Agrobiotecnología

Curso 2007

Vacunas Veterinarias
Andrés Wigdorovitz

Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Universidad de Buenos Aires
Sumario

Tipos de vacunas

Nuevas vacunas

Referencias

Agrobiotecnología

Vacunas
veterinarias
 Tipos de vacunas

Agrobiotecnología

Vacunas
veterinarias
Conceptos
introductorios
• El objetivo de la vacunación es generar una
respuesta inmune protectora de larga duración
mediante la estimulación de una respuesta
inmune adecuada.

• La vacunación reduce la cantidad de agente

infectante ante una exposición. Usualmente
no se logra inmunidad esterilizante.

• Las vacunas pueden ser preventivas

o terapéuticas.

• El mercado mundial de vacunas veterinarias

Agrobiotecnología
alcanza los 2000 millones de dólares anuales.
Vacunas
veterinarias
Características
de una vacuna
ideal: • Segura

• Específica

• Protectora

• Inmunidad duradera

• Debe prevenir la dispersión

del patógeno

• Aplicación en dosis única

• Bajo costo y estable

Agrobiotecnología
• Fácil de administrar
Vacunas
veterinarias
Vacunas
en medicina • Convencionales:
veterinaria - La gran mayoría de las vacunas licenciadas
al presente pertenecen a esta categoría.
- Estas vacunas se desarrollan empíricamente
y no se necesita un amplio conocimiento del
patógeno y de la respuesta inmune que induce.

• Modernas:
- Incorporan para su desarrollo tecnologías del
ADN recombinante y de purificación de proteínas.
- Estas vacunas se basan en un desarrollo racional
donde se utiliza la información derivada del
Agrobiotecnología
estudio de la respuesta inmune que el agente
Vacunas patógeno genera así como de cuales son los
veterinarias
antígenos principales.
Vacunas
actuales

- Microorganismos muertos (inactivados).

- Microorganismos vivos atenuados.

- Toxoides bacterianos.

Agrobiotecnología

Vacunas
veterinarias
Vacunas
inactivadas

Inactivados
Tratamiento

Patógenos
(químico, calor,
irradiación, etc.)

Agrobiotecnología

Vacunas
veterinarias
En las
vacunas
inactivadas • Ventajas:
el agente
- Son fáciles de producir.
biológico - Son estables.
no se replica - Son más seguras que las vacunas
en el basadas en microorganismos atenuados.

hospedador • Desventajas:
- No generan una respuesta inmune
de larga duración.
- No generan reacciones adversas debidas
al uso de adyuvantes.
- Requieren gran cantidad de antígeno.
Agrobiotecnología
- El agente vacunal puede no estar
Vacunas
completamente inactivado.
veterinarias
 Vacunas a toxoides

Tratamiento
químico

Toxina bacteriana
activa
Vacunas vivas atenuadas

Pasajes sucesivos en distintos hospedadores

Patógenos Atenuados
En las vacunas
basadas en • Ventajas:
microorganismos
atenuados - Son eficaces.
el agente - Requieren una única dosis.
biológico se
- Generan una respuesta inmune
replica en el
de larga duración.
hospedador
- No requieren adyuvantes.

• Desventajas:

- El microorganismo puede revertir

a una forma virulenta.
- La atenuación puede ser excesiva o
Agrobiotecnología insuficiente.

Vacunas - Requieren cadena de frío para

veterinarias
su conservación.
Desventajas
de las vacunas
convencionales • Inactivación completa
(patógeno
inactivado/ • Reactivación de la patogenicidad
atenuado)
• No se diferencian vacunados de infectados

• Manipuleo del agente infectado durante

el proceso de producción

• Reacciones inespecíficas con otros patógenos

• Reacciones de hipersensibilidad
Agrobiotecnología por los inactivantes usados
Vacunas
veterinarias
 Nuevas vacunas

Agrobiotecnología

Vacunas
veterinarias
¿Por qué
nuevas
• Enfermedades infecciosas donde los métodos
vacunas?
tradicionales fallaron.
• Nuevas regulaciones de las autoridades
sanitarias.
• Uso de la tecnología de ADN recombinante.
• Uso de técnicas genómicas y proteómicas.
• Aparición de patógenos emergentes.
• Patógenos que no se pueden cultivar in vitro
• Vacunas que combinen las ventajas
Agrobiotecnología
de las inactivadas (seguridad) y las de
Vacunas organismos vivos modificados (eficacia)
veterinarias
El desarrollo de nuevas vacunas es un área
que se nutre de múltiples disciplinas
Nuevas
vacunas: • Innovación:
desafíos para
- Identificar nuevos métodos para
la industria la producción de vacunas o mejorar
los existentes.
- Identificar nuevos métodos para
la administración de vacunas.

• Seguridad:
- Evitar reacciones locales y/o sistémicas.
- Evitar efectos negativos en el medio
ambiente y otras especies.

Agrobiotecnología • Eficacia:

Vacunas
- Proveer immunidad de por vida.
veterinarias
- Proveer protección cruzada.
Etapas a
seguir para
el desarrollo
de nuevas
vacunas • Identificación de los mecanismos efectores
protectores de la respuesta inmune.

• Elección de antígeno(s) que induzca(n)

una respuesta inmune en una amplia mayoría
de los individuos a ser vacunados.

• Uso de un modo correcto de presentación

del/de los antígeno/s al sistema inmune.
Agrobiotecnología

Vacunas
veterinarias
Estrategias
para la
• Basadas en bacterias y virus atenuados por
obtención modificación genética.
de nuevas
• Basadas en bacterias patógenas atenuadas
vacunas por modificación genética que expresen
antígenos heterólogos de otros patógenos.
• Basadas en subunidades de antígenos
recombinantes.
• Basadas en baculovirus como vectores de
presentación de antígenos heterólogos.
• Basadas en virus Vaccinia y Avipoxvirus
recombinantes vivos.
Agrobiotecnología
• Basadas en ADN (génicas).
Vacunas
veterinarias
• Basadas en plantas recombinantes.
Nuevas
• Replicativas:
vacunas
- Atenuadas por ingeniería genética:
No marcadas
Marcadas (DIVA)
- Portadas por vectores
Virales
Bacterianos
• No replicativas:
- Subunidades
Recombinantes
Procariotas
Eucariotas
Levaduras
Plantas
Agrobiotecnología
No recombinantes
Vacunas Péptidos sintéticos
veterinarias

- Vacunas génicas (a ADN)

Vacunas
replicativas • La estrategia común involucra introducir
atenuadas mutaciones en uno o más genes. Los genes
candidatos a ser mutados usualmente son:
- Codificantes para factores de virulencia
(generalmente proteínas exportadas)

- Codificantes para proteínas de rutas

metabólicas biosintéticas

• La metodología involucrada es el reemplazo

alélico mediante la recombinación homóloga.

• Para su liberación al medio ambiente, la cepa

Agrobiotecnología vacunal no debe llevar marcadores
de resistencia a antibióticos.
Vacunas
veterinarias
Identificación
de genes • El 20% de las proteínas sintetizadas
que codifican por bacterias se alojan fuera del citoplasma.
proteínas
• Las proteínas exportadas cumplen diversas
exportadas funciones: captación y transporte de nutrientes,
biogénesis e integridad de membranas,
motilidad, división celular, generación de
energía, detoxificación, transducción de señales,
comunicación celular, virulencia, etc.

• Identificación y caracterización molecular de

genes que codifican proteínas exportadas.

Agrobiotecnología
• Análisis sistemático de la contribución de
proteínas exportadas a la virulencia bacteriana.
Vacunas
veterinarias
Estrategías
utilizadas
para la • Los genes que codifican proteínas
identificar exportadas pueden identificarse mediante
fusiones traduccionales al gen de la fosfatasa
proteínas alcalina (phoA) de Escherichia coli.
exportadas
• La actividad de fosfatasa alcalina se manifiesta
cuando la enzima se encuentra fuera del ámbito
citoplasmático.

• El gen reportero phoA utilizado no posee

su promotor ni la región que codifica
el péptido señal amino terminal.

Agrobiotecnología
• La actividad PhoA se detecta fácilmente
utilizando BCIP como sustrato.
Vacunas
veterinarias
Actividad de PhoA de acuerdo con la localización subcelular

NH2

MEDIO EXTERNO NH2

Membrana externa

NH2
PERIPLASMA NH2
NH2

Membrana interna

CITOPLASMA NH2
NH2

PhoA enzimáticamente inactiva Segmento hidrofóbico

PhoA enzimáticamente activa de transmembrana
Búsqueda
de proteínas
exportables

Agrobiotecnología

Vacunas Clonado y expresión de fusiones a

veterinarias
PhoA en Escherichia coli CC118
Vacunas
marcadoras
(differentiate Principio:
infected from
La vacuna perdió un gen específico que
vaccinated codifica un antígeno inmunodominante.
animals; Sin embargo, sigue siendo protectiva.
DIVA)
El presupuesto es que los animales
vacunados no presentarán anticuerpos
contra la proteína delecionada.

Estas vacunas vienen asociadas

a un kit diagnóstico donde el antígeno
Agrobiotecnología
es la proteína inmunodominante. Estas
vacunas tienen ventajas diagnósticas.
Vacunas
veterinarias
Vacunas
marcadoras NUEVAS VACUNAS CONTRA HERPESVIRUS BOVINO
(Differentiate TIPO 1: DESARROLLO DE UNA CEPA VIRAL CON
PATRÓN ANTIGÉNICO DIFERENCIAL CON RESPECTO
Infected from AL DE LAS CEPAS CIRCULANTES EN EL CAMPO
Vaccinated
Animals; Situación en la República Argentina:
DIVA)
• Cepa circulante de HVB-1 tipo Los Angeles

• Seroprevalencia general
• 20-70% de animales y 8,9% de abortos

• Vacunación NO OBLIGATORIA
Agrobiotecnología

Vacunas
• Vacuna comercializada actualmente inactivada
recombinantes . en base al virus completo
Vacunas
marcadoras Importancia económica
(Differentiate
Comunidad Europea:
Infected from
Suecia, Finlandia, Noruega y Austria - países libres de HVB-1
Vaccinated Dinamarca y Suiza HVB-1-erradicado
Animals;
Restricciones para la comercialización de productos derivados
DIVA) Campañas de control y erradicación actualmente en marcha
Vacunación con vacunas marcadoras.

Mercosur:
Brasil y Argentina existe un interés creciente en el desarrollo de
nuevas vacunas y evaluación de la situación epidemiológica.

Hasta el momento, no se realizan planes oficiales de control de

Agrobiotecnología la enfermedad.

Vacunas
recombinantes
Disposición de la Comunidad Europea (64/432, 86/566)-
restricción para la comercialización de semen, embriones y
ganado en pie.
Vectores
virales HVB-1
salvaje HVB-1 gE (-)

Transmisión
reducida dentro
del rodeo

Agrobiotecnología

Vacunas Sintomatología Sintomatología reducida o nula

recombinantes Excreción viral Discriminación entre
vacunados e infectados
Vacunas
portadas por
un vector

• El gen que codifica el antígeno es

portado por un vector (un virus o una
bacteria) que lo presenta al sistema inmune.

• El vector puede presentar varios antígenos

heterólogos de interés, constituyendo
así una vacuna multivalente.

Agrobiotecnología

Vacunas
veterinarias
Vacunas
modernas no • Solamente un componente de un
replicativas. microorganismo es parte de la vacuna.
Vacunas a • Existen vacunas tradicionales a subunidades
que generalmente son componentes
subunidades
de una fracción subcelular.
• Este componente puede estar definido
(una proteína específica) o ser una
fracción subcelular (membranas celulares).
• Con las modernas tecnologías se puede
expresar un antígeno definido y purificarlo
por métodos convencionales.
• Usualmente los vectores de expresión
son eucariotas (levaduras o plantas).
Agrobiotecnología
• Es necesario tener presente que se necesita
Vacunas conocer previamente cuales son lo antígenos
veterinarias
que inducen una respuesta inmune protectora.
Vacunas a
Antígenos de agentes patogénicos involucrados
subunidades en la generación de respuestas inmunes protectoras

Agrobiotecnología

Vacunas
veterinarias
Vacunas
recombinantes Principales etapas en la obtención
de una vacuna recombiante

Agrobiotecnología

Vacunas
veterinarias
Vacunas
a ADN

• Las vacunas a genes representan un

novedoso medio para expresar antígenos
in vivo para la generación de una respuesta
inmune tanto humoral como celular.

• Consisten de un plásmido bacteriano

que contiene un promotor eucariota fuerte
(generalmente viral), el gen de interés
que codifica el antígeno y una secuencia
de terminación transcripcional
Agrobiotecnología y de poliadenilación.

Vacunas
veterinarias
Desarrollo
de vacunas Expresión in vivo en tejido de ratones inoculados
a ADN con plásmidos control y con plásmidos
portadores del gen de la β-galactosidasa

Agrobiotecnología

Control negativo Control positivo

Vacunas
veterinarias
Vacunas
Desarrollo de vacunas a ADN
a ADN

Agrobiotecnología

Vacunas
veterinarias
Vacunas a ADN

Respuesta inmune citotóxica a vacunas a ADN

Vacunas a ADN

Desarrollo de construcciones genéticas que permiten

acumular el antígeno en diferentes fracciones celulares

Citoplasmática PCMV

Secretada PCMV

Anclada a PCMV

membrana

Promotor de citomegalovirus

Secuencia de anclaje a membrana

Secuencia de exportación
Desarrollo • Ventajas:
de vacunas - Simplicidad metodológica
a ADN - No requieren el cultivo de agentes infecciosos para
su producción
- Pueden desarrollarse aunque el microorganismo
no pueda cultivarse
- No requieren cadena de frío
- Pueden inducir la generación de linfocitos T
citotóxicos
- Se pueden generar vacunas multivalentes

• Desventajas:
- Generan una respuesta inmune de baja intensidad
- Existe riesgo de integración del ADN vacunal al
genoma del receptor.
Agrobiotecnología
- Existe riesgo de generar tolerancia inmunológica.
Vacunas - Riesgo de integración al genoma de células
veterinarias germinales.
- Aplicable solamente a antígenos proteicos.
Impacto
de las
técnicas
genómicas y
proteómicas • La “vacunología reversa” es una estrategia
derivada de la secuencia de los genomas de
en el
microorganismos patogénicos.
desarrollo
de vacunas • En esta estrategia, todos los marcos de
lectura abiertos son clonados y expresados,
y las proteínas evaluadas como vacunas,
o bien clonados en vectores para vacunas
a ADN e inoculados en este formato.

Agrobiotecnología

Vacunas
veterinarias
Vacunología
reversa
• Ventajas:
• Se pueden identificar antígenos de escasa
abundancia.
• Se pueden identificar antígenos no
expresados in vitro.
• Es aplicable a agentes no cultivables.

• Desventajas:
• Es necesario disponer de la secuencia
genómica completa del agente en estudio.
• No es aplicable a antígenos no proteicos.
Agrobiotecnología

Vacunas
veterinarias
Vacunas no
convencionales
• Neutralización de la hormona
para
liberadora de gonadotrofina
incrementar
(GNRH) en vacunos
la producción
animal
• Inmunización de vacunos contra
miostatina

• Regulación de la fertilidad en
animales de compañía

Agrobiotecnología

Vacunas
veterinarias
Requisitos
para la • Resultados de pureza, seguridad, potencia
aprobación y eficacia
de vacunas • Efectos en el ambiente y en humanos
recombinantes - Caracterización bioquímica del agente
recombinante.
- Estabilidad genética (in vitro e in vivo).
- Cambios en el tropismo o virulencia
del microorganismo en el hospedador.
- Evaluar la posible diseminación (shedding)
del organismo a partir del hospedador
vacunado y su esparcimiento a especies
blanco y no blanco
- Evaluar la persistencia en el ambiente.
Agrobiotecnología
- Evaluar la posibilidad de recombinación
Vacunas con cepas de campo que son similares
veterinarias al microrganismo.
Conclusiones
• En medicina veterinaria, más del 90% de las
vacunas licenciadas son obtenidas mediante
métodos convencionales y se asume que
esta situación se mantendrá en la próxima
década. Sin embargo, durante este período
también comenzaran a comercializarse vacunas
de nueva generación.

• Razones:
• Muchas de las vacunas actuales son efectivas.
• Los costos para registrar los nuevos desarrollos
son muy elevados.
• Las agencias regulatorias son cautelosas.
• La sociedad es generalmente conservadora.
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Vacunas
veterinarias
Conclusiones
• Las nuevas tecnologías de generación
de organismos vivos modificados (OVM)
son un método eficaz en el desarrollo de
. vacunas en medicina veterinaria

• Los documentos necesarios para el registro

de OVM buscan fortalecer la
bioseguridad y eficacia de las nuevas vacunas

• Los futuros desarrollos incluyen: vacunas de

ácidos nucleicos, nuevos adyuvantes y vías
de administración (oral, epidermal)
Agrobiotecnología
• La tendencia actual se orienta a la producción
Vacunas
de vacunas no replicativas.
veterinarias
Referencias 1. Babiuk, L.A. Vaccination: a management tool in veterinary
medicine. Veterinary Journal, 164:188-201, 2002.
2. Arnon, R. and Ben-Yedidia, T. Old and new vaccine approaches.
International Immunopharmacology, 3:1195-1204, 2003.
3. Rappuoli, R. Reverse vaccinology, a genome-based approach to
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proteomics. Trends in Biotechnology, 19:181-188, 2001.
5. Green, B. A. and Baker, S.M. Recent advances and novel
strategies in vaccine development. Current Opinion in
Microbiology, 5:483-488, 2002.
6. Ada, G. Overview of Vaccines. Molecular Biotechnology, 8:123-
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Vacunas
veterinarias