Instituto Federal Goiano campus Urutaí

Laboratório de Microbiologia
Disciplina de Microbiologia

PRINCÍPIOS
BÁSICOS EM
MICROBIOLOGIA

Prof. Milton Luiz da Paz Lima

Experimentos de Louis Pasteur

2 Dr. Milton Luiz da Paz Lima

CONCEITOS
 Assepsia: Isento de todo germe séptico
 Limpeza: Ação ou efeito de limpar
 Desinfetar: "Esterilizar-não totalidade" um ambiente, um
instrumento, ou livrar de infecção uma parte do corpo, pela destruição
ou inativação de­ substâncias ou organismos patogênicos
 Desinfestação: Livrar de insetos, roedores ou outros animais
infestantes, capazes de transmitir infecção, e que estão presentes
numa pessoa, em sua roupa, ou no meio em que vive.
 Esterilização: tornar livre de microrganismos
 Preparo de Meios de Cultura: receitas especiais para cultivo de
microrganismos.
 Isolamento: retirada de propágulos da fonte para uma condição
artificial.
 Repicagem: manipulação de propágulos de microrganismos em
condições artificiais.
 Conservação: de cepas de microrganismos.

3 Dr. Milton Luiz da Paz Lima

DESINFETANTES
 são sanitizantes utilizados na indústria farmacêutica, são
substâncias ou produtos capazes de destruir, indiscriminadamente,
os microrganismos de uma superfície ou instrumento, sem no
entanto, eliminar as formas esporuladas.
 Utensílios do laboratório não podem ser esterilizados;
 Desinfetantes: substâncias químicas de superficial ou profunda;
influenciados pelo tempo, concentração, durabilidade.

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Esterilização
 Via calor
 Álcool, cloro, iodo e fenol
 Via vapor (autoclave)
 Radiação UV
 Gases tóxicos e
 Filtragem

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Métodos Físicos

 Calor (Fis) Úmido: materiais que não alteram

sua forma sob elevada temperatura. Vapor
Saturado – AUTOCLAVE. 10-15 min 121 o.C
sob pressão 1,1 e 0,7 kgf/cm2. Para solos
descanso por 4-5 dias!

 Calor (Fis) Seco: tempo maior, uso da

ESTUFA ESTERILIZADORA. Temperaturas
maiores via calor úmido; 1 hora 180 o.C, 2 h
170 o.C, 4-6 h a 140 o.C
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Métodos Físicos
 Flambagem: agulhas, estiletes, bisturis, alça de Drigalski. Bico
de Bunsen ou lamparina com álcool. Temperatura de 45 o.C –
metal fica avermelhado. Objetos de vidro várias vezes na
chama.
 Filtragem: Separação física de microrganismos. Tipos de
membrana de celulose, filtro de vidro, filtros de amiantos

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Métodos Físicos
 Radiação UV: Desarranjo dos ácidos nucléicos; Lâmpadas que
emitem UV (250-265 nm). Estão acopladas a câmara de Fluxo
Laminar.
 Radiação Gama e Beta: Esterilização a baixas temperaturas e alto
poder de penetração; para materiais termosensíveis.

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 MÉTODOS QUÍMICOS

 Esterilizantes:
Óxido de etileno: elevado poder de penetração período
de 3 horas para esterilização,
Formaldeído: baixo poder de penetração; restringe ao
uso em incubadoras.
Oxido de propileno: menor poder de penetração 5-10 mL
de óxido de propileno por 24 h. Meios de cultura em
placas de Petri.

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 MÉTODOS QUÍMICOS

 Desinfestantes:
Álcool 70%: desinfestação de superfícies como câmaras
de fluxo e superfícies de trabalho. Imersão de
fragmentos por 30 a 60 seg.
Hipoclorito de Na e Ca: Ação oxidante; eficiente para
eliminar organismos saprófitas da superfície dos tecidos
vegetais, atua nas [0,05 a 1%] por 30 a 60 seg.
Peróxido de Hidrogênio: Ação oxidante, [5%], usado
como desinfetante de tecidos vegetais.

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 Higienização do Laboratório

 Bancadas e todas as superfícies devem

ser desinfestadas;
 Piso limpo diariamente com solução
desinfestante.
 Entrada do laboratório com pano
úmido com solução desinfestante;
 Compartimentalização dos locais do
laboratório – área suja e área limpa.
 Autoclavagem de vidrarias 121 o.C por
20 min. Alguns casos esterilização a
seco na estufa
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AUTOCLAVE

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15 Dr. Milton Luiz da Paz Lima
 Estufa de esterilização

16 Dr. Milton Luiz da Paz Lima

 Incubadora e Bico de Bunsen

Bico de Bunsen
17 Câmara de Crescimento
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 EQUIPAMENTOS

18 Dr. Milton Luiz da Paz Lima

 Câmara de fluxo vertical

19 Dr. Milton Luiz da Paz Lima

 Câmara de fluxo horizontal

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21 Dr. Milton Luiz da Paz Lima
 Câmara Asséptica

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23 Dr. Milton Luiz da Paz Lima
24 Dr. Milton Luiz da Paz Lima
25 Dr. Milton Luiz da Paz Lima
26 Dr. Milton Luiz da Paz Lima
 Métodos físicos de controle do
crescimento microbiano

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 Câmara de Fluxo laminar

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29 Dr. Milton Luiz da Paz Lima
 Teste de Patogenicidade ou
postulados de Koch
 o organismo deve estar associado a todas as
plantas e ao mesmo sintoma;
 o organismo deve ser isolado e cultivado
axenicamente (cultura pura livre de
contaminantes) em meio de cultura, e seus
dados morfológicos anotados;
 o organismo vindo de cultura pura deve ser
inoculado em plantas hospedeiras
susceptíveis iguais às que originalmente ele
fora isolado, e induzir os mesmos sintomas
anteriormente encontrados;
 o organismo deve ser isolado novamente em
cultura pura e apresentar as mesmas
características observadas anteriormente.

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31 Dr. Milton Luiz da Paz Lima
 Uso de Meios de culturas
 Somente para fungos e bactérias
 Não utiliza-se meio de cultura para:
 Vírus e nematóides.
 biotróficos como oídios (Blumeria, Erysiphe, Microsphaera e
Sphaerotheca), míldios (Peronospora, Bremia e
Plasmopara), ferrugens (Puccinia, Uromyces e Transchelia)
e carvões (Tilletia, Ustillago, Sphaceloma e Urocystis).

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Nutrientes nos meios de Cultura

 Elementos essenciais: Os principais são: C , H, O, N (função:

principais constituintes da estrutura celular), S (função:
constituinte da cisteína, metionina, fosfato de tiamina,
coenzima A, biotina e ácido alfa-lipóico), P (função:
constituinte do ácido nucléico, fosfolipídeos e nucleotídeos), K
(função: principal cátion inorgânico da célula; é o cofator de
algumas enzimas), Mg (função: cofator de diversas enzimas;
está presente na parede celular, membranas e éster fosfato),
Ca [função: cofator de enzimas; presente em exoenzimas
(amilases e proteases); dipicolinato de cálcio (presente
também na parede celular e) é o componente mais importante
dos endósporos] e Fe (presente nos citocromos, ferrodoxinas e
outras proteínas ferro-sulfurosas; cofator de algumas enzimas
[algumas desidratases]). Além destes fazem-se presentes
outros bio-elementos utilizados em menor quantidade pelos
organismos tais como Zn, Mn, Na, Cl, Mo, Se, Co, Cu, W e
Ni.
33 Dr. Milton Luiz da Paz Lima
 Condições Especiais de Meios
 Elementos estimulantes: Alguns sais com: MgSO4.7H2O,
CaCO3, etc.

 Elementos tamponantes: responsáveis pela estabilização do

pH, tais como: K2HPO4, Na2HPO4 e CaCO3.

 Elementos solidificantes: ágar e menos freqüentemente,

gelatina.

 Elementos inibidores: antibióticos e ácidos orgânicos, etc.

 Elementos indicadores: substâncias que conferem uma

característica especial à colônia a qual se pretende isolar.

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Quanto a composição os meios
podem ser:
 Semi-sintéticos: com constituintes de
composição química indefinida (caldo de
batata, caldo de verduras, extrato de
malte, extrato de carne, extrato de
levedura, peptona, caseína hidrolizada,
ágar, suco de tomate, e outros) e outros
constituintes de composição química do
meio é definida (Sais minerais e
carboidratos);
 Sintéticos: com todos os constituintes
de composição química definida (Sais
minerais, carboidratos, vitaminas e
aminoácidos).
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 Quanto à consistência: (a) Líquido: sem constituinte
solidificante; (b) Sólido: possui como constituinte solidificante
a gelatina ou ágar.
 Quanto à finalidade: (a) Não seletivo: onde vários tipos de
organismos podem crescer; (b) Semi-seletivo: onde poucos
tipos de organismos são capazes de desenvolver; (c) Seletivo:
onde uma espécie ou gênero de organismo se desenvolve.

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 Meio BDA
 Composição: 200g de batata descascada e fatiada;
20g dextrose; 15g ágar; 1 L água destilada;
 Preparo: descascar, fatiar e pesar 200 g de batata;
cozinhar as batatas por trinta minutos em 1,2 L de
água; filtrar e manter o caldo; pesar e colocar em um
frasco com capacidade superior a 1,2 L a dextrose
(glucose) e o ágar; adicionar o caldo ao frasco,
completando o volume para 1l; tampar o frasco com
rolha termo-resistente ou algodão; misturar e
dissolver o conteúdo em banho-maria por 15 minutos;
autoclavar o frasco por 20 minutos (121oC, 1 atm);
resfriar a 50oC ou a temperatura onde seja suportável
segurar o frasco e vertê-lo.
37 Dr. Milton Luiz da Paz Lima
Receitas de Meios de Cultura para
FUNGOS
 Meio Ágar-água: 15-20g de ágar e 1000ml de água destilada.
 Meio Suco de tomate - ST (10%): 12-18g de ágar, 3g de CaCO3,
100 ml de suco de tomate temperado (“SuperBom” temperado ou
normal) e 900ml de água destilada.
 Meio V8 (10%): 12-18g de ágar, 3g de CaCO3, 100ml de suco de
tomate V8 e 900ml de água.
 Malte-ágar: 25g de extrato de malte, 15-20g de ágar e 1000 ml de
água destilada.
 Solução de Czapek em ágar: 30g de sacarose, 2g de NaNO3, 1g de
KH2PO4, 0,5g de MgSO4.7H2O, 0,5g de KCl, 0,01g de FeSO4.7H2O,
0,01g de ágar e 1l de água.
 Meio ágar Leonian modificado: 6,25g de maltose, 6,25g de extrato
de malte, 1,25g de KH2PO4, 1g de extrato de levedura, 0,25g de
MgSO4.7H2O, 0,625g de peptona, 20g de ágar e 1000ml de água
destilada.
 Meio ágar Rosa de Bengala de Martin: 10 g de glicose, 5 g de
peptona, 1g de KH2PO4, 0,5g de MgSO4.7H2O, 0,03 g de
38 estreptomicina,
Dr. Milton Luiz da Paz Lima
15 g de ágar e 1000 ml de água destilada.
Receitas de Meios de Cultura para
FUNGOS
 Meio ágar de farinha de milho: 60g de farinha de milho amarelo, 15g ágar e 1000ml
de água destilada.
 Meio ágar de farinha de aveia: 100g de farinha de aveia, 15g de ágar e 1000ml de
água destilada.
 Meio de Nash Snyder: 15g de peptona, 1g de KH2PO4, 0,5g de MgSO4.7H2O, 1g de
PCNB a 75 % PM, 0,12g de neomicina em 100ml de água, 1g de streptomicina em
100ml de água, 15g de ágar e 700ml de água destilada.
 Meio de Reis: 50mg de benomyl em 100ml de água, 500mg de sulfato de
streptomicina em 100ml de água, 30mg de sulfato de neomicina em 100ml de água
destilada, 3ml de captam (solução estoque = 133,33mg [75% pm] em 100ml de água),
5ml de Botram (=dicloram; solução estoque = 200mg [50% pm] em 100ml de água),
10g de ágar, 15g de batata com casca em fatias e 2,5g de sacarose, 700ml de água.
 Meio de Oxygall: 10g de dextrose, 10g de peptona, 15g de oxygall, 0,4g de
estreptomicina, 20g ágar e 1000ml de água destilada.
 Meio ágar para extrato de plantas (variável a composição): 50g do vegetal, 12g
ágar e 1000 mL de caldo de planta.

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Receitas e Meio de Cultura para
Bactérias
 Meio ágar nutritivo (NA): 3g de extrato de carne, 5-10g de peptona, 2,5g de
glicose, 15-20g de ágar, 1l de água destilada. Após a autoclavagem, acrescentar 50ml
de solução autoclavada de glicose (10%) e 1ml de MgSO4.7H2O 1M, ajustar para pH
7,2.
 Meio 523 (Kado e Heskett): 10g de sacarose, 8g de caseína hidrolizada, 4g de
extrato de levedura, 2g de K2HPO4, 300mg de MgSO4.7H2O, 20g de ágar e 1000ml
de água.
 Meio ágar caldo nutritivo de extrato de levedura: 8g de caldo nutritivo, 2g de
extrato de levedura, 2g de K2HPO4, 2g de KH2PO4, 15g de ágar e 1000ml de água
destilada. Meio líquido padrão para a bacteriologia com pH = 6,6-7,0.
 Caldo de extrato de carne: 3g de extrato de carne, 5g de peptona e 1000ml de
água.
 Meio de extrato de levedura-dextrose-CACO3 (YDC): 10g de extrato de levedura,
20g de glicose, 2 g de CaCO3, 15g de ágar e 1000ml de água destilada. A glicose deve
ser autoclavada separadamente. O meio deve ser resfriado a 50 o.C em ‘banho maria’,
e o CaCO3 acrescentado por agitação antes de ser vertido nas placas.
 Meio King B (KB): 20g de protease peptona no. 3, 2,5g de K2HPO4.3H2O, 6g
MgSO4.7H2O, 15ml de glicerol, 15g de ágar e 1000ml de água destilada.

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 Receitas e Meio de Cultura para
Bactérias
 Meio NDLA (Nutriente-dextrose-levedura-ágar): 5g de extrato
de carne, 10g de peptona, 4g de extrato de levedura, 5g de
dextrose, 0,5g de K2HPO4, 20g de ágar, 1000ml de água.
 Meio PSA (potato-sucrose-ágar): 300g de batata picada e fervida
em 1250ml de água, 2g Na2HPO4, 0,5g de Ca(NO3)2, 15g de
sacarose, 5g de peptona, 20g de ágar.
 Meio glucose peptona ágar (GP): 5g peptona bacteriológica, 20g
de glucose, 0,5g K2HPO4 (anidro), 0,25g MgSO4.7H2O, 15g de ágar
no 3, 1l de água, pH 7,2-7,4.
 Meio sacarose nutriente ágar (SNA) ou meio Levan (Lev): 28g
nutriente ágar (Oxoid, CM3), 50g sacarose, 1000ml de água destilada
(pH 7,2 ).
 Meio nutriente dextrose ágar (NDA): 28g nutriente ágar (Oxoid,
CM3), 10g D-glucose, 1000ml de água destilada (pH 7,2).

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