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Metabolismo microbiano

Nutrição e cultivo de
microrganismos

Profa. Beatriz Martins Borelli


Metabolismo
• Conjunto de todas as reações químicas dentro de uma célula
Crescimento celular,
reprodução,
manutenção
e movimento

Componentes celulares
como proteínas (enzimas),
DNA, RNA, carboidratos, CATABÓLICAS
ANABÓLICAS lipídeos, etc.
E requerida

Síntese de E liberada Degradação


compostos e Sistema de
estruturas Armazenamento Quebra de
celulares De energia (ATP) substratos ou
nutrientes

Produtos da degradação
servem como unidades
para a produção de
compostos celulares

A energia das reações CATABÓLICAS é utilizada para conduzir as reações


ANABÓLICAS.

A energia para as reações químicas é armazenada em ATP


CLASSIFCAÇÃO NUTRICIONAL DOS ORGANISMOS
Obtenção de energia
Principais compostos utilizáveis:
• Açúcares (glicose),
• Proteínas,
• Gorduras.

Processos de obtenção de energia


• Respiração aeróbica e anaeróbica Produção de
• Fermentação energia à
partir da
glicose
Ambos os processos iniciam-se com a glicólise (glicose
em ác. pirúvico), mas seguem vias diferentes
posteriormente
• RESPIRAÇÃO ANAERÓBICA: Ocorre na ausência de
oxigênio

- Energia é gerada a partir da cadeia transportadora de


elétrons;
- Aceptor final de elétrons: compostos inorgânicos
Ex: íons nitrato, sulfato, carbonato
- Rendimento: varia com o micro-organismo (menor que
na respiração aeróbica).

• FERMENTAÇÃO: ocorre na ausência de oxigênio


- Não há cadeia transportadora de elétrons ou ciclo de
Krebs;
- Apenas 2 moléculas de ATP são produzidas;
- Aceptor final de elétrons: molécula orgânica.
FATORES NECESSÁRIOS AO CRESCIMENTO
MICROBIANO

- FATORES FÍSICOS OU ABIÓTICOS (ambientais):


temperatura
pH
pressão osmótica
atmosfera gasosa

- FATORES QUÍMICOS:
água
carbono, nitrogênio, enxofre e fósforo
elementos traço
fatores de crescimento
oxigênio
FATORES FÍSICOS

1- TEMPERATURA: reações enzimáticas celulares

Classificação de acordo com à temperatura de crescimento


Taxa de crescimento X temperatura

Temperatura mínima:
< temperatura onde a
espécie é capaz de
crescer.

Temperatura ótima:
melhor crescimento
microbiano.

Temperatura máxima:
> temperatura, onde
ainda é possível o
crescimento.

Células inativas Morte celular


Classificação dos micro-organismos quanto à
temperatura de crescimento

- Psicrófilos: crescem em baixas temperaturas – 0º a


20ºC (ótima 150C), não crescem a 250C. Regiões
polares, Antártica, fundo dos oceanos.

- Psicrotróficos: 0º a 30ºC (ótima 20º a 30ºC), não


crescem a 40ºC.

Deteriorantes de alimentos em
baixas temperaturas
-Mesófilos: crescem em temperaturas moderadas
de 10 a 50ºC (ótima 25 a 400C) – patogênicos (TO
37ºC) e deteriorantes de alimentos.

- Termófilos: crescem em altas temperaturas 40 a


850C (ótima 50º a 60ºC). Encontrados em solos
quentes e águas termais.

- Termófilos extremos ou Hipertermófilos:


Arquibactérias (ótima 68 a 110ºC) encontradas em
fontes de água quente associadas à atividade
vulcânica.
2 – pH

- refere-se a acidez ou a alcalinidade de uma


solução, escala varia de 0 a 14.

Bactérias: próximo a neutralidade pH 6,5 -7,5


poucas bactérias são capazes de crescer em pH
ácido (pH 4,0).

- Bactérias acidófilas: alto grau de


tolerância à acidez (Thiobacillus de 0,5 a 6,0
com ótimo entre 2 e 3,5).
2 - pH

- Bactérias alcalifílicas: (Bacillus e Archaea)


(pH 10 – 11).

Fungos filamentos e leveduras: tendem a ser


mais acidófilos pH 5-6.

Em laboratório: durante a multiplicação a produção de


ácidos: interferem no crescimento – uso de tampões
(neutralizam ácidos e mantém o pH apropriado)
Tolerância microbiana ao pH

Fungos e
leveduras

Bactérias
3 - PRESSÃO OSMÓTICA:

Microrganismos obtêm a maioria dos nutrientes


necessários da água presente no ambiente
(conteúdo celular 80 – 90 % de água).

Célula em ambiente isotônico


3 - PRESSÃO OSMÓTICA:

Entrada
de água

Célula em ambiente hipotônico Célula em ambiente hipertônico


(plasmólise)
Halófilos extremos e obrigatórios: requerem
obrigatoriamente altas concentrações de sais
para o crescimento.

Halófilos facultativos ou halotolerantes: não


requerem altas concentrações de sais para
crescer, mas são capazes de tolerar (até 2% -
15% de sal) .

- Adição de ágar (polissacarídeo):normalmente 1,5% para


solidificar o meio
> concentração = inibição de alguns microrganismo
Taxa de crescimento de alguns micro-organimos
X concentração de sal.
FATORES QUÍMICOS

1 - ÁGUA

-Essencial para os microrganismos.

-Disponibilidade variável no ambiente.

Ambiente com < concentração de água:


desenvolvem mecanismos para obter água através do
aumento da concentração de solutos internos seja pelo
bombeamento de íons para o interior celular ou pela síntese
de solutos orgânicos (açúcares, álcoois ou aminoácidos).
FATORES QUÍMICOS

2 - CARBONO

- essencial para a síntese de todos os compostos


orgânicos necessários para a viabilidade celular
(elemento estrutural básico para os seres vivos).

- organismos quimio-heterotróficos: obtém C a


partir de materiais orgânicos como proteínas,
carboidratos e lipídeos.
- organismos quimio-autotróficos e organismos
fotoautotróficos: CO2
3 - NITROGÊNIO

- utilizado para sintetizar (grupo amino) aminoácidos e


proteínas,

- síntese de ácidos nucléicos (DNA e RNA),

-14% do peso seco da célula.

Fonte de N: decomposição de proteínas, amônia (NH4) e


nitrato (NO-3)
4 - ENXOFRE

- Utilizado na síntese de aminoácidos contendo


enxofre
- Síntese de vitaminas (tiamina e biotina)
Fonte de S: íon sulfato, aa que contenham S.

5 - FÓSFORO 4% do
peso seco
- Síntese dos ácidos nucléicos (DNA e RNA)
- Síntese de ATP
-Síntese de fosfolipídeos componentes da MP
Fonte de P: íon fosfato, DNA, RNA, ATP
Macronutrientes Funções
gramas
Carbono
Oxigênio
Hidrogênio Constituintes de carboidratos, lipídeos, proteínas e
Nitrogênio ácidos nucléicos
Enxofre
Fósforo
mg
Potássio (K+) Atividade enzimática
Cálcio Resistência ao calor do endosporo
Magnésio (MG2+) Cofator de enzimas, complexos com ATP, estabiliza
ribossomos e membranas
Ferro (Fe2+/Fe3+) Constituição de citocromos, cofator de enzimas,
cofator de proteínas transportadores de elétrons
6 - FATORES DE CRESCIMENTO

Compostos orgânicos específicos, necessários em


pequenas quantidades devido à incapacidade das
células os sintetizarem

Vitaminas, aminoácidos

Fornecidos como componentes dos meios de


cultura (peptonas, extrato de levedura) utilizados
para o crescimento in vitro dos micro-organismos.
8 – OXIGÊNIO

- extremamente importante no desenvolvimento


microbiano, mas pode ser tóxico para alguns
microrganismos

- Classificação:

AERÓBIOS

- Estritos ou obrigatórios: necessitam de O2.


- Microaerófilo: necessitam de O2 mas em níveis
menores.
8 - OXIGÊNIO

- Classificação:

ANAERÓBIOS

- Facultativos: não necessitam de O2 mas crescem


melhor na presença de O2.
- Aerotolerantes: não utilizam o O2 mas toleram bem a
presença deste.
- Estritos ou obrigatórios: não toleram O2 (letal).
POR QUE O OXIGÊNIO É TÓXICO PARA OS
ANAERÓBIOS?
• Produção de H2O à partir de O2

Formas tóxicas do oxigênio


Enzimas que inativam o O2 tóxico
Teste da catalase
Caracterização de micro-organismos quanto ao
metabolismo de O2
(a) Aeróbio obrigatório
(catalase e superóxido
dismutase)
(b) Anaeróbio (catalase e
superóxido dismutase
ausentes na maioria)
(c) Anaeróbio facultativo
(catalase e superóxido
dismutase)
(d) Microaerófilo (necessitam
de baixos teores de O2)
(pequenas quantidades
de catalase e superóxido
dismutase)
(e) Anaeróbios aerotolerante
(suportam a presença de
O2, apesar de não o
utilizarem) (superóxido
dismutase)
Cultivo de bactérias microaerófilas e/ou
capnofílicas (métodos de produção de CO2)
Cultivo de bactérias anaeróbias

Jarra de anaerobiose
Câmara de anaerobiose
Cultivo de anaeróbios estritos.
Preenchida com gases inertes N2, H2 e CO2 livre de O2.
Meios de cultura utilizados para o cultivo de
microrganismos

• Meio de cultura: material nutriente preparado em


laboratório para o crescimento de micro-
organismos. Contém: C, N, S, P e outros
componentes.

- Os meios de cultura tentam simular o ambiente


natural.
Classificação dos meios de cultura quanto à
consistência
* Meios de cultura líquidos: sem
agente solidificador. Crescimento –
turvação do meio.

* Meios de cultura semi-sólido:


0,75% ágar.
* Meio de cultura
sólidos: uso de
agente
solidificador: ágar
funde-se à 1000C e
solidifica-se à
400C. Crescimento
de colônias.
Meio quimicamente definido e Meio
complexo

• Definido: cuja a composição exata é conhecida.

Componente Quantidades

Glicose 5,0 g

Fosfato de amônio 1,0g

Cloreto de sódio 5,0g

Sulfato de Magnésio 0,2g

Fosfato de potássio 1,0g

àgua 1L
• Complexo:
- Composição química desconhecida adição de nutrientes como
extrato de leveduras, extrato de carne, peptonas.

Componentes Quantidades

Peptona (proteína parcialmente 5,0g


digerida)

Ext. de carne 3,0g

Cloreto de sódio 8,0g

ágar 15g

Agua 1L
→ Meios com finalidades especiais

* Meio redutor

adicionados de agentes redutores (tioglicolato


de sódio, cisteína) que se combina com o oxigênio
eliminando-o do meio de cultivo.

- Incubação em anaerobiose.
 Meios seletivos: impedir o crescimento de MO
indesejáveis e favorecer o crescimento dos MO de
interesse.

Ex: ágar Sabouraud: fungos


ágar + antibióticos: resistentes
* Meios diferenciais – diferenciação das colônias
do microrganismo desejado em relação aos outros
que crescem na mesma placa.

Ex: Ágar sangue: bactérias hemolíticas X não


hemolíticas.

Streptococcus pyogenes
Meio seletivo e diferencial

Ágar eosina azul de


Ágar hipertônico
metileno (EMB)
manitol:
Staphylococcus
aureus.

Ágar Cled
* Meio de Transporte

- Meio isento de nutrientes, utilizados para o


transporte e conservação de um material biológico
a partir do qual se propõe isolar um ou mais micro-
organismos. O papel principal deste meio é manter
os microrganismos vivos.

Ex.: Meio de Stuart, Meio de Cary-Blair.


* Meio de Enriquecimento

São meios líquidos, que favorecem o crescimento de


determinadas espécies aumentando a sua quantidade em
relação a outras, facilitando o isolamento de um
microrganismo de interesse.

Ex.: caldo de selenito de sódio => permite enriquecimento


de Salmonella e Shigella nas fezes.
TÉCNICAS DE SEMEADURA E ISOLAMENTO DE
MICRORGANISMOS
Semeadura ou inoculação: transferir MO de uma meio de
cultura para outro, introduzir MO em um meio de cultura.
Técnica de esgotamento por estrias

* Obtenção de culturas puras e colônias isoladas.


MÉTODOS DE CONSERVAÇÃO DE MICRORGANISMOS

- REFRIGERAÇÃO: curtos períodos de tempo (meios de


cultura em placas ou tubos de ensaio).

- CONGELAMENTO

- Adição de crioprotetor à cultura microbiana: glicerol

- Ultrafreezer -860C
CONGELAMENTO

- Nitrogênio líquido: -1960C


LIOFILIZAÇÃO (congelamento e dessecação)

- Congelamento rápido : -600C


- Sublimação: remoção da água por vácuo.
CRESCIMENTO MICROBIANO: aumento do número de
células, e não ao aumento das dimensões celulares.

* Colônia = proveniente de
um ÚNICO esporo ou uma
ÚNICA célula vegetativa.
Reprodução bacteriana

• A maioria das bactérias se multiplica-se pelo processo


de reprodução assexuada.

FISSÃO BINÁRIA

células dividem-se individualmente em duas células-


filhas de tamanho aproximadamente igual.
Crescimento celular e fissão binária
Tempo de Geração

é o intervalo de tempo necessário para que uma célula se


divida (população duplique), varia de acordo com sua
constituição genética e condições do meio.

- o tempo de geração é diferente para cada espécie de


microrganismo

Ex: Escherichia coli se divide a cada 20 minutos em caldo


em laboratório e a cada 2-3 dias no cólon.
Mycobacerium tuberculosis ~ 13 a 15 horas

Maioria das bactérias: 1 a 3 horas


❖ Crescimento de uma cultura bacteriana

- aumento da população bacteriana, a partir de uma única


célula (duplica):
1 – 2 – 4 – 8 – 16 – 32 – 64 →........
❖ Cálculo do n° de células a cada geração: notação
exponencial
número de células é expresso na potência de 2, o
expoente reflete o número de gerações
20 – 21 – 22 – 23 – 24 – 25 – 26→ .......... 2n
n= número de gerações (duplicações)
2n = número total de células em uma cultura bacteriana
Fases do Crescimento
• CURVA DE CRESCIMENTO:
representação gráfica do crescimento das células
bacterianas durante um período de tempo.

Fases do crescimento bacteriano:

• fase lag – não ocorre divisão celular, intensa atividade


metabólica.

• fase log ou exponencial – divisão celular exponencial.

• fase estacionária – parada do crescimento, estabilização da


população. Acúmulo de produtos tóxicos do metabolismo.

• fase de morte celular.


Curva de crescimento bacteriano
MÉTODOS PARA QUANTIFICAÇÃO DO
CRESCIMENTO MICROBIANO

• Medidas diretas: contagem do n° de cél. (mL ou g), contagem


em placas, diluição seriada, filtração, Técnica do Número
Mais Provável, contagem microscópica.

*Medidas indiretas: turbidimetria, atividade metabólica e peso


seco.
Contagem em placas e diluição seriada

- Determinação do
número de Unidades
Formadoras de
Colônias por mL
(UFC/mL)

- Apenas células
viáveis, mais de 24h
para se ter resultados.

- Placas com 30-300


colônias: diluições
seriadas.
CONTADOR DE COLÔNIAS
MÉTODO DE
INCORPORAÇÃO
EM PLACA
x
MÉTODO DE
ESPALHAMENT
O EM
SUPERFÍCIE
FILTRAÇÃO
Microrganismo ficam retidos nos
poros dos filtros.
Transferido para meio de
cultura: UFC/ vol filtrado.
CONTAGEM DIRETA AO MICROSCÓPIO

- um volume conhecido de suspensão bacteriana é


colocado em uma área definida da lâmina de
microscópio.
- a amostra pode ser corada ou analisada a fresco.
- utilizam câmaras de contagem.

DESVANTAGENS:
-não separa células mortas e vivas-pode haver
erros de contagem.
-difícil contagem para bactérias móveis.
Contagem direta ao microscópio
Contagem direta ao microscópio

Não há como diferenciar


cél. mortas de cél. vivas
CÂMARA DE NEUBAUER

Ao microscópio – aumento de 400X

Ao microscópio – aumento de 100X


MÉTODOS INDIRETOS
Quando não há a necessidade da contagem de células
Turbidimetria: maneira de monitorar o crescimento
bacteriano em meio líquido

Crescimento microbiano:
Turvação do meio

Espectrofotomêtro
• Atividade metabólica
Maneira indireta de estimar o numero de células
através dos produtos das reações metabólicas de
uma população.

• Peso seco
Mais utilizada para fungos
filamentos. Fungo é seco e
então pesado.

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