensíveis para essas drogas, com os
seguintes intervalos de CIM para fluconazol, 0,12 a 8 µg/mL; itraconazol,
0,015 a 0,12 µg/mL e anfotericina B, 0,015 a 1 µg/mL. No entanto, ainda
com esses valores, todas os isolados ambientais foram classificadas como
sensíveis aos 3 antifúngicos, assim como no trabalho daqueles autores.
Souza et al. (2005) avaliaram a sensibilidade de 70 isolados
clínicos e 40 ambientais de C. neoformans, pelo documento CLSI M27-A2,
frente aos mesmos antifúngicos utilizados no presente trabalho. Os
intervalos de CIM, para os isolados clínicos, foram de 0,125 a 8 μg/mL para
93
fluconazol; 0,03 a 0,5 μg/mL para itraconazol; 0,03 a 0,25 μg/mL para
voriconazol e 0,06 a 1 μg/mL para anfotericina B. Para os isolados
ambientais, os valores de CIM form de 0,25 a 2 μg/mL para fluconazol; 0,015
a 0,125 μg/mL para itraconazol e voriconazol; e 0,015 a 0,125 μg/mL para
anfotericina B. Valores semelhantes foram obtidos na presente pesquisa,
exceto para fluconazol, onde verifica-se a presença de isolados com menor
sensibilidade à droga, em relação àquele trabalho, tanto para isolados
clínicos quanto ambientais.
Em relação à metodologia EUCAST, os intervalos de CIM
encontrados para os 133 isolados de C. neoformans foram equivalentes ao
CLSI, quais sejam 0,12 a 64 µg/mL para fluconazol; 0,015 a 0,5 µg/mL para
itraconazol e 0,015 a 1 µg/mL para anfotericina B. Resultado semelhante foi
encontrado por Pappalardo (2002) em 168 amostras de C. neoformans,
isoladas de 35 pacientes com AIDS, que apresentaram intervalos de CIM de
0,25 a 32 µg/mL para fluconazol; 0,06 a 0,12 µg/mL para itraconazol e 0,06 a
0,5 µg/mL para anfotericina B. Resistência a fluconazol (CIM ≥16 µg/mL) foi
encontrada nos isolados de 4 (11 %) dos 35 pacientes do trabalho. Taxa de
resistência igual à encontrada na presente pesquisa.
Vivaldini (2003) avaliou o perfil de sensibilidade de 46 amostras
clínicas de C. neoformans, isoladas de 13 pacientes, frente a fluconazol,
itraconazol, anfotericina B e 5-fluorocitosina, segundo o documento
EUCAST. Os valores de CIM variaram de 1 a 32 µg/mL para fluconazol; de
0,06 a 2 µg/mL para itraconazol; de 0,25 a 1 µg/mL para anfotericina B e de
1 a 16 µg/mL para 5-fluorocitosina. Resistência a fluconazol, considerando
valores de CIM ≥16 µg/mL, foi encontrada nos isolados de 2 (15,3 %) dos 13
pacientes do estudo. Assim como no presente trabalho, resistência “in vitro”
a anfotericina B não foi encontrada. No entanto, valores altos de CIM de
itraconazol (1 ou 2 µg/mL), foram obtidos para 52,2 % dos isolados. No
presente estudo, não foi encontrada resistência (CIM ≥ 1 µg/mL) para
itraconazol, no entanto, 18 % dos isolados foram classificados como SDD
por apresentarem CIM de 0,25 ou 0,5 µg/mL.
94
Soares (2004), pelo documento EUCAST, encontrou intervalo de
CIM semelhante ao do presente trabalho para três dos antifúngicos aqui
analisados: 0,25 a 64 µg/mL para fluconazol; 0,015 a 0,5 µg/mL para
itraconazol e 0,015 a 0,12 µg/mL para anfotericina B.
Soares et al. (2005) estudaram a sensibilidade a antifúngicos de
11 amostras de C. neoformans, isoladas de fezes de pombo, segundo
metodologia EUCAST. Todas as cepas foram sensíveis ao itraconazol,
voriconazol e anfotericina B, com respectivos intervalos de CIM de 0,015 a
0,06 µg/mL; 0,015 a 0,25 µg/mL e 0,25 a 1 µg/mL. No presente estudo, os
isolados ambientais apresentaram intervalos semelhantes para essas
drogas, com CIM variando de 0,015 a 0,25 µg/mL para itraconazol, de 0,03 a
0,125 µg/mL para voriconazol e de 0,015 a 0,5 µg/mL para anfotericina B.
Para fluconazol, naquele trabalho, 9 % dos isolados foram classificados
como resistentes (CIM = 64 µg/mL), sendo o restante, inibidas à
concentração igual ou menor que 8 µg/mL. No presente trabalho, baixa
porcentagem de isolados ambientais (6 %) classificadas como resistentes
(CIM = 16 µg/mL) foi igualmente observada.
Dias et al. (2006b) avaliaram a sensibilidade a antifúngicos de 100
isolados clínicos de C.neoformans, segundo a metodologia EUCAST, em um
estudo comparativo da referida metodologia em relação aos resultados
obtidos pelo sistema comercial E-test (AB Biodisk, Suécia). Os intervalos de
CIM obtidos pela metodologia EUCAST para fluconazol, itraconazol,
voriconazol e anforeticina B, foram respectivamente: 0,12 a 64 µg/mL; 0,015
a 0,25 µg/mL; 0,015 a 4 µg/mL e 0,03 a 4 µg/mL. Valores semelhantes foram
observados na presente pesquisa somente para fluconazol e itraconazol,
sendo que os valores encontrados para voriconazol e anfotericina B são
mais elevados, inclusive em relação aos demais trabalhos brasileiros aqui
referenciados. Entretanto, todos os isolados classificados como resistentes
para voriconazol ou anfotericina B (pelo método EUCAST) foram
classificados como sensíveis pelo E-test, naquele trabalho. Os próprios
autores sugerem que os isolados classificados como resistentes devem ser
reavaliados, repetindo-se o teste, ou pelo emprego de outros métodos.
95
A análise comparativa entre as metodologias CLSI e EUCAST
permitiu verificar boa concordância (acima de 80 %) entre os resultados,
para todos os antifúngicos utilizados. Cuenca-Estrella et al. (2002) avaliaram
a concordância entre as 2 metodologias na determinação da sensibilidade a
antifúngicos de isolados de Candida spp e encontraram concordância de
80 % a 100 %, segundo o antifúngico analisado. No presente trabalho, os
melhores resultados de concordância foram obtidos para voriconazol
(100 %) e anfotericina B (92 %), seguidos do fluconazol (85 %) e, por fim, do
itraconazol (82 %).
Alves (2004) avaliou a concordância entre os documentos do CLSI
e EUCAST para cepas de várias espécies do gênero Candida, segundo o
mesmo critério, qual seja, diferença máxima de 2 diluições. Os autores
obtiveram os seguintes índices: anfotericina B, 100 % para todas as
espécies analisadas, fluconazol, de 91 a 100 % e itraconazol, de 79 a
100 %, segundo a espécie analisada.
Espinel-Ingroff et al. (2005), em estudo multicêntrico, avaliaram a
correlação entre as metodologias CLSI M27-A2 e EUCAST E.Dis.7.1 para
fluconazol, itraconazol, voriconazol e posaconazol, frente a 71 isolados de
Candida sp. A concordância para fluconazol foi de 89 a 100 % e para
itraconazol foi de 81 a 100 %, dependendo da espécie. Para os demais
azóis, a concordância geral foi acima de 85 %. A reprodutibilidade
interlaboratorial também foi elevada (>92 %) para ambos os métodos.
Neste mesmo trabalho, Espinel-Ingroff et al. (2005) verificaram
que, quando as cepas são classificadas segundo os pontos de corte
estabelecidos pelo CLSI, a correlação e concordância entre as duas
metodologias ficam menores. Além disso, foi verificada tendência de
obtenção de valores de CIM mais baixas por EUCAST para os triazóis, em
relação àqueles obtidos pela metodologia do CLSI. Os autores concluíram
que os pontos de corte estabelecidos pelo CLSI não devem ser utilizados
para interpretação dos resultados quando se utiliza a metodologia EUCAST.
96
Na presente pesquisa, com a utilização dos pontos de corte aqui
selecionados, os valores de CIM obtidos pela metodologia EUCAST
permitiram maior discriminação entre os diferentes grupos de isolados
estudados. Obeservou-se maior sensibilidade ao fluconazol e itraconazol
para o grupo de isolados ambientais, seguido do grupo de isolados clínicos
iniciais e, por fim, do grupo de isolados clínicos não-iniciais. Tal fato poderia
refletir uma maior probabilidade de obtenção de valores de CIM mais
elevados em cepas isoladas após exposição à terapia antifúngica, em
relação às demais.
Para voriconazol, a concordância entre os métodos foi alta e
semelhante à encontrada por Espinel-Ingroff et al. (2005). O resultado de
100 % de sensibilidade dos isolados frente à droga reflete a sua forte
atividade antifúngica “in vitro”, como observado por diversos autores
(Espinel-Ingroff, 1998; Pfaller et al., 1999; Chang et al., 2004; Pfaller et al.,
2004; Trilles et al., 2004; Pfaller et al., 2005; Soares et al., 2005; Souza et
al., 2005; Dias et al., 2006b).
Em relação à anfotericina B, a concordância entre os métodos foi
alta, com 100 % de sensibilidade de todos os isolados para a droga. Apesar
da alta concordância, parece que nenhuma das metodologias está
totalmente adequada para detectar isolados resistentes de C. neoformans ao
antifúngico, sendo que modificações da metodologia ou mesmo o emprego
de outros métodos estão sendo avaliados (Lozano-Chiu et al., 1998; Brandt
et al., 2001; NCCLS, 2002).
Em termos técnicos, o aumento do inóculo foi uma grande
vantagem observada no documento E.Dis.7.1 do EUCAST, que permitiu
antecipar os resultados em 24 h em relação ao documento M27-A2 do CLSI,
além de maior facilidade e rapidez no seu preparo. Por outro lado, o
aumento da concentração de glicose parece ser favorável apenas no caso
de leveduras fermentadoras, como Candida albicans (Rodriguez-Tudella e
Martinez-Suarez, 1994). A leitura espectrofotométrica foi utilizada para
ambas as metodologias, por eliminar a subjetividade e permitir o registro
automatizado dos resultados (Pfaller et al., 1995). O registro automatizado
97
proporciona rastreabilidade e permite que os resultados sejam re-analisados
por diferentes critérios.
A necessidade de realização dos testes de sensibilidade é
incontestável para monitorar isolados resistentes causadores de infecção. A
metodologia mais adequada para isso, no entanto, será aquela que
possibilitar melhor correlação entre os dados obtidos “in vitro” e os
resultados “in vivo” da terapia antifúngica. Nesse sentido, o agente da
criptococose carece de estudos metodológicos e da definição de critérios
para interpretação de resultados, como pontos de corte (“breakpoints”), que
possibilitem a referida correlação.
98
6. Conclusão
• Isolados clínicos não-iniciais foram capazes de maior produção de

cápsula do que os iniciais ou isolados ambientais.
• A produção de fosfolipase foi semelhante nos 3 grupos estudados.

Porém, o perfil de atividade enzimática fortemente positiva foi maior
nos isolados clínicos iniciais, em relação aos não-iniciais.
• Não foi detectada produção de proteinase extracelular em nenhum

dos isolados analisados.
• O teste de seleção de fenótipos resistentes ao fluconazol possibilitou

o isolamento de clones resistentes à droga em 54 % das amostras
avaliadas, sendo positivo para os 3 grupos estudados.
• Foi encontrada baixa resistência para fluconazol, em torno de 10 %,

dos isolados, segundo ambos os documentos, CLSI e EUCAST, cuja
concordância foi considerada boa (85 %) para a droga.
• Não foi encontrada resistência para Itraconazol. No entanto, houve

percentual razoável de cepas classificadas como SDD (20 %) pelo
documento EUCAST e em menor índice (8 %) pelo CLSI. A taxa de
concordância entre os documentos foi a menor (82 %), em relação às
outras drogas.
• A concordância entre os documentos CLSI e EUCAST foi alta para

voriconazol (100 %) e anfotericina B (92 %). Os testes de
sensibilidade a antifúngicos revelaram 100 % de sensibilidade dos
isolados frente a essas drogas.
99
7. Considerações Finais
O estudo de fatores de virulência e resistência a antifúngicos,

nos diferentes grupos de isolados de C. neoformans, possibilitou a
identificação de padrões distintos nestes aspectos, associados às origens
das amostras. Possivelmente, existem mecanismos múltiplos que, em
função do meio ao qual o fungo encontra-se exposto, levam à expressão de
diferentes fatores, como produção de cápsula e fosfolipase. Tais fatores,
isolados ou não, contribuem para a patogenicidade e persistência da
levedura no organismo hospedeiro, constituindo elementos importantes para
o desenvolvimento de novas estratégias de controle da criptococose.
100
8. Referências Bibliográficas
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9. Anexos
Anexo 1 – Espessura capsular (μm) de 40 isolados clínicos iniciais de

C. neoformans cultivados em dois meios de cultura.
Amostra CS CSM Amostra CS CSM

L44/96 0,5 0,8 L308/00 0,5 0,5
L53/96 0,5 0,5 L03/01 0,5 0,8
L91/96 0,5 0,5 L117/01 0,5 0,5
L169/96 0,5 1,0 L174/01 0,5 2,0
L02/97 0,5 0,5 L263/01 0,5 0,5
L19/97 0,5 0,5 L270/01 0,5 0,5
L116/97 0,5 0,5 L08/02 0,5 0,5
L08/98 0,5 0,5 L68/02 0,5 0,5
L78/98 0,5 0,5 L174/02 0,5 2,0
L108/98 0,5 0,5 L92/02 0,5 0,5
L113/98 0,5 0,5 L121/02 0,5 0,5
L122/98 0,5 0,5 84L/03 0,8 0,5
L13/99 0,5 0,5 102L/03 0,5 0,5
L39/99 0,5 0,5 128L/03 0,5 0,5
L76/99 0,5 0,5 358L/03 0,5 0,5
L112/99 0,5 0,5 77L/04 0,5 0,5
L47/00 0,5 0,8 86L/04 0,5 0,5
L101/00 0,5 0,5 92L/04 0,5 0,5
L207/00 0,5 0,5 127L/04 0,5 0,8
L273/00 0,5 1,0 202L/04 0,5 0,5
Legenda: CS = Caldo Sabouraud, CSM = Caldo Sabouraud diluído em MOPS.
Anexo 2 - Espessura capsular (µm) de 60 isolados clínicos não-iniciais de
C. neoformans cultivados em dois meios de cultura.

L15/96 0,5 0,8 L21/00 0,5 0,5
L159/96 0,5 1,8 L50/00 0,5 0,5
1281/96 0,5 0,5 L57/00 0,5 0,5
1592/96 0,8 2,0 L266/00 0,5 0,5
1805/96 0,5 0,5 L18/01 0,5 0,5
L46/97 0,5 0,5 L23/01 0,5 2,0
89/97 0,5 0,5 L48/01 0,5 0,5
579/97 0,5 1,5 L52/01 0,8 4,5
1150/97 0,5 2,0 L61/01 0,5 0,5
1172/97 0,5 1,5 L71/01 0,5 0,5
1524/97 0,5 1,2 L91/01 0,8 3,0
1549/97 0,5 0,5 L102/01 0,5 0,5
1606/97 0,5 2,0 L208/01 0,5 0,5
1707/97 0,5 0,5 L293/01 0,5 0,5
L20/98 0,5 1,2 L300/01 0,5 0,8
L46/98 0,5 0,8 L49/02 0,5 0,5
L91/98 0,5 0,5 Afg299 0,5 2,0
L106/98 0,5 0,8 Afg302 0,5 1,8
L142/98 0,8 0,5 59L/03 2,0 4,8
146/98 0,5 0,5 150L/03 0,5 0,5
L148/98 0,5 1,0 176L/03 0,5 2,0
L149/98 0,5 0,8 181L/03 0,5 1,2
L22/99 0,5 0,5 184L/03 0,5 0,5
L42/99 0,5 0,8 191L/03 0,5 0,5
L51/99 0,5 1,0 195L/03 0,5 0,5
L83/99 1,0 0,8 202L/03 0,5 0,5
L144/99 0,5 0,5 220L/03 0,5 0,8
L251/99 0,5 0,5 49L/04 0,5 0,8
L09/00 0,5 1,8 50L/04 0,5 0,8
L10/00 0,5 0,8 269L/04 0,5 0,5
Anexo 3 – Espessura capsular (μm) de 33 cepas de C. neoformans de
origem ambiental cultivadas em dois meios de cultura.

A01 0,8 0,5 A18 0,5 0,8
A02 0,5 2,5 A19 0,5 0,8
A03 0,5 1,2 A20 0,5 0,5
A04 0,5 0,5 A21 0,5 0,5
A05 0,5 0,5 A22 0,5 0,5
A06 0,5 1,2 A23 0,5 0,5
A07 0,5 0,5 A24 0,5 1,2
A08 0,5 0,5 A25 0,5 1,0
A09 0,5 1,2 A26 0,5 1,2
A10 0,5 1,2 A27 0,5 1,0
A11 0,5 1,5 A28 0,5 0,8
A12 0,5 1,8 A29 0,5 1,2
A13 0,8 0,5 A30 0,5 1,2
A14 0,5 0,5 A31 0,5 0,5
A15 0,5 0,5 A32 0,8 1,5
A16 0,5 0,8 A33 0,5 1,2
A17 1,0 1,0
Anexo 4 – Análise estatística da produção de cápsula de 133 amostras de
C. neoformans cultivadas em meio de indução, comparação entre os grupos
de origem.
Teste T Teste F
Grupos de origem
(P) (P)
CI x CNI 0,003 9,7 x 10-9
CI x A 0,278 0,069
CNI x A 0,001 2,1 x 10-5
Legenda: Teste T= teste t de Student, Test F = teste exato de Fisher. P = probabilidade associada ao teste,
diferença significativa é observada quando valor de p < 0,05. CI = isolados clínicos iniciais, CNI = isolados clínicos
não-iniciais e A = isolados ambientais.
Anexo 5 – Produção de fosfolipase em 133 isolados de C. neoformans.
Cepas Pz Código Cepas Pz Código Cepas Pz Código
Clínicas Iniciais
L44/96 0,60 3 L76/99 0,77 2 L68/02 0,75 2
L53/96 1,00 1 L112/99 0,87 2 L74/02 0,66 2
L91/96 0,66 2 L47/00 0,70 2 L92/02 0,54 3
L169/96 0,80 2 L101/00 0,85 2 L121/02 0,87 2
L02/97 1,00 1 L207/00 1,00 1 84L/03 0,66 2
L19/97 0,70 2 L273/00 0,75 2 102L/03 0,70 2
L116/97 1,00 1 L308/00 0,57 3 128L/03 0,77 2
L08/98 0,63 3 L03/01 0,75 2 358L/03 0,64 2
L78/98 0,87 2 L117/01 0,75 2 77L/04 1,00 1
L108/98 0,70 2 L174/01 0,66 2 86L/04 1,00 1
L113/98 0,62 3 L263/01 0,75 2 92L/04 0,63 3
L122/98 0,75 2 L270/01 0,63 3 127L/04 0,75 2
L13/99 0,75 2 L08/02 1,00 1 202L/04 0,85 2
L39/99 0,75 2
Clínicas Não-iniciais
L15/96 0,71 2 L148/98 0,62 3 L91/01 1,00 1
L159/96 0,71 2 L149/98 0,69 2 L102/01 1,00 1
1281/96 0,71 2 L22/99 1,00 1 L208/01 1,00 1
1592/96 0,75 2 L42/99 0,75 2 L293/01 0,88 2
1805/96 0,80 2 L51/99 1,00 1 L300/01 1,00 1
L46/97 0,82 2 L83/99 0,83 2 L49/02 0,80 2
89/97 0,71 2 L144/99 0,86 2 Afg299 0,83 2
579/97 0,69 2 L251/99 0,86 2 Afg302 0,83 2
1150/97 0,71 2 L09/00 0,69 2 59L/03 1,00 1
1172/97 0,57 3 L10/00 0,71 2 150L/03 0,82 2
1524/97 0,75 2 L21/00 0,86 2 176L/03 0,80 2
1549/97 1,00 1 L50/00 0,80 2 181L/03 0,75 2
1606/97 0,75 2 L57/00 0,71 2 184L/03 0,88 2
1707/97 0,75 2 L266/00 1,00 1 191L/03 0,75 2
L20/98 0,86 2 L18/01 0,75 2 195L/03 0,80 2
L46/98 0,86 2 L23/01 0,83 2 202L/03 0,67 2
L91/98 0,80 2 L48/01 0,86 2 220L/03 0,73 2
L106/98 0,70 2 L52/01 0,88 2 49L/04 0,63 3
L142/98 0,75 2 L61/01 1,00 1 50L/04 0,66 2
L146/98 0,75 2 L71/01 0,83 2 269L/04 0,80 2
Ambientais
A01 0,73 2 A12 0,73 2 A23 1,00 1
A02 0,69 2 A13 0,82 2 A24 0,78 2
A03 0,62 3 A14 0,64 2 A25 0,85 2
A04 0,82 2 A15 0,83 2 A26 0,71 2
A05 0,75 2 A16 1,00 1 A27 0,80 2
A06 0,75 2 A17 0,62 3 A28 1,00 1
A07 0,73 2 A18 0,54 3 A29 1,00 1
A08 0,78 2 A19 0,46 3 A30 0,66 2
A09 0,75 2 A20 0,53 3 A31 0,62 3
A10 0,67 2 A21 1,00 1 A32 0,75 2
A11 0,67 2 A22 1,00 1 A33 1,00 1
Legenda: Código 1 = ausência de atividade enzimática, código 2 = atividade enzimática positiva e código 3 =
atividade enzimática fortemente positiva.
Anexo 6 – Análise estatística da produção de fosfolipase extracelular em
133 amostras de C. neoformans, segundo grupo de origem.
Teste T Teste F
Grupos de origem
(P) (P)
CI x CNI 0,065 0,182
CI x A 0,490 0,498
CNI x A 0,082 0,043
Legenda: Teste T= teste t de Student, Test F = teste exato de Fisher. P = probabilidade associada ao teste,
diferença significativa é observada quando valor de p < 0,05. CI = isolados clínicos iniciais, CNI = isolados clínicos
não-iniciais e A = isolados ambientais.
Anexo 7 – Valores de CIM (µg/mL) de fluconazol, voriconazol, itraconazol e
anfotericina B para 40 isolados clínicos iniciais de C. neoformans.
Amostra
CLSI EUCAST CLSI EUCAST CLSI EUCAST CLSI EUCAST
L44/96 2 8 0,015 0,25 0,06 0,015 0,25 0,25
L53/96 16 4 0,12 0,03 0,03 0,015 0,25 0,12
L91/96 0,25 8 0,015 0,12 x x 0,12 0,25
L169/96 4 8 0,015 0,25 0,03 0,03 0,25 0,25
L02/97 2 4 0,03 0,03 x x 0,5 0,12
L19/97 2 4 0,015 0,06 0,03 0,03 0,25 0,5
L116/97 2 1 0,25 0,12 x x 0,5 1
L08/98 4 0,5 0,06 0,015 0,03 0,03 0,25 0,25
L78/98 8 1 0,12 0,03 0,125 0,03 0,12 0,25
L108/98 16 8 0,12 0,5 0,12 0,12 0,5 0,25
L113/98 8 2 0,06 0,015 0,03 0,03 0,5 0,25
L122/98 4 4 0,015 0,03 0,015 0,015 0,015 0,25
L13/99 0,12 8 0,015 0,12 0,06 0,03 0,25 0,25
L39/99 8 8 0,06 0,12 0,06 0,06 0,25 0,12
L76/99 2 8 0,06 0,03 0,06 0,03 0,5 0,25
L112/99 32 16 0,25 0,25 x x 0,12 0,25
L47/00 2 8 0,015 0,06 0,03 0,03 0,25 0,12
L101/00 8 8 0,015 0,25 0,03 0,03 0,25 0,25
L207/00 4 8 0,015 0,25 0,06 0,06 0,25 0,5
L273/00 32 16 0,25 0,25 0,06 0,03 0,25 0,12
L308/00 2 8 0,015 0,5 0,06 0,06 0,25 0,5
L03/01 2 4 0,03 0,06 0,125 0,06 1 0,12
L117/01 4 0,25 0,015 0,015 0,03 0,03 0,5 0,25
L174/01 8 4 0,12 0,015 0,06 0,06 0,25 0,12
L263/01 0,5 0,25 0,015 0,03 0,06 0,015 0,5 0,25
L270/01 4 4 0,015 0,06 0,06 0,015 0,5 0,5
L08/02 4 0,5 0,06 0,015 0,03 0,03 0,5 0,25
L68/02 8 8 0,06 0,015 0,06 0,06 0,5 0,25
L74/02 16 16 0,03 0,06 0,12 0,12 0,12 0,12
L92/02 8 2 0,25 0,06 0,015 0,015 0,25 0,12
L121/02 2 2 0,25 0,015 0,03 0,03 0,25 0,12
84L/03 4 4 0,015 0,015 0,06 0,06 0,25 0,12
102L/03 1 0,5 0,015 0,25 0,06 0,06 0,25 0,06
128L/03 1 0,25 0,015 0,06 0,03 0,03 0,5 0,06
358L/03 2 4 0,015 0,03 0,06 0,03 0,5 0,12
77L/04 0,5 0,5 0,015 0,015 0,015 0,015 0,25 0,25
86L/04 4 2 0,12 0,06 0,03 0,03 0,06 0,03
92L/04 1 2 0,015 0,015 0,015 0,03 0,5 0,12
127L/04 8 4 0,12 0,06 0,12 0,12 0,25 0,12
202L/04 8 0,5 0,06 0,12 0,03 0,03 0,12 0,06
Anexo 8 – Valores de CIM (µg/mL) de fluconazol, itraconazol e anfotericina
B para 60 isolados clínicos não-iniciais de C. neoformans.
Amostra
L15/96 1 2 0,015 0,015 x x 0,5 0,25
L159/96 1 0,5 0,015 0,03 0,06 0,12 0,12 0,06
1281/96 2 8 0,015 0,25 0,06 0,06 0,25 0,25
1592/96 4 8 0,015 0,25 0,03 0,015 0,25 0,5
1805/96 4 4 0,015 0,015 0,03 0,03 0,5 0,012
L46/97 1 16 0,015 0,25 x x 0,5 0,5
89/97 8 16 0,25 0,5 0,12 0,25 0,5 0,5
579/97 8 8 0,12 0,25 x x 0,25 0,25
1150/97 4 4 0,03 0,06 0,015 0,015 0,12 0,25
1172/97 4 8 0,06 0,25 0,03 0,03 0,5 0,5
1524/97 4 4 0,12 0,06 0,03 0,03 0,5 0,25
1549/97 8 4 0,12 0,06 0,015 0,015 0,25 0,06
1606/97 8 8 0,06 0,03 0,06 0,03 0,025 0,06
1707/97 16 16 0,12 0,5 0,12 0,12 0,25 0,25
L20/98 16 8 0,25 0,25 0,12 0,03 1 0,5
L46/98 4 8 0,03 0,12 0,06 0,03 0,5 0,12
L91/98 8 16 0,06 0,25 0,03 0,06 0,25 0,12
L106/98 8 4 0,03 0,12 0,06 0,06 0,12 0,06
L142/98 32 32 0,03 0,015 0,06 0,12 0,5 0,25
L146/98 4 32 0,015 0,015 0,03 0,03 0,5 0,25
L148/98 32 8 0,12 0,12 0,06 0,03 1 0,25
L149/98 4 8 0,015 0,25 0,03 0,03 0,5 0,5
L22/99 8 64 0,03 0,5 0,12 0,12 0,25 0,25
L42/99 2 8 0,015 0,25 0,03 0,12 0,25 0,5
L51/99 4 4 0,015 0,015 0,03 0,03 0,5 0,5
L83/99 1 32 0,015 0,03 0,12 0,12 0,5 0,25
L144/99 2 8 0,015 0,12 0,06 0,03 0,25 0,25
L251/99 8 8 0,25 0,015 0,06 0,03 0,25 0,25
L09/00 0,12 0,12 0,015 0,015 0,03 0,03 1 0,12
L10/00 0,12 0,12 0,015 0,03 0,015 0,015 0,5 0,12
L21/00 4 4 0,015 0,03 0,06 0,03 0,5 0,25
L50/00 2 1 0,015 0,03 0,06 0,03 1 0,12
L57/00 4 2 0,015 0,015 0,015 0,015 0,5 0,25
L266/00 4 1 0,06 0,015 0,06 0,03 0,25 0,12
L18/01 1 2 0,015 0,03 0,03 0,03 1 0,25
L23/01 1 2 0,015 0,03 0,03 0,03 0,5 0,12
L48/01 0,5 1 0,015 0,06 0,03 0,03 0,5 0,12
L52/01 4 2 0,015 0,03 0,12 0,03 0,5 0,12
L61/01 4 4 0,015 0,015 0,03 0,03 0,25 0,12
L71/01 2 0,25 0,015 0,015 0,06 0,03 0,5 0,12
L91/01 8 8 0,12 0,06 0,06 0,03 0,25 0,12
L102/01 1 2 0,015 0,06 0,06 0,03 0,5 0,12
L208/01 2 2 0,015 0,03 0,03 0,03 1 0,25
L293/01 4 16 0,015 0,06 0,12 0,25 0,5 0,12
L300/01 2 1 0,015 0,06 0,03 0,03 1 0,25
Anexo 8 – Continuação...
Amostra
L49/02 0,5 1 0,015 0,015 0,03 0,015 0,5 0,12
Afg299 16 8 0,25 0,12 0,12 0,12 0,25 0,12
Afg302 16 8 0,25 0,25 0,12 0,06 0,25 0,12
59L/03 0,25 0,25 0,015 0,06 0,03 0,03 0,5 0,06
150L/03 4 8 0,015 0,015 0,03 0,03 0,5 0,12
176L/03 2 2 0,015 0,015 0,03 0,015 0,5 0,25
181L/03 2 2 0,015 0,03 0,03 0,015 1 0,012
184L/03 2 2 0,015 0,015 0,03 0,015 0,25 0,12
191L/03 1 0,25 0,015 0,015 0,03 0,015 0,5 0,12
195L/03 0,5 0,25 0,015 0,03 0,03 0,03 0,12 0,12
202L/03 8 64 0,015 0,015 0,03 0,015 1 0,12
220L/03 0,5 2 0,015 0,03 0,06 0,03 0,5 0,12
49L/04 2 2 0,015 0,015 0,03 0,015 0,5 0,12
50L/04 8 8 0,25 0,25 0,25 0,12 0,25 0,03
269L/04 1 1 0,015 0,12 0,015 0,015 0,06 0,06
Anexo 9 – Valores de CIM (µg/mL) de fluconazol, itraconazol e anfotericina
B para 33 isolados ambientais de C. neoformans.
Amostra Fluconazol Itraconazol Voriconazol Anfotericina
A01 4 4 0,015 0,12 0,03 0,06 0,12 0,12
A02 0,25 0,5 0,015 0,03 0,03 0,06 0,5 0,06
A03 4 8 0,015 0,12 0,06 0,06 0,12 0,12
A04 1 4 0,06 0,015 0,015 0,015 0,5 0,12
A05 4 4 0,06 0,03 0,015 0,015 0,12 0,25
A06 0,12 1 0,015 0,015 0,015 0,015 0,015 0,06
A07 0,5 4 0,015 0,015 0,015 0,015 0,25 0,25
A08 2 4 0,015 0,015 0,015 0,015 0,12 0,12
A09 1 8 0,015 0,03 0,06 0,06 0,12 0,12
A10 2 4 0,015 0,06 0,015 0,06 1 0,12
A11 4 8 0,12 0,12 0,03 0,06 0,12 0,25
A12 0,5 4 0,03 0,015 0,015 0,015 0,12 0,25
A13 1 8 0,12 0,015 0,015 0,015 0,25 0,25
A14 2 4 0,03 0,015 0,015 0,015 0,12 0,12
A15 0,5 2 0,015 0,015 0,015 0,015 0,12 0,25
A16 1 0,5 0,015 0,06 0,015 0,06 0,12 0,06
A17 1 8 0,03 0,03 0,015 0,03 0,12 0,25
A18 0,5 1 0,015 0,015 0,015 0,03 0,12 0,12
A19 4 4 0,03 0,03 0,015 0,015 0,12 0,25
A20 0,5 0,5 0,015 0,015 0,015 0,015 0,12 0,06
A21 4 4 0,03 0,015 0,015 0,015 0,12 0,25
A22 2 2 0,015 0,03 0,03 0,03 0,12 0,06
A23 0,5 1 0,015 0,03 0,015 0,015 0,06 0,015
A24 2 0,25 0,03 0,03 0,015 0,015 0,12 0,12
A25 1 2 0,12 0,03 0,03 0,03 0,25 0,25
A26 2 1 0,03 0,03 0,03 0,06 0,25 0,25
A27 0,5 0,25 0,03 0,03 0,03 0,015 0,12 0,03
A28 2 2 0,015 0,06 0,06 0,015 0,12 0,12
A29 0,5 0,5 0,015 0,015 0,03 0,015 0,12 0,25
A30 4 16 0,12 0,015 0,03 0,015 0,12 0,12
A31 8 16 0,12 0,25 0,03 0,015 0,12 0,5
A32 4 2 0,015 0,015 0,03 0,015 0,12 0,06
A33 4 8 0,12 0,015 0,03 0,015 0,12 0,06

1308-Tese CCD Coutinho Giovane 2006

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GIOVANE COUTINHO

Fatores de virulência e resistência a antifúngicos

Orientador: Profa. Dra. Marcia de

©reprodução autorizada pelo autor

1. Cryptococcus neoformans 2. Criptococose 3. Fatores de virulência

“Pai misericordioso, Amigo fiel e consolador!

Aos meus irmãos, Júnior, Juliano e Janaina,

Aos amigos da Seção de Micologia do Instituto Adolfo Lutz:

Aos bolsistas Fundap: Tamara, Elaine, Mariana, Sandra, Sônia e

À Profa. Dra. Marilia Caixeta Franco, pela disponibilidade e

Aos membros da banca examinadora de qualificação do mestrado,

Aos companheiros de pós-graduação: Hilda, Toninho, Beth, Fábio,

À Dra. Maria de Fátima e às secretárias, Emiliana e Tirces, que

Aos amigos, Amanda e Paulo, que me receberam na cidade grande.

Às amigas Patrícia e Karina, colegas de profissão e de convívio na

À minha namorada, amiga e companheira, Mariana Leite Gomide.

Aos meus amigos de Viçosa - MG, especialmente os familiares, que

Misto de professora, irmã e amiga...

“Que a suas forças e sabedoria, sejam renovadas a cada dia, para

Cryptococcus neoformans é causa importante de

Cryptococcus neoformans is a common cause of life-threatening

ATCC – “American Type Culture Collection”

CGB – Canavanina-glicina-azul de bromotimol

CI – Isolados clínicos iniciais

CIM – Concentração inibitória mínima

CLSI – “Clinical and Laboratory Standards Institute”

CNI – Isolados clínicos não-iniciais

CSM – Caldo Sabouraud diluído em tampão MOPS

EUCAST – “European Committee on Antifungal Susceptibility Testing”

HAART – “Highly Active Antiretroviral Therapy”

NCCLS – “National Committee for Clinical Laboratory Standards”

RAPD – “Random Amplified Polymorphic DNA”

SDD – Sensibilidade dependente da dose

YEPD – “Yeast extract peptone dextrose”

Tabela 1 – Variedades, grupos de isolados e material de origem de

Tabela 2 – Resposta ao teste de indução de cápsula em 133 isolados de

Tabela 3 – Análise da atividade enzimática (Pz) de fosfolipase extracelular

Tabela 4 – Resultado da seleção de fenótipos resistentes de 13 isolados de

Tabela 5 – Valores de CIM de fluconazol (μg/mL) para 11 fenótipos

Tabela 6 – Intervalos de CIM (μg/mL) de 4 antifúngicos obtidos para

Tabela 7 – Valores de CIM50 e CIM90 (μg/mL) de fluconazol, itraconazol,

Tabela 8 – Valores de CIM50 e CIM90 (μg/mL) de fluconazol, itraconazol,

Tabela 10 – Comparação dos valores de CIM de itraconazol obtidos pelas

Tabela 11 – Comparação dos valores de CIM de voriconazol obtidos pelas

Tabela 12 – Comparação dos valores de CIM de anfotericina obtidos pelas

Tabela 13 – Distribuição dos isolados por diferença de diluições entre os

Figura 1 – Blastoconídios de C. neoformans: cápsulas induzidas no meio de

Figura 2 – Espessura da cápsula de 40 isolados clínicos iniciais de

Figura 3 – Espessura da cápsula de 60 isolados clínicos não-iniciais de

Figura 4 – Espessura da cápsula de 33 isolados ambientais de

Figura 5 – Distribuição de 40 isolados clínicos iniciais de C. neoformans

Figura 6 – Distribuição de 60 isolados clínicos não-iniciais de C. neoformans

Figura 7 – Distribuição de 33 isolados ambientais de C. neoformans

Figura 8 – Ilustração do resultado obtido no teste de produção de proteinase

Figura 9 – Perfil de crescimento de C. neoformans em meio ágar batata

Figura 11 – Perfil de sensibilidade ao fluconazol de 133 isolados de

Figura 12 – Perfil de sensibilidade ao fluconazol de 133 isolados de

Figura 13 – Perfil de sensibilidade ao itraconazol, de 133 isolados de

Figura 14 – Perfil de sensibilidade a itraconazol de 133 isolados de

Figura 15 – Perfil de sensibilidade ao voriconazol de 126 isolados de

Figura 16 – Perfil de sensibilidade à anfotericina B, de 133 isolados de

Figura 17 – Concordância geral dos resultados de CIM, obtidos pelas

1.1. Cryptococcus neoformans ............................................................. 21