2019 Biologia Celular e

Molecular

Olá! Este é um upgrade à sebenta que existia de 2008 de

BCM da FCNAUP. Espero que vos seja útil. Não garanto que
não possam existir alguns erros. Não invalida estudarem
pela biblio recomendada. Bons estudos! Diana Costa –
UP201903525

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T1. Apresentação
T2: Células procarióticas e eucarióticas. Visualização das células - microscopia
BCM: Estudo das estruturas e funções das células, até ao nível molecular, que concorrem para a manter viva.

CÉLULA
Unidade morfo-funcional dos seres vivos.
Estrutura/Compartimento natural, contendo uma solução aquosa complexa, rodeada por uma membrana capaz de manter
gradientes químicos com o exterior. Além de realizar trocas de metabolitos com o meio ambiente, dotada de maleabilidade,
excitabilidade e capacidade de se auto-replica
Composição base das células
Biomoléculas:
 Açúcares complexos, ác. nucleicos e proteínas e seus monómeros.
 Lípidos

Tipos de células e outras entidades biológicas

PROCARIONTES / EUCARIONTES
As células, estruturalmente, dividem-se em duas classes:
EUCARIOTAS, com núcleo individualizado por membrana nuclear essencialmente lipídica e com bastantes
organelos. O material genético encontra-se no interior do núcleo.
PROCARIOTAS, caracterizados pela ausência de núcleo individualizado, não são ricas em organelos (a maioria
são vacúolos aquosos) o material genético encontra-se disperso no citoplasma
(nucleóide) ou nos ribossomas (sintetizando as suas próprias proteínas). Têm larga membrana celular e parede
celular, importante pois a ausência de organelos faz com que processos como produção de energia ocorram neste
local e possuem estruturas externas a parede celular, com função essencialmente de mobilidade.
As células PROCARIOTAS podem adquirir 3 arranjos celulares:
Coccus, com forma arredondada, como o streptococcus ou o staphilococcus.
Bacillus, forma alongada, tipo bastão, como por exemplo o streptobacilus.
Espirilo, forma de bastonete ondulado.

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BACTÉRIAS
Em termos químicos, o método de Gram permite distinguir as bactérias pelo tipo de parede celular que possuem,
com o uso de corantes:
1) Corar as bactérias com roxo de metilo/violeta de cristal.
2) Juntar soluto de Lugol, que com o corante anterior forma um complexo corado.
3) Juntar etanol/acetona, que remove o violeta de cristal das Gramnegativas, pois estas não têm poros, ao
contrário das Grampositivas, onde o corante permanece.
4) Juntar safranina/fucsina básica, que cora de vermelho as Gramnegativas.

A membrana celular dos procariotas é semelhante para Gram positivos e negativos: bicamada fosfolipídica com
proteínas e glícidos integrados, estas últimas em maiores concentrações do que no nosso organismo. Assim, o que
distingue estas bactérias é a sua parede celular, cujas funções são: determinar a forma da bactéria, protegê-la
contra a lise osmótica e de substâncias e aumentar a patogenicidade da bactéria.
Constituição química da parede celular: MUREÍNA ou PEPTIDOGLICANOS (únicos nas bactérias). Os
peptidoglicanos são heteropolímeros constituídos por cadeias lineares com N-acetilglicosamina e ácido N-
acetilmurâmico alternados entre si. A ligação entre os monómeros são ß1,4 e as cadeias são unidas entre si por
aminoácidos D em cadeia, por vezes intercalados com DAP (ácido diaminopimélico), que por vezes aparece em
algumas bactérias. TUDO ISTO CONFERE RIGIDEZ À PAREDE.

Gram (-): tem apenas uma membrana de peptidoglicanos, uma membrana externa com polissacarídeos O e
lípidos A, que são antigénios, e é atravessada por proteínas porosas que ligam os peptidoglicanos à membrana.
Contêm também um ESPAÇO PERIPLASMÁTICO, com enzimas, sacarídeos e proteínas. Membrana interna
Mucopéptido Membrana externa
Gram (+): neste caso, a parede é 90% feita de peptidoglicanos, com ácidos teicoicos ou lipoteicoicos, que
ligam a membrana celular à parede. Membrana interna Mucopéptido

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A penicilina atua essencialmente sobre as Gram (+), pois estas têm mais quantidade de peptidoglicanos e, ao
contrário das Gram (-), não têm ß-lactamases (espaço periplasmático). Também por ter maior [peptidoglicanos],
as Gram (+) são mais sensíveis à lisozima, enzima que degrada as ligações ß1,4.
O DNA bacterial é haploíde, não contém histonas, é circular e contém um único cromossoma. A divisão das
bactérias dá-se por DIVISÃO BINÁRIA.
As bactérias podem ter cápsula, uma estrutura de natureza polissacarídea, presente embora não seja
necessária ao crescimento celular. Contém água, evitando a desidratação e propriedades antifagocíticas,
aumentando a virulência das bactérias.
O DNA bacterial é haploíde, não contém histonas, é circular e contém um único cromossoma. A divisão das
bactérias dá-se por DIVISÃO BINÁRIA.
Variações
 Procariontes com estruturação: Cianófita
 Procariontes sem parede: Micoplasma

Estruturas de mobilidade:
Fímbrias, projeções proteicas finas e curtas, originárias da membrana, com funções de adesão e fixação a
superfícies.
Pili, maiores do que as fímbrias, têm função reprodutiva, estabelecem conexão entre duas células permitindo a
passagem de material genético.
Flagelos, constituídos por flagelina, ao contrário dos flagelos humanos, têm várias localizações e conferem
mobilidade à célula.

VÍRUS
Agentes infeciosos (parasitas obrigatórios) específicos, cujo conteúdo genético é de apenas um tipo, ou DNA
(cadeia dupla, mais estável) ou RNA (mais suscetível a mutações). Necessitam do hospedeiro para replicar o
genoma. Têm forma e constituição específica que lhes permite chegar à célula hospedeira e invadi-la 
VIRIÃO.
Todos possuem um invólucro proteico que protege o genoma, o nucleocapsídeo, que é constituído por monómeros
de capsómeros (a sua mutação origina novos tipos de vírus). Além do nucleocapsídeo, alguns vírus podem ter
invólucro, porção da membrana celular do hospedeiro com proteínas virais.
Consoante a forma do nucleocapsídeo, os vírus podem ser:
De simetria ecosaédrica, como os adenovírus, onde o genoma é rodeado por 20 faces triangulares.
De simetria helicoidal, em forma de hélice, como é o caso do vírus da gripe.
De simetria complexa, como é o caso dos bacteriófagos.
Os vírus podem ter 2 ciclos de vida distintos:
1) Ciclo de vida LÍTICO, em que ocorrem os seguintes acontecimentos: o vírus adere à parede celular, com ajuda
da lisozima, que degrada a parede celular, faz entrar o seu DNA na bactéria; na fase eclipse, o metabolismo da
célula é afectado e o genoma viral começa a expressar-se, sob forma de proteínas; ocorre a produção de novo
genoma viral, a montagem de todas as partes do vírus e a lise da hospedeira libertação dos novos vírus.
2) Ciclo de vida LISOGÉNICO, em que o vírus faz entrar na célula o seu genoma, que vai incorporar o genoma da
hospedeira. Esta multiplica-se, bem como o genoma viral nela contido. A partir do momento em que esta se
expressa, a célula passa para um ciclo de vida lítico.

Nucleocápside + envelope e matriz

Priões
PrPC , PrPSC Dç. Creutzfeldt-Jacob Encefalopatia Bovina Espongiforme Variante da Dç. Creutzfeldt-Jacob Scrapie Kuru

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Proteínas anormais que têm acção infectante nas células. Ex: a PrPsc leva à alteração da PrPc, causando assim a
BCE, doença das vacas loucas.
As técnicas de combate às bactérias e vírus passam por ataques aos seus componentes específicos:
Ataque de componentes específicos da parede celular (com as beta-lactamases ou lisozimas)
Inibição da síntese proteica ao nível dos ribossomas (eritromicina, estreptomicina)
Interferir no metabolismo do ácido fólico que as bactérias sintetizam (com sulfanamidas, que levam a produzir
o composto errado)
Prejudicar a síntese da parede celular (penicilina e fosfomicina)

Técnicas de BCM
1. Microscopia
2. Citoquímica
3. Imunocitoquímica
4. Hibridação in situ
5. Autorradiografia
6. Fracionamento subcelular por centrifugação diferencial
7. Cultura de células
8. Electroforese
9. Western, Northern e Southern Blotting
10. PCR e sequenciação de DNA

Aplicações das técnicas:

 Ver células
 Separar e estudar isoladamente as células
 Decompor as parcelas das células (organelos)
 Separar e identificar as macromoléculas dos organelos
 Sequenciar os componentes das macromoléculas
 Localizar as moléculas nas células
 Identificar as funções das moléculas e a diversidade de interações
 Manipular células e moléculas

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1. Microscopia
O aparecimento da BCM como ciência deve-se ao uso do microscópio, quando em 1838 Schleiden e Schwann
propuseram a teoria celular.
Existem vários tipos de microscopia, sendo que todos eles se baseiam num único objetivo diminuir o limite
de resolução, a capacidade de distinguir dois pontos como separados.

Microscopia de luz

Limite de resolução:
Legenda da fórmula de Abbe:
L.R. – limite de resolução
K – Constante (0,61)
λ – Comprimento de onda da luz utilizada pelo microscópio
A.N. – Abertura numérica = nsena

Os vários campos desta fórmula podem ser trabalhados para melhorar o LR: diminuir o comprimento de onda (λ)
e aumentar a abertura numérica. Por ex, o uso de óleo de imersão tem como objetivo diminuir o índice de
refração entre a objetiva e a lamela.
A microscopia baseia-se nas propriedades físicas da célula para formar uma imagem:

Microscopia de campo claro, o mais simples, a luz passa diretamente pela célula, e distinguem-se os
componentes pela capacidade diferente que têm em absorver a luz (também podem ocorrer diferenciação por
organelos corados).
Microscopia de contraste de fase e de interferência de Nomarski, ambos se baseiam em diferentes
intensidades de luz que passam pelas células, distinguindo os componentes pelas suas densidades.
Microscopia de fluorescência, usada para detetar moléculas na célula, consiste em coloca marcadores
fluorescentes (como o GFP) que se excitam a certos comprimentos de onda, emitindo assim outros específicos,
permitindo localizar, por exemplo, proteínas.
Microscopia confocal, junção da microscopia de fluorescência com um detetor dessa fluorescência, que
permite focar apenas a imagem pretendida e obtê-las a 2D.
Microscopia eletrónica de transmissão, ultrapassa a barreira do comprimento de onda (λ), pois o seu valor é
menor nos eletrões do que em qualquer tipo de luz utilizada nos outros microscópios. O material tem de ser fixo
na lâmina e ―corado‖ metais pesados, passando por ele um feixe de eletrões, que quando encontra os metais é
refletido, não contribuindo para formar a imagem.
Microscopia eletrónica de varrimento (scanning), também ultrapassa a barreira do comprimento de onda, dá-
nos uma imagem 3D, visto que o feixe de eletrões passa/ ―varre‖ a lâmina com o material, é refletido para a
amostra e apenas os eletrões que por ela passam vão constituir a imagem.

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 Microscopia de luz: campo claro

Microscopia eletrónica de transmissão Microscopia eletrónica de varrimento

Sombreamento metálico
Microscopia confocal M. de fluorescência para visualização de fluorocromo

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2. Citoquímica – localizar moléculas particulares
Para identificar compostos químicos nas células/organelos. Técnica de coloração que resulta de reações químicas
Reagente de Feulgen, usa o reagente de Schiff para corar ácidos nucleicos (cora a desoxirribose do DNA).
PAS, corante de glicoproteínas.
Método de Gomori, reação enzimática da fosfatase ÁCIDA com o glicerofosfato, permitindo identificar os
lisossomas, onde esta enzima predomina.

3. Imunocitoquímica
Permite a localização de antigénios na célula, com recurso a anticorpos (policlonais, que reconhecem várias
sequências aminoacídicas do antigénio ou monoclonais, que só reconhecem uma sequência).
A localização vê-se através do marcador (fluorescente ou de reação enzimática) que está ligado ao ATC.
Pode ser: direta, com a utilização de apenas um anticorpo; indireta, com a utilização de um ATC secundário, o que
permite amplificação do sinal (existência de mais anticorpos secundários a reconhecerem o primário).

(microscopia de campo claro para visualização de DAB oxidado):

Imunocitoquímica ultrastrutural - Localizar antigénios particulares c/ técnica imunológica aplicada ao microscópio eletrónico

4. Hibridação in situ - Deteção de segmentos de ADN ou ARN com sondas complementares. Técnica que permite localizar
sequências específicas de DNA/RNA, usando a complementaridade de bases DNA-DNA, RNA-RNA e DNA-RNA.
Introduzem-se cadeias de DNA/RNA que complementam a cadeia a localizar, marca-se essa cadeia, que tem o
nome de SONDA, com radioisótopos ou substâncias não radioativas (biotina, digoxigenina, etc.)
Permite localizar sequências específicas, que codificam por vezes proteínas únicas de uma célula.

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Aula Teórica 3 – Moléculas da Vida Substâncias de reserva
As células são compostas por:
 Água (~70% massa celular)
 Iões Inorgânicos (Na+, K+ , Mg2+, Ca2+, HPO42- , Cl- , HCO3- ) (≤1% massa celular)
 Biomoléculas: Carboidratos, ác. Nucleicos, proteínas e lípidos.

GLÍCIDOS (Carboidratos)
Incluem açúcares simples (Monossacarídeos) e Polissacarídeos
Os Monossacarídeos apresentam a estrutura (CH2O)n.

Monossacarídeos

A Glucose (C6H12O6 ) é especialmente importante uma vez que constitui a principal fonte de energia na célula. Açúcares
com 5 ou mais C podem ciclizar. Podem existir na forma alfa ou beta, dependendo da configuração do C1.

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Polissacarídeos
Os Monossacarídeos podem estabelecer ligações glicosídicas através de desidratação formando polissacarídeos.

 Glicogénio: armazenamento de glucose nas células animais

 Amido: armazenamento de glucose nas células vegetais
Ambos são compostos apenas por glucose na configuração alfa

O conjunto dos glícidos da parte externa da membrana constitui o GLICOCÁLICE. A sua função é proteger a
célula e marcar interações entre as mesmas, como acontece nos leucócitos quando se ligam ao epitélio nas
respostas inflamatórias. Neste caso, as selectinas reconhecem oligossacarídeos específicos. Nos intestinos
impede a junção das vilosidades, aumentando a área de absorção.

In paraffin sections of liver stained with hematoxylin and eosin, accumulations of glycogen in hepatocytes do not stand
out. However, when stained with using the periodic acid-Schiff (PAS) technique, glycogen stains bright pink in color.
The images represent PAS-stained sections of liver from two mice:
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  Left panel: from a mouse that fasted overnight and thus had very low levels glycogen in liver.
 Right panel: from mouse that stuffed himself on mouse chow two hours prior to fixing the liver, and thus had
high levels of hepatic glycogen. These accumulations are seen as pink areas of PAS-positive material
throughout the section.

Fig 1. Transmission electron micrograph showing starch granules inside two chloroplasts in a
mesophyll cell of an Arabidopsis leaf. The bar represents 0.5 μm. Courtesy of Sue Bunnewell,
John Innes Centre.
A Celulose é o principal componente estrutural da parede celular das plantas. As ligações
β(1→4) permitem que as unidades de glucose se disponham lado a lado formando fibras com
elevada resistência mecânica.

Glicoproteínas

Funções dos Glícidos

 Fonte de energia
 Reconhecimento celular (marcadores da superfície celular; adesão celular)
 Endereçamento e enrolamento proteico
 Estrutura celular

Ácidos Nucleicos: ADN e ARN

Ácido Desoxirribonucleico (ADN) constitui o material genético.
Ácido Ribonucleico (ARN)
 ARN mensageiro (mRNA) transporta a informação do ADN para os ribossomas; molde síntese proteica
 ARN ribossomal e ARN de transferência estão envolvidos na síntese proteica.
Existem ainda pequenos ARNs envolvidos na regulação da expressão genética e no processamento e transporte de
ARNs e proteínas.
O ADN e ARN são polímeros de nucleotídeos- base púrica ou pirimidínica ligada a açúcar fosforilado.
O ADN contém 2 purinas: adenina e guanina e 2 pirimidinas: citosina e timina. O ARN apresenta uracilo em vez da
timina.

Nucleosídeo: conjunto da base azotada associada ao açúcar. O ADN contém o açúcar 2’-desoxirribose; o ARN tem
ribose.
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Nucleotídeo: apresenta também um grupo fosfato ligado ao C5 do açúcar

Os nucleotídeos estabelecem entre si ligações fosfodiéster entre o grupo fosfato a 5’ de um nucleotídeo e o hidroxilo
a 3’ de outro. O ADN é uma molécula de cadeia dupla. As bases complementares estabelecem pontes de hidrogénio
entre si: C≡G e A=T.
As cadeias polinucleotídicas são antiparalelas e são sempre sintetizadas na direção 5’-3’

PROTEÍNAS
As proteínas são polímeros de AA (20 diferentes). Um AA consiste num C α ligado a um grupo carboxílico (COO−), um
grupo amino (NH3+), um átomo de H e um grupo lateral variado.
Proteínas da membrana biológica: podem ter várias funções e serem glicosiladas.
São intrínsecas (atravessam a membrana) ou extrínsecas (superficiais, como a espectrina dos eritrócitos). As
intrínsecas são ricas em aminoácidos hidrofóbicos e podem ser divididas em:
Multipass, o caso da banda 3 (nas hemácias, alfahélice), porina (nas Gra-, beta-pregueada) e
bacteriorrodopsina (nas bactérias, têm grupo retinol ativado pela luz, 7 alfa-hélices).
Singlepass, o caso da glicoforina, nas hemácias, com 131 aminoácidos.

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Estrutura dos aminoácidos

Ligação Peptídica
Os AA unem-se por ligações peptídicas, formando cadeias polipeptídicas. Uma extremidade da cadeia termina com o
grupo amino (N-terminus) e a outra com grupo carboxílico (C-terminus)

Sequência aminoacídica da insulina: a primeira sequência polipeptídica identificada- Frederick Sanger, 1953

Estrutura das proteínas

Desnaturação- envolve quebra das ligações não covalentes

Estrutura tridimensional da mioglobina - A sequência aminoacídica determina a estrutura tridimensional da proteína,

que pode ser identificada por cristalografia de raios X.
ESTRUTURA PRIMÁRIA: sequência de aminoácidos da cadeia polipeptídica
ESTRUTURA SECUNDÁRIA: arranjo regular de aminoácidos que estabelecem pontes de hidrogénio entre grupos CO e
NH da ligação peptídica.
 Hélice α
 Folha β

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ESTRUTURA TERCIÁRIA: resulta do enrolamento (folding) da cadeia polipeptídica. Dá origem à formação de domínios,
unidades básicas da estrutura terciária.
ESTRUTURA QUATERNÁRIA: interação entre vários polipéptideos. Ex: Hemoglobina: 4 cadeias polipeptídicas.

Funções das proteínas:

 Componentes estruturais
 Transporte e armazenamento de pequenas moléculas (Hemoglobina-O2)
 Transmissão de informação (hormonas)
 Defesa (anticorpos)
 Enzimas

Proteoglicanos
Proteínas glicosiladas com os polissacarídeos glucosaminoglicanos (GAGs). Constituintes importantes da matriz
extracelular.

Funções Lípidos:
 Fonte energia
 Constituinte das membranas biológicas
 Sinalização celular: (hormonas esteroides e mensageiros secundários)

ÁCIDOS GORDOS- lípidos mais simples, constituídos por uma cadeia hidrocarbonada, com um grupo carboxílico
numa extremidade. Podem ser insaturados se contêm ligações duplas entre os átomos de C ou saturados se os átomos
de C são rodados pelo número máximo de H.

TRIGLICERÍDEOS- forma de armazenamento dos AG; 3 AG ligados a uma molécula de glicerol; são insolúveis e
acumulam-se em gotículas lipídicas

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FOSFOLÍPIDOS- principal componente das membranas biológicas: 2 AG unidos a um grupo polar = moléculas
anfipáticas. Consiste numa molécula de glicerol ligada a 2 AG e um grupo fosfato (que se pode ligar a outro grupo
polar). O grupo polar define o nome do composto, sendo os mais comuns:
Fosfatidilcolina e esfingomielina, predominantes da parte externa da bicamada.
Fosfatidilserina e fosfatidiletanolamina, predominantes na parte interna da bicamada, conferindo-lhe carga
negativa, juntamente com o fosfatidilinositol.
As suas caudas (AG) apolares e a cabeça é polar, sendo esta a parte que está voltada para o meio aquoso. A
molécula denomina-se de anfipática e forma uma bicamada lipídica, impermeável a moléculas hidrossolúveis.
Possuem 3 tipos de movimentos: flip-flop, de troca entre folhetos, mais raro, rotação e flexão, das caudas, e
difusão lateral, o que contribui para a fluidez da membrana.

GLICOLÍPIDOS- contém 2 cadeias hidrocarbonadas ligadas a um grupo polar que contém CHO. São também
anfipáticos. São 2% da membrana, e estão presentes no folheto externo (fruto da glicosilação no complexo de
Golgi), com a parte glicídica virada para a matriz extracelular. Os diferentes glícidos contidos nestas moléculas
determinam o tipo sanguíneo.
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COLESTEROL- formado por 4 anéis hidrocarbonados muito hidrofóbicos em vez de cadeias lineares, mas o
hidroxilo num dos anéis confere um carácter também hidrofílico. Portanto, é também uma molécula anfipática.
Existe apenas nas membranas de células animais, em iguais concentrações dos fosfolípidos. É um lípido rígido,
constituído por anéis de ciclopentanoferantreno (comum a todos os esteroides), a parte apolar da molécula, e por
um grupo hidroxilo no final da cadeia, a parte polar -molécula anfipática. Faz diminuir ainda mais a permeabilidade
a moléculas hidrossolúveis e evita transições de fase da membrana face a variações de temperatura.

Aula Biocel 4 – Membranas organização estrutural

Membranas: Modelos mais relevantes

Membranas: Mosaico fluido com «rafts» lipídicos

SM: esfingomielina; GS: glicoesfingolípido;
PC: fosfatidilcolina; PE: fosfatidiletanolamina; PS: fosfatidilserina.

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Membranas: Composição química fundamental
Lípidos:
 Fosfoglicerídeos/fosfolípidos
 Esfingolípidos
 Colesterol
 Glicolípidos
Proteínas: Integrais / Periféricas
O conjunto destes lípidos não está permanentemente definido quer quimicamente quer espacialmente. Na verdade,
existem na membrana locais chamados de rafts lipídicos, zonas com maiores concentrações de colesterol,
esfingomielina e glicolípidos, que se podem mover e associar-se a certas proteínas, ativando-as.
A fluidez da membrana é influenciada por vários fatores:
Comprimento dos ácidos gordos dos fosfolípidos, quanto maior, mais fluida é a membrana.
Saturação dos ácidos gordos dos fosfolípidos, quanto mais insaturados, mais fluidez.
Movimentos dos fosfolípidos e proteínas, quantos mais forem, mais fluidez.
Presença de colesterol, a baixa temperatura impede o empacotamento dos fosfolípidos (o congelamento da
membrana), a alta temperatura interfere com o movimento dos fosfolípidos, impedindo que a membrana se desfaça.
Temperatura, quanto maior for, maior é a fluidez da membrana.

Fosfoglicerídeos/fosfolípidos:
Ác. Fosfatídico, Fosfatidilglicerol, Fosfatidiletanolamina, Fosfatidilserina, Fosfatidilcolina, Fosfatidilinositol

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 Alguns Lípidos das membranas - % do teor total de lípidos

Fosfoglicerídeos:
 Flexibilidade/Rigidez
 Polaridade
 Assimetria
 Difusibilidade…

Lípidos: Esfingolípidos

Lípidos: Colesterol

Membranas: Composição química fundamental

Proteínas: Integrais / Periféricas

Funções das proteínas membranares:

1.Receptores
2.Transportadores de moléculas
3. Intervenientes nos processos de adesão
4. Transporte de eletrões e protões
5. Conversão energética e movimentação de flagelos

Membrana Eritrocitária: Um modelo exemplar

Proteínas integrais: glicoforina, banda 3
Proteínas periféricas: espectrina, ankirina

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Biocel AT 5 - Transporte de materiais na superfície celular
Singer-Nicholson 1971

Concentrações de várias substâncias (mmol/L)

Passagem de moléculas através das membranas:

Difusão passiva
Difusão facilitada
 Transportadores/facilitadores
 Canais iónicos
Transporte ativo - Bombas

DIFUSÃO PASSIVA: Propriedade natural de todas as moléculas e membranas biológicas.

Taxa de Difusão: P.A. (C1aq-C2aq)
P: coeficiente de permeabilidade
A: área da membrana
C1aq e C2aq: [concentração] do soluto em cada lado da membrana

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Permeabilidade das moléculas

Notar que mais importante do que a dimensão, importa a carga elétrica da molécula a transportar!

DIFUSÃO FACILITADA
 Não carece de energia
 É feita a favor de gradientes
 Não carece de dissolução nos fosfolípidos
 Usa proteínas transmembranares transportadoras/facilitadoras

Captação de glicose pelo eritrócito:

Comparação da taxa real (vermelho) com a taxa por difusão passiva estimada (azul).
Consumo energético na passagem de solutos hidrofílicos através de uma membrana
Dissolução/Não dissolução nos fosfolípidos
Comparação entre difusão passiva e facilitada:

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Difusão facilitada:
Transportadores/facilitadores (carriers)
 Uniportadores -1
 Simportadores -2
 Antiportadores -3

1 2 3

1- DIFUSÃO FACILITADA: uniportador.

GLUT1, um exemplo de transportador uniportador.

2- DIFUSÃO FACILITADA: Simportador

2Na+/glicose - SGLT1, Sodium-dependent glucose transporter, um exemplo de simportador.
Modo de operação do Simportador 2Na+/glicose

O enterócito possui o simportador SGLT1, além do uniportador GLUT2 para difusão facilitada da glicose recém-
captada.

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3- DIFUSÃO FACILITADA: Antiportador
AE1, Cl-/HCO3- antiportador, exemplo antiportador da célula parietal do estômago

4 - DIFUSÃO FACILITADA: Canais iónicos

Medeiam a passagem de iões através da membrana citoplasmática;
Permitem a passagem de ~1 milhão de iões/seg
São muito seletivos para os diferentes iões
Tipicamente variam entre aberto ou fechado
- Uns são ligand-gated (abrem na presença do ligando)
- Outros são voltage-gated (respondem ao potencial)

TRANSPORTE ACTIVO: Bombas

Gastam energia
Contra o gradiente de concentração

Acionadas pela luz - Bacteriorodopsina, Membro peculiar da família dos GPCRs

Acionadas pelo ATP (ATPases)
 F ATPases (F0F1 ATPases)
 V ATPases (ATPases de vacúolos)
 P ATPases (Na+/K+; Ca++; Cu++…)
 Transportadores ABC (MDR, CFTR)

RESUMO DAS PROPRIEDADES ESSENCIAIS transportadores

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Aula 6 – Fundamentos de Biologia Molecular - Análise e deteção de ácidos nucleicos e proteínas

6. Centrifugação
Separação dos constituintes celulares pelas suas densidades, após rutura da membrana plasmática. Dois tipos:
Centrifugação diferencial, usando uma ultracentrifuga e obtendo-se 2 fases: o pellet, a fase mais densa, e o
sobrenadante, a fase menos densa. Tem a desvantagem de ser necessário fazer várias centrifugações para separar
componentes de baixa densidade.
Permite separar frações enriquecidas em organelos depois de homogeneizar os tecidos através de
sucessivas centrifugações: Estudo da função dos diferentes organelos

Centrifugação por gradientes de densidade, em que se usa, por ex, uma solução de sacarose com diferentes
densidades no tubo da centrífuga, colocando-se no topo a solução a centrifugar. Em cada solução de sacarose vão
sedimentar os organelos com densidade igual a essa solução.
Conforme a densidade dos organelos, a sua ordem de sedimentação é:
Núcleos Mitocôndrias,cloroplastos,lisossomas e peroxissomas RER e membrana Ribossomas

7. Cultura de Células
Técnica que permite estudar o crescimento e diferenciação celular, a manipulação genética para estudo dos genes,
as funções dos organelos celulares, através do crescimento de células e sua manutenção em meios de cultura,
estando assim disponíveis. As células são primeiro isoladas (tratadas com colagenase e tripsina na presença de
EDTA, um agente protetor de DNA) e depois colocadas num meio nutritivo (com sais, glucose, aminoácidos, etc.),

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num suporte sólido (a maioria das células não vive em meio líquido) revestido muitas vezes com colagénio ou laminina
(componentes da matriz extracelular).
Isolamento de células - Dispersar o tecido numa suspensão celular; tratamento dos tecidos com enzimas
proteolíticas como colagenase e tripsina
Crescimento celular - Normalmente existe a necessidade de um suporte sólido (como frascos de cultura celular),
muitas vezes revestido com componentes específicos da matriz extracelular (exº colagénio ou laminina)

7.1. Cultura de células animais

Permite estudar processos biológicos como o crescimento celular, a diferenciação e o envelhecimento celular. A
manipulação genética destas células in vitro é crucial para o estudo da função e estrutura de determinados genes

Cultura de células animais – composição dos meios

Nesta técnica é preciso ter em conta:

 Controlar a densidade celular, evitando a proliferação descontrolado das células.
 Evitar contaminação (bactérias/fungos) através de fungicidas e meios estéreis (fluxo laminar).
 Crescimento a 37ºC (temperatura constante) com 5% de CO2 e uso de incubadoras.
 Possibilidade de preservação celular, em congelação, com uso de DMSO (evita a formação de cristais de
gelo nas células) a -190ºC em azoto líquido.

Culturas Primárias/Secundárias
Culturas primárias: com células obtidas a partir do tecido original;
Culturas secundárias: com células obtidas de uma cultura primária.
As células podem ser sub-cultivadas durante semanas ou meses, mas existe um número finito de divisões celulares
A replicação das células em cultura apresenta um limite máximo, chamado limite de senescência celular, o nº de
divisões máximo que uma célula pode sofrer.
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- A transformação celular consiste em aumentar o tempo de vida das células adicionando o gene que codifica a
telomerase (impedindo assim o encurtamento dos genes) ou oncogenes virais que promovem o cancro, cujas células
são as únicas onde esta transformação celular ocorre naturalmente. Forma-se uma LINHA CELULAR, um conjunto
de células imortais suscetíveis de sofrer transformações.
Esta cultura de células permite a produção de hibridomas (fusão de linfócitos T com mielomas) e,
consequentemente, de anticorpos monoclonais.

Transformação e Linha celular

Transformação Celular -Surge da necessidade de manter as culturas celulares por um período maior de tempo. -
Acontece naturalmente em células derivadas de alguns tumores e raramente em células que espontaneamente
sofreram alterações genéticas -Pode ser induzida fornecendo às células o gene que codifica para a subunidade
catalítica da telomerase ou introduzindo-lhes certos oncogenes de origem viral promotores de cancro. Células
imortais estabelecem uma cultura designada de Linha celular

Métodos básicos de Biologia Molecular

Análise de ácidos nucleicos Análise de proteínas
Eletroforese SDS-PAGE
PCR Western-blotting
Southern-blotting Imunocitoquímica
Hibridação in situ
Sequenciação de DNA

8. Eletroforese
Técnica de separação de proteínas/ ácidos nucleicos com a aplicação de um campo elétrico. A mais usada é a PAGE-
em gel de poliacrilamida, que pode ser dividida:
- NATIVA, as moléculas são separadas pela sua massa, carga e forma;
- DESNATURANTE, as moléculas sofrem um processo de desnaturação com detergentes como o SDS
(dodealssulfato de sódio) que quebra ligações H e confere carga negativa à molécula e o DTT (ditiotreitol), que
quebra pontes dissulfureto. Assim, a molécula é apenas separada pelo seu peso molecular.
A poliacrilamida é um gel que possui poros, cujo tamanho varia com a % de acrilamida usada no gel:
+ acrilamida - poros mais pequenos, melhor separação de pequenas moléculas;
-acrilamida - poros maiores, melhor separação de grandes moléculas.
As moléculas desnaturadas (com carga negativa) são colocadas nos poços do gel, no polo negativo, migrando para o
polo positivo, podendo depois visualizar esta migração corando o gel com nitrato de prata ou azul de Comassie.
A eletroforese pode também ser de 2 tipos:
- Contínua, existe apenas o gel de separação (agarose ou poliacrilamida) e usa-se sempre o mesmo tampão.
- Descontínua, usa-se 2 géis: gel de empacotamento, colocado imediatamente depois dos poços, e que possuindo
poros maiores vai permitir a livre passagem de todas as moléculas, deixando-as no mesmo ponto de partida; gel de
separação, agarose ou poliacrilamida.
Relativamente ao DNA, o grupo fosfato concede-lhe carga negativa, migrando assim sempre de acordo com a sua
massa molecular, e no caso da separação de DNA, é mais frequente o uso de agarose, e a observação é feita com
recurso a brometo de etídio, nitrato de prata ou azul de metileno, sendo o primeiro cancerígeno pois tem a
capacidade de se intercalar entre as bases azotadas (emite cor laranja quando submetido a ultravioleta).

DNA/RNA naturalmente carregado negativamente

Na forma linear migra de acordo com a sua massa molecular

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ELETROFORESE EM GEL for dummies
Uma técnica utilizada para separar fragmentos de DNA e outras macromoléculas por tamanho e carga.
 A eletroforese em gel é uma técnica usada para separar fragmentos de DNA de acordo com seu tamanho.
 As amostras de DNA são carregadas nos poços (cavidades) localizados numa das extremidades de um gel, e
uma corrente elétrica é aplicada para fazê-las avançar pelo gel.
 Os fragmentos DNA estão carregados negativamente, então movem-se na direção do elétrodo positivo. Já
que todos os fragmentos de DNA têm a mesma quantidade de carga por massa, os fragmentos menores
atravessam o gel mais rapidamente do que os maiores.
 Quando um gel é pigmentado com um corante que se liga ao DNA, os fragmentos de DNA podem ser vistos
como bandas, cada uma representando um grupo de fragmentos de DNA de mesmo tamanho.

Introdução
Suponha que tenha acabado de fazer uma reação de PCR, criando várias cópias de uma região de interesse do
DNA. Ou talvez tenha feito uma clonagem de DNA, tentando "colar" um gene em um plasmídeo de DNA circular.
Agora, quer verificar se seu PCR funcionou, ou se seu plasmídeo contém o gene certo. Que técnica pode usar
para visualizar (observar diretamente) os fragmentos de DNA?

A Eletroforese em gel é uma técnica usada para separar fragmentos de DNA (ou outras macromoléculas, como
o RNA e proteínas) com base no tamanho e carga. A eletroforese envolve a passagem de uma corrente através
de um gel contendo as moléculas de interesse. Em função de seu tamanho e carga, as moléculas vão se mover
através do gel em diferentes direções ou em diferentes velocidades, o que permite que sejam separadas umas
das outras. Todas as moléculas de DNA têm a mesma quantidade de carga por massa. Por essa razão, a
eletroforese em gel de fragmentos de DNA faz a separação baseada apenas no tamanho. Através do uso da
eletroforese, podemos ver quantos diferentes fragmentos de DNA estão presentes em uma amostra, e o quão
grandes eles são em relação aos outros. Podemos também determinar o tamanho absoluto de um pedaço de DNA
examinando-o ao lado de um DNA "padrão", composto de fragmentos de DNA de tamanhos conhecidos.

O que é um gel? Géis para separação de DNA são muitas vezes feitos de um polissacarídeo chamado agarose,
que vem na forma de flocos secos em pó. Quando a agarose é aquecida em um tampão (água com alguns sais) e
deixada para esfriar, forma um gel sólido ligeiramente mole. No nível molecular, o gel é uma matriz de moléculas
de agarose que são mantidas unidas por ligações de hidrogênio e formam micro poros. Numa extremidade, o gel
tem cavidades semelhantes a bolsos chamadas poços, onde as amostras de DNA serão colocadas:

Antes das amostras de DNA serem adicionadas, o gel deve ser colocado em uma caixa de gel. Uma extremidade
da caixa é ligada a um elétrodo positivo, enquanto a outra extremidade é ligada a um elétrodo negativo. O corpo
principal da caixa, onde o gel é colocado, é preenchido com uma solução tampão contendo sal que pode conduzir
corrente. Embora você não seja capaz de ver na imagem acima (graças a minhas incríveis habilidades artísticas),
o tampão preenche a caixa de gel até o nível em que ele mal chega a cobrir o gel.
A extremidade do gel com os poços está voltada para o elétrodo negativo. A extremidade sem poços (para a
qual os fragmentos de DNA vão migrar) está voltada para o elétrodo positivo.

Como os fragmentos de DNA movem-se através do gel?

Uma vez que o gel esteja na caixa, cada uma das amostras de DNA que queremos examinar (por exemplo, cada
reação de PCR ou cada plasmídeo digerido por restrição) é cuidadosamente transferida para um dos poços. Um
poço é reservado para uma escada de DNA, um padrão de referência que contém fragmentos de DNA de

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comprimentos conhecidos. As escadas de DNA comerciais vêm em diferentes intervalos de tamanho, então
podemos escolher uma que tenha boa "cobertura" para a faixa de tamanho esperada de nossos fragmentos.
A seguir, a caixa é ligada e a corrente começa a fluir através do gel. As moléculas de DNA têm carga negativa
devido aos grupos fosfato em seus esqueletos de açúcar-fosfato, assim elas começam a se mover através da
matriz de gel, para o polo positivo.

As amostras de DNA são carregadas nos poços na extremidade do elétrodo negativo do gel. A energia é ligada
e os fragmentos de DNA migram através do gel (para o elétrodo positivo).
Após a corrida do gel, os fragmentos são separados por tamanho. Os fragmentos maiores estão perto da
extremidade superior do gel (elétrodo negativo, onde eles começaram), e os fragmentos menores estão próximos
da extremidade inferior (elétrodo positivo).
Qual fragmento de DNA vai ganhar a "corrida" para o polo positivo? Pedaços curtos de DNA vão viajar através
dos poros da matriz de gel mais rapidamente que os mais longos. Após o gel ter corrido por algum tempo, os
pedaços mais curtos de DNA vão estar mais próximos do polo positivo do gel, enquanto os mais longos vão
permanecer próximos aos poços. Pedaços muitos curtos de DNA podem correr diretamente para a extremidade
do gel se forem deixados por períodos suficientemente longos.

Visualização dos fragmentos de DNA: Uma vez que os fragmentos tenham sido separados, podemos examinar
o gel e ver quais tamanhos de faixas são encontrados. Quando um gel é pigmentado com um corante que se liga
ao DNA e depois colocado sob luz UV, os fragmentos de DNA brilham, o que nos permite visualizar o DNA
presente em diferentes locais ao longo da extensão do gel.

O bp ao lado de cada número na escada indica quantos pares de base tem o comprimento do fragmento de DNA.
Uma "linha" bem definida de DNA em um gel é chamada de banda. Cada banda contém um grande número de
fragmentos de DNA do mesmo tamanho e todos os que viajaram, como um grupo, para a mesma posição. Um
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 fragmento único de DNA (ou até mesmo um pequeno grupo de fragmentos de DNA) não seria visível por si só
em um gel. Ao comparar as bandas em uma amostra à escada de DNA, podemos determinar os tamanhos
aproximados. Por exemplo, a banda brilhante no gel acima tem, aproximadamente, o tamanho de 700 pares de
bases (bp).

10. PCR- polimerase chain reaction

Técnica de amplificação de sequências de DNA, por replicação sucessiva da cadeia principal/inicial. (cadeias
obtidas ao fim de x ciclos - 2x). Requisitos:
Cadeia molde a replicar
2 primers específicos, que determinam o inicio e o fim da sequência a replicar (sequências de 15 a 20
pares de bases)
TAQ DNA polimerase, enzima termorresistente obtida da bactéria thermus aquaticus, que vai copiar a
região a replicar
Nucleótidos livres.
Ocorre em 3 fases principais, que são repetidas num máximo de 50 ciclos:
1. Desnaturação, temperaturas elevadas (95ºC) separam a cadeia dupla de DNA.
2. Annealing, ligação dos primers, a temperatura baixa (60ºC) e os primers ligam-se às sequências complementares.
3. Elongação, os nucleótidos livres ligam-se a cadeia complementar por ação da TAQ DNA polimerase, que é
resistente a temperatura do processo (70ºC).

REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR) for dummies

 A reação em cadeia da polimerase, ou PCR, é uma técnica para fazer muitas cópias de uma região
específica do DNA, in vitro (em um tubo de ensaio, ao invés de um organismo).
 A PCR depende de uma DNA polimerase termoestável, a Taq polimerase, e requer primers de DNA
projetados especificamente para a região de interesse do DNA .
 Na PCR, a reação é repetida ciclicamente através de uma série de alterações de temperatura, o que
possibilita a produção de muitas cópias da região de interesse.
 A PCR tem muitas aplicações práticas e em pesquisa. Ela é rotineiramente usada em clonagens de DNA,
diagnósticos médicos e análises forenses de DNA.

A PCR é uma técnica rotineira de laboratório usada para fazer milhões de cópias de uma região específica do
DNA. Essa região do DNA pode ser qualquer objeto de interesse do pesquisador. Por exemplo, pode haver um
gene cuja função o pesquisador queira compreender ou um marcador genético usado pelos cientistas forenses
para correlacionar o DNA da cena do crime com os suspeitos. Tipicamente, o objetivo da PCR é fabricar
quantidade suficiente da região de interesse do DNA, de modo que essa possa ser analisada e utilizada de
alguma outra maneira. Por exemplo, DNA amplificado por PCR pode ser enviado para sequenciamento, visualizado
por eletroforese em gel, ou clonado em plasmídeo para futuros experimentos. É usada em muitas áreas da
biologia e medicina, incluindo pesquisa em biologia molecular, diagnósticos e mesmo alguns ramos da ecologia.

Taq polimerase
Assim como a replicação de DNA em um organismo, a PCR requer uma enzima DNA polimerase que faça novas
fitas de DNA usando as existentes como moldes. A DNA polimerase tipicamente usada na PCR é chamada
de Taq polimerase, em homenagem à bactéria resistente ao calor da qual ela foi isolada (Thermus aquaticus).
T. aquaticus vive em fontes termais e de água quente. Sua DNA polimerase é bastante estável ao calor e é mais
ativa a 70º (temperatura em que as DNA polimerases humanas ou de E. coli seriam disfuncionais). Essa
estabilidade ao calor torna a Taq polimerase ideal para PCRs. Como veremos, a alta temperatura é usada
repetidamente na PCR para desnaturar o DNA molde, isto é, separar as fitas.

Primers de PCR
Como outras DNA polimerases, a Taq polimerase consegue fabricar DNA somente quando lhe é dado um primer,
uma sequência curta de nucleotídeos que fornece um ponto de partida para a síntese de DNA. Em uma reação
de PCR, o pesquisador determina a região do DNA que será copiada, ou amplificada, pelos primers que ela ou ele
escolher. Os primers são pedaços curtos de DNA de fita simples, geralmente por volta de 202020 aminoácidos

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de comprimento. Dois primers são usados para cada reação de PCR, e eles são projetados de modo que englobem
a região de interesse (região que deve ser copiada). Isto é, são dadas sequências que os farão se ligar a fitas
opostas do DNA molde, bem nas extremidades da região a ser copiada. Os primers ligam-se ao molde por
pareamento de bases complementares.

Quando os primers são ligados ao molde, podem ser estendidos pela polimerase, e a região que está entre eles
será copiada.

As etapas da PCR: Os principais ingredientes de uma reação PCR são a Taq polimerase, primers, DNA molde e
nucleotídeos (blocos que compõem o DNA). Os ingredientes são reunidos em um tubo, juntamente com cofatores
de que a enzima precisa, e passam por repetidos ciclos de aquecimento e resfriamento que permitem que o DNA
seja sintetizado. As etapas básicas são:
1. Desnaturação (96 °): Aquece fortemente a reação para separar, ou desnaturar, as fitas de DNA. Isso
proporciona um molde de fita simples para a próxima etapa.
2. Annealing (65°): Arrefece a reação para que os primers possam ligar-se às suas sequências complementares
no DNA molde de fita simples.
3. Extensão (72 °): Eleva a temperatura da reação para que a Taq polimerase estenda os primers, sintetizando
novas fitas de DNA.

Este ciclo se repete 25 - 35 vezes em uma reação típica de PCR, que geralmente ocorre em 22 - 44 horas,
dependendo do comprimento da região de DNA a ser copiada. Se a reação for eficiente, a região de interesse
pode gerar de uma ou poucas cópias até bilhões. Isso porque não é apenas o DNA original que é utilizado como
molde a cada vez. Ao invés, o novo DNA feito em uma rodada pode servir de molde na próxima rodada de síntese
de DNA. Há muitas cópias dos primers e muitas moléculas de Taq polimerase flutuando pela reação, então o
número de moléculas de DNA pode aproximadamente dobrar a cada rodada do ciclo.

Uso da eletroforese em gel para visualizar os resultados da PCR

Os resultados de uma reação PCR são geralmente visualizados (tornam-se visíveis) através do uso
da eletroforese em gel. Eletroforese em gel é uma técnica na qual fragmentos de DNA são puxados por uma
corrente elétrica através de uma matriz de gel, e que separa os fragmentos de DNA de acordo com o tamanho.
Um padrão, ou escada de DNA, é tipicamente incluído para que o tamanho dos fragmentos nas amostras da PCR
possa ser determinado. Fragmentos de DNA de mesmo comprimento formam uma "banda" no gel, que pode ser
vista a olho nu se o gel for pigmentado com um corante que se liga ao DNA. Por exemplo, uma reação de PCR
produzindo um fragmento de 400400400 pares de bases (pb) apareceria desta maneira no gel:

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Coluna esquerda: Escada de DNA com bandas de 100, 200, 300, 400, 500 pb.
Coluna direita: resultado da reação PCR, uma banda em 400pb.
Uma banda de DNA contém muitas e muitas cópias da região de interesse do DNA, não apenas uma ou algumas
cópias. Como o DNA é microscópico, muitas cópias têm de estar presentes antes que possamos vê-las a olho nu.
Isso é uma grande parte do porquê de a PCR ser uma ferramenta importante: ela produz cópias suficientes de
uma sequência de DNA de modo que possamos ver ou manipular aquela região de DNA.

Aplicações da PCR: Através da PCR, uma sequência de DNA pode ser amplificada milhões ou bilhões de vezes,
produzindo cópias suficientes de DNA para serem analisadas por outras técnicas. Por exemplo, o DNA pode ser
visualizado por eletroforese em gel, enviado para sequenciamento, ou digerido por enzimas de restrição
e clonado em um plasmídeo. A PCR é usada em muitos laboratórios de pesquisa e também tem aplicações práticas
em ciências forenses, testes genéticos e diagnósticos. Por exemplo, a PCR é utilizada para amplificar genes
associados a desordens genéticas a partir do DNA de pacientes (ou do DNA fetal, nos casos de teste pré-natal).
A PCR também pode ser utilizada para testar se há DNA bacteriano ou viral no corpo de um paciente: se o
patógeno estiver presente, pode ser possível amplificar regiões de seu DNA a partir de uma amostra de sangue
ou tecido.

Amostra-problema: A PCR nas ciências forenses

Suponha que trabalhe num laboratório de ciências forenses. Acabou de receber uma amostra de DNA de um
cabelo deixado numa cena de crime, juntamente com amostras de DNA de três possíveis suspeitos. O seu
trabalho é examinar um marcador genético em particular e verificar se algum dos 3 suspeitos coincide com o
DNA do cabelo para esse marcador. O marcador vem em dois alelos, ou versões. Um deles contém uma única
repetição (região castanha abaixo), enquanto o outro contém duas cópias da repetição. Em uma reação PCR com
primers que atuam na região de repetição, o primeiro alelo produz um fragmento de DNA de 200, enquanto o
segundo produz um fragmento de DNA de 300 pb:

Marcador do alelo 1: primers que atuam na região de repetição amplificam um fragmento de DNA de 200 pb
Marcador do alelo 2: primers que atuam na região de repetição amplificam um fragmento de DNA de 300 pb
Faz uma PCR nas quatro amostras de DNA e visualiza os resultados por eletroforese em gel, como abaixo:

O gel tem cinco faixas:

Primeira faixa: Escada de DNA com bandas de 100, 200, 300, 400, e 500 pb.
Segunda faixa: DNA da cena do crime, banda de 200 pb.
Terceira faixa: DNA do suspeito #1, banda de 300 pb.
Quarta faixa: DNA do suspeito #2, bandas de 200 e 300 pb.
Quinta faixa: DNA do suspeito #3, banda de 200 pb.
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PCR- aplicação

Reverse Transcriptase-PCR- permite determinar níveis de expressão de genes

Quantitative Real Time PCR (PCR em tempo real)

O CYBRgreen é uma molécula que emite fluorescência apenas quando se intercala na cadeia dupla de DNA. A
quantidade de fluorescência é assim proporcional à quantidade de DNA. Na imagem à direita, a linha a azul é
detetada mais cedo a fluorescência (precisa de menos ciclos para ser detectada).

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10.Sequenciação DNA- Método de Sanger
A sequenciação de DNA é feita atualmente pelo método de Sanger: também com a utilização de primers, consiste
em adicionar em excesso didesoxirribonucleotidos marcados, que quando incorporados na cadeia de DNA fazem
parar a sua formação. A junção das sucessivas paragens e respetiva análise por eletroforese ou autorradiografia
permite saber qual a sequência de adição dos nucleotídos.

Revelação por autoradiografia (Raio X)

Técnica de coloração utilizada para identificar compostos químicos e processos celulares, usando precursores
metabólicos marcados radioactivamente (Exs: leucina, uracilo)
Ex: um precursor nucleótido de RNA é marcado radioactivamente e usado para estudo da transcrição do RNA.
As radiações dos precursores atingem a emulsão fotográfica colocada por cima da amostra, fazendo precipitar
cristais que se notam após revelação da emulsão, como é o caso dos cristais de brometo de prata.

Sequenciação DNA- aplicação

Sequência do exão 17 do gene da CFTR normal e mutado com a mutação 3272-26AG, mutação característica da
população Portuguesa

9. Bloting
Técnica que permite a transferência de moléculas previamente separadas por eletroforese para membranas de
alta afinidade (como a nitrocelulose), com o objetivo de detetar proteínas/RNA/DNA específicas, quer com
corantes ou por imunocitoquímica.

9.1. Southern-blotting
Separação e identificação de DNA, após:
Digestão com enzimas de restrição, endonucleases específicas que cortam sequências de DNA em locais
predefinidos, originando sequências chamadas de PALINDROMAS, obtidos normalmente a partir de bactérias.
Eletroforese.
Transferência do DNA para a membrana de alta afinidade.
Desnaturação reversível do DNA, onde as cadeias duplas são separadas.
Hibridização, onde as cadeias previamente desnaturadas se complementam com sondas marcadas que estão
inseridas nas membranas.
Deteção dos locais hibridizados por raio-x.

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Southern genómico

Southern genómico- aplicação

Hibridação- sondas
Sondas: Complementar à cadeia de ácido nucleico de interesse.
Desnaturação: Processo que permite separar 2 cadeias de DNA geralmente a 95ºC
Hibridação: Processo que permite que duas cadeias de DNA complementares possam voltar a formar uma dupla
hélice. Reações similares podem ocorrer com qualquer cadeia de ácidos nucleicos complementares (DNA/DNA;
RNA/RNA; DNA/RNA)

Marcação de sondas
Nucleótidos modificados:
 Radioactivamente (com radioisótopos)
 Com grupos químicos (como digoxigenina, biotina)
 Com grupos fluorescentes (como fluoresceína-FITC, rodamina)

9. Northern-blotting
Identificação de RNA, que sofre um processo semelhante ao DNA, embora sem digestão prévia e desnaturação.
(apenas possui cadeia simples).

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Análise de proteínas – Electroforese PAGE
Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) - migração de proteínas através de um gel de poliacrilamida quando
sujeitas a um campo elétrico. Podem ser:
 Nativas –Depende da Massa/Carga/Estrutura
 Desnaturantes – ultrapassam a Massa Carga Estrutura - SDS-PAGE

SDS (Dodecilssulfato de sódio) -mercaptoetanol Agente redutor: Quebra as pontes

Detergente iónico desnaturante: dissulfureto
Confere carga negativa às proteínas

Para visualização das proteínas após SDS-PAGE, os géis de acrilamida são normalmente corados com nitrato de
prata ou azul de Coomassie

9. Western-blotting
Separação de PROTEÍNAS, após eletroforese desnaturante, passagem das mesmas para a membrana, por
condução elétrica e seu reconhecimento por anticorpos fluorescentes/radioativos. TRANSFERÊNCIA das
proteínas, sob ação de corrente elétrica e após separação por PAGE, para uma membrana de alta afinidade
(normalmente nitrocelulose) As proteínas na membrana podem ser posteriormente coradas (por ex, com Ponceau
S) ou detetadas com ATC específicos

QUADRO- RESUMO DAS TÉCNICAS DE BLOTTING:

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Aula 7 – Tecnologia DNA recombinante. Transgénese

A tecnologia do DNA recombinante deu aos cientistas a possibilidade de isolar o DNA, separá-lo e manipulá-lo,
bem como fazer a sua sequenciação ou amplificar certas porções. Uma técnica de DNA recombinante que envolve
a utilização de plasmídeos e enzimas de restrição tem como função síntese de moléculas de DNA recombinado:
- Plasmídeos, são moléculas de DNA circular que se replicam independentemente do DNA cromossómico, nas
bactérias.
- Enzimas de restrição, ou endonucleases de restrição, são enzimas que quebram o DNA em locais específicos.

Técnicas de ADN Recombinante

Técnicas que se empregam na síntese, amplificação e purificação/isolamento e recombinação/manipulação de
segmentos discretos de ADN
Tem possibilitado o estudo molecular da estrutura e função de genes eucariotas e dos genomas

Enzimas de restrição
As enzimas de restrição- enzimas que cortam o ADN em sequências específicas, foram inicialmente identificadas
em bactérias, onde constituem uma defesa contra a entrada de ADN estranho

Acão de uma enzima de restrição que, neste caso, corta em G│AATTC - EcoRI recognizes the sequence GAATTC.
Existem imensas.

O MÉTODO:
1) As enzimas de restrição são usadas no DNA humano, para obter os fragmentos de restrição, que são as
porções que queremos ver inseridas nos plasmídeos e depois recombinados. A mesma enzima atua sobre o
lasmídeo para lhe retirar a mesma sequência, deixando livre o espaço para recombinação com a porção do DNA
humano.
2) A ligação entre o fragmento de restrição e o plasmídeo é catalisada pela DNA ligase, resultando numa nova
molécula recombinada.
3) Dado que o plasmídeo possui origem de replicação, tem um gene que confere resistência a um dado antibiótico
(ex: ampicilina), ele é colocado num meio com esse antibiótico, garantindo então que só o plasmídeo recombinado
sobrevive e multiplica. Posteriormente faz-se a extração do DNA pretendido.

EcoRI digestion and gel electrophoresis of λ DNA

GAATTC is present at five sites in DNA of the bacteriophage λ, so EcoRI digests λ DNA into six fragments ranging from
3.6 to 21.2 kilobases long.
1 kilobase (kb) = 1000 base pairs
The fragments can be separated by gel electrophoresis.
A gel of agarose or polyacrylamide is placed between two electrodes and the sample added to the gel. Nucleic acids
are negatively charged so they migrate toward the positive electrode.
Smaller molecules move through the gel more rapidly, allowing the fragments to be separated by size.

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Mapas de restrição
The order of restriction fragments can also be determined, and maps of restriction sites generated.
Detailed restriction maps of viral DNA molecules have been produced.

Recombinant DNA
Purified DNA fragments can be obtained through molecular cloning.
In molecular cloning a DNA fragment of interest is inserted into a DNA molecule (a vector) that is capable of independent
replication in a host cell.
The result is a recombinant molecule or molecular clone.

Vetores de clonagem (exº, DNA de Plasmídeos ou Fagos)

Fragments of human DNA can be cloned in plasmid vectors: small circular
DNA molecules that can replicate independently in bacteria.
Recombinant plasmids with human DNA inserts can be introduced into E. coli, where they replicate along with the
bacteria to yield millions of copies of plasmid DNA.

Plasmídeo recombinado, para Transformação

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Transformação

Biblioteca genómica
A elevada síntese e clonagem através do DNA recombinante permite-nos elaborar uma biblioteca genómica. No
entanto, cada genoma de cada espécie possui milhares de milhões de pares de bases, sendo então mais prático
fazer uma biblioteca de DNA complementar. Este DNA obtém-se através da transcriptase reversa a partir do
RNA, o que reduz os pares de bases pois o cDNA apenas contem as bases necessárias a formação de um produto
funcional (proteína/RNA).
Se cada fragmento de ADN a clonar tiver ~20 Kb de comprimento…
Para um genoma humano de 3,2 mil milhões de pb, teremos uma Biblioteca Genómica de …150 000 clones !!!!
Alternativa: Bibliotecas de ADN complementar (ADNc).
RNA can also be cloned.
RNA is copied using reverse transcriptase. The resulting DNA (cDNA) is ligated to a vector DNA. This allows
mRNA to be isolated as a molecular clone, and allows exploration of the noncoding sequences in eukaryotic genes
(introns).

Bibliotecas genómica e de ADN complementar (ADNc).

Molecular cloning is also used to make large amounts of protein for study.
Many proteins in cells are present in small amounts and can’t be purified. Cloned genes can be used to engineer
vectors that lead to high levels of gene expression in bacteria or eukaryotic cells.
In bacteria, cDNA is cloned into a plasmid or phage vector (an expression vector).
Inserted genes can be expressed at levels as high as 10% of the total bacterial protein.

Estudar a função genética em Eucariontes

Organismos geneticamente modificados: Os genes clonados podem ser também introduzidos em células da linha
germinativa de organismos multicelulares.
TRANSGENE: Segmento de ADN, previamente isolado de um organismo/entidade dadora, e introduzido num
organismo/entidade diferente, recetora. Pode ser um gene ou um segmento não codificante.

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A construção de uma planta transgénica

Embora este processo seja mais complexo, também é possível transformar o genoma de uma planta, um ser
eucariota.
Ex: o plasmídeo Ti faz parte da Agrobacterium tumefaciens, uma bactéria que se liga às folhas das plantas,
transmitindo assim esse plasmídeo. Assim, se queremos induzir alterações genómicas na planta, basta inserir no
plasmídeo Ti o DNA que queremos ver manifestado, porque depois ele será incorporado no DNA da planta. Estas
alterações servem, por exemplo, para tornar uma planta mais resistente a um certo herbicida.

A bactéria Agrobacterium tumefaciens - O plasmídeo Ti e a formação de tumores

No Laboratório: Vector intermédio a preparar em E. coli, desarmado
Construção de um «polylinker» com o gene de interesse (e outros, deselecção para a espectinomicina e a kanamicina)
Transformar a A. tumefaciens e seleccionar com espectinomicina
Infectar caules jovens da planta a transformar. Aguardar a transformação e seleccionar as células transgénicas em
meio com kanamicina)
Since many plants can be regenerated from a single cell, transgenic plants are easily established.
Many economically important plants, including corn, tomatoes, soybeans and potatoes, are transgenic varieties.

Desvantagens:
Tóxicos para outros organismos;
Podem não ter o mesmo sabor
Possíveis danos ao meio ambiente
Possível agravamento de alergias
Desequilíbrios ecológicos
Poucos estudos

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Ratinho transgénico

A construção de um animaltransgénico O «knock-out»

Objetivo final: animal com o gene X inativado em todas as suas células
Princípio: Inativar o gene nas células mais primitivas
Production of mutant mice (KO mice) by homologous recombination in ES cells
In mice, approximately 20% of genes have currently been knocked out by homologous recombination, but there is

O objetivo final será obter um rato em que o gene X esteja

inactivo em todas as suas células, partindo do princípio que:
os genes injetados integrarão aleatoriamente as células por
recombinação; as células continuarão viáveis; o processo é
exequível em células jovens.
1) Produzem-se células jovens transgénicas, introduzindo o
gene X já inativo em vetores que serão introduzidos nas
células estaminais do rato. Aguarda-se a recombinação e
verifica-se a viabilidade das células.
2) Introduzem-se estas células jovens recombinadas nos
blastocistos de rato, onde podem surgir quimeras, células com
2 DNA’s, por recombinação.
3) Cruzam-se várias estripes de ratos com as quimeras, ate
obter uma geração de ratos knock-out, onde todos os ratos
possuem o gene X inativo em todas as suas células.

an international effort to knockout all mice genes.

Engenharia genómica usando o Sistema CRISPR/Cas “do inglês Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic
Repeats”

Small Interfering RNA (siRNA)- outra forma de interferir com a expressão de genes
Os ácidos nucleicos anti-sense são RNAs ou DNAs de cadeia simples complementares ao mRNA de um gene de
interesse. Hibridizam com o mRNA e impedem a sua tradução em proteínas.

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Aula 8 - Genómica e proteomica
A abordagem experimental da biologia celular e molecular tem mudado.
Tradicionalmente: estudar um ou poucos genes ou proteínas de cada vez. Os projetos de sequenciação dos genomas
mudaram este paradigma: surgiram abordagens experimentais de grande escala.

Sequenciação do genoma humano:

1990-2000 – The Human Genome Project: Um consórcio de vários cientistas trabalharam para descodificar o
genoma. Francis Collins era o diretor do projeto público; Craig Ventner o presidente da Celera Genomics (privado).
No início do projecto: cada investigador conseguia sequenciar cerca de 2000 pares de bases/dia; o genoma humano
tem cerca de 3 biliões de bases.. Seriam precisas1.5x106pessoas/dia para sequenciar todo o genoma humano.
 Sequenciação manual – géis de poliacrilamida + radioisótopos
 Sequenciação automática – capilar (500pbases/segundo)

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Análise da Expressão Genética
DNA chip array

Permite analisar, em simultâneo, a expressão diferencial de milhares de genes em populações celulares diferentes.
Doenças poligénicas, p.e. esquizofrenia, Alzheimer
Cancro (disfunções genéticas e epigenéticas)
0,2-10% dos 10000-20000 mRNA são diferencialmente expressos entre tecidos normais e cancerígenos
Hybridization Based Gene Expression Quantification
DNA microarray analysis can reveal differences in gene expression in fibroblasts under different experimental
conditions.

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RNA-Seq
Transcriptome profiling using NGS
RNA-seq-revelaas sequencias dos transcritos de uma célula e não apenas a sua presença como o microarray.
Também revela a abundância dos mRNAs.

Advanced protein techniques

 SDS-PAGE
 IEF-Focagem isoelétrica
 Electroforesebidimensional
 Immunoprecipitation
 Two-hybridsystem

Electroforese bidimensional: 1º Focagem isoelétrica (para igual todas as proteínas para carga negativa); 2º SDS-
PAGE (separá-las pelo tamanho/peso molecular)

A eletroforese bidimensional consegue separar milhares de proteínas diferentes. A sua identificação pode ser
feita por espectrofotometria de massa

Métodos que permitem determinar interações entre proteínas

•Two-hybridmethodin yeast
•Co-immunoprecipitation

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Aula 9 – Estrutura e função do ADN – Genes e Genoma
 Estrutura dos genes eucariotas
 Sequências não codificantes
 Cromossomas e cromatina
Genomas completos de bactérias, leveduras, várias espécies de plantas e animais já se encontram sequenciados. A
maioria dos eucariotas posui genomas maiores e mais complexos que os procariotas
Mas…o tamanho do genoma nem sempre está relacionado com a complexidade do organismo: os mamíferos possuem
genoma menor que algumas plantas ou anfíbios
Maioria dos genomas dos eucariotas contém grande quantidade de DNA não codificante
Principal responsável pelas diferenças nos tamanhos dos genomas dos eucariotas.
Onde se localizam as sequências não codificantes?

Gene: segmento de DNA que é expresso de modo a originar um produto funcional, pode ser uma proteína ou RNA.
A maior parte dos genes eucariotas também contém uma grande quantidade de DNA não codificante
 Intrões: sequências não codificantes
 Exões: sequências codificantes
A totalidade do gene é transcrita em RNA e só depois os intrões são removidos por splicing, de forma a que apenas
os exões sejam incluídos no mRNA
Para que servem os intrões? Regulação da expressão génica. Permitem que os exões de um determinado gene
possam ser unidos em diferentes combinações, através de splicing alternativo: várias proteínas codificadas pelo
mesmo gene
A informação crítica necessária para a “produção” de um ser humano encontra-se num estado alarmante de
desordem/caos: “sótão desarrumado onde ao longos dos anos se foi acumulando de tudo e nunca se descartou nada”

Análise do genoma humano

Sequências não codificantes

Sequências repetitivas – cerca de 50% do genoma
Sequências repetitivas de DNA não codificante – podem apresentar centenas de milhares de cópias

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Dois tipos principais de sequencias repetitivas:
1) Repetições em tandem (Tandem repeats) - Repetições adjacentes de um padrão de dois ou mais nucleotídeos.
Formam uma banda com densidade diferente (sequências ricas em AT são menos densas que sequências ricas em
GC) da maioria do DNA quando separado por centrifugação em gradiente de CsCl – DNA satélite
2) DNA repetitivo disperso (Interspersed repetitive DNA) - Cada unidade tem entre 5-300 pb, dependendo das
espécies. Repetem-se entre 100 000 e 1 000 000 de vezes. Apresentam geralmente localização na
heterocromatina. Ex: DNA telomérico e DNA centromérico

Tandem repeats vs Doença

Número aumentado de repetições em tandem encontra-se relacionado com algumas doenças neurológicas

Short-Tandem Repeats (STRs) - Número de repetições é variável entre indivíduos

DNA repetitivo disperso (Interspersed repetitive DNA)

SINEs (short interspersed elements) 100 –300 pb;

~13% do DNA humano
Retrotransposões
Movem-se no genoma com o
LINEs (long interspersed elements) 4–6 kb; ~21% do
auxílio da transcriptase
DNA humano
reversa

Retrovirus-like elements (Long terminal repeats)

DNA transposons – movem-se no genoma por mecanismo de “cut and paste”

Mecanismos de transposição
 DNA transposão: Cut and Paste
 Retrotansposão: Copy and Paste
Transposição de SINEs e LINEs induzem mutações que se encontram associadas com várias doenças como a
hemofilia, fibrose cística, distrofia muscular e cancro
Algumas das mutações resultantes do movimento destes elementos podem ser benéficas e contribuir para a
evolução das espécies
A presença de múltiplas cópias dos mesmos genes também contribui para a grande dimensão do genoma.

Família de genes
Genes relacionados que podem ser transcritos em diferentes tecidos ou em diferentes fases do desenvolvimento
Exe: α and β subunits of hemoglobin are encoded by gene families; different members of these families are
expressed in embryonic, fetal, and adult tissues

Duplicação de genes
As famílias de genes terão tido origem na duplicação de um gene ancestral, seguida de mutação e divergência
Evolução de proteínas otimizadas para diferentes funções
Ex: fetal globins have a higher affinity for O2 than do adult globins
As famílias de genes terão tido origem na duplicação de um gene ancestral, seguida de mutação e divergência
Algumas mutações resultam na perda de função

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Pseudogenes: Cópias de genes não funcionais que contribuem para a dimensão do genoma, existem cerca de 11000
pseudogenes no genoma humano

Organização do genoma
O DNA de uma célula eucariota estendido terá cerca de 2 m mas tem de estar contido no núcleo que tem um
diâmetro de 5 a 10 micrómetros
Equivalente a enrolar 40 km de arame fino dentro de uma bola de ténis
Compactação do DNA tem de ser muito eficiente!
Nos eucariotas, está dividido em cromossomas que são compostos por cadeias longas e lineares de DNA
No humano, existem 24 cromossomas diferentes: 22 autossómicos + 2 sexuais
A maioria das nossas células (diplóides) contém duas cópias de cada cromossoma (cromossomas homólogos, excepto
os sexuais)
No total, o cariótipo humano possui 46 cromossomas – 46,XX ou 46,XY

Cromossomas e cromatina
Nos cromossomas, o DNA encontra-se associado a proteínas, essencialmente histonas – cromatina!
As histonas são pequenas proteínas que contêm uma percentagem elevada de aminoácidos básicos (arginina e lisina)
que facilitam a sua ligação à molécula de DNA que apresenta carga negativa
Nos cromossomas, o DNA encontra-se associado a proteínas, essencialmente histonas – cromatina!
A cromatina pode apresentar diferentes graus de compactação:

Compactação da cromatina
O primeiro nível de compactação de DNA é o seu enrolamento em nucleossomas: octâmero formado por: 2 x H2A
+ 2 x H2B + 2 x H3 +2 x H4
em torno do qual se enrolam 147 pb de DNA
Nucleossoma é estabilizado pela ligação da Histona H1 (+20 pb), originando o cromatossoma

Cromatina – fibra 10 nm: A formação de cromatossomas unidos por segmentos de DNA origina fibras de
cromatina de 10 nm (compacta 6x o comprimento da molécula de DNA)

Cromatina – fibra 30 nm: A fibra de 10 nm enrola sobre ela própria e torna-se mais compactada formando
fibras de cromatina de 30 nm (H1 é importante para este nível de compactação) – compacta 50x

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Cromatina – Interfase: Na interfase, a maioria da cromatina (eucromatina) encontra-se na forma de fibras de
30 nm (às vezes 60 a 130nm) – pode ocorrer replicação e transcrição. A heterocromatina (cerca de 10% na
interfase) encontra-se num nível bastante elevado de compactação fazendo lembrar a cromatina nas células em
mitose - transcripcionalmente inactiva

Metafase – Cromossomos
Origem de replicação - Local onde se inicia a produção de um novo cromossoma
Centrómeros - Locais onde os cromossomas são puxados de forma a serem separados – Região especializada
que assegura a distribuição correta dos cromossomas pelas células-filhas durante a mitose;
local de ligação para as proteínas que formam os cinetocoros. No humano, 1-5 Mb de sequências repetitivas em
tandem (171 pb ricas em A/T), constituem 5% do genoma
A cromatina nos centrómeros apresenta uma estrutura particular. Nos nucleossomas, histona H3 é substituída
pela variante CENP-A, que é indispensável para a ligação das proteínas do cinetocoro a esta região

Telómeros - Extremidades dos cromossomas: Sequências das extremidades dos cromossomas; importantes para
a replicação de DNA linear. Sequências repetitivas semelhantes entre os eucariotas, repetidas centenas de
milhares de vezes e terminam com DNA em cadeia simples em 3’ (forma um loop e é protegida por ligação à
shelterina)

Resumo
Eucromatina- 30nm ou 60-130 nm
Heterocromatina- muito condensada-contém sequencias repetitivas de DNA, tais como as presentes
nos centrómeros e telómeros, e genes não activos

Dinâmica dos nucleossomas

Os nucleossomas não são estruturas estáticas: o DNA de cada nucleossoma está constantemente a
desenrolar-se permitindo a ligação de proteínas e a ocorrência dos mecanismos de leitura genéticos

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Aula biocel 10 – Replicação e reparação de ADN
Replicação: processo anterior à mitose, pelo qual as moléculas de ADN de uma célula são copiadas (duplicadas),
permitindo que, na conclusão da divisão celular, as novas células tenham moléculas de ADN iguais às da célula
original. A replicação do ADN é conservadora ou semi-conservadora? Experiências de Meselson e Stahl
A replicação do DNA de uma célula é um processo através do qual uma cadeia (em hélice dupla) de DNA serve de
molde ao fabrico de outra ―nova‖ mas totalmente igual.
É um processo semiconservativo dado que metade da cadeia original é conservado na nova cadeia.

A replicação começa nas Origens de Replicação com a ligação de um complexo ORC e a abertura da cadeia, e
ocorre nos dois sentidos (bidirecional). As origens de replicação são sequências conhecidas. Nos humanos há várias.
A zona criada chama-se “forquilha de replicação”.

Existem vários parâmetros necessários à replicação do DNA:

1) Cadeia líder e cadeia lenta, forquilha de replicação. A cadeia de DNA é uma dupla hélice, em que duas cadeias
singulares crescem antiparalelamente. A ―Abertura‖ desta cadeia resulta numa forquilha de replicação, em que
surgem duas cadeias, que crescem em sentidos opostos:
Cadeia líder, de replicação contínua. A cadeia cresce no sentido contrário ao da abertura (3’5’), ou seja, a
adição de nucleótidos será feito normalmente de 5’3’ (a DNA polimerase atua no sentido 5’3’, logo é fácil para
ela prosseguir na replicação da cadeia).
Cadeia lenta, de replicação descontínua. A cadeia cresce no sentido da abertura da dupla hélice, ou seja, a
adição de novos nucleótidos seria feita ao contrário, de 3’5’. Isto não é possível pois a DNA polimerase apenas
trabalha no sentido 5’3’, o que torna necessário um primer (3 a 10 nucleótidos) de RNA, sintetizado pela primase,
que será depois preenchido pela DNApolimerase, resultando nos fragmentos de Okazaki, que serão adicionados a
cadeia lenta. No final, a DNA ligase une os fragmentos.
2) DNA polimerases. Enzimas que catalisam a adição de novos nucleótidos a uma cadeia de DNA já existente,
apenas no sentido 5’3’. Existem vários tipos de DNA polimerases nos eucariontes: polimerase α, que atua com a
primase na formação dos fragmentos de Okazaki; polimerase ß, atua na reparação do DNA; polimerase δ, atua na
replicação do DNA mitocondrial; polimerase σ, preenche falhas entre os fragmentos de Okazaki. Não conseguem
dar início à formação de uma cadeia de DNA; requerem uma cadeia pré-existente ou uma pequena sequência de
nucleotídeos chamada de primer.
 Polimérase α: tem subunidade com atividade de prímase 5’3’.
 Polimérase δ: dímero com elevada capacidade de adição de nucleotídeos (processividade) em ambas as
cadeias e dotada de actividade de exonuclease 3´5´ após verificação de complementaridade (proof-
reading) e deletam o missmatch.
 Polimérase ε: reparação após a exonulease
 Lígase
3) Origem de replicação. É uma sequência de nucleótidos específica onde tem inicio a replicação. São zonas ricas
em ADENINA e TIMINA, pois estão unidas apenas por 2 ligações fracas, sendo mais fácil quebrá-las. Quanto
mais complexo é o ser, mais origens de replicação existem.
4) Topoisomerases. Enzimas que impedem o enrolamento entre as diversas partes da hélice dupla do DNA (como
no fio de telefone), enrolamento esse que se dá após a abertura da forquilha de replicação.
5) Helicases. Enzima que separa a abertura da dupla hélice através da quebra das pontes de H, induzindo a
formação da forquilha de replicação.
6) Single stranded binding proteins. Ligam-se à cadeia de DNA aberta e impedem-na de se ligar novamente, pelo
menos quando a helicase lá permanecer.
7) Telomerases. O final de uma cadeia de DNA tem o nome de telómero, e constitui uma parte em cadeia única e
linear de DNA. Isto representa um problema no processo de replicação, pois a DNA polimerase não consegue
replicar a extremidade 5’ da cadeia, o que significaria o corte da mesma e perda de material genético. Este
problema é resolvido pela telomerase, uma transcriptase reversa, que vai acrescentando nucleótidos à cadeia
através de um molde de RNA, estendendo a cadeia em AGGGTT, impedindo assim o encurtamento dos telómeros
(permitindo o não encurtamento da vida da célula de modo exagerado).

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Evidência das 2 forquilhas de replicação

Origem de Replicação
-na E. Coli (única)
-nos fungos (centenas)
-nos seres humanos (dezenas de milhares) – quanto mais complexo o animal, mais origens de replicação.

Princípio maior da replicação: A replicação do ADN faz-se de 5´ para 3´

A DNA polimerase pode somente fazer DNA na direção 5' para 3', e isto coloca um problema na replicação. Uma
dupla hélice de DNA é sempre antiparalela; ou seja, uma fita vai na direção 5'3', enquanto a outra vai na direção
3'5'. Uma das novas fitas, a que se desloca de 5' para 3' em direção ao garfo de replicação, é a fácil. Esta fita é
feita continuamente, porque a DNA polimerase se move na mesma direção que o garfo de replicação. Esta fita
sintetizada continuamente e rapidamente é chamada fita líder.

A outra fita nova, que se desloca de 5'3' é feita de modo descontínuo, em fragmentos, chamada fita lenta. Os
pequenos fragmentos são chamados de fragmentos de Okazaki. A fita líder pode ser ampliada a partir de um
único primer, enquanto a fita tardia precisa de um novo primer para cada um dos curtos fragmentos de Okazaki.
Finalmente, há um pequeno trabalho de limpeza a fazer se queremos que o DNA não contenha nenhum RNA ou
lacunas. Os primers de RNA são removidos e substituídos por DNA através da DNA polimerase. Os cortes que
permanecem depois dos primers são substituídos e fechados pela DNA ligase.

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 - REPARAÇÃO DO ADN –
Por ser sujeito a várias reações químicas, o DNA é suscetível de sofrer várias alterações, o que pode ter
implicações graves, já que codifica a formação de proteínas importantes no funcionamento das células. Estas
alterações são frequentemente conhecidas como MUTAÇÕES. Globalmente: cerca de 100,000 ações
potencialmente mutagénicas sobre cada célula… por dia!!
1. Erros de replicação
Erros na Selecção das bases: 1: mil
Erros na verificação de complementaridade (Proof-reading) : 1: 1 milhão
Erros na remoção de nucleotídeos (Mismatch excision repair) logo após a polimerização: 1:1 bilião.
2. Alteração espontânea de ligações químicas no ADN
Depurinação e Desaminação (formação de aductos por dimerização)
3. Agentes físicos: radiação UV e radiação ionizante ou Agentes químicos: genotóxicos ambientais ou industriais
(aflatoxina, asbesto, cloreto de vinilo, benzeno, benzopireno…) e produtos laterais do metabolismo (ROS). Estes
podem criar dímeros de pirimidinas (ex: anel de ciclobutano criado pelas radiações UV), alquilação, etc.
Se as mutações que ocorrem forem compatíveis com a vida e não corrigíveis, ocorre uma doença. Se a mutação não
for compatível causa a morte.

Os MECANISMOS DE REPARAÇÃO são:

Excisão e reparação de bases, em que a base é retirada e introduzida a correta. Exemplo: desaminação da
citosina origina uracilo.
Excisão e reparação de nucleótidos, em que o nucleótido inteiro é removido e substituído, como acontece na
dimerização da timina. Ex: Sdr Werner (mutação no gene codificador de uma helicase usada no processo de excisão
e reparação); Xerodermia pigmentosa (Mutação em genes XP codificadores de fatores de reparação global); assim
como reparação associada à transcrição (erros em gene ativamente transcritos) como na Sindrome de Cockayne;
Excisão de não complementaridade/mismatch, que reconhece bases mal emparelhadas que escaparam ao
proofreading da DNA polimerase durante a replicação; os MLH e MSH ligam-se ao par de bases desemparelhadas,
removem a porção da cadeia que apresenta o mismatch. O espaço é preenchido pela DNA polimerase e ligado pela
DNA ligase. Também existe a translesion DNA Synthesis, que é uma forma de lidar com DNA modificado na
forquilha de replicação, ou seja, o DNA contém danos, como por exemplo dímeros de timina, e não consegue ser
replicado pelas DNA polimerases; neste caso umas DNA polimerases especializadas são capazes de replicar o DNA
com danos, apesar de existirem muitos mais erros, e não possuírem atividade exonuclease 3’5’.
Reparação de quebras nas duas cadeias, por recombinação homóloga/não homóloga. A recombinação homóloga
verifica-se quando os dois cromatídeos irmãos ainda se encontram próximos/acessíveis (antes da divisão celular),
e utilizam-se as sequências do íntegro para servir de molde para o danificado. Na recombinação não homóloga, não
existe um molde de cromatídeo íntegro, pelo que apenas se ligam as zonas remanescentes do danificado (possível
de vários erros).

NOTA:
As reparações são normalmente promovidas pela proteína P53, guardiã do genoma, e cujo mau funcionamento
resulta na maioria das mutações visíveis no organismo.

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Aula biocel 11 - Transcrição e processamento do RNA


A transcrição é o primeiro passo para a expressão de um gene, e consiste num processo em que uma cadeia de
RNA é sintetizada a partir de uma cadeia de DNA complementar, pelas RNA polimerases. Após a transcrição, nos
eucariotas, o RNA produzido passa por um processo de amadurecimento, migra para o citoplasma, sendo finalmente
traduzido em proteínas. Sempre na direção 5’3’.
Gene: Sequência de DNA que contém a informação necessária para a síntese de uma cadeia polipeptídica ou um
RNA funcional (rRNA ou Trna).

O RNA pode ser de 3 tipos distintos:

RNA mensageiro (mRNA), que encerra em si o código para a síntese de proteínas.
RNA ribossomal (rRNA), produzido a nível nucleolar, integra os ribossomas, onde se dá a síntese proteica.
RNA de transferência (tRNA), cuja função é captar os aminoácidos livres e conduzi-los aos ribossomas.

Por sua vez, também as RNA polimerases, enzimas que catalisam o processo de transcrição (catalizam reacções
fosfodiéster), podem ser de 3 tipos:
RNA polimerase I (poli I), transcrição do rRNA 5,8S, 18S, 28S.
RNA polimerase II (poli II), transcrição do mRNA e do snRNA e snoRNA. (small nuclear RNA)
RNA polimerase III (poli III), transcrição no tRNA e do rRNA 5S.

Diferenças entre a RNA polimerase e a DNA polimerase: a RNA não necessita de primers, utiliza
ribonucleotídeos e possui proof-reading menos eficiente.

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O CICLO DE TRANSCRIÇÃO geral apresenta 3 fases:
1. INICIAÇÃO, a ligação da RNA polimerase à cadeia de DNA (até 50 nucleotídeos iniciais). A RNA poli liga-se a
uma sequência de DNA chamada promotor. Cada gene tem seu próprio promotor. Para reconhecer e colocar-se
corretamente no promotor, a RNA polimerase II necessita de várias proteínas acessórias (fatores de transcrição).
Uma vez ligada, a RNA poli separa as fitas de DNA e cria cerca de 50 primeiros nucleotídeos. Após isso, liga-se a
fatores de elongação, que continuam o processo.

2. ELONGAÇÃO, a adição de novos ribonucleótidos. Um filamento de DNA, a fita molde, age como molde para a
RNA polimerase. Conforme ela "lê" esse molde uma base por vez, a polimerase constrói uma molécula de RNA feita
de nucleotídeos complementares, formando uma cadeia que cresce de 5´para 3´. O transcrito de RNA carrega a
mesma informação que o filamento não-molde (codificador) de DNA, mas contém a base Uracilo (U) em vez de
tiamina (T)
3. TERMINAÇÃO, saída da RNA polimerase (quando a fita de RNA é libertada). A RNA poli transcreve até
encontrar sinais para parar. O processo de término da transcrição é chamado terminação e isso acontece uma vez
que a poli transcreve uma sequência de DNA conhecida como terminador.

MECANISMO DE TRANSCRIÇÃO PELA RNA POLIMERASE IrRNA

 Nucléolo: Local onde ocorre a transcrição e processamento do rRNA e montagem dos ribossomas
Requer fatores transcritivos, que se ligam a uma zona promotora.
A cadeia de DNA a ser transcrita tem o nome de sequência tandem.
Da transcrição destas sequências resulta o rRNA 45S, que depois será processado (clivado pelo snoRNA).
O processamento deste rRNA 45S dá-se no nucléolo, e resulta no rRNA 18S e no rRNA 28S ligado por uma
ponte de H ao rRNA 5.8S.
Nos ribossomas eucariotas (80S), a pequena subunidade (40S) é constituído por proteínas e pelo rRNA 18S,
enquanto a grande subunidade (60S) é constituída por proteínas e os restantes 5S, 5.8S, 28S.

MECANISMO DE TRANSCRIÇÃO PELA RNA POLIMERASE II mRNA

O início da transcrição requer 5 factores transcritivo (TDIID, TFIIB, TFIIE, TFIIH…) pela poli II, uma helicase
e uma cinase.
Esses FT ligam-se a uma região PROMOTORA, o TATA box (ou outro). Esta ligação serve de apelo à poli II,
que se liga ao DNA, resultando num complexo enzimático (complexo de pré-iniciação), que dá inicio à transcrição.
O mRNA recém produzido é modificado antes de ir para o citoplasma, tendo por isso o nome de pré-mRNA.

PROCESSAMENTO DO mRNA:
A sequência de DNA que serve molde chama-se UNIDADE TRANSCRITIVA, e a cadeia de RNA resultante,
codificadora de uma proteína, contém intrões e exões, sendo os intrões as zonas não codificantes, removidas
posteriormente por splicing.
Envolve 3 enzimas: fosfatase, guanil-trasnferase e metil-transferase.
1) ―Fecho da extremidade 5’, é-lhe adicionado a 7N-metil-guanosina-3P, conhecido como CAP, que impede o ataque
de enzimas endonucleases e tem importância para dar início à síntese proteica. Ocorre após a RNA pol II ter
polimerizado os primeiros 20-30 nucleotídeos do RNA, muito antes de completar a transcrição
2) Poliadenilação, a extremidade 3’ sofre clivagem num local com riqueza em Uracilo e Guanina, onde depois é
acrescentada uma cauda poli-A (100 a 200 adeninas), pela ação da enzima poli-A-polimerase. Previne também o
ataque enzimático a esta extremidade do RNA. CstF (cleavage stimulating factor) e CPSF (cleavage and
polyadenylation specificity factor) são importantes para o processo

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3) Splicing, a remoção dos intrões. Ocorre no núcleo, e faz a remoção dos intrões e junções dos exões que restam,
tornando a cadeia de RNA mais curta e fácil de passar para o citoplasma. Os intrões são reconhecidos por
possuírem adeninas irregulares e sequências muito específicas. A remoção dá-se pelos spliceossomas, segmentos
de RNA conhecidos por SnRNAs (U1, U2, U6) e alguns péptidos. No final do splicing, o spliceossoma promove a
interação de várias proteínas com o local previamente ocupado pelo intrão removido, criando um Complexo de
junção de exões (EJC).
O splicing pode ser também alternativo, com genes semelhantes a originarem proteínas diferentes, pela remoção
alternativa de exões (silencio), permitindo mRNA diferentes. Para o splicing ocorrer, é necessário: um local de
corte a 5’, um local de corte a 3’ e um brunch point para fazer um loop no intrão e o remover.

Além disso, pode ocorrer RNA editing, ou seja, alteração de algumas bases (ou desaminação de adenina para
inosina, ou de citosina para uracilo). Alteração de sequências nucleotídicas (single base) dos transcritos de RNA
assim que estes são sintetizados Pode causar frameshifts, alterando a mensagem codificada pelo RNA – alteração
das reading frames. Nos mamíferos existem dois tipos principais de RNA editing
- Desaminação de adenina para produzir inosina (A-para-I)
- Desaminação de citosina para produzir uracilo (C-para-U)

Apenas os RNAs corretamente processados são exportados do núcleo! A mRNA apenas passa para o citoplasma,
se se verificarem os seguintes requisitos:
 Proteina que reconhece a CAP 5’
 Complexos de junção de exões
 Poliproteinas

Pode também verificar-se o Non-sense mediated mRNA: Quanto atinge o citoplasma, é traduzido e verificado por
uma primeira proteína. Se não passar, é degradado.

MECANISMO DE TRANSCRIÇÃO PELA RNA POLIMERASE III tRNA e 5S

Responsável pela transcrição dos genes do tRNA, rRNA 5S e alguns RNAs pequenos 3 tipos de promotores que
necessitam de diferentes combinações dos fatores de transcrição: TFIIIA, TFIIIB e TFIIIC
A sequência de aminoácidos de um polipéptido é determinada pela sequência de bases na molécula de mRNA através
de moléculas adaptadoras, tRNA. Cada tRNA liga um aminoácido específico e transporta-o até ao ribossoma. Cada
grupo de três nucleótidos adjacentes no mRNA constitui um codão que se liga a um grupo de três bases adjacentes
no tRNA, o anticodão. A RNAseP cliva a extremidade 5’, e o AA é ligado à extremidade CAA3’.

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Aula biocel 12 – Síntese e direcionamento de proteínas
A síntese proteica (SP) ocorre pelo processo de tradução do mRNA, que envolve o tRNA, os ribossomas e os
aminoácidos livres. É denominado de tradução pois as letras que codificam os ácidos nucleicos são traduzidas em
20 aminoácidos. Dá-se no sentido do terminal carboxilo. A SP a partir de mRNA baseia-se num código GENÉTICO.
Aqui, uma sequência de 3 nucleótidos específicos tripleto/codão codifica um aminoácido (AA)
Características do código genético:
A tradução é sequencial, a cada 3 nucleótidos forma-se uma ligação entre 2 AA.
Não é universal (varia dentro de cada espécie, no nosso caso, varia entre nuclear e mitocondrial).
É degenerado, ou seja, um aminoácido pode ser codificado por vários codões.
Existem 64 (43) codões e 20 aminoácidos possíveis.
Existem codões especiais, como o de iniciação (AUG), que codifica sempre metionina, e codões STOP, que definem
o fim da cadeia peptídica UGA, UAG, UAA.

INTERVENIENTES DA SINTESE PROTEÍCA:

1) mRNA – A cadeia com a informação em si, provinda do núcleo após transcrição e processamento (eucariontes);
Cada zona delimitada por 3 nucleotídeos denomina-se CODÃO. Esta cadeira de mRNA tem um CAP de guanosina
na extremidade 5’ e uma poliadenina na extremidade 3’.
1) tRNA, que transporta o AA até ao ribossoma; Tem aspeto de folha de trevo, e possui duas áreas principais: a
zona inferior ou ANTICODÃO (uma zona com 3 nucleotídeos complementares à cadeira do mRNA) que se liga ao
CODÃO do mRNA para reconhecimento; e na extremidade superior CCA’3’ encontra-se o AA ligado. Cada tRNA
transporta um AA, e a ligação entre eles dá-se pela enzima aminoacil-tRNA. Os AA não se ligam diretamente ao
CODÃO. Primeiro, tem de se ligar a tRNA, que reconhecendo-se no CODÃO, fornece o AA que transporta.
2) Ribossomas, os transformadores de mRNA em proteínas, nos eucariotas (80S). São proteínas associadas a RNA
ribossomal 5S, 5,8S, 18S e 28S. Organizam-se em duas subunidades, a 40S e a 60S, que apenas estão juntas
durante a tradução. A subunidade menor (40S) liga o mRNA ao tRNA, enquanto a subunidade maior (60S) catalisa
as ligações peptídicas. Os ribossomas podem ser LIVRES, cujas proteínas produzidas têm como destino
mitocôndrias, plastos, o núcleo e peroxissomas; LIGADOS AO RER, cujas proteínas produzidas têm como destino
membranas, lisossomas e vesículas diversas. A cadeia de mRNA é transcrita simultaneamente por vários
polirribossomas, que tornam a tradução mais rápida. Possuem três locais principais de atividade: a zona E (de exit),
a zona P (de peptidil..) e a zona A (de aminoactil…) que vão sendo ligadas e formando a cadeia de AA.

TRADUÇÃO: mRNA PROTEÍNAS

1) Iniciação: inicia-se sempre pelo codão de iniciação AUG, que traduz apenas metionina – esta liga-se ao local P (é
a única que se liga ao local P, todas as outras se ligam ao local A). Ocorre a junção das 2 subunidades (complexo
de iniciação 80S) e dá-se início à SP. Os complexos de iniciação incluem fatores de iniciação e GTP. O facto de a
metionina ser sempre o primeiro aminoácido não quer dizer que se mantenha (quando a proteína estiver traduzida,
pode sofrer alterações). Os fatores de iniciação ligam-se à cadeira de mRNA, e a subunidade 40S liga-se a estes,
realizando um “scan” do mRNA na direção 5’3’, até encontrar o tal codão de iniciação UAG. Mas como podem existir
várias zonas UAG, o processo definiu que apenas se inicia no UAG que estiver inserido numa sequência pré-definida,
designada de Kozak, ou ACCAUGG. Por vezes, existem locais internos no mRNA independentes da leitura inicial do

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40S (associadas a particularidades fisiológicas como stress, entre outros, no qual a iniciação pode começar em
vez do “padrão”).

2) Elongação: ocorre a ligação do tRNA ao local A, com intervenção de fatores de alongamento (eEF, que se ligam
externamente ao ribossoma). Ocorre a ligação peptídica do AA que está no local P (metionina) ao do local A,
catalizada pela transferase de peptidil. Ocorrendo esta ligação, a metionina passa para o local E (exit) e liberta-
se do ribossoma, e este processo mantém-se continuamente na direção 5’3’, até o aparecimento do codão STOP
(UGA, UAG, UAA). Ou seja, o tRNA passa para o local E (libertando-se), podendo outro tRNA ligar-se à zona A, e
assim sucessivamente.

3) Finalização: quando um codão STOP entra no local A, não existe um anticodão complementar, pelo que se liga a
ele um fator de libertação (ou eRF1, que tem uma estrutura similar ao tRNA). Este vai alterar a atividade da
transferase do peptidil, terminando a formação do peptídeo, e libertando-o do ribossoma, assim como o tRNA.

A SP pode ser inibida a vários níveis, no entanto, existem formas de travá-la nos procariontes, tendo o uso de
inibidores da SP efeito antimicrobiano aparentemente sem lesão a eucariontes:

As proteínas só ficam funcionais quando são dobradas (folding ou conformação tridimensional), através de vários
processos, como acetilação, metilação, proteólise (perderem parte da cadeia como a pró-insulina se tornar
insulina), glicosilação (adição de açúcares quer seja no RER ou no Complexo de Golgi, ou seja, tipo N se for ligação
ao N da asparagina, tipo O se for ligação ao Oxigénio da serina/treonina), lipidadas (adição de lípidos, GPI como
exemplo de âncoras, que ligam algumas proteínas à membrana biológica).
As chaperones ou HeatShock proteins, HsP (proteínas que as dobram) são os responsáveis pelo processo. Outras
enzimas são faladas na aula do reticulo endoplasmático.
Existem por vezes alterações no FOLDING, que podem levar a patologias. Caso das doenças degenerativas de
acúmulo de resíduos, como Alzheimer, Huntington, ELA, etc.

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Aula biocel 13 – regulação expressão génica
A regulação da expressão génica é diferente para procariotas e eucariotas.

REGULAÇÃO NOS EUCARIOTAS

Nos eucariotas a regulação pode acontecer: a nível transcritivo (no gene) ou a nível pós-transcritivo (no
processamento do hnRNA e na proteína recém sintetizada).
O gene é uma sequência nucleotídica completa que é necessária para a síntese de um produto funcional
(péptido/RNA), podendo dividir-se em regiões reguladoras:

1) SEQUÊNCIAS REGULADORAS (cis-acting regulatory)

1.1) Região promotora, como a TATA box, por ex, que serve de ligação aos fatores de transcrição sempre antes
da zona a replicar.
1.2) Enhancers, (antes ou depois) das zonas promotoras que estimulam a transcrição pela ligação de fatores
transcritivos, estejam onde e em que direção estiverem. A posição destes não influencia a sua atividade. É sempre
ativo independentemente do local onde estejam. Ligam-se a FT (faz um loop com a coesina como elástico), e
encontram-se em zonas livres de nucleossomas, para reagir melhor. Como é que os enhancers só ativam um gene
específico? Porque eles só funcionam em loops, através da interação da CTSF e a coesina, só afetando os genes
que se encontram dentro desse loop.

2) PROTEÍNAS REGULADORAS
Além da regulação por sequências nucleotídicas, também ocorre regulação por ligação de proteínas a regiões
reguladoras. Estes fatores são constituídos por dois domínios: um de ligação ao DNA, e outro de ativação regulado
por ligação a mediadores ou outras proteínas.

1- Por ligação ao DNA:

 Zinc fingers – Ligam iões de zinco e formam loops (fingers) que ligam hélices alfa a uma folha beta.
 Helix-turn-helix – Duas hélices alfa; a hélice alfa com C-terminal reage com o DNA, as outra hélices
estabilizam-nas.
 Leucins zippers – duas hélices alfa ligam-se formando um Y invertido que se liga ao DNA.
 Helix-loop-helix – Duas hélices alfa (uma curta, outra mais comprida) ligadas por um loop muito flexível;
liga-se a outras proteínas. Só exercem a sua função na forma de dímeros.
2 - Por mediação por proteínas:
 Interação com mediadores ou FT
 Interação com co-activadores (alteram a estrutura da cromatina)
 Proteínas repressoras (competem pelos ativadores, inibindo a transcrição)
 Repressores ativos ou silencers (inibem a transcrição por interação).
MECANISMO DE ACTUAÇÃO: o domínio de ativação interage primeiro com o mediador e outros fatores gerais
de ativação, facilitando a formação de um complexo de transcrição na zona promotora. Depois interagem com co-
activadores, estimulando a transcrição por alteração da cromatina.

A estrutura da cromatina também influencia a transcrição. Esta pode ser remodelada por modificações nas
histonas, e possuem caudas N-terminal cujos AA podem sofrer modificações:
Por acetilação, acrescentado um grupo acetil, que neutraliza a carga positiva da Lisina, relaxando a estrutura da
cromatina (descondensa, dispersa), logo aumenta a transcrição; facilita acesso ao DNA; associada a proteínas
ativadoras ou repressoras.
Por metilação da Lisina e Arginina. A metilação dos AA faz repressão da transcrição pois interferem com a
ligação de fatores transcritivos e recrutam repressores que se ligam ao DNA metilado.
*Herança Epigenética – transfere aos descendentes. Transmissões que não se encontram na cadeira original de
DNA. Na transmissão da informação às células filhas, há metilação de alguns C5 das citosinas, e por tal o gene
fica silenciado.

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*Imprinting genómico – depende do progenitor que lhe deu origem, num fica silenciado e o outro é expresso. Na
maioria dos imprintings, a metilação reprime a expressão de genes, com exceção do IGF-2, onde o inibido é mais
expresso.
Non-Coding RNA, modificam a cromatina, levam à sua condensação, transformando-a em heterocromatina.

Regulação da tradução eucariótica:

- Proteinas repressoras (a tradução global pode ser modulada por stress, nutrientes específicos ou fatores de
crescimento)
- RNA não-codificantes ou RNA interferência. Ligam-se ao mRNA complementar, clivando-os e logo eles não são
traduzidos. Podem ser:
 siRNA (small interference, RNA cadeia dupla
 miRNA (micro interference), transcrito pela RNA poli II, e clivados pela Dicer.

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Aula Biocel – Organização E Transporte Nuclear
O núcleo é a característica principal que distingue os procariotas dos eucariotas. É aqui que o material genético
é guardado, tendo este organelo também outras funções:
Replicação do genoma (DNA)
Transcrição e processamento do RNA (e respetivo controle)
O núcleo tem uma localização geralmente central, com forma arredondada e nele distinguem-se:
1) Cromatina – o material genético
2) Invólucro nuclear
3) Corpos nucleares
- Nucléolo (rRNA)
- Grânulos intercromatínicos/Speckle (Spliceossomas, proteínas p splicing mRNA)
- Grânulos pericromatínicos (mRNA que não sofreu splicing)
- Corpos de Cajal (snRNA)

Espaço intercromatínico, zona entre as heterocromatinas perinuclear e perinucleolar.

Grânulos pericromatínicos, presentes no espaço intercromatínico, têm genes precursores de mRNA (imaturos),
à periferia da heterocromatina.
Fibrilas pericromatínicas, com localização idêntica aos grânulos.
Corpos nucleares simples, de natureza proteica, sem cápsula, recetores hormonais e que aumentam o seu
número nas Infecções virais.
Corpos nucleares complexos, possuem uma cápsula microfibrilar, cujo interior tem grânulos. Têm origem no
nucléolo, transportam RNA e são recetores de estrogénio.
Corpos espiralados de Cajal, formado por pequenos bastonetes enrolados entre si, e constituem o local de
acumulação dos factores de splicing, fazendo a sua reciclagem.
Matrizes nucleares, locais sem material genético que permitem a observação do nucleoesqueleto.
A cromatina de Barr é um corpúsculo ligado à inactivação de um dos cromossomas X da mulher.
Em interfase, a heterocromatina encontra-se dispersa não aleatoriamente, no núcleo. Ao contrário do RNA, o
DNA tem genes únicos, sem cópias.
Um gene constitui uma determinada sequência nucleotídica que, após o seu processamento e tradução, irá originar
uma proteína. O processamento é o splicing que remove intrões, as zonas que não codificam nada. Este splicing
pode ser alternativo, pois numa dada sequência podem ser removidos intrões diferentes.
Isto explica o porquê de a partir de um gene podermos obter diferentes proteínas.
Os cromossomas constituem a junção de DNA e de proteínas. A unidade básica de um cromossoma denomina-se
de nucleossoma, um conjunto de 8 proteínas, as HISTONAS, à volta de quais se enrola o DNA. As histonas podem
ser de vários tipos: H2A, H2B, H3, H4, onde se enrolam 146 pares de bases. Estas proteínas podem não ser apenas
histonas, mas proteínas cromatínicas não histónicas.
A cromatina descondensada apresenta fibras de 10nm, e quando ocorre o seu enrolamento com a ajuda da histona
H1, apresenta fibras de 30nm.
Por sua vez, os cromossomas formados em metáfase apresentam 2 regiões distinguíveis: os TELÓMEROS, região
terminal, ligada ao invólucro nuclear (lâmina B) em região oposta aos CENTRÓMEROS, região central dos
cromossomas, também ligada ao invólucro nuclear.

CROMATINA
EUCROMATINA, a cromatina nuclear descondensada e dispersa no núcleo (matriz nuclear) e que pode ser
transcrita; transcricionalmente ativa. Aparece de forma mais clara em ME.
HETEROCROMATINA, a cromatina nuclear condensada e não transcrita. Tem duas localizações: perinuclear (na
membrana do núcleo) ou perinucleolar (à volta do nucéolo), bem como cariossomos dispersos. Pode ser constitutiva,
com sequências de DNA que nunca serão transcritas, ou facultativa, com sequências que são transcritas,
dependendo da célula.
Em termos de material genético, o núcleo possui DNA e RNA, que se individualizam em zonas específicas. O
método do EDTA permite contrastar estes dois ácidos nucleicos. O EDTA vai retirar o acetato de uranilo do DNA,
restando apenas aquele que está presente no RNA, que depois é corado de cor escura com a adição de citrato de
chumbo. Assim, a zona escura corresponde ao RNA, e a zona clara ao DNA (cromatina).

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NUCLÉOLO
Local da transcrição e processamento do RNA ribossomal e da montagem dos ribossomas.
Por ele passam também outros tipos de RNA, durante o seu processamento.
Contém as regiões cromossómicas que têm os genes que codificam o rRNA 5,8S, 18S e 28 S, transcritos pela
RNA polimerase I.
Além destes rRNA’s, existe outro, o 5S. No entanto, este é transcrito no citosol, pela RNA polimerase III.
O tamanho e número dos nucléolos varia ao longo do ciclo celular.
Composição morfológica do nucléolo (não possui membrana):
Centro fibrilar, parte mais clara, contém os genes que codificam os rRNAs e que são transcritos na interface
com o Componente fibrilar denso.
Componente fibrilar denso, formado por fibrilas, a parte escura, o local de processamento do rRNA.
Componente granular, local do processamento dos rRNA’s e de montagem das subunidades dos ribossomas.
Existem sub-compartimentos no núcleo fundamentais para o processamento dos RNAs

Fibrilharina- existe no nucléolo e corpos de Cajal

Coilina- Presente apenas nos corpos de Cajal

INVÓLUCRO NUCLEAR
 Limite do núcleo – 2 Membranas nucleares
 Poros de grandes dimensões (complexo poro
nuclear)
 Lamina nuclear (complexo proteico dentro
do núcleo)

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Constitui a barreira entre o citoplasma e o conteúdo nuclear e a sua constituição é semelhante à de qualquer
membrana biológica.
É um conjunto de 2 membranas, em que a mais exterior pode ligar-se diretamente ao RER, e que regula a passagem
de moléculas pela existência de complexos de poros nucleares. Nestes poros ocorrem cerca de 1000 translocações
por segundo, e tem 60 a 80 mil kDA, cerca de 16 vezes maior que os ribossomas. Rodeando interiormente existe
uma lâmina nuclear fibrosa. A membrana externa, ligada ao RER, possui ribossomas, ao contrário da membrana
interna, que possui apenas proteínas específicas do núcleo, como as que se ligam à lâmina nuclear (emerina e recetor
de lamina B).
A lâmina nuclear fibrosa tem uma função estrutural, sendo constituída essencialmente por filamentos
intermédios, as laminas, que se ligam a proteínas da membrana nuclear interna, e à cromatina. Dão estabilidade à
estrutura do núcleo, por isso patologias que a afetem podem por ex ocasionar Porfiria /envelhecimento acelerado.
Os complexos de poros nucleares são canais complexos de passagem de moléculas como o RNA e as proteínas.
Estruturalmente são definidos como 8 canais que rodeiam um anel central, com uma estrutura em forma de cesto
invertido voltado para o interior do núcleo.

TRANSPORTE CITOPLASMA - NÚCLEO

O RNA é sintetizado no núcleo e passa para o citoplasma. As proteínas que estão no citoplasma e que são
necessárias no núcleo (histonas, coesinas, polimerases, laminas etc) são para lá levadas através de importinas,
proteínas transportadoras dispersas no citoplasma. As moléculas pequenas (<40kDa), passam por difusão passiva.

Como entram no núcleo? As proteínas apresentam na sua sequência primária um “sinal” NLS (nucleal localization
signal), e por isso deve ser endereçada ao núcleo (sinal rico em lisina e arginina, de carga positiva), que é
reconhecido pelas importinas (receptor do citoplasma), que as leva até ao interior do núcleo. Este processo de
transporte foi descoberto em 1984 e é mediado pela proteína RAN associada a GDP. Assim:
A importina liga-se à proteína com sequência-sinal NLS. Este complexo interage com as proteínas do poro nuclear,
entrando para o interior do núcleo.
No núcleo, associa-se ao Ran.GTP, que faz a proteína dissociar-se da importina.
O complexo importina.RanGTP é enviado ao citoplasma através do poro nuclear, e o Ran.GTP é hidrolisado a Ran.GDP
pela Ran-GAP, dissociando-se da importina (podendo voltar a ser utilizada para transportar proteínas com
sequencia NLS).
O Ran.GDP regressa ao núcleo através do NTF2, e é convertido em Ran.GTP pela Ran-REF.
O ciclo Ran.GDP e Ran.GTP cria então um ciclo de entrada e saída das moléculas.

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Ex 1: O NFKB, se estiver associado a proteínas, não se desloca ao núcleo e não é expresso, visto que a ligação à
proteína “mascara” o NLS. Ao desconectar o NFKB da proteína, este é movido ao núcleo e promove a transcrição.
Exemplo 2: o NLS pode apresentar resíduos fosforilados, que não o deixam reconhecer. Ao desfosforilar, passa a
ser reconhecido e passa ao núcleo.

TRANSPORTE NÚCLEO - CITOPLASMA

O transporte inverso (núcleo para o citoplasma), segue o mesmo processo, mas desta vez com exportinas e
RAN+GTP+Proteinas, tendo as proteínas uma sequência-sinal designada NES.

Most RNAs are exported from the nucleus to the cytoplasm for use in protein synthesis. RNAs are transported
as ribonucleoprotein complexes (RNPs).
Many small RNAs (snRNAs and snoRNAs) function within the nucleus.
snRNAs are transported to the cytoplasm by an exportin (Crm1), where they associate with proteins to form
snRNPs and return to the nucleus. It is an active, energy-dependent process requiring the transport receptors
to interact with the nuclear pore complex.
Transport of snRNAsbetween nucleus and cytoplasm
Assim: A snRNA é enviada ao citoplasma através da exportina Crm1, é associada a outras proteínas para formar o
snRNPs e é direcionada de volta ao núcleo através da snurportina.

Quanto ao mRNA, não há transporte mediado por importinas, nem depende de Ran.

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Aula Biocel 15 - Ciclo celular
O ciclo celular constitui uma série de processos que se dão na célula e que lhe permitem produzir descendência.
Uma célula origina 2 novas células, com o seu genoma. O ciclo constitui uma das características fundamentais das
células indiferenciadas. Os processos acontecem de forma coordenada e são: crescimento celular (contínuo ao
longo do ciclo), replicação do DNA, distribuição do material genético pelas células filhas, divisão celular.
O ciclo (24h, nos humanos) divide-se então em 2 fases distintas:
1) Interfase (23h)
2) Mitose (1h)

1) INTERFASE
Representa 95% do tempo do ciclo celular, e é a fase em que ocorre essencialmente crescimento celular e
replicação do DNA (que se encontra disperso e descondensado). A interfase divide-se igualmente, mas em 3 fases:
Fase G0, o estado normal das células diferenciadas. Estas permanecem neste estado até sofrerem um estímulo
que as faça avançar para mitose consequente.
Fase G1 (intervalo GAP) entre a mitose e a replicação do DNA, onde existe atividade metabólica e a célula
cresce. O DNA é diploide e dura cerca de 11h.
Fase S (de síntese), onde ocorre a replicação do DNA, dura à volta de 8h.
Fase G2 (2º GAP), intervalo entre a replicação e a mitose, onde continua o crescimento celular e há muita
síntese proteica, preparando a mitose, dura cerca de 4h.

2) MITOSE
A mitose (divisão nuclear) é a parte do ciclo em que os cromossomas duplicados na replicação são distribuídos
pelas células filhas (2) e ocorre a divisão celular citocinese. Garante a passagem bem-sucedida do património
genético, e divide-se em 4 fases distintas:
Profase, onde os cromossomas condensam, cada um constituído por 2 cromatídeos (replicação), unidos pelo
centrómero, ao qual se juntam proteínas (microtúbulos), originando o cinetocoro. Começa lentamente a formar-se
o FUSO MITÓTICO, a partir dos centríolos (que migrando para os pólos, separadamente). No fim da profase
ocorre a dissolução do invólucro nuclear. Na prometafase, os microtúbulos do fuso ligam-se então ao centrómero,
orientando os cromatídeos para pólos opostos.
Metafase, os cromossomas encontram-se alinhados na célula, com os centrómeros dispostos na placa equatorial,
ocorre afastamento dos braços dos cromatídeos. É a fase mais breve e onde termina a formação do fuso mitótico.
Anafase, os cromatídeos-irmãos ascendem em sentidos opostos (separam-se), puxados pelos microtúbulos do
cinetocoro. No final ocorre a despolimerização dos microtúbulos astrais e polares.
Telofase, ou nucleocinese, ocorre a reorganização do invólucro nuclear nas 2 células filhas, descondensam-se
os cromatídeos e dá-se a despolimerização dos microtúbulos do cinetocoro.
Citocinese, estrangulamento do citoplasma e divisão celular. Nas células animais existe o anel de constrição,
filamentos de actina e miosina II que vão contraindo ate dividir o citoplasma. Nas células vegetais existe o sulco
de segmentação, uma nova parede celular constituída por vesículas do complexo de Golgi fundidas.

REGULAÇÃO DO CICLO CELULAR

A complexidade do ciclo celular e dos seus processos implica que seja necessária a sua regulação, através de uma
série de proteínas que interagem entre si. A regulação é obtida por paragem do ciclo em pontos estratégicos, em
que se verifica o sucesso dos vários processos do ciclo. Estes fatores incluem tanto sinais externos (como sinais
moleculares) quanto sinais internos (como dano ao DNA). Os reguladores respondem a pistas que vêm de dentro e
de fora da célula. Essas pistas influenciam a atividade dos principais reguladores para determinar se a célula
avança ou não no ciclo celular. Pistas positivas, como fatores de crescimento, normalmente aumentam a atividade
de Cdks e ciclinas, enquanto as negativas, como danos ao DNA, normalmente diminuem ou bloqueiam a atividade.
Existem 3 pontos de controlo significativos:

1) Checkpoint G1 determina se as células passam ou não para a fase S, mesmo que já não exista o estímulo inicial
que levou à divisão. É regulado por fatores de crescimento extracelulares. Assim, perto do final de G1 há uma S-

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ciclina que se associa ao CDK – essencial para passar para G2. Após isso, a ciclina é destruída
(não pode voltar atrás). Excetuando-se problemas inesperados, como dano no DNA ou erros
de replicação, uma célula que passa pelo ponto G1, continuará pelo resto do
caminho através do ciclo celular e produzirá duas células filhas.
Ex: a ciclina D é produzida como resposta a um fator de crescimento (que
numa 1ª fase provoca a fosforilação da tirosina) e mantém-se apenas enquanto
ele existir, pois degrada-se rapidamente. O complexo CDK4,6/ciclina D
fosforila a proteína Rb, do retinoblastoma, levando-o a desligar-se do E2F-1,
permitindo que este estimule a replicação do DNA passagem de G1 a S. A
associação de CDK à ciclina faz ultrapassar a fase de G1. A E2F é um fator de
transcrição. Se ficar livre do Rb, exerce a sua função de passagem para a fase de replicação:
deteção de Rb fosforilado.
Como ativar a entrada em replicação: Os fatores de crescimento (hormonas) são variados e
controlam o ciclo celular em G1. Atuam ligando-se a recetores na membrana celular, ativando vias
de sinalização no interior da célula.

2) Checkpoint G2, determina se as células passam para mitose, o que apenas acontece se o
DNA duplicado não estiver danificado. Se os mecanismos detetam problemas com o DNA, o
ciclo celular é interrompido e a célula tenta completar a replicação ou reparar o DNA
danificado. Se o dano é irreparável, a célula pode sofrer apoptose.

3) Check point de fuso, ou M: aqui, a célula examina se as cromátides irmãs estão

corretamente ligadas aos microtúbulos do fuso. Como a separação das cromátides irmãs
durante a anáfase é um passo irreversível, o ciclo não irá continuar até que todos os
cromossomos estejam firmemente ligados a pelo menos dois filamentos do fuso em
lados opostos da célula. Como? Parece que as células na realidade não examinam a placa
metafásica para confirmar que todos os cromossomos estão lá. Em vez disso, procuram
por cromossomos no lugar errado (por ex, a flutuar no citoplasma). Se um cromossomo
está fora do lugar, a célula pausa a mitose, permitindo capturar o cromossomo perdido.

Proteínas reguladoras do ciclo celular:

Normalmente, a regulação é feita por um complexo proteico – DÍMEROS. A existência destes complexos regula o
ciclo celular, quer por fosforilação de proteínas-alvo, permitindo a continuação do ciclo, quer pela inativação dessas
proteínas, e é constituído por 2 moléculas:
1) CICLINAS, 4 tipos de proteínas básicas: ciclinas G1, G1/S, S e M. Como os nomes sugerem, cada ciclina está
associada a uma determinada fase ou transição, e ajuda a conduzir os eventos dessa fase. Por ex, a ciclina M
promove os eventos da fase M, como a quebra do invólucro nuclear e a condensação cromossómica. Os níveis das
diferentes ciclinas variam consideravelmente no ciclo celular. Ciclina M, por exemplo, atinge um pico de forma
acentuada na transição entre as fases G2 e M.
2) CDK – cinases dependentes da ciclina. Para fazer com que o ciclo celular avance, uma ciclina deve ativar ou
desativar proteínas alvo na célula. As ciclinas desencadeiam os eventos do ciclo celular associando-se a uma CdK.
Uma Cdk sozinha é inativa, mas a ligação com uma ciclina a ativa, tornando-a funcional e permitindo que ela
modifique proteínas alvo. Cinases fosforilam. O grupo fosfato ligado age como um interruptor, tornando a proteína
mais ou menos ativa. Quando uma ciclina se liga a uma Cdk, isto tem dois efeitos importantes: ativa a Cdk como
uma cinase, mas também direciona a Cdk para um
conjunto específico de proteínas alvo, adequadas para o
período do ciclo celular controlado pela ciclina. Por ex,
Ciclinas G1/S enviam Cdks para alvos da fase S
(promovendo, por ex., a replicação do DNA), enquanto
ciclinas M enviam Cdks para alvos da fase M (fazendo a
membrana nuclear se romper).

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Em geral, os níveis de Cdk permanecem constantes por todo o ciclo, mas a atividade das Cdk e as proteínas-alvo
mudam à medida que os níveis das várias ciclinas aumentam e diminuem. Além de precisar de uma ciclina, as Cdks
também devem ser fosforiladas num local específico para serem ativadas, e também podem ser reguladas
negativamente pela fosforilação de outros locais.

Existem dímeros diferentes para cada fase:

 G1 CDK4,6/ciclina D – inicia com fatores de crescimento, trauma, sob controlo da p53.
 G1/S CDK2/ciclina E
 S CDK2/ciclina A (fosforilam ORC)
 G2/M CDK1/ciclina B (MPF e APC) – condensa cromatina, rompe invólucro, fuso, degrada ciclina, MAP.

Fator de promoção de maturação (MPF maturation-promotion factor)

Fator presente no citoplasma e composto por CDK1 e ciclina B, um exemplo de como ciclinas e Cdks trabalham
juntas para controlar as transições do ciclo celular. O nome data da década de 1970, quando pesquisadores
descobriram que células na fase M continham um fator desconhecido que podia forçar óvulos de rã (presos na fase
G2) a entrar na fase M. Nos anos 80 descobriu-se que esta molécula, chamada MPF, é uma Cdk ligada a ciclina B.
Como uma ciclina típica, a ciclina B mantém-se em níveis baixos durante a maior parte do ciclo celular, porém
acumula-se assim que a célula se aproxima da transição G2/ M. Conforme a ciclina B se acumula, ela liga -se a Cdks
presentes, formando complexos que ativam a fase M. Assim que esses complexos recebem um sinal adicional
(essencialmente, um ok que confirme que o DNA está intacto), tornam-se ativos e iniciam a fase M. Os complexos
MPF adicionam fosfato a várias proteínas diferentes no invólucro nuclear, resultando no seu rompimento (evento
chave do início da fase M) e também ativam alvos que promovem a condensação cromossómica. Resumindo:
Fosforila laminas: a malha nuclear, se for fosforilada, fragmenta e rompe o invólucro da membrana nuclear.
Condensação da cromatina, por fosforilação das condensinas e da histona H1 (sua ativação).
Fuso mitótico, a sua organização depende da estabilidade dos microtúbulos, por fosforilação das MAP’s
(microtubul associated proteins), proteínas associadas aos microtúbulos.
Fragmentação do complexo de Golgi e do RE, por fosforilação da GM130, impedindo a ligação das vesículas
COPI ao complexo de Golgi e facilitando a sua fragmentação.
Separação das cromatídeas-irmãs, através do APC (anafase promoting complex que adiciona a ubiquitina às
ciclinas), ativado pelo MPF, marca a ciclina B, e deixa de existir fosforilação. Por tal, verifica-se uma reformatação
de tudo: a membrana nuclear fecha, o fuso desaparece, etc.
Citocinese, por fosforilação da miosina na periferia da célula, criam uma cintura por dentro da membrana
citoplasmática. As fibras contráteis criam uma depressão de tal forma vincada que separa as duas células filhas.

Fases do ciclo celular em imagens:

Complexo promotor da anáfase/ciclossomo (APC/C)

Além de dirigir a fase M, o MPF também aciona a sua própria destruição ao ativar o complexo promotor de
anáfase/ciclossomo(APC/C), um complexo proteico que causa a destruição das ciclinas B a partir da anáfase. A
destruição das ciclinas B força a célula a sair da mitose, permitindo que as novas células entrem em G1. O APC/C
também causa a destruição das proteínas que juntam as cromátides irmãs, permitindo que se movam para polos
opostos da célula. Como? Assim como uma Cdk, o APC/C é uma enzima, com uma função diferente da Cdk. Em vez
de ligar um grupo fosfato, ele adiciona ubiquitina (Ub). Quando um alvo é marcado com ubiquitina, ele é enviado
pelas chaperonas ao proteassomo, a zona da reciclagem do lixo celular, e é destruído. Assi, o APC/C liga ubiquitina
à ciclinas B, fazendo com que sejam recicladas pelo proteassomo e permitindo que as recém-formadas células

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filhas entrem na fase G1. Se o APC/C recebe os sinais certos durante a metáfase, inicia também uma cadeia de
eventos que destrói a coesina, a cola que mantém as cromátides juntas. O APC/C primeiro adiciona ubiquitina a
securina. A securina normalmente liga-se a uma separase, inativando-a. Quando a securina é destruída, a separase
torna-se ativa. A separase corta a coesina que mantém as cromátides juntas, permitindo que se separem.

Regulação do complexo CDK/Ciclina – inactivação

A inativação do complexo CDK/ciclina pode ocorrer: por inibição do CDK, o que acontece por exemplo no caso de
existirem erros no DNA, altura em que o P21, induzido pela P53, inibe o CDK; por inibição da ciclina.

NOTA: P53 é conhecido como o guardião do genoma, uma proteína que funciona como um travão do ciclo celular
(incentiva as células alteradas a avançar para a apoptose). Trabalha em vários níveis para garantir que as células
não transmitam DNA danificado através da divisão celular. Primeiro, ela pára o ciclo celular no checkpoint G1
desencadeando a produção de proteínas inibidoras de Cdk (CKI). As proteínas CKI se ligam aos complexos Cdk-
ciclinas e bloqueiam a sua atividade, ganhando tempo para o reparo do DNA. Depois, ativa enzimas de reparo do
DNA. Se o dano ao DNA não é reparável, a p53 vai desempenhar a sua terceira e última função: ativar a apoptose
para que o DNA danificado não seja transmitido.

De todo o genoma humano, p53 é o gene mutado com maior frequência em cancros.

Direcionamento de proteínas for dummies - texto de apoio

Diversas proteínas precisam ser transportadas para diversas partes da célula eucariótica, ou em alguns casos,
exportadas da célula para o espaço extracelular. Para garantir que as proteínas cheguem aos destinos certos,
as células possuem vários sistemas de entrega, assim como os nossos serviços postais. Nesses sistemas, rótulos
ou identificadores moleculares (muitas vezes, sequências de aminoácidos) são utilizados para endereçar as
proteínas para entrega nos locais específicos.

Aspetos gerais das rotas de transporte celular: O transporte de todas as proteínas de uma célula eucariótica
começa no citosol (exceto umas poucas proteínas feitas nas mitocôndrias e cloroplastos). Assim que uma
proteína é produzida, ela segue passo a passo pela "árvore decisória" da entrega. A cada passo, a proteína é
verificada para marcadores moleculares, para ver se ela precisa ser redirecionada para um caminho ou destino
diferente.

Todas as proteínas começam sua síntese no citosol. Muitas ficam ali para sempre, mas algumas são transportadas
para outros destinos celulares. Algumas são completamente sintetizadas no citosol. Elas podem ser importadas
para o interior da mitocôndria, peroxissomo, cloroplasto e núcleo, após o transporte. Outras proteínas são

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importadas para o interior do retículo endoplasmático. Daí, a maioria vai até o Complexo de Golgi por transporte
vesicular. Do Complexo de Golgi (ainda por transporte vesicular), as proteínas podem alcançar o exterior celular
(por secreção), membrana plasmática, lisossomo, ou outras partes do sistema de endomenbranas.
O primeiro ponto principal da ramificação é logo no início do transporte. Neste ponto, a proteína pode
permanecer no citosol pelo resto do processo, ou ser enviada para o interior do retículo endoplasmático (RE),
pelo transporte^22squared.
 As proteínas são entregues no RE pelo transporte se elas tiverem uma sequência de aminoácidos
chamada de peptídeo sinal. Em geral as proteínas destinadas às organelos do sistema de
endomembranas (como o RE, aparelho de Golgi e lisossomo) ou ao exterior da célula, entram no RE nesta
etapa.
 As proteínas não sinalizadas com peptídeo permanecem no citosol pelo restante do transporte. Se elas
não tiverem outros "rótulos de endereçamento," ficarão de forma permanente no citosol. Mas se elas
tiverem o rótulo correto, elas serão encaminhadas para a mitocôndria, cloroplastos, peroxissomos ou
núcleo pelo transporte.

Sistema de endomembranas e via secretória: As proteínas destinadas a qualquer parte do sistema de

endomembranas (ou para o meio extracelular) são trazidas ao RE pelo sistema de transporte e inseridas
conforme são produzidas.

O peptídeo-sinal que envia a proteína para o interior do retículo endoplasmático durante a tradução é
constituído por uma série de aminoácidos hidrofóbicos ("que temem a água”), geralmente encontrados próximo
ao início (N-terminal) da proteína. Quando essa sequência sai do ribossomo, é reconhecida por um complexo
proteico chamado de partícula reconhecedora de sinal (PRS), que leva o ribossomo
para o RE. Ali o ribossomo entrega a sua cadeia de aminoácidos no lúmen (interior) do
RE, conforme produzida.
A imagem à direita mostra o transporte de uma proteína membranar a partir do RE
rugoso, através do Golgi, até a membrana plasmática. A proteína é inicialmente
modificada pela adição de cadeias de carboidratos ramificadas no RE rugoso; depois,
estas são reduzidas e substituídas por outras cadeias de carboidratos no complexo
de Golgi. A proteína, com seu conjunto final de cadeias de carboidratos é então
transportada para a membrana plasmática em uma vesícula de transporte. A vesícula
se funde com a membrana plasmática, seus lipídios e carga de proteína se tornam
parte da membrana plasmática.

1. A Partícula Reconhecedora de Sinal (SPR) liga-se ao peptídeo sinal da proteína.

2. A SPR trás o ribossomo ao RE, ligando-se a um recetor do RE. O recetor está
associado a outras P que fazem um poro.
3. O ribossomo retoma a tradução, alimentando o polipeptídeo através do poro e
para dentro do lúmen (interior) do RE.
4. Uma enzima associada com o poro corta o peptídeo sinal.
5. A tradução continua e a cadeia crescente de aminoácidos desliza para o interior do RE.
6. O polipeptídeo completo é liberado no lúmen do RE, onde fica flutuando livremente.
Em alguns casos, o peptídeo-sinal é cortado durante a tradução e a proteína final é liberada no interior do RE
(como mostrado acima). Em outros casos o peptídeo-sinal ou outro segmento de aminoácidos hidrofóbicos fica
incorporado na membrana do RE. Isto cria um segmento transmembranar (membrana cruzada) que ancora a
proteína à membrana.

O transporte através do sistema de endomembranas

No RE, as proteínas dobram-se nas suas formas corretas e podem também ter grupos de açúcares ligados a ela.
A maioria das proteínas é então transportada para o complexo de Golgi, em vesículas membranosas. Algumas
proteínas, no entanto, precisam ficar no RE e fazer seu trabalho ali mesmo. Essas proteínas têm aminoácidos
marcadores que asseguram que elas sejam trazidas de volta para o RE se "escaparem" para dentro do Golgi.
No complexo de Golgi, as proteínas podem sofrer mais modificações (como adição de açúcar), antes de
alcançarem seus destinos finais. Esses destinos incluem lisossomos, membrana plasmática e exterior da célula.
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Algumas proteínas precisam executar suas funções no Golgi (são as "Golgi residentes"), e uma variedade de
sinais moleculares, incluindo marcações de aminoácidos e características estruturais, são usados para mantê-
las ali e para trazê-las de volta.
Se elas não têm nenhum marcador específico, as proteínas são enviadas do Golgi para a superfície celular, onde
são secretadas para o exterior celular (se forem livres) ou entregues para a membrana plasmática (se forem
incorporadas às membranas). Essa via padrão é mostrada no diagrama acima para a proteína de membrana,
colorida em verde, que carrega grupos de açúcar, coloridos de roxo. As proteínas são enviadas para outros
destinos se contiverem os marcadores moleculares certos. Por exemplo, as proteínas destinadas aos lisossomos
têm marcador molecular consistindo de um açúcar com um grupo fosfato aderido. No complexo de Golgi, as
proteínas com marcadores são organizadas nas vesículas destinadas aos lisossomos.

Direcionando para organelas não endomembranosas

As proteínas que são feitas no citosol (não entram no RE durante a tradução) podem ficar permanentemente no
citosol. Porém elas também podem ser encaminhadas para outros destinos não membranosos na célula. Por
exemplo, proteínas limitadas pela mitocôndria, cloroplastos, peroxissomos e núcleo, são geralmente produzidas
no citosol e entregues após a conclusão da tradução.
Para ser entregue a algumas dessas organelas após a tradução, a proteína precisa conter um aminoácido
específico "rótulo de endereço." O rótulo é reconhecido por outras proteínas na célula, o que ajuda o transporte
da proteína para o destino correto.
Como exemplo, vamos considerar a entrega ao peroxissomo, uma organela envolvida na destoxificação. As
proteínas necessárias ao peroxissomo têm uma sequência específica de aminoácidos chamada sinal alvo do
peroxissomo. O sinal clássico consiste de apenas três aminoácidos, serina-lisina-leucina, encontrado no final (C-
terminal) da proteína. Esse padrão de aminoácidos é reconhecido pela proteína auxiliar no citosol, que trás a
proteína para o peroxissomo.
O direcionamento mitocondrial, para o cloroplasto e nuclear, geralmente são similares ao alvo peroxissomal. Isto
é, uma certa sequência de aminoácidos envia a proteína para sua organela-alvo (ou um compartimento dentro da
organela). No entanto, a natureza dos "rótulos de endereçamento" são diferentes em cada caso.

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Aula 17 - Retículo endoplasmático e complexo de Golgi
A existência de material genético nas células tem como fim a obtenção de proteínas com as mais variadas funções.
Organelo: rede de membranas com túbulos e cisternas interligados e que se estendem pelo citosol a partir da
membrana nuclear externa, representando 50% do conteúdo membranar celular. Há 3 tipos:
1) RUGOSO (com ribossomas) – síntese proteica e reserva Ca2+
2) LISO (sem ribossomas) – síntese lipídica e reserva Ca2+
3) De TRANSIÇÃO ou de saída (últimas cisternas antes de envio para o C. Golgi).

RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO RUGOSO

Constitui uma rede revestida por ribossomas, sendo os tubos ligados entre si. Estende-se desde a membrana
externa do invólucro nuclear até ao citoplasma e a parte interior chama-se lúmen.
A sua principal função é a Síntese Proteica, fazendo parte da via secretora. A sua membrana também é
importante, pois faz a secreção de proteínas transmembranares de certos organelos.

A síntese proteica em eucariotas pode ser de dois tipos – ou em ribossomas LIVRES, ou em ribossomas associados
ao RER (retículo rugoso). Inicia-se sempre nos ribossomas LIVRES.
 LIVRES: para o núcleo, citosol, cloroplastos, mitocôndrias, peroxissomas (proteínas maiores)
 RIBOSSOMAS ligados ao RER: para membranas, Golgi, endossomas (proteínas mais pequenas, porque o
sinal é clivado…)

O papel do RER no direcionamento e processamento de proteínas:

Via de secreção (Polade, 1960):
1º: Proteínas no RER
2º: Proteínas no C. Golgi
3º: Proteínas em vesículas secretoras para serem enviadas para o exterior
4º: Exterior da célula

EUCARIONTES: As proteínas iniciam a tradução nos ribossomas livres no citosol. Os ribossomas são direcionados
para o RER por uma sequência sinal existente no terminal-N (amino) do polipéptido nascente.
Esta SEQUÊNCIA SINAL é constituída por 15 a 40 aa, e possui uma região com 7 a 12 resíduos hidrofóbicos
precedidos de aminoácidos básicos (arginina, Lisina). A sequência é introduzida no translocão canal (em eucariotas
é o complexo SEC61) na membrana do RER, sendo seguida de toda a cadeia polipeptídica. No final, a sequência sinal
é clivada pela enzima sinal peptidase, e a proteína fica no lúmen do RER (exceto as que têm como destino as
membranas). O endereçamento proteico para o RE tem a particularidade de translocação e tradução poder ocorrer
em simultâneo (translocação co tradução).

A SRP liga-se à sequência sinal da Proteína. A membrana do RE tem um recetor (recetor de SRP), que se liga à
sequência sinal e mantém a tradução a ocorrer. O TRANSLOCÃO (sec61) abre em duas direções após reconhecer
a SRP/sequencia sinal:
1-Forma um canal através da membrana do RE de modo a que porções hidrofílicas das P atravessem a membrana;
2-Abre lateralmente de modo a que porções hidrofóbicas (domínios transmembranares) se insiram na membrana.

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Em LEVEDURAS verifica-se mais frequentemente a Translocação Pós-tradução: independentes de SRP.
As proteínas sintetizadas em ribossomas livres são reconhecidas pelo complexo Sec62/63 que se encontra
associado ao translocão (Sec61), e requerem chaperones HSP70 no citosol, que mantém a sua estrutura linear e
chaperones Bip no lúmen (que puxam a P para o lúmen), cuja ligação à proteína mantém a sua forma correta de
modo a entrarem no RER. As proteínas com destino membranar são integradas na membrana do RER (têm a
sequência sinal a meio da cadeia), seguindo depois a via secretora das proteínas.

Inserção de Proteínas nas membranas:

Inseridas na membrana do RE; transportadas pela vida de secreção até ao seu destino final. As orientações das P
e o nº de domínios transmembranares (hidrofóbicos) que possuem são variáveis. Mas a topologia ao longo da via de
secreção é conservada, ou seja, os domínios extracelulares correspondem às regiões orientadas para o lúmen do
RE/Golgi. Assim:
1 - Proteína com sequência sinal NÃO clivável: A seq-sinal é reconhecida pela SRP, não é clivada e consiste numa
hélice alfa transmembranar que insere as proteínas na membrana do RE em qualquer orientação (N-C, C-N)
2 - Proteína com sequência sinal Clivável, mas com sequência transmembranar interna: N no lúmen e C no citosol.
3- Proteína com múltiplos domínios membranares: são inseridas na membrana através de séries alternadas de
sequências sinal internas e sequências transmembranares em movimentos laterais.
4 – Proteínas com domínio transmembranar localizado no C-terminal: a sequência transmembranar é reconhecida
pelo fator TRC40 que endereça a proteína para o recetor GET1-GET2 existente na membrana do RE. C-Citosol,
N-lúmen.

Uma vez no RER, as proteínas sofrem MODIFICAÇÕES/PROCESSAMENTO:

Folfing e estrutura quaternária/enrolamento da cadeia (As chaperones do lúmen do RE assistem na formação
da estrutura terciária/quaternária das P).
Formação de pontes dissulfureto, ocorrem ligações entre as cisteínas por ação da disulfite.isomerase (PDI),
permitindo o enrolamento. O citosol tem ambiente redutor. Os SH das cisteínas encontram-se na forma reduzida.
No RE (ambiente oxidante), a PDI promove a formação de ligações dissulfureto. Ela própria tem uma S-S oxidada
e “transfere” a ligação (reduzindo-se). Para a reciclar usa-se a Ero1, que oxida os seus enxofres (e a recicla).
Glicosilação (no CG é glicosilação, no RE é N-glicosilação), no terminal N, onde um oligossacarídeo (14 açúcares)
é sintetizado num lipídio transportador ancorado na membrana (o dolicol), e é transferido em bloco para o grupo
amino de asparaginas pertencentes à sequência consenso Asn-X-Ser/Thr, com posterior remoção de 3 glucoses
antes de seguir para o C.Golgi.
Adição de âncoras peptídicas; âncoras de glicosilfosfatidilinositol (GPI). Âncoras GPI são formadas nas
membranas do RE e depois adicionadas ao C-terminal de algumas proteínas. Estas proteínas seguem a via de
secreção como componentes membranares, sempre expostas na face extracelular da membrana plasmática.
Controlo de qualidade proteica no RE; as proteínas incorretamente enroladas são translocadas de volta para o
citosol e são desglicosiladas, ubiquitinadas e degradadas no proteossoma.

RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO LISO

O REL é uma região do RE não revestida por ribossomas, e as suas funções são:
Síntese de lípidos membranares (fosfolípidos, AG, esfingolípidos), na membrana do REL. Os fosfolípidos são
sintetizados na face citosólica da membrana do RE, a partir de percursores hidrossolúveis (Glicerol-3-P e AG-
ligados à CoenzimaA). As FLIPASES fazem a sua translocação para a face citoplasmática, mantendo intacta a
bicamada fosfolipídica.
Destoxificação, através da presença das proteínas do complexo P450, oxidam substâncias.
Síntese de VLDL’s, lipoproteínas de densidade muito baixa, que transportam lípidos no sangue.

Exportação de proteínas/lípidos do RE
Após PROCESSAMENTO, as proteínas são enviadas para o C. Golgi em vesículas que partem da região de saída
(Eres) e fundem o compartimento intermediário RE-Golgi (Ergic) e seguem para o C.Golgi – marcados por sinais de
exportação. A topologia de proteínas e lípidos é conservada ao longo da via de secreção.

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COMPLEXO DE GOLGI
Organelo responsável pelo processamento e endereçamento das proteínas sintetizadas no RE para os endossomas,
lisossomas, membranas plasmáticas ou secreção. Responsável pela síntese da maioria dos glicolípidos e
esfingomielina, assim como o processamento das Proteínas vindas do RE. Nas células vegetais, é o local onde são
sintetizados polissacarídeos da parede celular. Divide-se:
1) Zona cis, onde as proteínas chegam (podem ser marcadas com ósmio), usualmente voltada para o núcleo.
2) Zona média, onde se dão as modificações proteicas.
3) Zona trans, onde se dão as modificações proteicas, usualmente afastada do núcleo (podem ser marcadas
enzimaticamente por pirofofatase da tiamina)

Glicosilação no C. Golgi (O-glicosilação):

Contém mais de 250 enzimas que catalizam a adição de diferentes CHO às glicoproteínas. Estas enzimas
encontram-se distribuídas pelos diferentes compartimentos. O processamento dos CHO dá-se de forma ordenada
ao longo do C. Golgi:
 Glicosidases: remoção de resíduos de açúcar
 Glicosiltransferases: adição de resíduos de açúcar
Ex1: proteínas lisossomais: fosforilação da manose impede a sua remoção; a manose-6-P é reconhecida pelo
seu recetor na face trans do Golgi; as P com manose-6-P são direcionadas para os lisossomas.

O-glicosilação (Golgi) vs N-glicosilação (RE)

Na N-glicosilação, o açúcar N-acetilglucosaminaliga-se através de um átomo de azoto (NH) a uma asparagina
Na O-glicosilação, o açúcar N-acetilgalactosaminaliga-se através de um oxigénio (OH) a uma serina ou treonina
A extensão da O-glicosilação é variável, como ex dos proteoglicanos (componentes importantes da matriz
extracelular) apresentam uma extensa O-glicosilação, extensas cadeias de glicosaminoglicanos (GAG) que são
repetições de dissacarídeos.

Sintese de esfingomielina e glicolípidos:

Esfingomielina (fosfolípido que não contém glicerol) é sintetizada por transferência de um grupo fosforilcolina da
fosfatidilcolina para a ceramida (produzida no RE). Os glicolípidos são sintetizados, por adição de CHO à ceramida

Exportação de proteínas
Algumas proteínas são residentes do RER, e quando são enviadas para o C.Golgi, são novamente reencaminhadas
para o RER, porque possuem uma sequência específica, a KDEL (lis-asp-gli-leu). A KDEL tem 4 aa de sequência no
N-terminal das PTN, e reagem com recetores do complexo de Golgi. No C. Golgi (o pH é mais baixo), há maior
afinidade de ligação KDEL com o recetor. Se se liga ao recetor, há transporte deste para o RER. Quando chega ao
RER, uma vez que este tem pH mais alto, perde-se a afinidade e elas dissociam-se. Este processo evita que as
proteínas do RER sejam depletadas.
As proteínas no Golgi podem ser enviadas para o meio extracelular, por exocitose. Pode ser:
 Constitutiva, que não sofre regulação e expulsa proteínas sem destino específico
 Regulada, em que as subs estão em vesículas e são libertadas mediante reconhecimento de um estímulo
(hormonas endócrinas, neurotransmissores ou enzimas digestivas das células pancreáticas).
O processo contrário é a endocitose, e consiste na captação de moléculas extracelulares em vesículas formadas
por invaginações membranares. Pode ser uma fagocitose, onde a célula forma pseudópodes captando seres
infeciosos (forma-se o fagossoma) ou uma pinocitose, que permite a captura de fluidos extracelulares.
Em células polarizadas (exemplo: células epiteliais) a membrana plasmática divide-se em domínio apical e domínio
basolateral, existem sequências que as marcam ou as vesículas que as transportam.
Antes de deixarem a face trans do Golgi, essas proteínas devem ser devidamente acondicionadas e transportadas
para o domínio correto.
Ex: Insulina. É traduzida no RER, em pré-Pro-Insulina. Vai para o C.Golgi, que a transforma em Pró-Insulina e a
envia em vesículas. Nas vesículas ela é clivada em Insulina. Ou seja, no C: Golgi existe PRÓ-insulina, a Insulina final
é processada nas vesículas.

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AULA 18- Mecanismos de transporte vesicular. Lisossomas
Tipo de revestimentos proteicos das vesículas:
 COP II – transportam vesículas do RE para a face cis do complexo de Golgi
 COP I – sentido inverso: do C.Golgi para o RE e intra-Golgi
 Clatrina – para a face trans do complexo de Golgi para as membranas plasmáticas, endossomas e lisossomas

Existem proteínas que regulam a montagem e perda do revestimento das vesiculas (GTPases). Assim:
 Proteínas ARF1 – COPI e clatrina nas membranas do complexo de Golgi
 Proteínas Sar1 – COPII na membrana do RE

Exemplo: a Sar1 fica ativa quando ligada ao GTP. Liga-se a recetores que sugerem o revestimento de COPII.
O tipo de revestimento regulado pelas proteínas já dá alguma especificidade à vesicula, mas não é suficiente. Aqui
entram as proteínas Rab, que regulam mais ainda a especificidade do transporte das vesículas (também são
GTPases). A Rab ajuda na direccionalidade Rab-GTP associa-se a fatores de ancoragem das membranas-alvo, e
assim ligam a vesícula a essa membrana.
Nesta fase, entram as proteínas designadas SNARES. As snares regulam o processo de fusão das vesículas com a
membrana-alvo. Existem dois tipos de snares:
 V-snares – de vesícula
 T-snares – de target, membrana-alvo
Ambas têm domínios transmembranares e facilitam a fusão da vesícula à membrana-alvo, para a vesicula ser
esvaziada.

Resumo do processo de transporte vesicular:

1. Vesícula como ponto de partida a sair do complexo de Golgi, liga-se a proteínas de revestimento.
2. As proteínas de revestimento de vesícula (criadas no citosol) definem que tipo de vesicula serão, conforme
sejam Arf1 ou Sar1.
3. Dissociação do revestimento e transporte pelo citosol através de microtúbulos/filamentos de
citoesqueleto
4. Ancoragem da vesícula à proteína-alvo (fatores de ancoragem).
5. As v-snares interagem com as t-snares e essa ligação favorece a ligação da vesícula à membrana-alvo.
6. Fusão no local de chegada (proteínas ou membranas) e libertação do conteúdo da vesícula.

LISOSSOMAS
Organelos só com uma membrana, com morfologias muito díspares dependendo do material que possuem, e contêm
uma série de enzimas de pH ácido (50), graças à sua bomba de protões, capazes de degradar várias moléculas:
nucleases, protéases, glicosidases, lípases, fosfatases, sulfatases, fosfolipases, etc. Consiste no sistema digestivo
da célula. Uma vez que apenas atuam, em meio ácido, isto fornece uma proteção à célula e caso de rutura do
lisossoma (como o citosol tem pH 7,2, as enzimas perdem função). Patologias em genes que codificam essas enzimas
(ou regulação da sua membrana) originam doenças lisossomais de acúmulo, significando acúmulo tóxico no interior
da célula. Podem ser:
Primários, apenas possuem conteúdo hidrolítico, ainda não se fundiram com nenhum agente, tendo por isso
aspeto homogéneo;
Secundários, quando ocorre a fusão de um lisossoma com produtos a ser degradados.
Ex. de fusão com fagossoma (macrófagos por fagocitose) fagolisossoma, ou a fusão de um lisossoma com um
organelo celular autolisossoma (reciclagem de componentes celulares).
A sua origem tem 2 teorias: ou provêm de cisternas imóveis, ocorrendo a sua maturação entre elas, ou provêm de
cisternas móveis, e são enviadas das diferentes zonas do Golgi, com as respetivas enzimas.

Como os lisossomas não são degradados? As suas proteínas são muito glicosiladas, que lhes confere uma proteção
anti-lise. Por isso se compreende em microscopia, a aréola branca que as recobre (glícidos).

Os lisossomas digerem material extracelular através de mecanismos de endocitose.

Os endossomas recebem vesículas diretamente da membrana plasmática. Distinguem os produtos a serem
reciclados, dos produtos a serem degradados. Os produtos a serem reciclados, vão para endossomas de reciclagem,
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retornando os produtos a serem exportados para fora da membrana. Moléculas com destino final de degradação,
são transportadas para endossomas tardios, que recebem endossomas digestivos do trans-golgi e fundem-se com
lisossomas. Para além de digestão por endocitose, os lisossomas também servem para digerir produtos de
fagocitose e autofagia.

Como saber que aquela vesícula deve ir para lisossoma? As proteínas recebem um tipo de glicosilação diferente
no RE, que as “marca” para serem enviadas para o lisossoma. São então proteínas que possuem uma manose-6-P,
que se ligam a recetores de manose-6-P presentes no trans-Golgi. Assim, esta associação da manose-6-P com os
receptores, induz um recrutamento do revestimento clatrina e fundem-se com os endossomas, ficando no interior,
e os recetores reciclados.

NOTA: nas células vegetais, não existe muita evidência de existência de lisossomas, sendo o seu papel digestivo
substituído pelos vacúolos.

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AULA 19 - Degradação proteica
O “Turnover” (ciclo de vida) das proteínas. O teor proteico nas células depende dos níveis de síntese e degradação
de proteínas. Nem todas possuem o mesmo tempo de semivida - importante na regulação das células.
Um proteoma funcional requere uma constante remodelação e reparação/eliminação de proteínas danificadas!
Cerca de 30 % das proteínas recém sintetizadas são rapidamente degradadas devido a erros (na formação de
complexos, conformação, etc…)

Quais os mecanismos conhecidos de degradação proteica?

1. Ubiquitin-Proteasome System (UPS) Responsável pela degradação de 80– 90% das proteínas (including
shortlived, native, misfolded, or damaged proteins in the cell)
2. Autophagy-Lysosome pathway (ALP) Responsável pela degradação da maioria das proteínas com tempo de
semi-vida longo que usualmente residem na membrana de organelos ou que formam agregados proteicos
disfuncionais

1) Reconhecimento e degradação pelo proteassoma 26S, é dependente de ubiquitina e ATP

Ubiquitina, polipéptido de 76 aa (“Kiss of Death”), é adicionada através do seu C-terminal a um grupo amino de um
resíduo de lisina das proteínas a degradar. Uma cadeia poli-Ub é formada por reações de ubiquitinação sucessiva
em resíduos de lisina da ubiquitina anterior (K48 proteossoma ou K63 na autofagia)
Os genes das proteínas intervenientes no UPS constituem cerca de 5% do genoma
 E1: 1-2 activating enzymes
 E2: 10-20 conjugating enzymes
 E3: 500-800 ubiquitin ligase- drives specificity
 DUB: 100 ubiquitin specific proteases - regulators of pathway T

Proteassoma 26S = 19S (tampa) + 20 S (o resto)

 19S – Local de reconhecimento e ligação das proteínas marcadas com poli-ubiquitina • Desenrolamento do
substrato ubiquitinilado para entrar no centro 20S (mediado por AAA ATPases – dependente de ATP) •
Remoção das cadeias de ubiquitina para permitir a entrada no centro 20S (~1.3 nm) pela ação de
desubiquitinases • Ativação/abertura do centro do 20S
 20S - • Contém atividade de endopeptidase • A função das subunidades α é de controlar a abertura e fecho
do 20S (interagem com 19S) • As subunidades 1, 2 e 5 contêm a atividade endopeptidase do
proteassoma • As proteínas não são degradadas em aa mas em pequenos péptidos

Vias controladas pela proteólise regulada

A ocorrência de proteólise regulada desempenha funções importantes numa variedade de processos celulares
fundamentais tais como:
- Regulação do ciclo celular;
- Desenvolvimento e diferenciação celular;
- Apoptose;
- Modulação das respostas imunes e inflamatórias;
Potencial alvo terapêutico para o tratamento do cancro e doenças neurodegenerativas
Ex: Regulação do ciclo celular: Complexo Cdk1/ciclina B é necessário para entrada em mitose, ativando:
- CdK1 cinase (inicia eventos da M, como condensação dos cromossomas e desintegração do invólucro)
- Ubiquitina ligase, marca a ciclina B para degradação de forma a inativar a Cdk1, permitir a conclusão da
mitose e progressão da célula para interfase do ciclo seguinte

2) Autophagy-Lysosome pathway (ALP)

- Mecanismo protetor em condições de stress
- Essencial para a manutenção da viabilidade celular: reciclagem de organelos danificados e proteínas misfolded;
e remoção de metabolitos tóxicos. No entanto, a degradação excessiva de componentes citosólicos leva à morte
celular.

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Importância fisiológica a autofagia:
1–1.5% das proteínas celulares são degradadas por hora via autofagia
Atuam como maquinaria de controlo de qualidade de componentes citoplasmáticos – crucial para várias células
diferenciadas, como os neurónios I

Tipos de autofagia:
• Microautofagia - pequenas porções de citoplasma são envolvidas pela membrana dos lisossomas ou endossomas
tardios para degradação
• Autofagia mediada por chaperones (CMA) - Proteínas que possuem sequência pentapeptídica KFERQ são
reconhecidas pela Hsc70 e co-chaperones, são translocadas para o lúmen do lisossoma após ligação à Lamp-2A na
membrana lisossomal. Cerca de 30% das proteínas citosólicas apresentam a sequência sinal KFERQ. Lys Hsc -70 –
forma lisossomal da Hsp70, estabiliza o multímero Lamp-2-A.
• Macroautofagia - A privação de nutrientes é reconhecida como um dos melhores estímulos para a ocorrência
de macroautofagia. Damaged organelles and Protein aggregates (starvation).
Formação do autofagossoma:
 Na presença de nutrientes o complexo mTORC1 inibe autofagia por supressão do complexo ULK1.
 Na privação de nutrientes: Ativação do complexo ULK1 que transloca para um determinado domínio
do RE. No RE, ULK1 regula o complexo PI3K que origina formação de PI3P. PI3P recruta DFCP1 e
promove formação do omegassoma, de onde se originam os autofagossomas Necessária a ação do
complexo Atg12-Atg5-Atg16L1 e ligação de LC3 ao PE da membrana para a ocorrência da
maturação/elongação e dissociação do autofagossoma. O L53 é lipidado. Formação do fagossomo e
depois do autofagossomo.

Interligação entre UPS e ALP

Inicialmente assumidos como dois sistemas de degradação independentes Estudos recentes sugerem a existência
de uma interação funcional entre o sistema ubiquitinaproteassoma e a autofagia lisossomal
Actuam de forma combinada de forma a manter a proteostasia celular
Quando proteínas misfolded escapam ao UPS, tendem a formar agregados proteicos que são inacessíveis para o
proteassoma, mas que ativam a ALP de forma a serem degradados no lisossoma

Ubiquitinação e autofagia
Monoubiquitinação – localização, atividade, interação
K63 poliUb – sinalização de degradação por autofagia
K48 poliUB – Degradação proteossoma

Controlo de qualidade proteíca no RE

 ERAD (UPS) – Degradação associada ao RE
 UPR (Unfolded Protein Response) – Stress: apoptose ou homeostase
O que garante o controlo de qualidade? O que garante a homeostasia do RE em situações de stress? (Ex: depleção
de Ca2+, stress oxidativo, hipóxia, privação de nutrientes, alterações metabólicas, alteração dos níveis de
glicosilação, inflamação, sobrecarga da síntese proteica, aumento do misfolding proteico e formação de agregados

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As chaperones/enzimas do RE são essenciais.
Calnexina/calreticulina no controlo de qualidade de glicoproteínas:
A calreticulina e a calnexina ligam aos oligossacarídeos de cadeia nascente ajudando no folding correcto, ou de
proteínas com folding incorrecto tentando corrigir o erro São (em conjunto com BiP) dos primeiros intervenientes
no controlo de qualidade Se os processos de aquisição da estrutura terciária/quaternária falharem, a proteína é
enviada para o citoplasma onde é degradada pelo proteassoma - ERAD (“ERassociated degradation”)

Modificações nos N-oligossacarídeos são utilizadas para controlar a qualidade do folding – ERAD

Papel da chaperone BiP no lúmen do RE Quando há acumulação de proteínas mal enroladas no lúmen do RE – stresse
do RE – a BiP desencadeia a ativação da UPR com o objetivo de repor a homeostasia proteica pela expansão do RE,
inibição da síntese de proteínas e aumento da expressão de chaperones. As Bip, ao estarem desconectadas dos
sensores na membrana, ativam-nos. Atenuam assim a produção de mais proteínas, enquanto as que estão no lúmen
estiverem a ser processadas.

Interligação entre UPR e autofagia

Não esquecer a interligação entre ALP e UPS!!

Resumo:

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AULA 20 – Plastos
Tipos de plastos (organelos):
Cloroplastos, contém clorofila e realizam a fotossíntese.
Cromoplastos, contêm pigmentos como carotenóides.
Leucoplastos, não têm pigmentos mas armazenam energia não fotossintética.
Amiloplastos, que armazena amido.
Elaioplastos, que armazena lípido (exemplo: oleaginosas).
Todos têm genoma semelhante e derivam de protoplastos que amadurecem, podendo uns originar os outros. No
amadurecimento, caso exista luz, surgem os cloroplastos, caso contrário, os etioplastos. O ADN presente nos
plastos é próprio, circular, mas pode derivar também do núcleo. O inverso não se verifica (proteínas no citoplasma
provém apenas do núcleo).

O CLOROPLASTO é, estruturalmente, semelhante à mitocôndria:

Membrana externa, permeável a pequenas moléculas por conter porinas.
Membrana interna, impermeável a pequenas moléculas e iões, que passam apenas por proteínas transportadoras.
Estroma, equivalente à matriz mitocondrial, contendo o genoma e enzimas necessárias à produção de ATP,
encerrando também os tilacóides.
Tilacóides, equivalentes às cristas mitocondriais, no entanto, são invaginações da membrana interna que se
isolaram, agrupando-se em pilhas granum (plural grana). É nas membranas que ocorre a fotossíntese.
Lúmen dos tilacóides, equivalente ao espaço intermembranar, para onde vai o bombeamento de H+, que gera
gradiente eletroquímico.
Como a mitocôndria, possui genoma próprio, circular, mas maior e mais complexo. Codifica proteínas necessárias
à tradução proteica, à fotossíntese e codifica os seus próprios tRNA’s e mRNA’s.
A principal ocorrência no cloroplasto é a FOTOSSÍNTESE, que usa energia solar para produzir glicose, a partir
de CO2 e H2O. Este processo divide-se em 2 fases:
1) Fase clara (produção de O2 a partir de luz e H2O)
2) Fase escura (produção de glícidos com fixação de Carbono. Também necessita de luz)
Depende da intensidade da luz até uma saturação. Depende também da temperatura, com curva em U.

1) Fase clara
Nesta fase as reações são dependentes da luz e ocorrem NA MEMBRANA dos tilacóides.
FOTOSSISTEMAS: dois dos 5 complexos proteicos presentes na membrana dos tilacóides, onde a luz é absorvida.
O I (700), maioritariamente nas lamelas e periferia do grana e o II (680) nos tilacoides empilhados onde ocorre
a fotólise da água, geram NADPH e ATP, que vão ser utilizados para criação de reservas de glicose.
CENTRO DE REACÇÃO CLOROFILINO: onde 2 moléculas de clorofila transferem os é excitados para a cadeia
transportadora. Clorofila: pigmento fotossintético que faz parte do centro de reação. Recebe energia dos eletrões
(é) excitados, que vem dos complexos de antena, conjunto de pigmentos moleculares que absorvem a luz.
Complexo de antena: recebe os raios UV e transmite para a zona central do complexo clorofilino.

Nos fotossistemas a luz é absorvida pelos pigmentos fotossintéticos e usada para quebrar uma molécula de água,
originando 2H e 2é excitados e O2. Os é serão levados em reações red-ox até ao centro de reação clorofilino.
Daí são levados por transportadores de é (plastiquinona) até ao 3º complexo, o citocromo bf, e esse transporte
faz com que os H anteriores sejam bombeados para o lúmen dos tilacóides, gerando gradiente protónico.
Finalmente, os é são aceites na NADP REDUTASE formando o NADPH e o gradiente protónico gerado faz
funcionar a ATP sintase (F0F1), levando à produção de ATP para o estroma do cloroplasto.
NOTA: Quando os é do fotossistema I são usados pelo citocromo bf para gerar energia, produzindo gradiente que faz
funcionar a ATPsintase, chama-se transporte cíclico de eletrões, sendo os eletrões depois enviados novamente o
fotossistema I (pela plastocianina). Quando acontece o processo normal, chama-se transporte acíclico de eletrões.

2) Fase escura
Aqui, o ATP e o NADPH gerados na fase clara são usados juntamente com o dióxido de carbono para produção de
glicose C6H12O6. Este processo é efetuado pela RuBisCo (uma carboxilase). Forma-se Gliceraldeído-3-P, o
percursor de todas as moléculas restantes.
INIBIÇÃO DA FOTOSSÍNTESE: Atrazina e Glifosato, como exemplos.
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AULA 21 - Mitocôndrias e Peroxissomas
MITOCÔNDRIA
Organelo com funções estruturais energéticas, contém genoma próprio
(circular e com várias cópias) com poucos intrões, e a maioria das suas
proteínas são importadas de ribossomas livres. O ADN mitocondrial
permite a estes organelos produzirem as suas próprias P, não mais que
5% das totais. Estruturalmente:
1) Membrana externa
2) Membrana interna
3) Espaço intermembranar
4) Cristas mitocondriais (cells com maior necessidades contêm + cristas)
5) Matriz mitocondrial

1) Membrana externa - Permeável a pequenas moléculas e iões devido a porinas. 40% constituída por lípidos
(sintetizados no RE). Permite a translocação de P, e dos substratos do ciclo do ácido cítrico (piruvato).
2) Membrana interna - Contém mais proteínas (80%), não tem poros e é muito seletiva; Contém muitos complexos
enzimáticos e sistemas de transporte transmembranar. Apenas 20% é constituída por lípidos, sendo mais rica em
transportadores de é, a F0F1ATPase e CARDIOLIPINA, lípido que lhe confere impermeabilidade. A área é
aumentada por cristas, e tudo isto reflete a sua função, produção de ATP. Contém os transportadores de é (que
ao funcionarem criam um gradiente de H+ no espaço intermembranar mantido pelas bombas de H, que não se dissipa
graças à impermeabilidade). Esse gradiente faz funcionar a ATPsintase, gerando ATP - fosforilação oxidativa.
3) Espaço intermembranar - Como a m. exterior é livremente permeável a moléculas pequenas, as concentrações
de moléculas pequenas no espaço intermembranar são as mesmas que o citosol. No entanto, as P grandes devem
ter uma sequência específica de sinalização para serem transportadas através da membrana externa, ou seja, a
composição de proteínas deste espaço é diferente da composição proteica do citosol.
4) Cristas mitocondriais - Prolongamentos da membrana interna através da matriz, aumentando a sua área. Podem
ser lamelares (fígado), vesiculares (suprarrenal) ou outra estrutura mais particular (ex: tecido adiposo castanho).

Córtex suprarrenal - Brown fat - Fígado rato

5) Matriz mitocondrial – Contém P, ribossomos e DNA mitocondrial com genes codificadores de 13 proteínas, de
rRNAs e 22 tRNAs.

Transporte de proteínas para a MEMBRANA INTERNA OU MATRIZ:

 COM SEQ Sinal: As P tem de possuir uma sequência sinal com resíduos+ (lisinas) no N-terminal, traduzindo-
se numa hélice-α anfipática. Têm de estar parcialmente desenroladas (HsP70). Atravessam o complexo
TOM40 (membrana externa) e o TIM23 (m. interna). A sequência sinal é +, importante para atravessar o
gradiente. Na matriz existe Hsp70 mitocondrial que interage com o TIM e “puxa” a P para a matriz (com
hidrólise de ATP), sendo a sequência clivada p/ MPP (matrix processing peptidase).
 SEM SEQ, SINAIS INTERNOS: A Hsp70 em associação com a HsP90 citosólica permite a interação da
P com TOM70. No espaço intermembranar interagem com TinyTIMS (Chaperonas 9 e 10), que direcionam
para a TIM22 (em vez da TIM23 das P com sinal) e daí passa para a membrana.
 COM SEQ E SINAIS INTERNOS: Reconhecidas pelo TOM20. Aqui, apresentam 3 rotas:
1) Ou são inseridas lateralmente na membrana interna (TOM 40);
2) Ou possuem domínios ricos em cisteínas que são reconhecidos por chaperones específicas e as mantêm
no espaço intermembranar;

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 3) Ou possuem uma segunda sequência de endereçamento que só é descoberta após clivagem da pré-
sequência na matriz, que as direciona para o translocão Oxa1. Da Oxa1 são transportadas de volta para
o espaço intermembranar ou inseridas na membrana interna (se hidrofóbica).
Proteínas produzidas na matriz e com destino final a membrana interna também são translocadas pela OXA1.

Importação de proteínas para a MEMBRANA EXTERNA:

Com domínio transmembranar em hélice alfa: Mim1
Com domínio transmembranar em folha-β: translocadas via TOM40, ligam-se às Tim9/10 do espaço
intermembranar e inserem-se na membrana via complexo SAM.

Transporte de proteínas para o ESPAÇO INTERMEMBRANAR:

As P contém sequências ricas em cisteínas e o seu folding é catalisado via complexo MIA.

Transporte de FOSFOLÍPIDOS para a membrana:

Saem do RE, em vesículas que os protegem e a levam para a mitocôndria. A mitocôndria cataliza a síntese da
cardiolipina (fosfolípido com 4 AG) exclusivo da membrana interna.

METABOLISMO NA MATRIZ MITOCONDRIAL:

A mitocôndria recebe piruvato ou acetilcoA (originando 32 a 34 ATPs).
O ciclo do ácido cítrico é a fase em que o acetil-CoA (obtido a partir do piruvato, dos AG e dos aa) é completamente
oxidado, com libertação de CO2, NADH e FADH2, estes 3 últimos transportadores de é que serão usados na cadeia
respiratória (energia sob forma de eletrões) e de uma molécula de GTP condições aeróbias.
Cadeia respiratória: os transportadores de é NADP: complexo I (m. interna) -> CoenzimaQ (ubiquinona) ->
complexoIII -> citocromoC, -> complexo IV (citocromooxidase) -> O2 -> H2O (todos estes complexos permitem
passagem de H+ para o espaço intermembranar.
O transporte de eletrões através dos complexoI, III e IV está acoplado ao transporte de protões da matriz para
o espaço intermembranar. A energia do gradiente de protões é convertida em ATP via a ATP sintetase (Bomba de
protões -Classe F, com 2 domínios, o F0 ligado à membrana interna e o F1 ligado à matriz). O fluxo de protões do
espaço intermembranar para a matriz (a favor do gradiente) através do F0 leva à rotação do F1 e produção de
ATP (por cada 4 protões é sintetizado 1 ATP).
O complexo II recebe os é do succinato, que os transfere para o FADH2 (e não para o NADH) -> CoenzimaQ
(mecanismo sem fluxo de é para o espaço intermembranar).
Existem drogas capazes de interferir com o processo de fosforilação oxidativa, nomeadamente:
- Cianeto e CO, bloqueia o complexo móvel citocromo c, deixando de haver transporte de é, logo síntese de ATP.
- Rotenona, bloqueia o complexo desidrogenase do NADH, impedindo a oxidação deste substrato, fluxo de é e
síntese de ATP
- Dinitrofenol, desconjugante do processo de fosforilação oxidativa, pois abre poros na membrana, permitindo a
dissipação do gradiente eletroquímico sem a produção de ATP.
- Termogenina, desconjugante, presente em altas concentrações no tecido adiposo castanho dos bebés e dos ursos
(castanho), permite a dissipação do gradiente eletroquímico, mas gera grandes quantidades de calor.

CONTROLO QUALIDADE MITOCÔNDRIA:

Antiox (superóxido dismutase)
Protease Lon ou Clp – degradam as Proteínas

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PEROXISSOMAS
Pequenos organelos esféricos envolvidos POR UMA MEMBRANA, sem genoma próprio. Tal como a mitocôndria,
replicam-se por divisão e recebe proteínas de ribossomas livres.
O conteúdo é essencialmente enzimático, cerca de 50 enzimas diferentes, com várias funções.
A função principal é obter, através de reações de oxidação, H 2O2, um tipo de ROS, que sendo prejudicial é
degradado pela catalase (reage com DAB), convertendo-se em H2O e O2, e também para oxidar outras moléculas,
como os AG de cadeia longa (acima de 26C) ß-oxidação (transformam-nos em cadeia média).
Em animais, tem também a função de síntese de lisina, colesterol e dolicol, bem como de plasmalogenos
(fosfolípidos com ligação éter), componentes membranares importantes no coração e cérebro.
Os plasmalogenos, em plantas, convertem AG em CHO (glioxalato, variante do ácido cítrico, muitas vezes
designando-se glioxissomas).
Pode ter tido origem num organelo ancestral onde ocorria o metabolismo de O 2.

Como se formam peroxissomas?

1) Vesículas membranares criadas no RE, que não são revestidas de COPII nem direccionadas para o C. Golgi,
fundem-se para formar peroxissomas, é importante que tenham dois tipos de vesículas com diferentes
peroxinas.
2) Peroxissoma formado cresce e divide-se (permite regular conforme necessidades da célula).

Como as P se dirigem aos peroxissomas?

O peroxissoma não contém ADN por isso todas as proteínas devem ser direccionadas para lá. Possuem
sequências PTS peroxissomal targeting sequence (PTS1, PTS 2 e MPTS). São reconhecidas pelas Peroxinas
(Pex), que levam ao complexo 14/17/13 e a P é internalizada.
 PTS1 – tripéptido C-terminal - Matriz Peroxissomal (+ comum) reconhecida pela Pex 5 que interage com o
complexo Pex14/Pex17/Pex13 e envia a P ao peroxissoma.
 PTS2 – nonapéptido N-terminal - Matriz Peroxissomal (- comum) reconhecida pela Pex7.
 MPTS – Membrana, reconhecida pela Pex19, que interage com a Pex13/16 e promove a passagem para a
membrana, sendo a Pex reciclada.

PATOLOGIAS PEROXISSOMAIS:
A maioria das patologias peroxissomais causam disfunção neurológica severa devido a malformações no SNC,
anormalidades na mielina e degeneração neuronal.
1) Único défice enzimático
2) Biogénese dos peroxissomas
São peroxissomas maiores e em menor quantidade que os sãos (visto por fluorescência). Normais muitas das
vezes surge como pontilhado, se patológico mais difuso.

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AULA 22 – Citoesqueleto
Rede de fibras proteicas no citoplasma que dá suporte físico à célula, com funções variadas: determinar a forma
celular e é responsável pelos movimentos celulares, quer a nível da célula quer organelos.
É uma rede não rígida e muito dinâmica, o que permite a constante reorganização celular quando necessário. É
constituída por 3 tipos de filamentos, ligados entre si por uma série de proteínas:
1) Microfilamentos (Filamentos de actina de 7 a 9nm)
2) Microtúbulos (25nm de tubulina α e β)
3) Filamentos intermédios (variadas proteínas, conforme a sua função)

1) MICROFILAMENTOS
Relacionados com a membrana celular, na periferia da célula, determina a forma e fornece suporte mecânico e
de movimento. A actina constitui a maior proteína do citoesqueleto. O seu monómero é a actina G, proteína globular
polar com estrutura terciária, que polimeriza formando filamentos de actina F, polares, com 7 nm de diâmetro:
Extremidade +, sofre polimerização rápida;
Extremidade -, sofre polimerização lenta.
Esta polimerização requer ligação e respetiva hidrólise do ATP, com o auxílio do magnésio. Cada actina G se liga
a outras duas, criando trímeros, que vão formando os filamentos (numa estrutura de pseudohélice). 20% das
proteínas das células musculares são actina (nas restantes células varia entre 5 a 10%).
Os agregados de 3 actinas G, vão formando filamentos F, através de ligação ao ATP e juntam à cadeia, na
extremidade +, 5 a 10 vezes mais rápido que na extremidade -, onde o ATP já foi hidrolisado a ADP e onde ocorre
a despolimerização, pois a actina ligada a ADP tem ligação mais fraca (permitindo assim sucessivas polimerizações
ou despolimerizações). Este carácter dinâmico da actina tem o nome de TREADMILLING.
Estes mecanismos são regulados por várias proteínas (Actin binding proteins, ABP).
Existem drogas capazes de bloquear o treadmilling da actina:
Citocalasinas, ligam à extremidade +, impedindo a elongação e seguimento de processos como a mitose.
Faloidinas, ligam aos filamentos, impedindo a dissociação (e logo impedindo a despolimerização).

Além destas drogas, existem proteínas que se ligam à actina, regulando a sua polimerização:
Forminas, facilitam a polimerização partindo da extremidade + e permitindo cadeias não ramificadas;
Arp 2/3, igual às forminas, mas permitindo cadeias ramificadas;
Profilina, permite a reciclagem da aG para ADP, para a actina poder voltar a entrar no filamento. Estimula a
troca de ATP por ADP;
Tropomiosina, estabiliza a actina;
Cofilina, liga à extremidade – da actina, acelerando a despolimerização; pode criar vários fragmentos.
CAP, ligam-se à extremidade + (Z) impedindo a polimerização ou – (tropomedulina) impedindo a
despolimerização.

Organização dos microfilamentos (actina):

Em feixes de actina-F que podem ser paralelos (ligados à fibrina, polares, como os casos de microvilosidades,
e a zona + voltada para as membranas); ou contráteis (como no caso muscular, unidos pela actinina e miosina)
Em redes de actina-F ligados por filaminas, dímeros.

2) MICROTÚBULOS
Tubos com aproximadamente 25 nm, com carácter dinâmico, e funções estruturais e de movimentação (cílios,
flagelos, movimento de organelos ou dos cromossomas na mitose.)
É essencialmente constituído por dímeros de tubulina α e ß, que polimerizam em 13 protofilamentos paralelos que
se unem formando um tubo polar, tal como a actina, sofrendo polimerização e despolimerização
TREADMILLING. Este processo é semelhante ao da actina, utilizando GTP em vez de ATP. O GTP liga-se à
tubulina na extremidade +, dependendo fortemente da concentração de ambos.
Existem proteínas associadas aos microtúbulos:
Polimerases, polimerização;
Despolimerases, estimulam a dissociação;

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CLASP, impedem o efeito de catástrofe - impedem o movimento de rápida despolimerização que ocorre no
défice agudo de GTP e tubulina (chamado de instabilidade dinâmica, que o permite atuar rapidamente, ora
construindo ora despolimerizando).
Em INTERFASE, os microtúbulos têm origem na zona pericentriolar. Junto aos centrossomas (zona -), e orientam-
se para a periferia da célula (+).
Na MITOSE, criam os cinetocoros (que atravessam os centrossomas), os astrais (que ligam os centríolos à parede
citoplasmática) e os polares (que ligam centrossomas diretamente sem passar pelos cinetocoros dos cromossomas).

Existem proteínas motoras que se deslocam ao longo dos microtúbulos p/transporte de subs, gastando ATP:
Cinesinas, responsável pelo transporte na direção da extremidade +.
Dineínas, responsáveis pelo transporte da direção da extremidade – dos microtúbulos.

Os cílios e flagelos são prolongamentos da célula que contêm microtúbulos e que conferem movimento à célula.

Existem drogas capazes de parar este carácter dinâmico dos microtúbulos:
Colquicina e colcemida, impedem a polimerização dos microtúbulos, não ocorrendo mitose.
Taxol, estabiliza o carácter dinâmico dos microtúbulos.
Vinblastina.
Paclitaxel (Taxol).
Nocodazol.

3) FILAMENTOS INTERMEDIÁRIOS:
O 2º maior constituinte do citoesqueleto, formam redes de 10 nm de diâmetro, de carácter mais estável.
Associam-se em dímeros, e a organização é apolar (os protofilamentos dispõe-se em alternância de fase),
antiparalela em tetrâmeros.
São compostos por várias proteínas, consoante as células, que se dividem essencialmente em 4 grupos:
1) Queratinas, ácidas ou básicas, e existem nas células epiteliais, unhas e cabelos. Tem função de ancorar o núcleo
à membrana celular e podem ligar-se às caderinas das junções celulares.
2) Vimentinas, existem nos fibroblastos e células musculares (desminas), ancorando o núcleo à membrana.
3) Neurofilamentos, abundantes nos axónios, conferem-lhes segurança.
4) Laminas nucleares, rodeiam internamente o invólucro nuclear e, sofrendo fosforilação, quebram-se.

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Aula 23 - Matriz extracelular e interações da superfície celular
As células animais possuem matriz extracelular, que preenche os espaços entre as células. A constituição base são
Proteínas fibrosas embebidas num gel de polissacarídeos, com proteínas de adesão celular.

Três classes principais de moléculas:

1) Proteínas estruturais da matriz (ex. colagénio e elastina)
2) Malha de proteoglicanos (complexo de polissacarídeos) onde se inserem as proteínas estruturais
3) Proteínas de adesão que permitem a ligação das células à matriz extracelular (ex. fibronectina e laminina)

1) PROTEÍNAS ESTRUTURAIS DA MATRIZ

O COLAGÉNIO é a maior P estrutural da matriz. Existem vários tipos (19) e a sua estrutura é:
3 Cadeias polipeptídicas que se enrolam entre si formando uma hélice tripla (Uma Glicina de 3 em 3 aa).
Os domínios são sequências glicina-prolina-hidroxiprolina, cujas estruturas em anel estabilizam a hélice tripla. A
glicina, tendo na cadeia lateral R um H permite melhor empacotamento.
Colagénio tipo I – mais abundante, tecidos conjuntivos. Cadeias polipeotídicas possuem cerca de 330 repetições
Gly-X-Y Após secreção formam fibrilas nas quais as hélices triplas se organizam de forma ordenada
Colagénios do tipo fibrilar - Sintetizados como pro-colagénios (precursores solúveis) que contêm segmentos não
helicoidais. O Pro-colagénio é clivado após secreção. Associação das fibrilas é reforçada por ligações covalentes
entre cadeias laterais das lisinas e hidroxilisinas. Fibrilas associam-se formando as fibras de colagénio. A síntese
ocorre no RER e sofre processamento no Golgi (formação da hidroxiprolina). No entanto, a secreção (formação de
fibras ou redes) é feita apenas quando o glicogénio se encontra no meio extracelular.
Os tipos de colagénio dividem-se em:
• Formadores de fibrilas (I, II, III), nos tecidos conectivos, cartilagem, na pele, etc.
• Associados a fibrilas (IX, XII), nas cartilagens e tecidos conectivos.
• Formadores de redes (IV, X), na lâmina basal, cartilagens, etc.
• Ancoradores de fibrilas (VII), ligam a lâmina basal ao tecido conectivo.
• Transmembranares (XXV), nas células nervosas.

2) MALHA DE PROTEOGLICANOS
Embebidas em géis de polissacarídeos designados glicosaminoglicanos (GAGs) – unidades repetitivas de
dissacarídeos N-acetilglucosamina ou N-acetilgalactosamina ligado a um açúcar acídico (ácido glucurónico ou
idurónico). Ligam iões com carga + e aprisionam moléculas de H2O formando um gel hidratado. Ligam-se a P
formando os proteoglicanos.

3) PROTEÍNAS DE ADESÃO
FIBRONECTINA
Responsáveis pela ligação dos componentes da matriz entre si e à superfície das células. Principal proteína de
adesão dos tecidos conjuntivos (Integrin). Glicoproteína dimérica – 2 polipéptidos com cerca de 2500 aa
Possui locais de ligação para o colagénio e proteoglicanos, formando cross-links com estes componentes
Tem também local de ligação para integrinas (ligação às células)

LÂMINA BASAL, matriz especializada, que as liga ao tecido conectivo. Dividida em Lúcida (mais interna rica em
laminina) e densa (mais externa rica em colagénio IV). • Fina (40-120 nm) • Resistente e
flexível • Várias localizações (sob a barreira epitelial, reveste células musculares e
adiposas, entre camadas celulares nos glomérulos renais). • Várias funções: Elo de ligação
entre as células e o tecido conjuntivo. Determinam características celulares (ex.
polaridade). Determinam a organização proteica na membrana. Constituição:
Proteínas estruturais/de adesão:
 Laminina - Principal componente. Proteína heterotriméica, grande e flexível,
fundamental para a organização da lamina. Apresentam vários locais de ligação a 1
perlecano 1 nidogénio> 2recetores celulares (corresponde à zona da lamina lúcida).
 Colagénio tipo IV – 2º mais abundante. Confere força de tensão. Hélice tripla com locais
de ligação para o perlecano e nidogénio (corresponde à zona da lamina densa).
 Nidogénio
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Polissacarídeos: Glicosaminoglicanos (GAGs) e Proteoglicanos (ex: perlecano)

Existem várias matrizes extracelulares para os diferentes tecidos:

• Lâmina basal - envolve células musculares e adiposas, ancorando também as células epiteliais do fígado.
• Cartilagem - elevada percentagem de polissacarídeos, tornando-a mais resistente a pressões.
• Tendões -têm maior percentagem de proteínas fibrosas.
• Osso - matriz endurecida por deposição de cristais de fosfato de cálcio.

- ESPECIALIZAÇÕES DA MEMBRANA PLASMÁTICA-

Envolvidas no movimento celular, fagocitose, ou absorção de nutrientes:
Microvilosidades / Cílios / Flagelos / Esterocílios
Microvilosidades
Especializações digitiformes. Função: aumentar a área de absorção de nutrientes na membrana (~10-20x)
Grande abundância no epitélio intestinal.
Microfilamentos de actina dispostos de forma paralela: Vilina, Fimbrina, Miosina I (confere capacidade contrátil)
Microvilosidades – glicocálice: Camada de glicoproteínas e polissacarídeos que reveste externamente a
membrana plasmática das células epiteliais, mas mt desenvolvida na região apical do epitélio intestinal.
Face apical das células epiteliais do intestino cora de vermelho devido ao glicocálice (PAS/CHO)

Cílios móveis
Projeções citoplasmáticas, digitiformes, mais compridas que as microvilosidades
No epitélio da traqueia com a função de limpar a árvore brônquica
Nas trompas de Falópio para arrastar o óvulo fecundado em direção ao útero
Constituídos por microtúbulos organizados em axonema (9periféricos + 2centrais), em que a extremidade (-)
encontra-se ancorada num centríolo designado corpo basal. Os braços de dineína do microtúbulo A projeta-se em
direção ao microtúbulo B do dupleto seguinte - responsáveis pelo deslizamento dos microtúbulos uns sobre os
outros (movimento xicote). A Discinesia ciliar primária (Sd Kartagener) - defeitos na estrutura ciliar que afeta a
mobilidade. Ausência das dineínas. O portador pode apresentar tosse crónica e infeções respiratórias
recorrentes, se for mulher pode ser infértil.

Flagelos
Estruturalmente similar aos cílios (9p + 2s), mas muito mais longos e em menor número.
O tipo de movimento é diferente do dos cílios – tipo sinusoidal
Nos espermatozoides o centríolo mais distal (corpo basal) ancora o axonema
Nota: Flagelos bacterianos não são cílios: Não têm microtúbulos; são externos à membrana celular (não
recobertos por membrana); fazem rodar um filamento proteico constituído por flagelina

Estereocílios
Apesar do nome, não são estruturalmente relacionados com os cílios
Microvilosidades modificadas na dimensão e forma, possuindo um citoesqueleto constituído por um feixe de
microfilamentos de actina
No Homem, existem no epidídimo e canal deferente (canais excretores genitais masculinos) e no ouvido interno

- ADESÃO CELULAR -
A organização de diferentes tecidos e órgãos é determinada por interações ao nível da superfície das células

INTERAÇÕES CÉLULA-MATRIZ EXTRACELULAR (mediadas pelas CAMs - integrinas)

1. Adesão focal (entre células não epiteliais) - Porção extracelular da integrina liga P da matriz extracelular.
Domínio citoplasmático da subunidade β da integrina liga aos microfilamentos de actina do citoesqueleto
através de P de ligação à actina como a talina e a vinculina.
2. Hemidesmossoma (liga células epiteliais à matriz) - Integrina específica α6β4: associa-se aos filamentos
intermediários através da plectina e distonina

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 INTEGRINAS - P transmembranares (heterodímeros), que apresentam duas subunidades, uma α e uma β
As principais P da superfície celular responsáveis pela ligação das células à matriz extracelular
Existem 18 genes diferentes para as cadeias a, e 8 para as cadeias b - Existem 24 diferentes integrinas
Ligam-se a pequenas seq de aa presentes em diversos componentes da matriz, como o colagénio, a fibronectina,
a laminina e os proteoglicanos
A afinidade para ligar depende do estado conformacional: estão completamente ativas quando extendidas e
ligadas tanto ao citoesqueleto como à matriz

INTERAÇÕES CÉLULA-CÉLULA (mediadas pelas CAMs - caderinas)

1) Int. heterofílicas - Fracas e transitórias: entre células sistema imunitário, por ex)
SELECTINAS -medeiam interações transitórias entre leucócitos e endotélio
Extravasamento dos leucócitos promovido pela ligação de integrinas ao ICAM

2) Int. homofílicas - Fortes e estáveis: envolvidas na organização e disposição das células nos tecidos)
CADERINAS - Principais P responsáveis pelas junções estáveis (homofílicas) entre as células nos tecidos. O
nome deriva da dependência por Ca2+ – a Ausência faz com que as adesões se desprendam
Formam ligações homofílicas específicas e não aleatórias, o que permite reconhecimento seletivo entre células
• Clássicas (ligam a filamentos de actina)
• Não -clássicas (desmossomais, ligam a filamentos intermediários)
A adesão entre caderinas é fraca: a força total é aumentada pela localização de várias moléculas de caderina
adjacentes, semelhante a velcro! Depende não só do tipo como também da quantidade de caderina expressa

1) JUNÇÕES DE ADERÊNCIA
Permitem a ligação entre o citoesqueleto de duas células adjacentes através de caderinas
• Desmossoma circular (adherens junction) - Caderinas clássicas como a E-caderina; Proteínas de ligação
aos microfilamentos de actina: α e β catenina.
• Desmossoma pontual (desmosome) - Caderinas não clássicas como a desmogleina e desmocolina. P para
ligação aos filamentos intermediários: Placofilina, placoglobina e desmoplaquina - O Pênfigo, Doença
autoimune – apresenta auto-ATC contra desmogleína - Afeta a adesão entre queratinócitos - Bolhas
generalizadas nas mucosas - Perda grave de fluidos (perda impermeabilização). Em microscopia, vistas
como uma placa mais densa.

2) JUNÇÕES IMPERMEABILIZANTES - Junção apertada (Tight junction)

Impermeabiliza os epitélios. P transmembranares das famílias das ocludinas, claudinas e JAMs (Junctional
Adhesion Molecule), ZO-1 (Zonula occludens proteins) ligam as proteínas no domínio citosólico aos microfilamentos
de actina

3) JUNÇÕES COMUNICANTES - Junções de hiato (Gap junction)

Permite a passagem livre de moléculas com menos de 1200 Da. Formadas pelas conexinas; 6 conexinas formam um
poro (o conexão). O alinhamento de 2 conexões em membranas de células adjacentes forma um canal de ligação
entre o citoplasma de células adjacentes. Em microscopia vê-se que as células apresentam sempre o mesmo
espaçamento, na zona que possui junções comunicantes.

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RESUMO DAS INTERAÇÕES

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Aula 24 Sinalização celular
Todas as células respondem a estímulos do meio que as envolve, quer sejam eles de origem químico-nutricional,
quer sejam enviados de outras células. Esses estímulos provocam na célula uma série de alterações, através da via
de sinalização celular, em células animais superiores:
1) Ligação de uma molécula sinalizadora ao recetor celular.
2) Ativação de uma série de proteínas sinalizadoras intracelulares.
3) Distribuição do sinal para locais apropriados da célula.
4) Nesses locais encontra-se a proteínas alvo, que pode influenciar: metabolismo, expressão génica, citoesqueleto
(forma e movimento celular)
As moléculas sinalizadoras podem ter várias naturezas: proteica, esteroides, óxido nítrico, CO; e são segregadas
pelas células sinalizadoras: exocitose, difusão passiva, ligação à membrana da célula sinalizadora.

TIPOS DE SINALIZAÇÃO:
 Sinalização dependente de contacto, em que há contacto direto entre as 2 células, pois a molécula sinalizadora
e o recetor estão ligados às membranas das respetivas células. Importante na resposta imune p ex.
 Sinalização autócrina, em que a célula alvo é a própria célula produtora da molécula sinalizadora (ex: resposta
imunitária dos linfócitos T)
 Sinalização endócrina, em que as hormonas (molécula sinalizadora) são levadas pela corrente sanguínea até à
célula alvo (ex: estrogénio).
 Sinalização parácrina, em que as moléculas sinalizadoras afetam apenas localmente as células vizinhas da célula
emissora (ex: neurotransmissores).
Ex. 1) Libertação de neurotransmissores pela célula nervosa na sinapse.
Ex 2) As células nervosas libertam os neurotransmissores para o sangue, ativando a NO.sintase, que produz NO a partir
de arginina. O NO difunde-se rapidamente pelas células musculares vizinhas, ligando-se à guanilil-ciclase. Esta enzima
activa-se, desfosforilando GTP em cGMP, que induz o relaxamento muscular - vasodilatação.

Os RECETORES das várias moléculas sinalizadoras podem ser:

 Recetores intracelulares, onde moléculas sinalizadoras hidrofóbicas difundem através da membrana e ligam-se
a recetores que se encontram dentro da célula. Dada a natureza destas moléculas, são transportadas no meio
extracelular ligadas a proteínas transportadoras; dissociam-se antes de entrar na célula alvo.
Mecanismo de ação dos glucocorticóides (ex: cortisol)
Recetor dos glucocorticóides encontra-se ligado à HSP90 no citosol
O glucocorticóide difunde através da membrana, liga-se ao seu recetor no citosol
Alteração conformacional do recetor leva à dissociação da HSP90 e dimerização
O dímero migra para o núcleo onde ativa a transcrição de genes alvo
 Recetores da superfície celular, onde moléculas sinalizadoras hidrofílicas são incapazes de atravessar a
membrana, ligando-se então a recetores na membrana que transmitem o sinal para o interior celular.
1) Canais iónicos (ligand-gated)
2) Recetores associados à proteína G
3) Recetores associados a enzimas
4) Recetores associados a fatores de transcrição

1) Recetores iónicos
Envolvidos na sinalização sináptica entre células eletricamente excitáveis. O que acontece nos neurotransmissores:
são libertados pela célula nervosa e, sendo hidrofílicos, ligam-se a proteínas-canais iónicos, provocando uma
mudança conformacional nestas, que resulta numa mudança na passagem de iões.

2) Recetores associados à proteína G (GPCRs)

Inclui recetores responsáveis por vários sentidos (visão, olfato, etc.). Estes recetores são estruturalmente
caracterizados por terem 7 domínios transmembranares em a-hélice, e a ligação da molécula sinalizadora ao
recetor na face externa permite uma mudança conformacional na parte interna que faz com que o recetor se ligue
a proteína G.
Proteína G  P trimérica (subunidades α, ß e δ), e tem este nome pois a subunidade alfa é responsável pela ligação
a uma guanina. Quando a guanina não está ligada a alfa, esta encontra-se num complexo juntamente com as
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outras 2 subunidades, ligada a GDP - INACTIVA. Quando se liga à guanina, troca GDP por GTP, dissociando-se das
outras 2 subunidades – ficando ACTIVA.

 Ex: Via do AMP cíclico (cAMP), a subunidade α ativada migra em direção à adenilato-ciclase que fica ativada e
produz cAMP a partir de ATP. A forma inativa da PKA é um tetrâmero constituído por 2 subunidades catalíticas
(C) e 2 subunidades reguladoras (R) O cAMP liga-se às subunidades reguladoras levando à sua dissociação das
catalíticas, que ficam livres e enzimaticamente activas, aptas para fosforilar resíduos de serina nas proteínas alvo
(atividade cínase)
A PKA ativa é translocada do citoplasma para o núcleo. No núcleo, a PKA fosforila o FT CREB (CRE Binding protein)
que, por sua vez, recruta coactivadores e promove a transcrição de genes alvo (cAMP-inducible genes), que contêm
uma sequência reguladora CRE (cAMP regulatory element)

Diferentes células respondem de forma diferente ao aumento de cAMP O mesmo tipo de células responde,
normalmente, da mesma forma mesmo que ativado por sinais extracelulares diferentes. Ex: 4 hormonas diferentes
ativam a adenilato-ciclase nos adipócitos, e todas elas estimulam a degradação de triglicerídeos a AG.

3) Recetores associados a enzimas

Segunda maior classe. Proteínas singlepass (um domínio transmembranar) cuja parte citosólica possui capacidades
enzimáticas, ou de associações enzimáticas. A família mais comum é a classe dos recetores cinases de tirosina. O
N-terminal é o local de ligação à molécula sinalizadora e a parte citosólica tem atividade de cinase de tirosina,
Recetores cínase de tirosina (RTKs)
N-terminal possui domínio de ligação ao ligando
Hélice-a transmembranar C-terminal citosólico possui domínio com atividade tirosina cinase
Proteínas sinalizadoras que atuam através de RTKs - Ex (na maioria fatores de crescimento)
A ligação do ligando induz a dimerização dos recetores, o que resulta na aproximação dos domínios com atividade
tirosina cinase e consequente autofosforilação dos resíduos de tirosina de ambos os recetores
Ativação Recetores tirosina cinase (RTKs): dimerização e autofosforilação
Domínio catalítico (vermelho) – aumenta atividade cinase da proteína Fora do domínio – cria locais específicos
de ligação a proteínas com domínio SH2 (domínio de ligação a fosfotirosinas) que vão propagar o sinal

E é ativada da seguinte maneira:

- A ligação da molécula sinalizadora provoca a dimerização do recetor, fazendo aproximar os domínios da cinase,
o que leva a uma autofosforilação dos resíduos de tirosina, e consequente ativação da cinase. A sua ativação cria
locais de ligação a proteínas sinalizadoras com domínio SH, que por sua vez origina 3 vias de sinalização:
 Via das MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinase) - ERK, JNK e p38
A proteína Grb2 (no domínio SH) liga-se ao recetor cinase de tirosina, fazendo com que se ligue a ela o
GEF. Este activa o Ras (proteína fixa no folheto interno), promovendo a libertação de GDP e ligação de
GTP. o Ras-GTP interactua com a Raf, activando-a, e esta vai fosforilar a MEK, outra cinase que activa os

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 ERK’s, que vão atuar sobre outras cinases e fatores de transcrição, como as cinases das MAP’s (proteínas
associadas a microtúbulos).
Ligação da SOS à Grb2 e Ras-GDP, ativando-a
Ligação da proteína Grb2 (com domínio SH2)
Ras-GTP interatua com proteínas efetoras como a Raf (serina/treonina cinase)
Raf vai fosforilar a MEK que é também uma cinase
A MEK activa ERKs por fosforilação
As ERKs fosforilam uma variedade de alvos incluindo outras proteínas cinase e fatores de transcrição
ERK ativada pode migrar para o núcleo onde vai fosforilar fatores de transcrição que regulam a transcrição de
vários genes alvo
A especificidade da sinalização da via MAPK é conseguida, em parte, pela organização dos vários componentes da
cascata em complexos associados a proteínas scaffold, tais como a KSR.
RAS-RAJ-MEK-ERK

 Via do PI3K (Fosfatidilinositol-3-cinase) /AKT - VIA DE SOBREVIVÊNCIA CELULAR. Após

autofosforilação, a PI- 3cinase liga-se ao recetor, fosforilando as membranares do fosfolípido PIP2 em
PIP3, e activando a PKB (cinase de serina e treonina), que por sua vez fosforila proteínas que regulam a
apoptose (ex:Bad), factores de transcrição e outras cinases.
1- Ligação do ligando
2- Autofosforilação
3- Ligação da proteína PI3K ao recetor
4- A PI3K fosforila o fosfolípido membranar PIP2 a PIP3
5- A PIP3 liga a Akt e a PDK1 que fosforila a Akt. A mTORC2 fosforila também a Akt, ativando-a
6- O Akt ativa vias de sobrevivência celular
Ex: Regulação do fator de transcrição FOXO
FOXO livre - Inibição da proliferação celular = Morte celular
FOXO fosforilado - Sobrevivência celular

 Via da Fosfolipase C (PL-C) Fosfolipase C-g → Diacilglicerol (DAG), Inositol-1,4,5-trifosfato (IP3) -

cálcio, DAG, PIP3, PKC. A PI-3cinase liga-se aos recetores autofosforilados, fosforilando o PIP2 a PIP3.
Este último serve de âncora à BTK e PLC-gama. A BTK activa a PLC-gama, por fosforilação. A PLC-gama
hidrolisa a PIP2, que origina DAG e PIP3, que no conjunto activam a PKC.
Ligação do ligando promove ativação da Fosfolipase C gamma (PL-C g)
PL-C g hidrolisa o fosfolípido PIP2 em DAG e IP3 DAG e IP3 funcionam como mensageiros secundários e dividem
esta via em dois ramos
IP3 ligam a canais de cálcio existentes na membrana do RE, abrindo-os, e aumentando os níveis de Ca2+ no citosol
DAG mantém-se associado com a membrana e ativa proteínas da família da Proteína cinase C (PKC)

4) Recetores associados a fatores de transcrição

A ativação da proteína cinase associada ao recetor ativa diretamente fatores de transcrição. Ex: Via TGFβ/Smad
Via NF-κB Vias Hedgehog, Wnt, e Notch
Ex: Via TGFβ/Smad - Recetores de TGFβ são heterodímeros de recetores tipo I e tipo II. Após ligação do ligando,
o recetor tipo II fosforila e ativa o recetor tipo I. Por sua vez o recetor tipo I ativa a proteína Smad que forma
complexos e migra para o núcleo onde atua como fator de transcrição regulando a expressão de genes envolvidos
na proliferação e diferenciação celular

INTERLIGAÇÃO E REGULAÇÃO DAS VIAS DE SINALIZAÇÃO

A ocorrência de interligação (crosstalk) das vias normalmente refere-se à interação entre duas ou mais vias de
sinalização diferentes
Por ex, as vias MAPK/ERK e PI3K encontram-se em constante interação sendo capazes de regular (quer negativa,
quer positivamente) a atividade uma da outra de forma a controlar a proliferação e sobrevivência celular
A interligação entre a via de sinalização ativada pelos GPCRs e a via das MAPK/ERK é mediada pela βarrestina.
A ligação do ligando ao GPCR leva à ativação das proteínas G; a GRK (G protein-coupled receptor kinases) fosforila
o GPCR desativando-o
Em seguida, a β-arrestina liga-se ao recetor fosforilado levando à ativação da via das MAPK/ERK; pode provocar
também a internalização do GPCR, desligando a sinalização.

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AULA 25 Meiose e Fertilização
Meiose, gâmetas e fertilização
MEIOSE
A meiose é um ciclo celular especializado que reduz o número de cromossomas das células filhas para metade
formação de gâmetas HAPLÓIDES para a reprodução sexuada
Tem início após a replicação do material genético (fase SG2) e nas plantas e animais multicelulares é exclusiva
de células germinativas chave da reprodução sexuada.
Divide-se em duas fases principais: meiose I e meiose II.
1) Meiose I - Fase em que ocorre o emparelhamento dos cromossomas homólogos, divididos em 2 células filhas.
Divide-se em 4 fases:
A. Profase I, fase em que ocorrem as recombinações entre os cromossomas homólogos, e divide-se em 5 partes:
Léptoteno, onde os cromossomas se encontram em novelos finos e pontuados (cromómeros), e a cadeia
linear invade o cromossoma homólogo.
Zigóteno, ocorre emparelhamento, formando-se o complexo sinaptonémico, estrutura proteica que se
forma ao longo dos homólogos emparelhados. Forma-se também o nódulo de recombinação, complexo
enzimático com as enzimas necessárias ao crossing-over.
Paquíteno, onde se completa o crossing-over, estando os homólogos ligados pelos pontos de quiasma.
Diplóteno, onde o complexo sinaptonémico desaparece, e os homólogos mantêm-se unidos pelos pontos
de quiasma, importante para o alinhamento na metáfase.
Diacinese, fase de transição para a metáfase, onde os cromossomas estão mais condensados.
B. Metáfase I, formação do fuso meiótico e alinhamento dos pontos de quiasma na placa equatorial, com os
centrómeros dos cromossomas homólogos para lados opostos. Os microtúbulos prendem-se às cromatídeas irmãs.
C. Anafase I, quebra dos pontos de quiasma e separação dos homólogos.
D. Telofase I, os cromossomas homólogos são divididos em 2 pronúcleos.
2) Meiose II, idêntica a uma mitose normal, originando 4 células com material genético haplóide.

GÂMETAS
Da meiose resultam células haplóides, os gâmetas (são então células diferenciadas, sendo estes gâmetas
denominados de primordiais antes da meiose). Surgem de células germinativas que migram para as gónadas
embrionárias, onde aumentam o seu nº por mitose. Sofrem meiose, reduzindo o seu material genético e sofrem
maturação GAMETOGÉNESE.
As gónadas diferenciam-se por presença ou não do cromossoma Y. Estando presente, expressa o gene Sry que
diferencia as gónadas em testículos. Não estando presente, transformam-se em ovários. A gametogénese pode
ter dois nomes, consoante o tipo de gâmeta produzido:

I. Espermatogénese
Processo de formação do gâmeta masculino espermatozóide. Ocorre nos testículos, mais precisamente nos
túbulos seminíferos, de fora para dentro, em direção ao lúmen. Estes túbulos seminíferos são rodeados por lâmina
basal. Fases do processo:
Formação das espermatogónias por amadurecimento das células germinativas primordiais nos testículos.
Mitoses sucessivas multiplicam o nº de espermatogónias.
Estas células dão entrada na meiose I. durante este processo têm o nome de espermatócitos primários.
No final da meiose I, os espermatócitos passam a ser secundáriosentrada na puberdade.
Final do processo de meiose, com formação das espermátides.
Estas espermátides sofrem maturação, o processo
ESPERMIOGÉNESE, com a libertação final de espermatozóides no lúmen do túbulo seminífero. Neste processo
dá-se a redução do tamanho do núcleo e condensação total dos cromossomas, reorganização do citoplasma,
condensação do complexo de Golgi na parte apical do núcleo acrossoma (que tem as enzimas necessárias para
penetrar o óvulo) e forma-se o flagelo, com uma parte intermédia, ladeada de mitocôndrias que fornecem ATP
para o seu movimento.

II. Oogénese
Formação dos gâmetas femininos – óvulos, que ocorre nos ovários.

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As células germinativas primordiais entram nos ovários, onde se designam oogónias, envolvidas em folículos
primordiais.
As oogónias sofrem mitoses sucessivas nos ovários.
Entram em meiose – ovócito primário – e, no momento do nascimento da menina, param o processo no diplóteno
da profase I, enquanto o ovário cresce.
Na puberdade, iniciam-se os ciclos menstruais e o ovócito primário, sob estímulo hormonal, prossegue a meiose
I – ovócito secundário – formando-se o primeiro glóbulo polar (a 2ª célula resultante de uma meiose I).
O ovócito II segue para meiose II, onde pára em metáfase, só concluindo o processo se for fecundado.

Tal como na mitose, o MPF regula a meiose, induzindo a condensação cromossómica, quebra do invólucro nuclear e
formação do fuso mitótico. A alta concentração de MPF na metáfase II é a explicação para a célula se manter
nesse estado. A concentração de MPF mantém-se elevada pela existência de CSF, que tem uma subunidade MOS,
uma cinase de serina e treonina, cuja ação resulta na ativação da ERK-MAP, que ativa a Rsk, que mantém a MPF
inibindo a degradação da ciclina B.

FERTILIZAÇÃO
Processo através do qual surge um novo ser diplóide, por fusão dos gâmetas femininos e masculinos, que se dá no
1º terço das Trompas de Falópio. Ocorre em 4 fases:
1) Contacto e reconhecimento entre os gâmetas, para o que é necessário a capacitação do espermatozóide
(aumento do pH citosólico e hiperpolarização membranar), processos que aumentam a mobilidade do mesmo e
possibilitam a reacção acrossómica. O 1º contacto envolve a reação acrossómica, em que através das enzimas do
acrossoma (ativadas pelas proteínas ZP3 do ovócito) que digerem a zona pelúcida, o espermatozóide atravessa-a,
fundindo-se com a membrana do óvulo.
2) Regulação da entrada do espermatozóide no óvulo, para impedir que mais espermatozóides entrem na célula,
dá-se uma reação cortical. A concentração de cálcio aumenta quando o espermatozóide entra, sendo libertado para
o exterior sob exocitose, onde inativa as proteínas ZP da zona pelúcida, alterando-a e impedindo a entrada de
outros gâmetas masculinos. O cálcio leva também à conclusão da meiose II, pois inativa a Rsk, induzindo a
degradação da ciclina B da MPF.
3) Fusão do material genético, após isto, o zigoto contém 2 núcleos haplóides, os pronúcleos, que entram em fase
S da mitose, replicando-se e aproximando-se. Quando se encontram, a célula avança para a sua 1ª mitose.
4) Ativação do metabolismo do ovo e início do seu desenvolvimento

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AULA 26 Diferenciação e envelhecimento celular
Diferenciação celular: células estaminais
A diferenciação celular é o processo pelo qual as células com igual genoma originam células com funções
diferentes e que explica a evolução dos organismos multicelulares. Ocorre pelo facto de existirem nas células
diferentes tipos de RNA e proteínas, expressos por genes que sofrem splicing alternativo.
É um processo gradual, que ocorre ao longo de várias gerações de células, até a diferenciação total. Todas as
células indiferenciadas têm um destino pré-definido e, quando diferenciadas, a sua proliferação diminui, havendo
mesmo algumas que não sofrem mais nenhuma divisão. Ex: espermatozóide.
Morfogenos – substância difusível transportadora de informação, que determina o local e modo como ocorre a
diferenciação.
Divisão assimétrica de morfogenos, ocorre em moscas e batráquios e origina um desenvolvimento em mosaico,
em que os morfogenos estão irregularmente distribuídos (distribuídos apenas por uma célula).
Divisão simétrica de morfogenos, em que as células irmãs se tornam diferenciadas por influência posteriores
à mitose. Ocorre nos mamíferos, com divisões iniciais equitativas. Neles o excesso ou perda de células não altera
a ―pré-definição‖ das mesmas.
No fundo, os morfogenos são substâncias necessárias à ativação/repressão de genes estruturais que afetam
morfologicamente o organismo, num estado embrionário. Existem 3 regiões no embrião que contêm genes que
codificam morfogenos necessários à definição dos eixos antero-posterior ou rostrocaudal e dorsoventral, que são
necessárias ao desenvolvimento embrionário, permitindo o desenvolvimento de outras estruturas na região
(braços, pernas,etc.).
Proteínas bicoides, activam uma série de genes na região rostrocaudal.
Recetores Toll, ajudam no desenvolvimento da região dorsoventral, são recetores que reconhecem bactérias e
ativam o sistema imunitário inato.
Familia Hedgehog, existem em diferentes concentrações nas várias partes do embrião e garantem a sua
evolução. Ex: crescimento da árvore traqueobrônquica, em que as Hedgehog inibem a F6F10, obrigando a uma
divisão dos brônquios em dois ramos.
Células estaminais
São células que quando se dividem originam quer células que se vão diferenciar quer células que se mantém
indiferenciadas, o que permite a constante renovação celular ao longo da vida
Totipotentes células estaminais embrionárias
Multipotentes células estaminais adultas
Estas células estaminais podem diferenciar-se em vários tipos de células:
Musculares, neste processo, respondendo a sinais externos, retiram-se os factores de crescimento, parando a
multiplicação dos MIOBLASTOS, e também as CDK. Com isto, deixa de haver fosforilação da myoD e myf-5,
activando a miogenina que induz à diferenciação.
Sanguíneas, aqui uma célula estaminal pluripotente pode originar vários componentes sanguíneos, dependendo
dos genes transcritos.
Crista neural, células da região embrionária do tubo ventral podem originar osso, cartilagem ou neurónios.
O uso de células estaminais pode ter vários benefícios na terapia humana, nomeadamente na regeneração de
tecidos ou tratamento de doenças degenerativas. As células estaminais com maior ―eficácia‖ em tratamentos são
as totipotentes (embrionárias), e através da sua cultura, poderíamos obter um determinado tipo de células
diferenciadas e transferi-las para o doente a tratar. No entanto, essa clonagem terapêutica implica o uso e
destruição de embriões humanos, bem como a sua clonagem, o que tem inúmeras implicações éticas.

Genoma igual Células diferentes: Quando acontece? Porque acontece? Como acontece?
1. Sinalização Celular parácrina
2. Morfogeno
Substância difusível transportadora de informação, que determina o local e o modo como uma célula indiferenciada
adquirirá uma diferenciação particular.
3. Desenvolvimento inicial
 Desenvolvimento em mosaico – - anfíbios - assimétrico – células criam-se diferentes
o Ovo de Xenopus laevis e Drosophila melanogaster. Notar as assimetrias na localização de
morfogenos

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  Desenvolvimento regulativo – mamíferos - simétrico – criam-se células iguais; influência do ambiente
o Nos mamíferos, as divisões iniciais são simétricas… mas é necessário tomar uma primeira decisão,
de re-metilação. Após as divisões iniciais… Fenómenos celulares indutivos: Gradientes de
morfogenos
o Exemplo de fenómenos indutivos e de gradientes de morfogenos: O crescimento da árvore
traqueo-brônquica (O FGF10 é inibido pela Shh, e cada inibição cria uma ramificação nessa zona)

… A re-metilação não é total e há células desmetiladas na vida adulta… Células estaminais (stem, tronculares)
(desmetiladas)
Vários graus de potencialidade: totipotentes (até mórula), pluripotentes (em vários tecidos mas não todos),
multipotentes (folículo piloso/cell derme). Exemplo: nas células cardíacas não existem células estaminais (na pele
existem).

Envelhecimento celular
O envelhecimento celular é a perda funcional e alterações graduais no fenótipo de uma célula, e foi descoberto
ao nível da investigação dos fibroblastos.
Estas investigações, feitas por Hayflick e Moorehead, permitiram verificar que, ao fim de 50/60 replicações,
os fibroblastos deixavam de ser replicar, morrendo. Este fenómeno tem o nome de SENESCÊNCIA REPLICATIVA
ou limite de Hayflick. O nº de replicações depende não só da ―idade‖ como também do potencial máximo de vida
que cada espécie possui. Esta senescência replicativa é a maior causa do envelhecimento celular.
O fenómeno de senescência replicativa está associado ao encurtamento dos telómeros, as extremidades das
cadeias de DNA. Visto que estas extremidades não conseguem ser replicadas, são cortadas, na ausência da
telomerase. A senescência replicativa representa o fim das divisões e evita a perda de material genético.
A beta-galactosidase é um marcador de envelhecimento celular, sendo detectada em grandes concentrações nas
células senescentes. A lipofuscina também é um marcador, acumulando-se em grandes concentrações na célula
senescente, pois esta não consegue degradá-la. É constituída por fosfolípidos e proteínas, dá à célula um tom
acastanhado e provém de organelos celulares mal digeridos.
Além do papel dos telómeros, os radicais livres de oxigénio também têm influência no envelhecimento celular,
provocando alterações ao nível de:
DNA, onde interferem com as bases azotadas, fazendo surgir mutações que afectam a síntese de proteínas.
Lípidos, essencialmente na membrana, onde a tornam menos fluida, abrindo brechas e deixando-a mais
permeável a todo o tipo de substâncias.
O combate a estes radicais livres de oxigénio pode ser feitos com mecanismos antioxidantes:
Enzimas, a dismutase do anião superóxido, que emparelha com o radical livre, e a catalase e a peroxidase, que
transformam o peróxido (formado pelos radicais e pela dismutase) em água.
Vitaminas, a vitamina C, que cede eletrões para emparelhar com o que está livre no radical, a vitamina E, que é
lipossolúvel e se liga à membrana, impedindo a sua oxidação em cadeia pelos radicais livres.

Aumento da probabilidade de morrer, com o aumento da idade cronológica (Comfort, 1979). Involução/declínio
funcional do organismo com o aumento da idade cronológica.
Causa: perda de células e/ou acumulação de erros moleculares.
Envelhecimento celular em Células NÃO DIFERENCIADAS (in vitro)
o Limite de Hayflick (1961): senescência replicativa; fenótipo senescente diferente;
o Marcadores de senescência celular: SA β-galactosidase
o Alteração da expressão génica: ARF ->p53 -> p21 / p16 -> CDKs -> pRB -> E2F

PROPRIEDADES DAS CÉLULAS SENESCENTES:

1) Paragem da replicação;
2) Resistência à apoptose
3) Fenótipo senescente - morfologia - SA β-galactosidase, SAHFs
4) Alteração da expressão génica - sobreexpressão de p21, p16; APO-J, TGFβ-1, IGFBP3. - subexpressão
de ciclinas e FT em relação com a proliferação

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CAUSAS DA SENESCÊNCIA, REPLICATIVA (limite de Hayflick): Encurtamento de telómeros;
Causas da senescência, mediada por stress:
 Lesão do ADN;
 Stress celular - H2O2, etanol, TGF-β, meios de cultura, UV, Cu, Fe (?)
 Oncogenes RAS
As células senescentes acumulam. Ex: Derme envelhecida com células positivas para a beta-galactosidase.

Envelhecimento celular em Células DIFERENCIADAS (in vivo)

Marcador de envelhecimento celular: Lipofuscina, Carbonilação de proteínas
Os erros moleculares continuados!
Génese de oxidantes – Espécimes reativos de oxigénio (ROS)
Alvos da oxidação - iron-sulfur clusters, sulfhydryl groups, lipids, proteins, DNA

Em suma, consequências do envelhecimento celular

1. Provável acumulação de células senescentes nos tecidos e sua perda posterior. Diminuição da renovação
tecidular.
2. Acumulação progressiva de células contendo erros. Disfunção tecidular. Redução funcional do organismo
(fragilidade/frailty) == Susceptibilidade à doença

Processo inexorável. Pode ser revertido?

Manipulação génica
 Inibidores ligando IGF-1
 Inibidores recetores IGF-1 (DAF2)
 Inibidores cinases
 Inibidores AKT
 Inibidores mTOR (Rapamicin?)
 Restrição calórica (experiências em macacos Rhesus) - Calorie Restriction (CR) Society International -
http://www.crsociety.org/
 Relembrar história da espécie de minhoca + longeva (possuía uma mutação num gene que codifica
utilização de nutrientes pela insulina e IGF-1)

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AULA 27 Cancro
Conjunto de doenças provocadas pela proliferação descontrolada de células anómalas com capacidade de invadir
os tecidos vizinhos
Proliferação/Diferenciação /sobrevivência - Processos celulares devem ser cuidadosamente regulados nos
organismos multicelulares de forma a satisfazer as necessidades do organismo como um todo. Nas células tumorais
esta regulação perde-se! Não respondem de forma apropriada aos sinais que controlam o correto
comportamento/funcionamento das células Crescem e dividem-se de forma descontrolada - podendo invadir
tecidos vizinhos e espalhar-se pelo organismo interferindo com a função dos vários tecidos/órgãos.

Tumores benignos vs tumores malignos

 Tumor (ou neoplasia): resulta da proliferação descontrolada de células
 Tumor benigno: mantém-se confinado à sua localização inicial; não é capaz de invadir o tecido normal vizinho
nem de se espalhar para outros locais do organismo
 Tumor maligno: é capaz de invadir o tecido normal vizinho e de se espalhar pelo organismo através do
sistema circulatório ou linfático, originando metástases
 Metástase: células do tumor primário localizadas num local do organismo diferente do local de origem

Tipos de cancro
Cancro pode ter origem na proliferação descontrolada de qualquer um dos diferentes tipos de células que existem
no organismo Existem mais de 100 tipos de cancro!
 Carcinomas: neoplasias de células epiteliais, constituem aproximadamente 90% dos cancros humanos
 Sarcomas: tumores sólidos com origem em células do tecido conjuntivo (osso, cartilagem) ou tecido
muscular; raros nos humanos
 Leucemias e linfomas: têm origem nas células hematopoiéticas e células do sistema imunitário,
respetivamente; constituem cerca de 8% das neoplasias humanas
Carcinogénese
Processo de formação de um tumor. Os tumores têm origem numa única célula! Demonstrado pela análise da
inativação do cromossoma X Tecidos das fêmeas são mosaicos de células nas quais o cromossoma X inativado varia
(X1 ou X2) Os tumores derivam de uma única célula e por isso todas as células do tumor apresentam o mesmo
cromossoma X inativado – tumor clonality. Não implica que a célula que origina o tumor apresente à partida todas
as características de uma célula tumoral
Desenvolvimento do cancro ocorre em várias etapas e envolve a mutação e seleção de células que vão adquirindo
maior capacidade proliferativa, de sobrevivência, invasiva e de migração
 Iniciação – mutação numa célula leva à sua proliferação anómala – formação de um grupo de células clones
 Progressão – dá-se assim que ocorrem mutações adicionais nas células tumorais (estas células apresentam
instabilidade genética e por isso maior probabilidade de sofrer mutações); algumas destas mutações
podem conferir vantagem seletiva às células que se multiplicam mais rapidamente, uma vez que estas
passam a ser dominantes no tumor. Este processo de mutação/seleção repete-se várias vezes, aumentando
a malignidade do tumor: células proliferam mais e estão mais alteradas
Exemplo: carcinoma do cólon Desenvolvimento do cancro
1- Proliferação aumentada das células epiteliais que revestem o cólon
2- 2- Formação de um adenoma ou pólipo a partir de uma das células pertencentes à população de célula
proliferativas
3- Crescimento dos adenomas através de ciclos sucessivos de seleção clonal (para além do aumento de
tamanho, adquirem maior potencial proliferativo)
4- 4- A progressão dos adenomas (benignos) para carcinomas (malignos) dá-se assim que as células tumorais
adquirem capacidades invasivas e atravessam a lamina basal para invadir o tecido conjuntivo subjacente
5- As células tumorais continuam a proliferar e migram através do tecido conjuntivo atingindo os vasos
sanguíneos e linfáticos, sendo então capazes de metastizar outros locais do organismo
5-
Propriedades das células tumorais
 Autossuficiência em sinais de crescimento - Células tumorais estimulam a sua própria proliferação –
estimulação autócrina do crescimento – independentes da estimulação por fatores de crescimento
produzidos por células não tumorais
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  Insensibilidade a sinais de inibição da proliferação - Inibição dependente de contacto deixa de existir
nas células tumorais em cultura
 Capacidade de invasão dos tecidos e metástase - Células tumorais são menos aderentes que células
normais Exemplo: perda de E-caderina (principal molécula de adesão das células epiteliais) encontra-se
frequentemente envolvida no desenvolvimento de carcinomas Células tumorais segregam proteases,
capazes de digerir as proteínas da matriz extracelular Ex: secreção de proteases que digerem o colagénio
é determinante para a capacidade dos carcinomas atravessarem a lâmina basal e invadirem o tecido
conjuntivo subjacente. Maior capacidade de invasão e metastização.
 Potencial de replicação ilimitado - Células tumorais não entram em senescência uma vez que expressam a
enzima telomerase e por isso conseguem dividir-se um número ilimitado de vezes sem ocorrer
encurtamento dos seus telómeros
 Capacidade de indução de angiogénese - Células tumorais segregam fatores de crescimento capazes de
induzir a formação de novos vasos sanguíneos, que são cruciais para fornecer oxigénio e nutrientes ao
tumor de forma a este conseguir continuar a crescer para além de um determinado tamanho Os fatores
de crescimento (ex. VEGF) segregam pelas células tumorais induzem a proliferação de células endoteliais
das paredes dos capilares existentes na proximidade, de forma a formarem-se novos capilares
 Evasão à apoptose - Células tumorais são resistentes à apoptose e por isso exibem maior longevidade. A
evasão à morte celular após a ocorrência de danos irreversíveis no DNA contribui para a resistência destes
tumores a tratamentos que funcionam por indução de danos no DNA

CAUSAS DO CANCRO
Carcinogéneos – substâncias/compostos capazes de provocar cancro, a maioria através da indução de mutações
no DNA
 Radiação UV – cancro da pele
 Benzo(α)pireno e dimetil-nitrosamina do fumo de tabaco – cancro do pulmão
 aflatoxina – carcinogéneo hepático produzido por alguns fungos que contaminam alimentos mal
acondicionados

Carcinogéneos promotores tumorais – substâncias capazes de induzir cancro através da promoção da

proliferação celular e não pela indução de mutações ao nível do DNA; Inevitavelmente levam ao aumento da
frequência de mutações aquando das sucessivas fases de replicação do DNA
 Estrogénios – cancro do endométrio (risco pode ser minimizado pela toma de progesterona que contraria
o efeito dos estrogénios)
 Helicobacter pilori – cancro do estômago
 Vírus da Hepatite B e C – cancro do fígado Vírus do papiloma humano (HPV) – cancro do cólo do útero

Oncovírus - Vírus capazes de causar cancro

 Hepatite B e C - Principais causas de cancro no fígado. Infecta especificamente hepatócitos e podem
originar infeções crónicas que se encontram associadas com um risco elevado de desenvolvimento de
cancro:
 Hepatite B (DNA vírus): 10 a 20% dos infetados crónicos desenvolvem cancro do fígado.
Capacidade de transformação do HBV mediado pela proteína HBx, que inibe a p53 (supressor
tumoral) e induz proliferação
 Hepatite C (RNA vírus): 5% dos infetados crónicos desenvolvem cancro do fígado. Pensa-se que a
indução da proliferação celular pela infeção crónica esteja na origem do cancro
 Pequenos vírus de DNA: Incluem várias famílias de vírus como os poliomavirus e os papilomavirus.
Poliomavirus de células Merkel – capaz de provocar um carcinoma da pele raro (Merkel cell carcinoma);
Vírus do papiloma humano (HPV) capaz de provocar cancro do cólo do útero
 Herpes vírus associado ao sarcoma de Kaposi (tumor maligno do endotélio vascular – várias formas de
manifestação, na pele, na boca, no tracto gastrointestinal ou respiratório) Vários genes do herpesvírus
são expressos nas células destes tumores – segregam várias citocinas e fatores de crescimento que
estimulam o desenvolvimento tumoral
 Vírus de Epstein-Barr (associado ao aparecimento do linfoma de Burkitt e a linfomas de células B em
pacientes com HIV ou outro tipo de imunossupressão) Capaz de transformar linfócitos B in vitro:
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 proteína LMP1 mimetiza um recetor da superfície celular dos linfócitos B e é capaz de ativar vias de
sinalização de promovem a proliferação celular e inibem a apoptose
 Retrovírus HTLV-I (Human T-cell lymphotropic virus type I) Causa leucemia de células T em adultos
(comum em regiões do Japão, Caraíbas e África) HTLV-I é capaz de transformar linfócitos T in vitro
pela expressão do gene vírico tax que codifica uma proteína reguladora que afeta a expressão de vários
genes envolvidos no controlo do crescimento celular
 Retrovírus HIV (Human immunodeficiency virus) não leva ao aparecimento de cancro pela transformação
directa de uma célula normal numa célula tumoral, mas aumenta a predisposição dos portadores para
desenvolverem doenças malignas como linfomas ou sarcomas de Kaposi

Oncogenes
Genes com capacidade de induzir a formação de tumores
Primeira evidência da existência de oncogenes celulares nos tumores humanos não induzidos por vírus:
Experiências de transferência génica (Weinberg e Cooper, 1981)
Têm origem em proto-oncogenes que sofrem modificações que levam à alteração da sua expressão, estrutura ou
função
Na sua maioria, codificam para proteinas envolvidas em vias de sinalização que controlam a proliferação celular
Primeiro oncogene humano identificado foi o gene homólogo do oncogene vírico rasH existente no vírus do
sarcoma de Harvey
Três membros da família ras no humano: rasH, rasK e rasN
Envolvidos em 25% dos casos de cancro humanos (50% dos casos de carcinoma do cólon e 25% dos casos de
cancro do pulmão)
Oncogene ras Os genes ras codificam proteínas de ligação a GDP/GTP cruciais para a transmissão intracelular
de sinais mitogénicos após ativação de receptores de fatores de crescimento
Mutações que originam oncogenes ras resultam na produção de proteínas Ras que se mantêm constitutivamente
ativas (ligadas a GTP) Ras/ GTP Proliferação celular descontrolada
Oncogene c-myc Ativação de oncogene por translocação cromossómica [t(8;14)] – c-myc – existente nos
linfomas de Burkitt
Expressão descontrolada do oncogene c-myc → sobreprodução de um fator de transcrição que leva à indução da
proliferação celular

Genes supressores tumorais Genes que codificam P que regulam negativamente a proliferação celular ou
sobrevivência Inativação de genes supressores tumorais é outro tipo de alteração genética capaz de
desencadear o desenvolvimento de tumores
Como foram identificados? Experiências de hibridização de células somáticas (Henry Harris 1969). Conclusão:
célula normal possui genes capazes de inibir ou suprimir o desenvolvimento tumoral. P53, Rb, etc.

Gene supressor tumoral p53

Inativação do p53 encontra-se associada a diversos cancros como leucemias, linfomas, sarcomas, tumores
cerebrais e carcinomas. Cerca de 50% dos cancros apresenta mutações na p53 Proteína p53 regula: - progressão
do ciclo celular - apoptose
A sua ausência/inativação faz com que as células não parem o ciclo celular ou sofram apoptose após a exposição a
agentes causadores de danos no DNA Proliferação celular descontrolada

Abordagens moleculares para o tratamento do cancro

Prevenção e deteção precoce - A abordagem mais eficaz é através da prevenção do desenvolvimento da doença
Deteção precoce de lesões pré-malignas que são ainda tratáveis através da remoção cirúrgica (exemplo:
carcinoma do cólon)
Taxas de sobrevivência em pacientes com carcinoma do cólon Deteção precoce do cancro pode ser determinante
para o desfecho da doença
Abordagem molecular para a identificação de indivíduos com maior susceptibilidade para desenvolver cancro com
base na hereditariedade
Realização de testes genéticos para deteção de mutações em genes supressores tumorais ou oncogenes

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Ex: Mutação no gene supressor tumoral BRCA1: ~ 50% a 65% das mulheres com esta mutação irão desenvolver
cancro da mama até aos 70 anos 35% a 46% desenvolverão cancro do ovário até aos 70 anos Mutação no gene
supressor tumoral BRCA2: ~ 40% to 57% das mulheres com esta mutação irão desenvolver cancro da mama até
aos 70 anos 13% to 23% desenvolverão cancro do ovário até aos 70 anos

Tratamento
Maioria dos fármacos usualmente utilizados para o tratamento de cancro causam danos no DNA ou inibem a
replicação de DNA
São tóxicos quer para as células tumorais como para as células normais (principalmente as que se dividem com
frequência) – responsável pelos efeitos secundários e baixa eficiência dos tratamentos
Possível Alternativa → utilizar fármacos anti-angiogénicos que não vão atuar diretamente nas células tumorais,
mas vão evitar a formação de novos vasos (bloqueio da proliferação das células endoteliais) e por isso impedir a
chegada de oxigénio e nutrientes ao tumor de forma a limitar o seu crescimento
Inibidores da angiogénese - Moléculas inibidoras do recetor do VEGF (vascular endothelial growth factor)
Terapias direcionadas para os oncogenes - Oncogenes não são exclusivos das células tumorais (proto-oncogenes
desempenham funções importantes nas células normais), por isso devem ser usadas com cuidado

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AULA 28 Apoptose

A apoptose é a morte celular programada e é importante na medida em que regula a proliferação das células,
mantendo constante o seu nº em cada tecido, evitando doenças como Parkinson.
É um processo discreto, ocorre em células isoladas e é lento devido a reações interiores de degradação. Um
exemplo é a morte durante o processo embrionário das células interdigitais. Outros exemplos: morte de células
infetadas com vírus, células mutadas, células em nº excessivo ou desnecessárias, como os gâmetas femininos.
Distingue-se da necrose pois esta é agressiva, afetando também as células vizinhas (visível fenotipicamente), e
é acompanhada de lise celular associado a processos inflamatórios.
É regulada por 2 tipos de moléculas:
Caspases, são proteínas que contêm cisteína, e que quebram os seus substratos em locais que sucedem o ácido
aspártico. São as últimas efectoras da apoptose, ativando as DNAases, que quebram o DNA, as laminas nucleares
e as proteínas do citoesqueleto. As caspases efectoras são ativadas pelas caspases iniciadoras, e são inibidas pelas
IAP,’s.
Família bcl-2, uma família de proteínas que tem função dupla: inibir a caspase e a apoptose, ou ativar a caspase,
induzindo a apoptose. Tem papel importante na mitocôndria, onde induz a libertação do citocromo c, que forma
com a caspase-9 o apoptossoma, que ativa as caspases efectoras.

A apoptose pode ocorrer por via:

Intrínseca, que se inicia na mitocôndria, com a libertação do citocromo c. Sinais intracelulares de morte
Dimerização de membros da família bcl-2 Libertação de citocromo c Agregação de Apaf-1 e pro-Caspase-9
Formação do Apoptossoma Activação da pro-caspase 9 Activação da cascata das caspases até à caspase 3 Sinais
morfológicos da apoptose
Extrínseca, que é despertada por recetores da superfície celular. 1. Estabelecimento da ligação FasL/FasR 2.
Adaptação de FADD 3. Agregação de pro-Caspase 8 Activação da pro-caspase 8 Activação da cascata das caspases
até à caspase 3 Sinais morfológicos da apoptose

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