PROYECTO FINAL DE SERVICIO SOCIAL

Nombre: AVILA CASTAÑEDA AURORA

Matrícula: 96225466

Teléfono: 57606289

Licenciatura: Biología

División: Ciencias Biológicas y de la Salud (CBS).

Unidad Universitaria: Iztapalapa

Trimestre lectivo: 02-P

Titulo del Proyecto de Investigación: “Simbiosis Micorrícica Arbuscular en Helechos”.

Titulo del trabajo de Servicio Social: Aplicación de diferentes técnicas para la

realización de cultivos axénicos y monoxénicos de hongos micorrícicos
arbusculares (HMA) con gametófitos de helechos.

Nombre del asesor: M. en C. Irma Reyes Jaramillo.

Lugar de realización: Laboratorio de Edafología AS-104 y S-159. En la UAM-Iztapalapa,

Av. San Rafael Atlixco 186, Col. Vicentina, Iztapalapa. 09340. México. D.F.

Clave de registro: B.023.02

1
Nombre: AVILA CASTAÑEDA AURORA

Matrícula: 96225466

Licenciatura: Biología

Título del Proyecto: APLICACIÓN DE DIFERENTES TÉCNICAS PARA LA REALIZACIÓN DE

CULTIVOS AXÉNICOS Y MONOXÉNICOS DE HONGOS MICORRÍCICOS ARBUSCULARES
(HMA) CON GAMETÓFITOS DE HELECHOS.

Registro del Servicio Social y fecha de entrega: B. 023.02 - 27/01/03

Nombre y adscripción del asesor: M. en C. IRMA REYES JARAMILLO Departamento de

Biología, D-CBS, UAMI.

Objetivo

1.- Realizar cultivos axénicos y monoxénicos con diferentes especies de hongos

micorrícicos arbusculares y de gametófitos de helechos, para probar su eficiencia en la
obtención de inóculo.
2.- Aplicar diferentes técnicas para obtener los cultivos axénicos y monoxénicos y
preservación del material biológico empleado.

Resultados

De macetas trampa se aislaron esporas de HMA de los géneros Gigaspora gigantea y

Glomus spp. Se hicieron cultivos axénicos de gametófitos de Blechnum occidentale y de
Tectaria mexicana. Estos cultivos se inocularon con las esporas de los HMA y se
establecieron así, cultivos monoxénicos, se hizo el seguimiento, se observo abundante
crecimiento micelial durante los primeros seis meses, no se ha observado esporulación.
Por otra parte, se hicieron cultivos axénicos con raíces de jitomate y tomate.
Finalmente con raíces de plantas de maíz cultivadas en mesetas trampa, se hicieron
tinciones con azul de Trypan, y de las preparaciones logradas se tomaron microfotografías de
hifas, vesículas, esporas intraradicales y arbúsculos

Conclusión

La dificultad de observar y estudiar a los HMA en el suelo ha propiciada que los

investigadores diseñen distintos medios de cultivo in vitro. A la fecha se han logrado obtener
sepas puras empleando raíces transformadas y no transformadas, lográndose así, una gran
producción de esporas libres de contaminación que permiten realizar estudios de diferente
índole. La inoculación de gametófitos de helecho es una propuesta experimental nueva que
pretende, aprovechar las características de estas microplantas para producir también inoculó
de HMA in vitro. Para lograrlo se requiere seguir experimentando con diferentes especies
tanto de helechos como de los HMA, lo cual no se resuelve en un corto plazo.

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APLICACIÓN DE DIFERENTES TÉCNICAS PARA LA REALIZACIÓN DE CULTIVOS
AXÉNICOS Y MONOXÉNICOS DE HONGOS MICORRÍCICOS ARBUSCULARES (HMA)
CON GAMETÓFITOS DE HELECHOS.

Introducción

La historia de la micorriza arbuscular se remonta a 460 millones de años, en el período

Devónico. Evidencias fósiles (Taylor et al., 1995) y moleculares (Simon et al., 1993) señalan
esta época como el principio de la asociación entre los antecesores de las actuales plantas
terrestres y los actuales hongos formadores de micorrizas arbusculares (HMA) (Zigomicota,
orden Glomales) (Morton y Benny, 1990). Desde entonces, los hongos MA y las plantas han
evolucionado conjuntamente hasta nuestro tiempo. El hecho de que, en la actualidad, más del
80% de las plantas terrestres formen MA en condiciones naturales (Smith y Read, 1997) da
una idea del éxito de la simbiosis entre ambos organismos (Bago et al., 2000).

Las micorrizas son simbiosis entre hongos y raíces de plantas superiores. Las plantas
suministran al hongo fuentes de carbono procedentes del producto de la fotosíntesis, además
de un nicho ecológico protegido de los fenómenos de antagonismo microbiano en la rizosfera.
Por su parte, el hongo ayuda a la planta a absorber nutrimentos del suelo, principalmente
fósforo, y nitrógeno entre otros (Azcón et al., 1980).

La infección vesículo arbuscular (VA) origina pocos cambios morfológicos en la raíz.

La infección se desarrolla a partir de clamidosporas (esporas de resistencia formadas por el
hongo) o bien a partir del micelio originado en una raíz previamente infectada. Las
clamidosporas, que resisten condiciones adversas en el suelo, tales como el calor y la sequía,
germinan cuando las circunstancias son favorables, pero los tubos de germinación producidos
mueren al no infectar una raíz huésped. En este caso, el tubo de germinación, o la hifa
infectiva, forma un apresorio sobre la superficie de la raíz, produciéndose así la penetración
del hongo, que tiene lugar normalmente entre dos células epidérmicas. A continuación, la hifa
invasora se ramifica intercelularmente, de forma rápida, en las células corticales de la raíz, sin
invadir endodermis, tejidos vasculares ni meristemos (Azcón et al., 1980).

Poco tiempo después de iniciada la infección se desarrollan los arbúsculos mediante

ramificaciones dicotómicas de hifas intracelulares. En algunos géneros se forman unas
estructuras ovoides llamadas vesículas, que contienen material lipídico de reserva, que se
pueden forman intra o intercelularmente y tanto fuera como dentro de la raíz (Azcón et al.,
1980).

El interés por el micelio externo de la MA no es reciente, hay diferentes estudios donde

se han centrado en la descripción de sus características morfológicas y fisiológicas más
relevantes. Los cuales han puesto de manifiesto que por cada metro de raíz colonizada se
producen entre 7 y 250 m de hifas externas de HMA (Barea et al., 1991;Smith y Read,1997),
dependiendo de la especie de hongo implicado y de las condiciones de crecimiento. De igual
manera, el micelio extraradical ha mostrado ser capaz de captar eficazmente nutrimientos
(Gianinazzi-Pearson y Azcón-Aguilar, 1991; Smith y Read, 1991; George et al., 1995), en
especial el fósforo (Harrison y Van Buursen, 1995; Jakobsen, 1995), nitrógeno (Johansen et
al., 1992, 1993; Tobar et al., 1994), y algunos micronutrimentos esenciales para la planta
(George et al., 1995), citados por Bago et al., (2000).

3
 En los trabajos arriba citados utilizaron suelo como sustrato de crecimiento. Aunque
definitivamente el suelo es el sustrato más natural para llevar a cabo estos ensayos, la
dificultad de controlar sus cualidades físicas y químicas y su actividad biológica pueden
dificultar en ocasiones la interpretación de los resultados obtenidos. De igual manera, el
estudio de la morfología y arquitectura de las hifas externas se complica por las partículas de
suelo que ocultan, probablemente, las estructuras fúngicas más finas. El desarrollo en la
última década de un sistema de cultivo que permite el crecimiento in vitro en medios
gelificados del hongo MA en simbiosis con una raíz hospedadora, ha contribuido de manera
importante al estudio de la fisiología y la arquitectura del micelio extraradical de los Glomales
(Bago et al., 2000).

Uno de los primeros hechos que se evidenciaron durante el estudio de los hongos MA
es que estos organismos no son capaces de completar su ciclo de vida en ausencia de una
raíz hospedera, es decir, en condiciones axénicas (Azcón-Aguilar et al., 1991, 1998). Ninguno
de los medios de cultivo comúnmente utilizados en el laboratorio para el crecimiento de
microorganismos parece cubrir las necesidades básicas de los hogos MA, lo que ha llevado a
considerarlos como simbiontes obligados (Azcón-Aguilar et al., 1991,1998). Tras esta
constatación, los siguientes pasos consistieron en intentos para llevar a cabo cultivos duales
en medios gelificados, es decir, cultivos en los que, además del hongo, esté presente la raíz
de una planta hospedera: es lo que se denomina cultivos monoxénicos (es decir dos
organismos en cultivo puro) (Williams, 1992; Azcón-Aguilar et al., 1998), citados por Bago et
al., (2000).

La relación entre micorrizas (VA) y varios grupos de plantas ornamentales es benéfica,

se ha observado que en los gametofitos de los helechos puede tener lugar esta asociación
con hongos endofíiticos, como ocurre en gametófitos subterráneos, aclorofílicos de
pteridofitas.

En los protalos de los helechos, el hongo micorrícico penetra a través de los rizoides,
desarrolla apresorios y en las células protalicas puede formar vesículas y arbúsculos. Los
hongos endofíticos infectan las raíces primarias de los esporofitos de manera similar que en
los gametofitos (Schmid y Oberwinkler, 1995).

Las asociaciones micorrícicas son comunes en las raíces de esporofitos de helechos y

de pteridofitas, como se conoce desde Rayner (1927). Los hongos endofíticos en gametófitos
de briofitas y de peridofitas se iniciaron con Gallaud (1905). Las micorrizas arbusculares de
gametófitos clorofílicos de helechos es la que menos se conoce, se han estudiado en
Marattiaceae, Gleicheniaceae y más recientemente en Gleichenia bifida (Willd.) Spreng
(Schmid & Oberwinkler, 1995), citados por Reyes J. I. (2001).

4
Objetivo

1.- Realizar cultivos axénicos y monoxénicos con diferentes especies de hongos

micorrícicos arbusculares y helechos, para probar su eficiencia en la obtención de
inóculo.

2.- Aplicar diferentes técnicas para obtener los cultivos axénicos y monoxénicos y
preservación del material biológico empleado.

Metodología

1. Aislamiento de esporas de suelo por el método de decantación (Gerdemann y

Nicolson,1963; Brundrett et al.,1996) Anexo l.

2. Selección y limpieza de las esporas aisladas, bajo microscopio estereoscópico.

3. Esterilización en superficie y germinación de las esporas de los HMA (Chabot et al.,

1992) Anexo ll.

4. Preparación de medios de cultivo Thompson (Klekowski, 1969) Anexo lll, M, MW

(Bécard et al., 1988) Anexo V, agar, (Bago et al., 1998).

5. Esterilización y siembra de esporas de helechos (Warne T. R. et al., 1986) Anexo lV.

1. Cultivos axénicos de raíces no transformadas (Chabot et al., 1992; Bago et al., 1998)
Anexo Vl.

2. Cultivos monoxénico (Bago et al., 1998) Anexo Vll.

3. Seguimiento de los cultivos.

4. Tinción y observación de estructuras micorrícicas en raíces (Phillips y Hayman, 1970;

Brundrett et al.,1996) Anexo Vlll.

5. Microfotografías de preparaciones de raíces micorrizadas obtenidas de macetas

trampa.

6. Resultados.

5
Plan de trabajo desarrollado durante el servicio social.

Etapas durante el servicio social 2002-2003

Actividades Agosto Septiembre Octubre Noviembre Diciembre Enero

Revisión bibliográfica v v v v v v
Aislamiento de esporas v v v v
obtenidas de suelo de
macetas trampa por el
método de decantación.
Selección de y limpieza de v v v v
las esporas aisladas, bajo
microscopio estereoscópico.
Esterilización en superficie y v v v v
germinación de las esporas
de los HMA.
Preparación de medios de v v v
cultivo.
Esterilización y siembra de v v v v
esporas de helechos
Seguimiento de los cultivos. v v v v v v
Tinción y observación de v v v v
estructuras micorrícicas en
raíces.
Macrofotografías de v
estructuras micorrícicas.
Cultivos de raíces no v v v
trasformadas.
Evaluación de los v v
resultados.

Objetivos y metas alcanzados

Se realizaron cultivos axénicos de dos especies de helechos Blechnum occidentale y

Tectaria mexicana, en medios de cultivo el de Thompson y el MW, también se realizaron
cultivos axénicos con raíces no transformadas de tomate y jitomate.

Se inocularon cultivos de helechos, con diferentes especies de hongos micorrícicos

arbusculares, se observo la germinación y crecimiento de hifas de estos.

Se hicieron preparaciones fijas de raíces micorrizadas obtenidas de macetas trampa,

de las cuales se fotografiaron las diferentes estructuras de los hongos micorrícicos
arbusculares, que se asociaron a su rizosfera.

6
Resultados

Se obtuvieron esporas de Gigaspora gigantea (Nicol. & Gerd.) Gerd & Trappe y de
Glomus sp. de diferentes macetas trampa, con suelo traído de Valle Nacional, Oaxaca y de
Rincón de Ugarte, Tejupilco de Hidalgo, México. Las esporas se esterilizaron en superficie y
se sembraron para su germinación en agar al 8%. Se inocularon con ellas cultivos de
gametófitos de T. mexicana y B.occidentale, se observo la germinación de las esporas HMA, y
el crecimiento de hifas asociándose con los gametófitos de los helechos.

pi

h
p

51.2 X 40 X
Fig. 1. Preparación fija de esporas de Gigaspora gigantea. e:
espora entera, p: pared celular, pi: pared interna, h: hifa de
sustentación. A la derecha espora rota .

Fig.2. Cultivo de gametófitos de Tectaria

mexicana inoculado con esporas de
HMA.

Se realizaron diferentes medios de cultivo de Thompson y MW donde se sembraron

esporas de B. occidentale y T. mexicana.

7
 Fig. 3. Cultivo de gametófitos de Blechnum occidentale en medio de Tohmpson.

Se hicieron cultivos de raíces de tomate y de jitomate, de los cuales se obtuvo una

mejor adaptación de las raíces de tomate.

Fig. 4. Raíces de tomate creciendo en medio MW.

De las macetas trampa con suelo de Rincón de Ugarte y de Morelos, se tiñeron las
raíces de maíz por el método de Phillips y Hayman (1970). Se hicieron preparaciones fijas en
lactoglicerol, para observar las estructuras micorrícicas.

Fig. 5. Raíces de maíz teñidas con Trypan azul.

8
 En las preparaciones se observaron: vesículas, hifas que se conectan con las
vesículas, hifas de sustentación de las esporas, esporas, y arbúsculos. Las esporas
intraradicales en los Glomales es poco frecuente, sin embargo se han encontrado en Glomus
intraradices y Glomus agregatum.

c
e

40.32 X

Fig. 6. Microfotografía de raíz de maíz; con

estructuras micorrícicas. e: espora, h: hifa de
sustentación, v: vesícula, c: células radicales.

100.8 X 78.75 X

Fig. 7. Vesículas encontradas en la raíz de Fig. 8. Hifa unida a una vesícula, paralela a
maíz, suelo de Morelos. esta estructura se encuentra un arbúsculo.

9
 51.2 X 64 X

Fig. 9. Vesículas y esporas, intraradicalmente. Fig. 10. La flecha de la derecha nos señala
una espora con su hifa de sustentación, la
de la izquierda nos señala una vesícula.

Célula cortical

arbúsculo

197 X
Fig. 11. Arbúsculo en raíz de maíz.

espora parda

hifa de
sustentación

célula cortical

75.6 X
252 X
Figs. 12 y 13. Formación de esporas intraradicalmente de Glomus sp.

10
Discusiones y Conclusiones.

El interés que se ha tenido por los hongos micorricícos arbusculares, ha impulsado a

los investigadores, a la formación de diferentes medios de cultivo para su obtención in vitro y
así lograr una sepa pura de las cual se pueda tener la mayor información de sus
características morfológicas y fisiológicas entre otras, además de hacer estudios de diferente
índole. En la última década se a creado un sistema de cultivo que permite el crecimiento in
vitro en medios gelificados del hongo MA en simbiosis con una raíz hospedadora, ha
contribuido de manera importante al estudio de la fisiología y a la arquitectura del micelio
extraradical de los Glomales (Bago et al., 2000).

La obtención de inóculo de los hongos MA es difícil de tener por medios axénicos ya

que se a observado que estos hongos no pueden completar su ciclo vida si no están
asociados en simbiosis con una raíz. Por lo anterior es que se trabaja con cultivos
monoxénicos, donde dos organismos, la raíz de una planta y los HMA interaccionan. De esta
manera se a podido obtener inóculo bajo condiciones controladas evitando la contaminación
por hongos y bacterias, lo cual no es fácil y menos cuando se extraen esporas del suelo y no
se conocen incluso su clasificación.

En la propuesta de realizar cultivos monoxénicos de gametófitos de helechos y HMA

se tiene que resolver varios aspectos relacionados con los medios de cultivo, debido a que por
separado in vitro cada uno tiene necesidades diferentes, y al tratarse de organismos
autótrofos fotosintéticos, los helechos no pueden crecer en la oscuridad como ocurre en los
cultivos monoxénicos con raíces.

Para resolver esto se realizaron medios de cultivo axénicos para los gametófitos de B.
occidentale y T. mexicana en medio de Thompson. Por otra parte también se sembraron en
medio MW que es el mas utilizado para los HMA que contiene diferentes micro y macro
nutrimentos, así como sacarosa, lo cual propicio una mayor contaminación de los cultivos de
gametófitos.

Otro factor que se ha observado en otras investigaciones como las de Mosse (1962),
es que existe una bacteria en los suelos que ayuda a que se lleve a cabo tal simbiosis entre
los HMA y la raíz hospedera, por lo que se han intentado realizar cultivos dixénicos, es decir
con tres organismos implicados en un mismo medio de cultivo (Bago et al., 2000), esta puede
ser otra razón por la cual la simbiosis en nuestros cultivo sea más lenta y difícil de que suceda.

En las preparaciones de raíces de maíz se pudieron observar con claridad todas las
estructuras micorrícicas de los HMA, aunque no se tiene identificada la especie,
probablemente se trate de Glomus intraradices o Glomus agregatum, por la esporulación
intraradical que se observó.

La aplicación de técnicas y métodos in vitro para la obtención del inóculo micorrícico,

nos da información del comportamiento morfológico y fisiológico que presentan los HMA y nos
permite experimentar, así como conocer las relaciones que se pueden presentar en cada
especie, ya sea creciendo con una raíz con otro organismo como los gametófitos de helecho.

La inoculación de gametofitos de helecho no se ha experimentado y se piensa que

puede ser otra forma de obtener inóculo in vitro de HMA, ya que estos son diminutos, tienen
estructuras más simples que las raíces (los rizoides), son autótrofos, realizan fotosíntesis y se
pueden obtener en gran cantidad a partir de las esporas que por miles se producen en las
hojas de los esporofitos. Al tener éxito con los cultivos monoxénicos de los gametófitos y HMA,

11
 seria muy fácil hacer el seguimiento de la simbiosis, por la sencillez y transparencia de sus
estructuras. Sin embargo, todavía hay dificultades en su obtención y se requiere seguir
experimentando con diferentes especies de ambos organismos.

Criterios de evaluación.

La evaluación esta en función del desempeño del estudiante en las diferentes

actividades que se llevaron a cabo durante el estudio que se esta realizando. En su
participación y criterio en diferentes etapas, así como en la elaboración de preparaciones fijas,
cultivos, fotografías, etc.

Bibliografía

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Bécard G., Fortin A. J. 1988 Early events of vesicular-arbuscular mycorrhiza formation on Ri T-DNA
transformed roots. New Phytol. 108: 211-218.

12
Bécard, G. y Piché, Y. 1990. Physiological factor determining vesicular-arbuscular mycorrhizal
formation in host and no host Ri T-DNA transformed roots. Can. J. Bot. 68: 1260-1264.

Bécard, G. y Piché, Y. 1992. Establishment of Vesicular-Arbuscular Mycorrhiza in Root Organ Cultura:

Review and Proponed Methodology. Methods in Microbiology. 24: 33-42.

Brundrett, M., Bougher, N., Dell, B., Grove, T. & Malajazuk N. 1996. Working with mycorrhiza in
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Warne, T.R., Walker G., Hickok L.G. 1986. A novel Method for surface-sterilizing and sowing Fern
spores. Am. Fern J. 76: 187-188.

13
 ANEXO l

Extracción de esporas por decantación y gradiente de sacarosa (Gerdemann y

Nicolson,1963; Brundrett et al., 1996).

1. Se toma el suelo de una maceta trampa y se vacía en un recipiente de plástico, al cual

se le agrega agua y se mueve vigorosamente con las manos disolviendo los
agregados especialmente los retenidos por las raíces, para que así se liberen las
esporas y queden en la suspensión del suelo.
2. Posteriormente se deja sedimentar el suelo y posteriormente se decanta por medio de
unos tamices.
3. El sobrenadante es tamizado a través de tres tamices de 2.38mm y 0.420mm, lo que
queda en el tercer tamiz de 0.050mm es vaciado a tubos de ensayo.

4. Los tubos con el sobrenadante se pusieron a peso constante para la centrifugación.

5. Se centrifuga durante 4 minutos a 2000 rpm.

14
6. Después, el sobrenadante se desecha ya que contiene esporas muertas y restos
orgánicos.
7. Al suelo que queda en el fondo de los tubos, por medio de una pipeta se les agregan
10 ml de una solución de sacarosa (70g/100ml), partiendo del fondo del tubo para
poder generar un gradiente, que ayude a la separación de las esporas del resto del
suelo.
8. Los tubos se vuelve a centrifugar durante 16 seg. a 2000rpm.
9. De manera rápida el contenido de los tubos se vacía en un tamiz de 0.050 mm y se
enjuaga con abundante agua destilada. El material concentrado en el tamiz se
recupera con ayuda de una pipeta en una caja de Petri.

10. Las esporas son separadas y clasificadas bajo el microscopio estereoscópico, por
medio de unas pinzas o una pipeta Pasteur.

11. Las esporas se colocan sobre papel filtro húmedo y sellando la caja de Petri con
parafilm se pueden conservar en el refrigerador por varios días.
12. Las raíces que se retiraron de las macetas trampa se enjuagaron y se guardaron en
frascos de vidrio en FAA (200 ml de alcohol al 50% + 13 ml de formol + 0.5 ml de ácido
acético) ya que no se tiñen al momento de su extracción.

15
 ANEXO ll

Esterilización de esporas de HMA (Chabot et al., 1992).

ü Esterilización de las esporas en superficie

1. A partir de este paso se trabaja en condiciones estériles.

2. Se prepararon las soluciones esterilizantes con cloramina y dos antibióticos.
a) Solución de cloramina T al 2%.
b) Solución de gentamicina 10mg/100ml + estreptomicina 20mg/100ml.
• Su preparación es con agua destilada estéril.

3. Se colocan las esporas en un frasco estéril con tapadera y se le agrega un poco de la

solución de cloramina T al 2%, se agita durante 10minutos.

4. Se vaciaron en un pequeño tamiz estéril y se coloca en una caja de Petri, donde se

enjugaron con agua destilada estéril repetidas veces.
5. La esterilización se repite con antibióticos gentamicina + estreptomicina, se agita
durante 20 min. Se desecha la solución y se enjuaga repetidas veces con agua
destilada estéril.
6. Bajo campana de flujo laminar o bien trabajando cercas de un mechero las esporas se
siembran colocándolas en la superficie del agar contenido en cajas de Petri. Las
cuales finalmente se sellan con parafilm y meten en la incubadora a 25°C, en la
oscuridad.

16
 ANEXO lll

Medio de Cultivo Thompson para Pteridophytas (Klekowski, 1969).

Macroelementos (solución stock)

1.Nitrato de amonio NH4NO 3 2.5 g /100 ml
2.Fosfato de potasio KH2PO4 2 g /100 ml
3.Sulfato de manganeso MgSO4 . 7H2O 1 g /100 ml
4.Cloruro de calcio CaCl2 1 g /100 ml

Microelementos (solución stock)

5.Sulfato de manganeso 0.022 g /l
6.Sulfato de copper 0.024 g /l
7.Sulfato de zinc 0.029 g/ l
8.Ácido borico
0.186 g /l
9.Molibdeno de amonio
10.Sulfato ferroso 0.0035 g /l
11.EDTA 2.5 g /l
3.7 g /l

Ingredientes para el medio de crecimiento

1. Un litro de agua destilada
2. 10 g de agar
3. Macroelementos de solución stock
1 5 ml
2 25 ml
3 12 ml
4 2 ml
4. Microelementos de solución stock
5 10 ml
6 10 ml
7 10 ml
8 10 ml
9 10 ml
10 10 ml
11 10 ml
ü Se esteriliza 20 minutos a 120°C que es igual a 15ib
ü Se vacía en cajas de Petri estériles y se sellan con parafilm, se guardan en el
refrigerador.

17
 ANEXO IV

Esterilización de esporas de helechos (Warne et al., 1986).

ü Esterilización de las esporas en superficie.

1. Se debe trabajar en condiciones asépticas.

2. Preparar una solución de hipoclorito de sodio (blanqueador) en una relación 1:6.
3. Se introducen las esporas en un frasco estéril con tapadera, y se añade un poco de la
solución esterilizante.

4. Mantener en agitación constante durante 2 minutos.

5. Las esporas se extraen con una jeringa estéril y se hacen pasar por un filtro (millipor).

18
 6. Con la misma jeringa se inyecta agua destilada estéril repetidas veces, para quitar el
exceso de clorox.
7. Con unas pinzas estériles se toma el papel que contiene las esporas y se siembran en
cajas de Petri con medio de Tompson y MW.
8. Con una varilla de vidrio en forma de bastón estéril se esparcen las esporas en la
placa del cultivo.
9. Se sellan las cajas de Petri con parafilm y se guardan en bolsas transparente de
polietileno y se exponen a la luz en una germinadora o en una ventana, para que
germinen.

ANEXO V

Medio de Cultivo M y MW para HMA (Bécard et al., 1988).

Reactivos M (1l) MW (1l)

Macroelementos de M/MW 100 ml 100 ml
Nitrato de calcio 100 ml 100 ml
NaFe/EDTA 5 ml 5ml
KI 1 ml 1 ml
Microelementos 1 ml 1 ml
Vitaminas 10 ml 10 ml
Sacarosa 10 g 30 g
Phytogel o Agar 3.5 g 3.5 g
ü Ajustar el pH a 5.5 con NaOH O KOH; HCl.

19
 ü Se esteriliza 20 minutos a 120°C que es igual a 15ib.
ü Se vacía en cajas de Petri y se sellan con parafilm, se guardan en el refrigerador.

ANEXO Vl

Cultivos axénicos de raíces no transformadas (Chabot et al., 1991; Bago et al., 1998).

ü Esterilización de semillas en superficie.

1. A partir de este paso se trabaja en condiciones estériles.

2. Solución esterilizante de semillas: 50 ml de cloros + 50 ml de agua destilada.
3. Se introducen las semillas en un tubo estéril con tapadera se le añade la solución
esterilizante.

20
 4. Mantener en agitación constante durante 15 minutos.
5. Se realizan tres lavados de 5, 10 y 15 minutos con agua destilada estéril, agitándose
suavemente y constantemente, se desecha el agua en cada lavada.
6. Recuperar las semillas y distribuirlas en cajas de Petri que contengan medio M.

7. Sellar las cajas con parafilm y se incuban las cajas a 25°C en la oscuridad hasta que
las semillas hayan germinado y presentado una radícula de unos 4 a 5 cm.

a) Inicio de los cultivos

Con la ayuda de una pinza y un bisturí estériles se cortan las radículas de las semillas
germinadas y se transfieren a las cajas de Petri que contienen el medio MW. Posteriormente
se sella la caja con parafilm y son incubadas en la oscuridad a 25°C de 3 a 5 días, hasta que
las raíces atraviesen completamente la placa del medio de cultivo y presente raíces
secundarias.

21
 b) Mantenimiento de los cultivos

Con la ayuda de una pinza y un bisturí estériles se cortan las zonas apicales de las raíces, se
transfieren a nuevas cajas de Petri con medio de MW, estas son selladas y nuevamente se
incuban durante 3 a 5 días.
El paso anterior se repite tres veces, para “acostumbrar” a las raíces a sus nuevas
condiciones in vitro. Tas este tiempo las raíces están preparadas para utilizarse en cultivos
monoxénicos.

ANEXO Vll

Cultivos monoxénico (Bago et al., 1998).

1. Se trabaja en condiciones estériles.

2. Se utiliza un medio de cultivo de raíces no transformadas de tomate, jitomate y
gametofitos de helechos.
3. En estos medios se colocan las esporas de los hongos micorrícicos arbusculares que
estaban germinando en las cajas de Petri con agar.
4. Las caja son selladas con parafilm y se incuban a 25°C.

ANEXO Vlll

Procedimiento para teñir estructuras fungales en raíces de plantas (Phillips y Hayman,

1970; Brundrett et al., 1996).

1. Se toman las raíces finas menores de 2 mm de diámetro y se lavan cuidadosamente

por medio de un tamiz. Cuando la tinción no se puede llevar a cabo de inmediato, se
deben guardar las raíces en solución de FAA: 200 ml de alcohol al 50% + 13 ml de
formol + 0.5 ml de ácido acético.

22
2. Lavar las raíces si se fijaron en FAA,

3. Colocar las raíces en frascos de vidrio con hidróxido de potasio (KOH) al 10% y
dejarlas de 2 a 3 días, esto dependerá de la especie,
4. Decantar la solución de KOH y lavar las raíces tres veces,
5. Se cubren las raíces con peróxido de hidrógeno (H2 O2) [567 ml de agua + 30 ml de
peróxido de hidrógeno al 10% + 3 ml de hodróxido de amonio]; esto se debe preparar
diariamente. Después de 10-20 minutos decantar la solución anterior y nuevamente
lavar las raíces cuidadosamente con agua.

6. Las raíces e cubren con ácido clorhídrico (HCl) al 10% para neutralizar el KOH, se
agita el frasco con las raíces y se dejan en el ácido por lo menos 15 minutos.
Decantar el ácido y poner el colorante Trypan azul al 0.5% o 0.08% en lactofenol
compuesto de [ácido láctico + glicerol + agua en proporciones 1+1+1], se dejan en
esta solución de 2 a 3 días ( hay especies que con menos de una hora se tiñen bien).
Para acelerar la tinción se puede calentar en baño María a 90°C.

23
7. Se decanta el Trypan azul lactoglicerol y se reemplaza con lactoglicerol sin trypan
azul. Si conserva el frasco bien cerrado la muestra se puede almacenar hasta 6
meses.

8. Se separa el material que sirve para las preparaciones fijas bajo un microscopio
estereoscópico, las preparaciones son fijadas con lactoglicerol, se eligen algunas
preparaciones y se toman algunas microfotografías en microscopio compuesto.

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