Universidade de São Paulo

Escola de Engenharia de Lorena – EEL/USP

César Augusto Marzola

Condições de cinética e análise comparativa entre diferentes

métodos de pré-tratamento do meio de cultura.

Lorena
2015
 César Augusto Marzola

Condições de cinética e análise comparativa entre diferentes métodos

de pré-tratamento do meio de cultura.

Trabalho de Conclusão de Curso de Engenharia

Química da Universidade de São Paulo – Escola de
Engenharia de Lorena para obtenção do grau de
Engenheiro Químico.
Área de concentração: Novas fontes de combustíveis.
Orientador: Prof. Dr. Messias Borges Silva

Lorena
2015
AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO
CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE

Ficha catalográfica elaborada pelo Sistema Automatizado

da Escola de Engenharia de Lorena,
com os dados fornecidos pelo(a) autor(a)

Marzola, César Augusto

Condições de cinética e análise comparativa entre
diferentes métodos de pré-tratamento do meio de
cultura. / César Augusto Marzola; orientador
Messias Borges Silva. - Lorena, 2015.
58 p.

Monografia apresentada como requisito parcial

para a conclusão de Graduação do Curso de Engenharia
Química - Escola de Engenharia de Lorena da
Universidade de São Paulo. 2015
Orientador: Messias Borges Silva

1. Planejamento de experimentos. 2. Microalga. 3.

Chlorella minutissima. 4. Desinfecção. 5.
Esterilização. I. Título. II. Silva, Messias Borges,
orient.
 Aos meus pais, Carlos Sérgio Marzola e Olmery Maria Salles
Pereira Marzola, que sempre incentivaram e apoiaram seus filhos,
principalmente no caminho do conhecimento, amo-vos.
 Agradecimento

A todos os elementos envolvidos, direta ou indiretamente. Pais,

irmãos, amigos, professores, colegas de faculdade, universidade e
principalmente cada dificuldade encontrada ao longo do caminho por
mais insignificante que fosse, tudo e todos que foram responsáveis
por moldar a pessoa que escreve este texto.

No mais agradeço aos:

Prof. Dr. Messias Borges Silva que me ofereceu a oportunidade de
realizar o trabalho de conclusão de curso no laboratório de Meio
Ambiente me orientando e coordenando o projeto.
Aos Mestres Carla Loures e Mateus de Souza Amaral pelo apoio,
ajuda, troca de experiências e presença constante durante a
elaboração deste trabalho.
Aos responsáveis pelo laboratório de graduação, departamentos e
amigos que cederam gentilmente materiais, substâncias e
equipamentos cruciais nas etapas de desenvolvimento dos cultivos.
Aos alunos de iniciação cientifica, estagiários e colegas que também
desenvolveram seus trabalhos de conclusão no laboratório que de
alguma forma contribuíram para essa realização.
 “Do not believe in anything simply because you
have heard it. Do not believe in anything simply because it is spoken
and rumored by many. Do not believe in anything because it is found
written in your religious books. Do not believe in anything merely on
the authority of your teachers and elders. Do not believe in traditions
because they have been handed down for many generations. But after
observation and analysis, when you find anything that agrees with
reason and is conducive to the good and benefit of one and all, then
accept it and live up to it.”
Siddhãrtha Gautama
 Resumo

Marzola, C. A. Condições de cinética e análise comparativa entre diferentes

métodos de pré-tratamento do meio de cultura. 2015. 58p. Trabalho de
Conclusão de Curso (Engenharia Química) - Escola de Engenharia de Lorena,
Universidade de São Paulo, Lorena, 2015.
As microalgas apresentam uma excelente alternativa frente aos combustíveis
fósseis pelo seu potencial energético renovável. Sua constituição natural
apresenta altas concentrações de lipídeos que é fonte de matéria-prima para
produção de biodiesel. Outras vantagens são seu crescimento rápido, maior
rendimento de óleo por hectare e não competição por espaço com culturas
alimentares, que tornam as microalgas uma alternativa a outras fontes de lipídeo.
Esse estudo buscou através de analises estatísticas definir o melhor arranjo de
fatores sendo esses as concentrações de cloreto de sódio, nitrato e fosfato. Como
objetivo concomitante comparou-se o método de pré-preparação do meio antes
da inoculação da espécie de alga Chlorella minutissima, que pôde ser esterilizado
usando uma autoclave, desinfeccionado com o agente químico a base de cloro ou
simplesmente sem nenhuma eliminação de micro-organismos concorrentes para
a cultura. Concluiu-se que o nitrato é o fator mais significativo e que o uso de
desinfecção é uma alternativa confiável produzindo um rendimento de 1048 mg/L
de biomassa. As técnicas de arranjo ortogonal de Taguchi indicaram as
combinações ideais permitindo a estimativa de produções de biomassa permitindo
dar continuidade no objetivo maior que é a produção de biodiesel.

Palavras Chave: Planejamento de experimentos. Microalga. Chlorella

minutissima. Biodiesel. Esterilização. Desinfecção.
 Abstract

Marzola, C. A. Conditions kinetics and comparative analysis of different

methods of pretreatment of the culture. 2015. 58p. Term Paper (Chemical
Engineering) - Escola de Engenharia de Lorena, Universidade de São Paulo,
Lorena, 2015.
The micro algae have an excellent alternative against the fossils fuels by its
renewable energetical potential. Their natural constitution show high
concentrations of lipids that is source of raw material biodiesel production. Among
the advantages of algae are its rapid growth, higher oil yield per hectare and non-
competition for space with food crops, that make the microalgae an alternative to
others fat sources. This study sought by statistical analysis to define the best
arrangement of the factors that are the concentrations of sodium chloride, nitrate
and phosphate. As a concomitant goal, compared the pre preparation before the
before inoculation of the species of algae Chlorella minutissima, which could be
sterilized using an autoclave, disinfected with a chemical agent based in chlorine
or simply without any elimination of rivals microorganisms in the culture. It was
found, as a conclusion, that nitrate is the most significant factor that the use of
disinfecting a reliable alternative is producing a yield of 1048 mg / L biomass. The
orthogonal array of Taguchi techniques indicated the optimal combinations
allowing the estimation of biomass production turning possible to seek the larger
goal that is the production of biodiesel.

Key words: Design of experiments. Microalgae. Chlorella minutissima. Biodiesel.

Sterilization. Disinfection.
 Sumário

1. Introdução.......................................................................................................... 9
2. Revisão bibliográfica ...................................................................................... 11
2.1. Definição das microalgas ............................................................................ 11
2.2. Tecnologias para o cultivo de microalgas.................................................... 12
2.3. Vantagens das microalgas .......................................................................... 13
2.4. Potencial de lipídeos ................................................................................... 15
2.5. Estágios essenciais na produção de microalgas ........................................ 17
2.5.1. Seleção de algas .................................................................................. 18
2.5.2. Cultivo................................................................................................... 19
2.5.3. Colheita ................................................................................................ 22
2.6. Pré-tratamento do meio de cultivo .............................................................. 22
2.6.1. Desinfecção .......................................................................................... 22
2.6.1.1. Desinfecção usando hipoclorito de sódio ....................................... 22
2.6.2. Esterilização ......................................................................................... 23
2.6.2.1. Esterilização usando uma autoclave .............................................. 23
2.7. Foto biorreator ............................................................................................ 24
2.8. Planejamento de experimentos................................................................... 25
3. Objetivo ............................................................................................................ 29
4. Metodologia ..................................................................................................... 30
4.1. Origem e acondicionamento das amostras ................................................. 30
4.2. Produção do inóculo de microalgas ............................................................ 30
4.3. Análise de crescimento ............................................................................... 30
4.4. Nutrientes usados na cultura ...................................................................... 31
4.5. Delineamento dos experimentos................................................................. 32
4.6. Empregando método Taguchi ..................................................................... 33
4.7. Ensaios com arranjo ortogonal Taguchi L4 ................................................. 34
4.7.1. Ensaio 1: sem esterilização ou desinfecção ......................................... 35
4.7.2. Ensaio 2: desinfeccionada .................................................................... 35
4.7.3. Ensaio 3: esterilizada............................................................................ 35
4.8. Colheita ....................................................................................................... 36
5. Resultados e discussão ................................................................................. 37
5.1. Ensaio 1: sem esterilização ou desinfecção ............................................... 37
5.2. Ensaio 2: desinfeccionada .......................................................................... 40
 5.3. Ensaio 3: esterilizada .................................................................................. 44
5.4. Comparação entre os ensaios .................................................................... 47
6. Conclusões ...................................................................................................... 50
7. Sugestões para trabalhos futuros ................................................................. 51
7.1. Análise de óleo............................................................................................ 51
7.2. Análise da água .......................................................................................... 51
Referências .......................................................................................................... 52
Anexo ................................................................................................................... 57
Anexo A – Meio Guillard “f/2” ......................................................................... 57
 9

1. Introdução

As microalgas em geral têm demonstrado, ao longo das últimas décadas,

um grande potencial para obtenção de lipídeos, carboidratos e outras substâncias
orgânicas. Dentre as várias espécies na natureza encontra-se algumas que
destoam em quantidade de determinada substância, como exemplo a Chlorella
minutissima, utilizada neste trabalho, que apresenta uma alta porcentagem em
massa de lipídeos. Esses podem ser utilizados em uma gama de aplicações como
na indústria alimentícia, cosméticos e produção de biodiesel (XU; BOEING, 2014).

A grande vantagem dos biocombustíveis é sua sustentabilidade. O

crescimento das microalgas envolve: a subtração do carbono atmosférico para
incorporação estrutural das células utilizando a energia solar, contribuindo assim
com a diminuição do efeito estuda. Diferentemente dos combustíveis provenientes
de fontes não renováveis, estes não apresentam concentrações de enxofre que é
o principal responsável no aumento da acidez da água pluvial (quando liberados
na forma de dióxido de enxofre na atmosfera após sua queima). Como
característica secundária o cultivo de microalgas não requer grandes espaços
territoriais e podem ter sua produção realizada em ambientes áridos e terrenos
acidentados descartados pela agricultura convencional. Outro fator importante é
uso de agua salgada para o cultivo (no caso das algas de origem marinha), que é
encontrada em abundância na natureza (PRAGYA; PANDEY; SAHOO, 2013).

O objetivo final da pesquisa no laboratório de Meio ambiente da Escola de

Engenharia de Lorena foi a produção outdoor em pequena escala de microalgas
para a produção de biodiesel. Várias pesquisas, como a ilustrada na Figura 1, são
conduzidas paralelamente afim de determinar diferentes condições relacionadas a
essa pequena produção. Uma dessas condições são os prévios tratamentos
dados a fonte de água usada para o cultivo. A literatura recomenda esterilização
usando uma autoclave, porém este procedimento é totalmente inviável diante da
magnitude do volume de água necessário para tais processos, restando a
alternativa da desinfecção, porém esse processo tem um custo que pode afetar
significantemente o preço final do produto, surgindo assim a opção de
 10

simplesmente não recorrer a nenhum tratamento. Nesse sentido este trabalho

propôs o estudo do comportamento da microalga Chlorella minutissima levando
em consideração essas três opções. Ao mesmo tempo reforça a busca do ajuste
ideal dentre os fatores: salinidade da água, concentração dos nutrientes nitrato e
fosfato que influenciam no peso de biomassa, a velocidade de crescimento das
algas, a concentração de lipídeos no interior das células e quantidade máxima de
células por litro de cultivo.

Figura 1 – Foto biorreatores fechados.

Fonte: LOURES et al., 2014.

 11

2. Revisão bibliográfica

2.1. Definição das microalgas

As microalgas são classificadas como eucariotas e são divididas em três

grupos distintos: as diatomáceas (Bacillariophyceae), as algas verdes
(Chlorophyceae) e as algas marrons douradas (Chrysophyceae) (DEMIRBAS,
2010). Podem ser multicelulares ou unicelulares, viver em água doce ou salgada.
Crescem rapidamente e conseguem viver em condições críticas para sua
sobrevivência (XU; BOEING, 2014). Além disso, estes micro-organismos estão
presentes em todos os ecossistemas existentes no planeta, não só aquáticos,
mas também terrestres. Estima-se que existam mais de 50.000 espécies, dos
quais 30.000 já foram estudadas e analisadas (PRAGYA; PANDEY; SAHOO,
2013). A Figura 2 exemplifica em detalhe a aparência dessas microalgas.

Figura 2 – Detalhe microalgas no microscópio.

Fonte: Schultz, 2013.

Dentre as variedades de algas encontram-se as autotróficas, que através

de compostos como CO2, sais minerais e absorção de energia solar produzem
seu próprio alimento através da fotossíntese, em contrapartida as algas
 12

heterotróficas precisam absorver compostos orgânicos do meio pois não os

produzem. Algumas espécies são mixotrópicas, ou seja, são capazes de
metabolizar compostos orgânicos e fazer fotossíntese (LEE, 1980). Para as algas
autotróficas, a fotossíntese é a principal chave para a sobrevivência, pois elas
transformam radiação solar e CO2, através dos cloroplastos, em Adenosina
Trifosfato (ATP) e O2 que fornece energia para seu crescimento (FALKOWSKI,
RAVEN, 1997; ZILINSKAS BRAUN G.; ZILINSKAS BRAUN B., 1974).

2.2. Tecnologias para o cultivo de microalgas

Para uma produção artificial deve-se tentar replicar ao máximo as

condições naturais ótimas de crescimento. Na natureza a célula através da
absorção da luz solar, dióxido de carbono e nutrientes da água completa seu ciclo
de crescimento (PULZ; SCHEINBENBOGAN, 1998).

A grande vantagem de se trabalhar com a produção comercial de algas é

que se pode utilizar como fonte de energia a luz solar, essa demanda, porém,
pode não ser atendida dependendo da região pois sofre alterações de intensidade
através das estações, isso tornaria a produção de microalgas sazonal limitando a
produção a áreas que recebem alta taxa de incidência solar. Logo, algas
cultivadas a céu aberto tem como sua variável limitante a luz solar (PULZ;
SCHEINBENBOGAN, 1998). Uma alternativa seria o uso de energia artificial na
forma de lâmpadas fluorescentes, levando em consideração que para a escolha
do tipo de iluminação é imprescindível que se conheça o espectro de absorção
ideal para determinado tipo de alga, para melhorar a eficiência de absorção. Estas
simulam a energia luminosa proveniente do sol (PULZ; SCHEINBENBOGAN,
1998) e também tornam ensaios laboratoriais mais confiáveis devido a frequência
constante de ondas luminosas. Porém isso aumentaria os custos de produção e
como uma porcentagem dessa energia elétrica usada pelas lâmpadas é fornecida
através de combustíveis fosseis isso também aumentaria a pegada de carbono.

As microalgas absorvem CO2 de três formas distintas: da atmosfera, de

descarga direta de CO2 da indústria e de carbonatos solúveis (Wang et al., 2008).
Em condições naturais as algas absorvem CO2 na concentração de 360 ppmv,
 13

porém podem tolerar concentrações de até 150.000 ppmv (BILANOVIC et al.,

2009).

Outros nutrientes inorgânicos essenciais incluem nitrogênio, fósforo e silício

(SUH; LEE, 2003). Enquanto algumas algas absorvem o nitrogênio direto da
atmosfera na forma de NOx (WELSH et al., 2000) outras necessitam que este
esteja dissolvido na água, onde a ureia é a melhor fonte (HSIEH; WUH, 2009).
Fósforo é o menos importante sendo absorvido em menor quantidade na fase de
crescimento (ÇELEKLI; YAVUZATMACA; BOZKURT, 2009) porém por fazer
ligações com os metais presentes em solução ele deve ser adicionado em grande
quantidade (CHISTI, 2007). Já o silício é importante para o crescimento de um
pequeno grupo de algas, por exemplo as diatomáceas (MARTIN-JÉZÉQUEL;
HILDENBRAND; BRZEZINSKI, 2000).

2.3. Vantagens das microalgas

Do ponto de vista prático, é fácil cultivar microalgas, elas podem crescer

com pouca ou nenhuma supervisão, usando água imprópria para o consumo
humano (exemplo efluentes) e com facilidade na obtenção dos nutrientes
envolvidos.

O ciclo de crescimento celular das microalgas se completa em poucos dias

e podem ser acelerados usando nutrientes específicos e com contínua aeração
do meio (ASLAN; KAPDAN, 2006).

Elas apresentam taxas de crescimento muito maiores que a silvicultura,

culturas agrícolas, e outras plantas aquáticas, requerem muito menos área que a
agricultura convencional voltada para a produção de biodiesel (CHISTI, 2007),
como mostra a Tabela 1. E mesmo assim a competição por solos aráveis é
extremamente reduzida já que não é um fator para sua produção.
 14

Tabela 1 - Comparação de diferentes fontes de óleo.

Fonte: Adaptado de BRENNAN; OWENDE, 2010.

Microalgas podem oferecer matéria-prima para uma série de

combustíveis renováveis como biodiesel, etanol, metano, hidrogênio e bio-óleo. O
biodiesel tem uma performance tão boa quanto o diesel oriundo do petróleo além
de não conter enxofre e emitir menos CO e hidrocarbonetos. Entretanto suas
emissões de NOx podem ser maiores (WANG et al., 2008).

Outros benefícios significativos estão listados abaixo:

- Remove CO2 da emissão de indústrias através da bio-fixação, removendo os

gases do efeito estufa (WANG et al., 2008).

- Tratamento de água residual removendo NH4+, NO3-, PO43- que são nutrientes
contaminantes (WANG et al., 2008).

- Após a extração do óleo, a biomassa restante pode ser processada em etanol,

metano, ração animal, usado como adubo orgânico devido a sua alta
concentração de nitrogênio e enxofre, ou simplesmente queimada para cogeração
de energia (eletricidade e aquecimento) (WANG et al., 2008).

- Combinada a sua condição de crescer em ambientes hostis, e sua reduzida

necessidade de nutrientes, elas podem crescer em áreas insustentáveis para a
agricultura independente da mudança climática, não competindo por solos aráveis
(WANG et al., 2008).
 15

Dependendo da espécie de microalga a ser cultivada uma gama de outras

substâncias com variada aplicações podem ser extraídas tais como gorduras,
ácidos poli-insaturados, óleos, corantes naturais, açucares, antioxidantes,
compostos bioativos de alto valor agregado e outros produtos da química fina (LI
et al., 2008).

- Graças a essa variedade de substâncias as microalgas podem revolucionar

diversos setores incluindo biocombustíveis, cosméticos, farmacêuticos, nutrição e
suplementos, aquicultura, e prevenção de poluição (ROSENBERG et al., 2008).

2.4. Potencial de lipídeos

As microalgas podem ser induzidas a produzirem uma quantidade

substancial de lipídeos (SHEEHAN et al., 1998), fazendo com que haja uma
produção de óleo com alto rendimento. O percentual médio de lipídeo nas várias
espécies de alga, mostrados na Tabela 2, varia entre 1 e 70% de peso da alga já
seca, sendo que algumas espécies podem passa desse valor (Li et al., 2008;
CHISTI, 2007; WANG et al., 2008; SPOLAORE et al., 2006).
 16

Tabela 2 – Dados sobre lipídeos em diferentes espécies de microalgas.

Fonte: Adaptado de TANG et al., 2011; MATA; MARTINS; CAETANO, 2010; ILLMAN; SGRAGG; SHALES,
2000.

É possível identificar na Tabela 2 a alga Chlorella minutissima que foi

utilizada nesse estudo e pelos dados se observa sua alta porcentagem de lipídeo.
Ainda, existem outras espécies tão boas ou melhores que a selecionada, porém
leva-se em conta outros fatores para a escolha como a capacidade de
desenvolvimento da microalga utilizando os nutrientes disponíveis ou sob as
condições ambientais que a envolvem.

Outro fator significante é a composição dos ácidos graxos produzidos, pois

eles influenciam significantemente na qualidade final do biodiesel, normalmente
são constituídos de cadeias saturadas e insaturadas com 12 a 22 átomos de
carbono. Nutrientes, condições ambientais, condições de cultivo e fases de
crescimento podem afetar a composição do lipídeo (CHISTI, 2007).

Segundo Lourenço (2006) os componentes químicos que constituem o óleo

das microalgas são: ácidos graxos saturados (AGS) ou insaturados (AGI),
pequenas quantidades de açúcares ou bases esterificadas e glicerol. As funções
 17

biológicas dos ácidos graxos dentro das células são isolamento térmico e reserva
energética. Sendo estes agrupados basicamente como lipídeos neutros
(triglicerídeos e colesterol), que são a principal matéria prima do biodiesel, e
lipídeos polares, ex. fosfolipídios.

2.5. Estágios essenciais na produção de microalgas

A produção de microalgas não difere muito de outras matérias-primas para

obtenção de biodiesel, leva-se em consideração que elas são micro-organismos
que vivem essencialmente em água, que através de um cultivo particular, colheita
e técnicas de processamento, especificadas na Figura 3, se tornam uma
excelente alternativa para a produção de biodiesel.

Todos os processos existentes começam com o crescimento e replicação

das células de microalgas, seguido de separação dessas células do meio de
cultivo e subsequente extração dos lipídeos do interior delas. Então os
biocombustíveis podem ser produzidos através de técnicas já utilizadas com
outras matérias-primas oriundas de outras fontes. Os lipídeos podem sofrer uma
quebra térmica (ou pirolise) ou clivagem dos triglicerídeos e outros compostos
presentes como alcanos, alcenos, aromáticos, ácidos carboxílicos, dentre outros
(BAHADUR; BOOCOCK; KONAR, 1995; BABU, 2008; BOATENG et al., 2008;
RODOLFI et al., 2008).
 18

Figura 3 - Cadeia de processos para produção de microalgas.

Fonte: autor próprio.

2.5.1 Seleção de algas

Inicialmente o cultivo de algas deve respeitar os seguintes critérios gerais:

1. Salinidade e química da água; 2. Geologia, topografia e propriedade das terras;
3. Condições climáticas, temperatura, isolamento, precipitação e evaporação; 4. O
fácil acesso a nutrientes e fontes de carbono (MAZWELL; FOLGER; HOGG,
1985).

É importante determinar se o cultivo será em sistema aberto ou fechado,

isso é escolhido pelo tipo de microalga usada, condições ambientais esperadas,
fornecimento de nutrientes e se há a possibilidade de combinar o crescimento da
alga com o consumo de poluição de industrias, como nitrogênio e fósforo de
 19

efluentes ou dióxido de carbono de emissões atmosféricas (MAZWELL; FOLGER;

HOGG, 1985).

Mais precisamente se pode listar os principais fatores de escolha com base

na produtividade de espécies química, e fatores já apresentados na Tabela 2
(MAZWELL; FOLGER; HOGG, 1985):

- Taxa de crescimento, que pode ser medida através da quantidade de biomassa

acumulada por unidade de tempo e volume;

- Concentração e tipo específico de lipídeos, no caso do biodiesel o tipo de lipídeo

pode afetar na qualidade do mesmo;

- Resistencia a mudanças drásticas no ambiente, as mais relevantes são

temperatura, competição com outras espécies de algas e bactérias, nutrientes e
luz;

- Disponibilidade de nutrientes, principalmente quando a meta do crescimento é

sequestrar o carbono atmosférico;

- Facilidade de separação e processamento da biomassa;

- Possibilidade de obtenção de outros produtos químicos.

Reforçando que o estudo exploratório deve se aproximar ao máximo das

condições reais de cultivo para a produção de determinados insumos.

2.5.2. Cultivo

Algas podem assumir diferentes tipos de metabolismo e são capazes de

alterar esse metabolismo como resposta a mudanças ambientais. Os exemplos de
como algas podem crescer são (CHOJNACKA; MARQUEZ-ROCHA; KINETIC,
2004):

- Heterotroficamente, consumindo exclusivamente compostos orgânicos (glicose,

acetato, etc).
 20

- Foto autotroficamente, crescimento baseado em fotossíntese de componentes

químicos disponíveis.

- Mixotroficamente, fazem fotossíntese e metabolizam compostos orgânicos.

- Foto heteroficamente, metabolismo onde a luz é necessária para transformação

de composto orgânicos.

Outro ponto vital para o crescimento é o controle dos parâmetros

operacionais como oxigênio, dióxido de carbono, intensidade de luz, pH,
temperatura e remoção de produtos e subprodutos. Quando se analisa mais
atentamente as algas para a produção de biodiesel é importante que se observe
esses parâmetros e suas relações, assim se pode manipula-los para que se
obtenha, no caso, total controle na quantidade de lipídeos e na população de
células (DE PAUW; MORALES; PERSOONE, 1984).

A Figura 4 representa o crescimento da alga (linha solida) e da

concentração de nutrientes (linha pontilhada). As fases de crescimento estão
indicadas por números sendo: 1. Fase lag, período de adaptação da célula ao
meio; 2. Fase exponencial, início da reprodução; 3. Fase linear, crescimento
contínuo; 4. Fase estacionaria, esgotamento de nutrientes e/ou saturação do
meio; 5. Fase de declínio ou morte, desequilíbrio do sistema biológico
(CARVALHO, 2010).
 21

Figura 4 - Representação esquemática do crescimento da alga (linha solida) e concentração de nutrientes

(linha pontilhada).

Fonte: CARVALHO, 2010.

Geralmente durante a fase exponencial de crescimento as algas possuem

mais proteína, enquanto na fase estacionaria elas possuem mais carboidratos e
glicogênio (DE PAUW; MORALES; PERSOONE, 1984).

Vários autores já examinaram os diversos fatores que influenciam no

crescimento das algas, abaixo algumas das conclusões encontradas:

- Quando há aeração adequada existe uma tendência no aumento da taxa de

crescimento, isso se deve porque a aeração mantem o meio mais homogêneo,
evita a sedimentação, melhorando o contato das microalgas com os nutrientes e
luz. O autor também observa que existe um limite de intensidade de luz no qual
há um aumento na taxa de crescimento (KAEWPINTONG, 2004).

- Para as espécies Chlorella, C, emersonii, C. munutissima e C. vulgaris foi

descoberto que a diminuição de nitrogênio também aumenta a concentração de
lipídeos nas células (ILLMAN; SGRAGG; SHALES, 2000).

- A temperatura também está intimamente ligada ao crescimento, sendo, por

exemplo, de 25 a 30°C para a espécie Chlorella, mesmo sendo observado seu
crescimento em temperaturas a partir de 16°C (SUALI; SARBATLY, 2012).
 22

2.5.3. Colheita

A capacidade das microalgas em se manter em suspensão está

relacionada com repulsão elétrica entre as células, polaridade da água e sais
dissolvidos. A carga da superfície das células está relacionada diretamente com a
espécie estudada. De forma geral o aumento do pH neutraliza essa estabilidade
elétrica ocorrendo a floculação das células e sua posterior sedimentação
(SHELEF; SUKENIC; GREEN, 1984).

2.6. Pré-tratamento do meio de cultivo

2.6.1. Desinfecção

O termo desinfecção está estritamente ligado ao termo desinfectante pois o

primeiro é uma causa do segundo. Sendo desinfectante um agente externo,
usualmente um agente químico, mas as vezes um agente físico, como luz
ultravioleta ou raios-x, que destroi ou inibe uma doença, um organismo perigoso
e, no caso em estudo, um micro-organismo concorrente. Entretanto não
eliminando sporos de bactérias mais resistentes (BLOCK, 2001).

2.6.1.1. Desinfecção usando hipoclorito de sódio

Hipoclorito de sódio (NaOCl) é um oxidante forte muito efetivo para

desinfecção de água, produz duas moléculas quando dissolvido em água, o ácido
hipocloroso (HClO), que é estritamente reativo e o íon hipoclorito (ClO-), formado
pela dissociação do ácido e menos reativo. Ambos importantes no mecanismo de
desinfecção (RONCO; MISHKIN, 2007).
 23

2.6.2. Esterilização

Esterilização é o ato ou processo, fisico ou quimico, que destrói ou elimina

totalmente as formas de vida, especialmente micro-organismos (BLOCK, 2001).

2.6.2.1. Esterilização usando uma autoclave

A nível laboratorial um método acessivel de esterilização é utilizando uma

autoclave, mostrado na Figura 5, que é uma câmara de pressão onde os objetos
acondicionados são mantidos a temperaturas de 121 °C em uma atmosfera
saturada por vapor d'água pressurizado por um determinado periodo de tempo
(normalmente inferior a 30min) (BLACK, 1993).

Figura 5 – Autoclave.

Fonte: autor próprio.

 24

2.7. Foto biorreator

Existem diversas configurações estudadas de reatores com a função de

cultivo de microalgas, as características principais que os diferem é se são de
sistema aberto ou em sistema fechado e que podem ser operados em sistema
contínuo ou batelada (RICHMOND, 2004).

Quando a céu aberto o reator é basicamente uma lagoa. Construída em

forma circular para que um fluxo seja criado, basicamente uma imitação de
correnteza feita por um sistema de pás. Esse movimento faz com que as células
se dispersem melhor no meio, recebendo mais luz solar e absorvendo melhor os
nutrientes. Esse reator deve ter no máximo 15cm de profundidade para que a luz
tenha sua energia apropriadamente absorvida pelas células, ele possui também
tubos de alimentação de oxigênio e CO2 distribuídos ao longo de sua área
(RICHMOND, 2004).

O reator de cultura fechado ou PBRs é um sistema altamente controlado

que poder ser operado continuamente ou por batelada. Nele controla-se todos os
parâmetros já citados anteriormente (como pH, temperatura, CO2, O2, etc), e tem
as vantagens de impedir a evaporação da água, reduzir as perdas de CO2 para a
atmosfera, pois conta com um sistema de mistura mais eficiente em relação a
absorção de luz, e nutrientes. Nele obtém-se maiores concentrações ou
densidades de microalgas (sendo de 3 a 5 vezes mais produtivo). Além de que
protege a cultura das variações climáticas e diferente de sistemas abertos ele
minimiza a contaminação por outros microrganismos competitivos (já que é
possível esterilizar ou desinfeccionar previamente o meio). Também se otimiza as
características biológicas e fisiológicas das microalgas, pois permite que sejam
cultivadas espécies que não se pode cultivar em sistemas abertos. Entretanto
algumas limitações como superaquecimento, acumulo de oxigênio, alto custo de
construção e operação, bio-incrustação e dificuldade de ampliação aumentam o
custo da produção comparada ao sistema aberto (WILLIAMS, 2002).

Em relação aos regimes de operação do PBR leva-se em consideração

algumas vantagens e desvantagens de cada regime de operação. Quando
 25

contínuo pode-se alcançar um maior grau de controle de qualidade do que na

forma de lotes, as taxas de crescimento além de serem ajustáveis podem ser
mantidas por longos períodos de tempo pois a diluição da biomassa pode ser
controlada. Nesse regime a reprodutibilidade da curva de crescimento é mais
exata podendo assim investigar melhor o sistema, porém deve-se tomar cuidado
com o fenômeno de wash-out onde a alimentação do sistema é maior do que a
taxa de crescimento exponencial. Em contrapartida em batelada pode-se obter
alguns produtos de bio-reação não relacionadas ao crescimento pois é possível
controlar um nutriente especifico e sua quantidade para determinada faixa de
crescimento. Dessa maneira se tem maior controle sobre a cepa original, evitando
mutações ao longo do tempo, isso é possível pois o tempo de processo é mais
curto, portanto a contaminação é menor e o custo inicial de equipamentos
também (WILLIAMS, 2002).

2.8. Planejamento de experimentos

Experimentos são utilizados para encontrar as características de um

sistema. Deles se abstraem uma resposta que deve ser analisada de forma
apropriada de acordo com os objetivos traçados. Fatores são as variáveis que
afetam as respostas. Um planejamento de experimentos (DOE, do inglês, design
of experiments) visa o estudo das relações dos fatores afim de otimizar os valores
repostas (PHADKE, 1988).

Na Figura 6 observa-se como funciona um processo de planejamento de

experimentos, onde a conclusão final do estudo pode ser reincorporada a outro
estudo posterior, um exemplo é o estudo exploratório dando origem a outro
experimento mais refinado.
 26

Figura 6 - Esquema geral de um processo DOE.

Fonte: autor próprio.

O método Taguchi dá possibilidade de incluir no estudo variáveis que não

são controláveis, as chamadas ruído (ex: temperatura, humidade, erro humano,
poeira, etc.) (PHADKE, 1988; TAGUCHI, 1991). A relação sinal ruído (S/N, do
inglês signal/noise) é usada como uma variável mensurável ao invés de desvio
padrão, fazendo assim com que diminuindo essa relação diminua também o
desvio padrão e vice-versa (PHADKE, 1988; TAGUCHI, 1991; PARK, 1996).

Taguchi encontrou empiricamente duas fases envolvendo S/N no processo

de otimização em que o desvio padrão é mínimo, fazendo com que a
característica desejável (que na indústria é chamada de qualidade) sempre seja
controlável (PHADKE, 1988; TAGUCHI, 1991; PARK, 1996). Dessa forma os
fatores da produção manipulada são divididos em três categorias (TAGUCHI,
1991):
 27

- Fatores de controle, que afetam a variabilidade do processo, e são medidos pela

razão S/N.

- Fatores de sinal, que não influenciam a razão S/N.

- Fatores, que também não influenciam a razão S/N.

Na pratica então, é alterado o valor da característica desejável durante o

desenvolvimento das técnicas de controle de fatores a serem usados.

Duas situações em que o uso desse conceito S/N é útil são a melhoria da
qualidade, através da redução da variabilidade e a melhoria da medição. A razão
S/N pode ser dividido em três categorias quando a característica é continua:

- Nominal é melhor: eq. 1

- Menos é melhor: eq. 2

- Mais é melhor: eq. 3

Onde é a média dos dados, é o desvio padrão de y (dados) e n é o

número de experimentos.

Portanto uma vez que a meta é minimizar a quantidade de ruído (N) deve-
se buscar, para todos os casos, a maior relação S/N que indica um melhor
resultado (TAGUCHI, 1991).

Posteriormente a execução dos experimentos é indicado o uso da análise

de variância ANOVA, que através de representação gráfica pode-se observar a
influência dos fatores sobre a resposta estudada. Essa ferramenta permite a
obtenção de valores dos fatores que otimizam os mesmos, pois ela decompõe as
origens da variação total da propriedade avaliada, fazendo assim com que ocorra
a diminuição de sua variabilidade (TAGUCHI, 1991).
 28

Comprova-se a validade dos resultados obtidos reproduzindo um

experimento com os fatores otimizados e obtendo um produto final com as
características ótimas desejadas.

Diferente da teoria clássica de planejamento de experimentos Taguchi visa

a diminuição da variância de uma função qualidade de um produto, supondo-se
que a qualidade se manterá constante para todos os níveis de todos os fatores do
modelo.
 29

3. Objetivo

O objetivo deste trabalho foi a comparação entre três diferentes formas de

pré-preparação de um meio de cultivo, que são: desinfecção por cloro,
esterilização por autoclavagem e uma cultura que não passou por nenhum tipo de
eliminação de micro-organismos concorrentes, afim de determinar qual desses
métodos produz melhores resultados. Concomitante a isso buscou-se descobrir
quais as significâncias dos fatores dentro dos níveis estudados. Os fatores foram
concentração de cloreto de sódio, nitrato e fosfato. Para isso utilizou-se as
ferramentas de análise bruta de fatores que o método Taguchi disponibiliza.
 30

4. Metodologia

4.1. Origem e acondicionamento das amostras

A cepa de microalga foi cedida pelo Instituto de Oceanográfico da USP, seu

nome de identificação é Chlorella minutissima clone 26 a. Esta foi mantida em
uma estufa a 19°C com ciclos luz/escuro de 12h, afim de simular o tempo de
iluminação natural. A potência da luz artificial foi de 15w. O meio de cultivo foi
mantido com base do meio Guillard f/2 (Anexo A) e salinidade na concentração de
30 g/L.

4.2. Produção do inóculo de microalgas

Todos os componentes da replicação ou repicagem foram

esterilizados em uma autoclave, que durante 20 minutos manteve a temperatura à
121 º C e 0,5 atm de pressão.
A primeira etapa da repicagem foi feita em períodos de 15 dias, onde
10 mL de cultura foram adicionados a 90mL de cultura nova em um erlenmeyers
de 125 mL sendo agitado manualmente uma vez por dia. Após 15 dias ocorreu a
segunda etapa onde novamente a proporção é de 1:10, portanto os 100 ml são
acondicionados em um balão volumétrico de 2000 mL com 900mL do novo meio
de cultura, a esse balão foi ligado uma vazão constante de ar que garantiu a
homogeneização adequada ao meio.

4.3. Análise de crescimento

A análise de crescimento foi feita utilizando um espectrofotômetro (marca

Femto espectro fotômetro 800 XL) com lâmpada de UV/visível. A absorção
 31

máxima observada foi em ʎ de 690 nm, sendo medida uma vez ao dia. O objetivo
desse procedimento foi traçar uma curva de crescimento (semelhante a
apresentada na Figura 4) para se identificar o começo da fase exponencial e
posteriormente o início da fase estacionária, na qual o experimento foi encerrado.
A Figura 7 mostra esse acompanhamento feito nos quatro primeiros dias, os
números em preto são guias para acompanhar o escurecimento de cada cultivo,
cada número representa um cultivo diferente.

Figura 7 – Cubetas para análise de espectrofotometria, detalhe para o escurecimento do cultivo durante o
período de tempo.

Fonte: autor próprio.

Como as microalgas passam por uma fase de adaptação ao meio de

cultivo, aonde se acostumam as novas condições em que foram expostas,
portanto os primeiros momentos da analise não apresentam dados relevantes.

4.4. Nutrientes usados na cultura

Dentre os nutrientes usados para alimentar as microalgas destaca-

se os macros nutrientes: carbono, hidrogênio, oxigênio, silício, nitrogênio, fósforo,
enxofre, potássio, magnésio, e ferro, e os micronutrientes: manganês, boro,
vanádio, selênio, cobalto, molibdênio, zinco e cobre. Alguns deles são mostrados
 32

na Tabela 3, cuja origem tem base no meio de cultivo Guillard f/2 (Anexo A).
Esses nutrientes compõem a estrutura de biomoléculas, membranas e meio
celular, participam de processos de troca de energia, regulam atividades
enzimáticas dentre outros (LOURENÇO, 2006).

Tabela 3 - Moléculas utilizadas para o preparo do meio de cultivo.

Fonte: Anexo A.

É importante salientar que as concentrações de nitrato e fosfato

(linhas 1 e 2 da Tabela 3) diferem no meio de cultivo, pois para o estudo estas
moléculas foram escolhidas como fatores e tiveram suas concentrações
alteradas.
Outros nutrientes relevantes são vitaminas como a Tiamina (B1), que age
principalmente como coenzima, a Biotina (B7) que atua no transporte de CO2 e a
Cianocobalamina (B12) cuja função não está claramente fundamentada
(LOURENÇO,2006).

4.5. Delineamento dos experimentos

Cada experimento utilizou 450mL de água em um erlenmeyer de 500mL,

na Tabela 4 são mostradas todas as constantes envolvidas. A proporção de
inóculo de microalgas usada foi de 5% do volume total do meio de cultivo, ou seja
22,5mL de inóculo para 450mL de cultivo.
 33

Tabela 4: valores das constantes.

Fonte: Adaptado de Anexo A.

4.6. Empregando o método Taguchi

Os experimentos foram executados usando um arranjo ortogonal de

Taguchi L4 que comporta a análise de 3 fatores e 2 níveis. Os fatores e seus
níveis são mostrados na Tabela 5, sendo os fatores selecionados com base em
sua importância previamente estudada, e o valor dos níveis com base no meio de
cultivo Guillard f/2 (Anexo A). Todas a análises matemáticas foram feitas usando o
programa estatístico Minitab versão 17.
Tabela 5 - Fatores selecionados para o experimento.

Fonte: autor próprio.

O arranjo ortogonal utilizado na experimentação é mostrado na Tabela 6.

 34

Tabela 6 - Experimentos determinados com base no arranjo dos fatores.

Fonte: autor próprio.

Cada experimento foi realizado três vezes (triplicata) para uma análise de
dados mais consistentes, sendo então utilizados 12 erlenmeyers.
A Figura 8 mostram cultivos mais adiantados e ilustra as diferenças visuais
obtidas em cada experimento, isso é uma indicação que as microalgas estão se
comportando de forma diferente dentro de cada conjunto de três erlenmeyers, os
números indicam os experimentos sendo 1 correspondente ao experimento 1 da
Tabela 6 e assim respectivamente.
Figura 8 – Em a, experimentos sendo executados, em b, detalhe da coloração.

Fonte: autor próprio.

4.7. Ensaios com arranjo ortogonal Taguchi L4

Uma característica comum nos três ensaios é adição dos nutrientes

provenientes das soluções-estoque cujo preparo é descrito no Anexo A. A adição
das vitaminas é feita após o processo de desinfecção e esterilização para evitar a
desnaturação das mesmas (LOURENÇO, 2006).
 35

4.7.1. Ensaio 1: sem esterilização ou desinfecção

A água usada para os experimentos, cuja origem foi a rede hídrica da EEL,
não passou por qualquer tratamento, ou seja, não foram eliminados quaisquer
tipos de micro-organismos competitivos.

4.7.2. Ensaio 2: Desinfecionada

O agente de desinfecção usado foi hipoclorito de sódio (NaClO) obtido na

forma de água sanitária. O volume de 10 ml foi adicionado a um balde contendo
20 l de água novamente proveniente da rede hídrica. Posteriormente em cada
erlenmeyer foram colocados 427,5 ml dessa solução. Após um período de 24
horas sob aeração neutralizou-se o cloro ativo com um pequeno cristal de
tiossulfato de sódio PA. A água foi testada com um teste padrão de cloro, se não
mais detectado dá-se prosseguimento aos experimentos, caso seja detectado
outro pequeno cristal é dissolvido no meio.

4.7.3. Ensaio 3: Esterilizada

A esterilização é feita em uma autoclave à temperatura de 121 º C e a 0,5

atm. de pressão durante 20 minutos. Neste caso 427,5 ml de água destilada é
colocada em um erlenmeyer junto com todos os nutrientes (com exceção das
vitaminas) dentro da autoclave. Este volume, assim como no caso anterior, é
calculado com base na porcentagem de inóculo a ser usado, sendo seu volume
22,5 ml, que representa 5% do volume total do meio de cultivo.
 36

4.8. Colheita

A floculação das microalgas foi feita através da diminuição do pH. O agente

floculante usado foi o sulfato de alumínio na concentração de 1N e o volume
respeitou a proporção de 3 ml/L. A biomassa foi decantada em um funil por uma
hora. Ouve a separação da porção inferior de interesse, microalgas decantadas e
porção superior, referente a água do de cultivo, que por sua vez foi descartada.
Esse procedimento acelera a filtração, pois menos liquido é filtrado e a formação
de flóculos maiores impede células passem pelos poros do filtro. A filtração foi
feita utilizando um papel filtro, previamente tarado e acomodado dentro de um
kitassato. Utilizou-se uma bomba à vácuo para acelerar a filtração. Ao final o
papel filtro com biomassa úmida foi acondicionado em estufa a 60ºC por 24 horas
para evaporação da água e obtenção da massa seca. A Figura 9 ilustra essas
etapas.

Figura 9 – Decantação, filtração e biomassa seca.

Fonte: autor próprio.

 37

5. Resultados e discussão

5.1. Ensaio 1: sem esterilização ou desinfecção

As médias dos valores de absorbância da triplicata são apresentadas na

Tabela 7. A leitura de absorbância do inóculo foi de 0,596.
Tabela 7 – Leituras de absorbância do ensaio 1.

A Figura 10 foi elaborada afim de ilustrar melhor a relação de cada

crescimento comparando os gráficos de todos os experimentos.

Figura 10 – Gráfico de comparação entre os experimentos do ensaio 1.

Para o cálculo do coeficiente de crescimento na fase linear foram ignorados

o primeiro e o último valor da tabela para que se obtenha um valor mais preciso.
As equações com seus respectivos valores de R-quadrado são mostradas na
Tabela 8.
 38

Tabela 8 – Equações da fase de crescimento linear.

A Tabela 9 mostra os dados recolhidos após a pesagem de cada

experimento, onde M1, M2 e M3 representam as massas obtidas em cada
repetição do ensaio. As análises dos cálculos, feitos a partir desses dados, se
apresentam na forma de três respostas: gráficos de efeitos para sinal-ruído
(Figura 13) e média (Figura 14), ANOVA (Tabela 10) e o teste T (Tabela 11).
Tabela 9 – Experimento, respostas, médias e sinal ruído (signal-to-noise: S/N) para a condição “mais é
melhor”.

Nos gráficos de efeito os fatores significativos são aqueles que apresentam

uma maior discrepância em relação as médias (linha pontilhada), tanto do sinal-
ruído (Figura 11) quanto das médias (Figura 12). No eixo x determina-se qual
ajuste usar, quando se quer aumentar o valor do fator resposta, no caso massa
em miligramas, usa-se o ponto superior a linha pontilhada, sendo o contrário
também verdade (TAGUCHI, 1991).
 39

Figura 11 – Gráfico dos principais efeitos para sinal-ruído.

Figura 12 – Gráfico dos principais efeitos para médias.

Na análise ANOVA o fator significativo é indicado pelos valores F e P, que

são duas das colunas da Tabela 10. No caso do valor-F, quanto maior o valor
correspondente de cada fator, maior sua significância. O contrário para o valor-P,
quanto menor o valor maior sua significância (TAGUCHI, 1991).
 40

Tabela 10 – Análise ANOVA.

A interpretação dos dados do teste T é semelhante, porém neste caso o

software acrescenta a coluna efeito junto a Tabela, na mesma extrai-se a
informação referente ao nível dos fatores representados pelo sinal que
acompanha o número, se negativo o fator é baixo se positivo o fator é alto. O
módulo do número indica a significância do fator, quanto maior mais significante.
Na coluna valor-T, analogamente observa-se o módulo do número, sendo também
mais significante o maior módulo. Na Tabela 11 o valor de efeito do cloreto de
sódio é -47,17, sendo, portanto, o fator significativo quando comparado com o
módulo dos outros fatores, o que indica que se deve usar o nível baixo 15 g/L
para a otimização dos futuros experimentos (TAGUCHI, 1991).
Tabela 11 - Teste T.

Portando após a constatação dos níveis se prevê através de análises

numéricas os resultados para o ensaio ideal, que neste caso seria usando os
fatores configurados da seguinte maneira: nível baixo para cloreto de sódio (15
g/L) e níveis altos para nitrato (150 mg/L) e fosfato (10 mg/L). O experimento
apresentou uma massa final de 226 mg ou 502 mg/L, considerando o volume do
cultivo como 450 ml, de biomassa seca e um S/N de 47,033.

5.2. Ensaio 2: desinfeccionada

As médias dos valores de absorbância da triplicata são apresentadas pela

Tabela 12, a leitura de absorbância para o inóculo foi de 1,261.
 41

Tabela 12 – Leituras de absorbância.

Analogamente ao ensaio anterior a Figura 13 mostra o crescimento de

todos os experimentos.

Figura 13 – Gráfico de comparação entre os experimentos.

Para o cálculo do coeficiente de crescimento na fase linear foram ignorados

o primeiro e os dois últimos valores da tabela para que se obtenha um valor mais
preciso. As equações com seus respectivos valores de R-quadrado são
mostradas na Tabela 13.
Tabela 13 – Equações da fase de crescimento linear.
 42

As análises dos cálculos, feitos a partir dos dados da Tabela 14, novamente
se apresentam na forma de três respostas: gráficos de efeitos para sinal-ruído
(Figura 14) e média (Figura 15), ANOVA (Tabela 15) e o teste T (Tabela 16).
Tabela 14 – Experimento, respostas, médias e sinal ruído (signal-to-noise: S/N) para a condição “mais é
melhor”.

Figura 14 – Gráfico dos principais efeitos para sinal-ruído.

 43

Figura 15 – Gráfico dos principais efeitos para médias.

Tabela 15 – Análise ANOVA.

Tabela 16 – Teste T.

As melhores condições são: níveis altos para cloreto de sódio (30g/L) e

nitrato (150 mg/L) e nível baixo para fosfato (5 mg/L). Esse experimento
apresentou uma massa final de 472 mg ou 1049 mg/L, considerando o volume do
cultivo como 450 ml, de biomassa seca e S/N de 53,463.
 44

5.3. Ensaio 3: esterilizada

As médias dos valores de absorbância da triplicata são apresentadas pela

Tabela 17, a leitura de absorbância para o inóculo foi de 0,518.
Tabela 17 – Leituras de absorbância.

Novamente o gráfico de comparação dos crescimentos é apresentado

sendo ilustrado na Figura 16.

Figura 16 – Gráfico de comparação entre os experimentos.

Para o cálculo do coeficiente de crescimento na fase linear foram ignorados

o primeiro e o último valor da tabela para que se obtenha um valor mais preciso.
As equações com seus respectivos valores de R-quadrado são mostradas na
Tabela 17:
 45

Tabela 17 – Equações da fase de crescimento linear.

As análises dos cálculos, feitos a partir dos dados da Tabela 14, mais uma
vez se apresentam na forma de três respostas: gráficos de efeitos para sinal-ruído
(Figura 17) e média (Figura 18), ANOVA (Tabela 19) e o teste T (Tabela 20).
Tabela 18 – Experimento, respostas, médias e sinal ruído (signal-to-noise: S/N) para a condição “mais é
melhor”.

Figura 17 – Gráfico dos principais efeitos para sinal-ruído.

 46

Figura 18 – Gráfico dos principais efeitos para médias.

Tabela 19 – Análise ANOVA.

Tabela 20 – Teste T.

As melhores condições são níveis altos para todos os fatores: cloreto de

sódio (30g/L), nitrato (150 mg/L) e fosfato (10 mg/L) esse experimento apresentou
uma massa final de 161 mg ou 358mg/L, considerando o volume do cultivo como
450 ml, de biomassa seca e S/N de 44,049.
 47

5.4 Comparação entre os ensaios

As Figuras 19 e 20 foram elaboradas para facilitar a visualização dos

principais efeitos para o sinal ruído e para a média. A escala y foi mantida
constante enquanto a escala x não, porém como essa não influencia nas
conclusões foi omitida. Como pode ser observado nas figuras, tanto para média
como para sinal ruído o nitrato no ensaio 2 se destaca dos demais fatores.
Figura 19 – Gráfico comparativo dos efeitos para sinal ruído para os três ensaios.
 48

Figura 20 – Gráfico comparativo dos efeitos para médias para os três ensaios.

Dentre os três ensaios realizados o que se mostrou mais proeminente foi o

ensaio 2, cujo experimento ideal apresentou uma massa de 1049 mg/L, mais que
o dobro de qualquer outro ensaio, sendo 502 mg/L para o ensaio 1 e 358 mg/L
para o ensaio 3. Outra característica foi o tempo necessário para que o cultivo
atinja a fase estacionária, o ensaio 2 chegou a essa fase com quase um dia de
antecedência se comparado aos outros dois. Nesse caso a maior absorbância do
inóculo usado, que é proporcional a concentração de microalgas, pode ter sido o
possível responsável por esse comportamento.
Uma possibilidade que explica o maior crescimento do ensaio 1 e 2 quando
comparado ao ensaio 3 pode ser a utilização da água da rede hídrica da EEL,
esta não foi analisada nos momentos de coleta para seu posterior uso nos cultivos
e, portanto, pode ter carregado substâncias que atuaram como nutrientes e/ou
coadjuvantes para as microalgas, uma limpeza na caixa-d’água do prédio foi feita
dias antes da coleta da água, não se sabe que tipo de agentes químicos foram
usados para tal e a disponibilidade de tempo não permitiu a realização de outra
batelada de experimentos.
 49

Quanto a discrepância do ensaio 2 quando comparado aos ensaios 1 e 3

Feng et al. (2004) já haviam estudado a relação do tiossulfato de sódio, que foi
usado para neutralizar o agente desinfetante hipoclorito de sódio, no crescimento
da microalga da espécie Chlorella minutissima, concluindo que o mesmo atua
aumentando as concentrações de lipídeos no interior da célula, mais
especificamente os lipídeos polares, portanto aumentando o peso final da
biomassa.
 50

6. Conclusões

O estudo de comparação concluiu que o método de desinfecção é um meio

confiável para a sanitização da água usada nos cultivos, sendo portando a
alternativa mais viável ao método de esterilização.
O estudo global dos fatores na faixa de nível estudada concluiu que o fator
mais significativo foi o nitrato, apresentando os maiores valores para sinal ruído e
para média de biomassa.
 51

7. Sugestões para trabalhos futuros

7.1 Análise de óleo

Os percentuais de óleos e sua composição podem ser medidos em futuras

análises afim de se descobrir a influência dos métodos estudados na
concentração final de lipídeo na célula.

7.2 Análise da água

A água usada proveniente da rede hídrica da EEL também poderia passar

por análises de composição afim de se identificar substâncias e suas
concentrações, diminuindo possíveis erros e aumentando a confiabilidade dos
futuros estudos.
 52

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Anexo

Anexo A – Meio Guillard “f/2” (Guillard, 1975)

A adição das soluções 2 a 5 à água do mar antes da autoclavagem pode

causar precipitação, sendo conveniente autoclava-las, separadamente, em um
pouco de água destilada (por exemplo, cada uma em 25mL de água destilada) ou
esteriliza-las por filtro e adiciona-las assepticamente à água do mar após a
autoclavagem. Esses componentes então, adicionados à água do mar pouco
antes da utilização do meio de cultura. A adição da solução 6 antes da
autoclavagem não causa precipitação da água do mar, mas pode causar
degradação de vitaminas.

Preparação das soluções-estoques

2. Solução-estoque de nitrato de sódio
Dissolver 7,5 g de NaNO3 em 100 ml de água destilada.
3. Solução-estoque de fosfato de sódio
Dissolver 0,5 g de NaH2PO4.H2O em 100 ml de água destilada.
4. Solução-estoque de silicato de sódio
Dissolver 3,0 g de Na2SiO3.9H2O em 100 ml de água destilada. Se
necessário a solução pode ser aquecida para promover a dissolução completa do
soluto. Essa solução deve ser guardada em frasco plástico.
5. Solução-estoque de metais-traço
Cada solução de metal (Cu, Zn, Co, Mn e Mo) deve ser preparada
separadamente
5.1. Cobre
Dissolver 0,98 g de CuSO4.5H2O em 100 ml de água destilada.
5.2. Zinco
Dissolver 2,2 g de ZnSO4.7H2O em 100 ml de água destilada.
5.3. Cobalto
Dissolver 1,0 g de CoCl2.6H2O em 100 ml de água destilada.
5.4. Manganês
 58

Dissolver 18,0 g de MnCl2.4H2O em 100 ml de água destilada.

5.5. Molibdênio
Dissolver 0,63 g de Na2MoO4.2H2O em 100 ml de água destilada.
Em seguida, preparar a solução 5.6:
5.6. Ferro seqüestreno
Dissolver 5,0 g de Fe seqüestreno em 900 ml de água destilada.
Adicionar a esta última solução 1,0 ml de cada uma das soluções-estoque
primária de metais-traço (soluções 5.1-5.5) anteriores e ajustar o volume final para
1,0 litro. O pH dessa solução é de 4,5. A solução de Fe seqüestreno, indicada na
formulação original do meio de cultura f/2, é de difícil obtenção, mas pode ser
substituída de forma bem-sucedida pela solução a seguir.
Solução 5.6 alternativa: ferro quelado
Dissolver 4,36 g de Na2EDTA em 900 ml de água destilada; em seguida,
adicionar à mesma solução 3,15 g de FeCl3.6H2O.
Da mesma forma que na formulação original do meio f/2, adicionar a esta
última solução 1,0 ml de cada uma das soluções-estoque primárias de metal-traço
(soluções 5.1-5.5) anteriores e ajustar o volume final para 1,0 litro. O pH final é de
± 2,0 e a solução é amarelada em função da presença de grande quantidade de
ferro. A adição de 1,0 ml dessa solução ao meio de cultura não acarreta variação
significativa no pH do meio.
6. Solução-estoque de vitaminas

Todos os componentes da solução de vitaminas são dissolvidos no mesmo

volume de água destilada, que totaliza 1.000 ml. Esta solução pode ser
esterilizada por filtração (filtros de 0,22 µm de poro), distribuída em frascos
pequenos esterilizados e guardada em geladeira ou congelador. Adicionar as
vitaminas ao meio de cultura, após a autoclavagem do mesmo.
Observações:
Geralmente, a adição das soluções de nitrato e de fosfato à água do mar
antes da autoclavagem não causa precipitação. Todavia, quase sempre as
soluções de silicato e de metais-traço provocam precipitação do meio de cultura,
sendo autoclavadas separadamente.