PROTEÍNAS: REAÇÕES DE CARACTERIZAÇÃO E PRECIPITAÇÃO

Objetivos

Evidenciar a presença de proteínas por meio de reações de coloração e verificar a precipitação de

proteínas com e sem desnaturação.

Relação teórico-prática

Estrutura de proteínas.

Fundamento

REAÇÕES DE CARACTERIZAÇÃO

As proteínas reagem com uma variedade de compostos, formando produtos coloridos. A maioria das
reações de caracterização de proteínas ou aminoácidos se deve à presença de ligações ou grupos funcionais
de aminoácidos encontrados nas proteínas, enquanto outras reações, chamadas de gerais, caracterizam
grupamentos comuns a todas as proteínas. Entre as reações consideradas gerais estão a reação da ninhidrina e
a reação do biureto, as quais caracterizam grupos amino e ligações peptídicas, respectivamente.

Reação da ninhidrina

Os grupos α-amino de aminoácidos livres, grupos aminos terminais de peptídeos e proteínas, e grupo
ε-amino da lisina reagem com a ninhidrina formando um produto de cor violeta, quando a solução é aquecida
(Figura 1). A intensidade da cor é proporcional à concentração de aminoácidos. Por esse motivo a técnica é
utilizada para sua determinação quantitativa. Os iminoácidos (Prolina e Hidroxiprolina) formam produtos
amarelos.

Aminoácido Ninhidrina Produto de cor violeta

Figura 1. Reação da ninhidrina com aminoácido

Reação do Biureto

A reação do biureto se deve às ligações peptídicas, sendo positiva para peptídeos com mais de dois
aminoácidos e proteínas. As proteínas ou peptídeos, quando tratados com uma solução de sulfato em meio
alcalino, desenvolvem uma coloração lilás característica. A cor é atribuída a formação de um complexo de
coordenação entre o Cu+2 e átomos de nitrogênio (provenientes de ligações peptídicas) de cadeias adjacentes
(Figura 2). Os dipeptídeos dão reação negativa por apresentarem apenas uma ligação peptídica.

Figura 2. Complexo formado pelo Cu+2 com os nitrogênios de ligações

peptídicas

O nome da reação é derivado do composto biureto (Figura 3), o qual também dá reação positiva neste teste.
Figura 3. Estrutura do biureto
 A solução de sulfato de cobre em meio alcalino que é utilizada na reação do biureto é conhecida
como reativo do biureto.

Reações de Precipitação

A solubilidade das proteínas é muito variável e depende da distribuição e da proporção dos grupos
polares (hidrofílicos) e apolares (hidrofóbicos) na molécula. Fatores como o pH do meio, a concentração de
sais e a constante dielétrica do solvente também afetam a solubilidade.
Muitas proteínas são solúveis em água ou soluções salinas. Uma vez que as proteínas podem possuir
muitos grupos carregados positivamente e negativamente provenientes das cadeias laterais dos aminoácidos,
as moléculas podem interagir umas com as outras, com pequenos íons de cargas opostas e com a água.
Assim, ocorrem interações proteína-proteína, proteína-água e proteína-pequenos íons. Se a interação
proteína-proteína é grande e a interação proteína-água é pequena, a proteína tenderá a ser insolúvel. Qualquer
condição que altere estas interações poderá afetar a solubilidade das proteínas.
Em geral, a desnaturação diminui a solubilidade das proteínas. A redução da solubilidade pode ser
explicada pela exposição de radicais hidrofóbicos e outros que prejudiquem as interações proteína-água e
favoreçam as interações proteína-proteína.
Existem várias condições desnaturantes, tais como temperaturas elevadas, pHs extremos, sais de
metais pesados e solventes orgânicos.
Temperaturas elevadas aumentam a agitação térmica, afetando as interações que estabilizam a
estrutura tridimensional das proteínas (pontes de hidrogênio, interações hidrofóbicas).
Condições de pHs extremos, por causa da adição de ácidos ou bases fortes, alteram o estado de
ionização dos aminoácidos afetando as interações iônicas que estabilizam a estrutura tridimensional das
proteínas. Além disto, as bases provenientes de certos ácidos fortes podem interagir com as cargas positivas
presentes na proteína, formando sais que resultam na desnaturação e precipitação.
A precipitação de proteínas pela adição de sais de metais pesados é atribuída a combinação do cátion
metálico (Pb+2, Hg+2, etc.) com cargas negativas que podem estar presentes na proteína, resultando na
formação de sais insolúveis (proteinato de chumbo, proteinato de mercúrio, etc.) a precipitação é favorecida
quando o pH está do lado alcalino do ponto isoelétrico da proteína graças ao aumento do número de cargas
negativas na proteína.
Solventes orgânicos também podem interferir nas interações que estabilizam a estrutura
tridimensional das proteínas (pontes de hidrogênio e interações hidrofóbicas), promovendo desnaturação e
precipitação. Entretanto, neste caso há um fator adicional envolvido no mecanismo de precipitação, a
constante dielétrica do solvente.
A força das interações eletrostáticas (F) depende da magnitude das cargas envolvidas (q 1, q2), da
distância entre os grupos carregados (r) e de uma propriedade física do solvente conhecida como constante
dielétrica (ε). A relação entre a força de atração eletrostática e os parâmetros mencionados é dada pela lei de
Coulomb:
F=q1 x q2/ ε x r2
A constante dielétrica é uma medida derivada do momento dipolar da molécula e pode ser
determinada por medidas de capacitância. Em termos simples, a constante dielétrica é uma medida da
assimetria de carga intrínseca ou induzida em um campo elétrico. A água apresenta uma constante dielétrica
elevada, ε=80, atenuando as interações iônicas. Assim a força de atração entre moléculas protéicas contendo
radicais com cargas opostas é baixa, fazendo que predominem interações proteína-água em vez de interações
proteína-proteína. Os solventes orgânicos apresentam constantes dielétricas inferiores à da água (por
exemplo, εbenzeno=2,3; εetanol=24,0; εclorofórmio=4,8). Consequentemente, as interações iônicas nestes solventes
são muito mais fortes do que em água. Portanto, a adição de um solvente orgânico a uma solução aquosa de
proteína pode conduzir à precipitação, por favorecer interações eletrostáticas proteína-proteína.
Em baixas temperaturas (0 C ou menos), os solventes orgânicos podem promover precipitação
somente por efeito da constante dielétrica. Nestas condições, as proteínas podem ser precipitadas sem
desnaturação.
As proteínas também podem ser precipitadas sem sofrer desnaturação por variação do pH e por
alterações da força iônica do meio.
Muitas proteínas podem ser precipitadas ao se variar o pH da solução até o seu ponto isoelétrico. O
ponto isoelétrico de uma proteína é definido como o pH no qual a carga liquida de uma molécula é zero.
Neste pH, a solubilidade das proteínas em solução aquosa é mínima, pois a presença de um número
equivalente de cargas positivas e negativas na superfície da molécula aumenta a atração iônica, minimizando
a repulsão eletrostática entre as cadeias.
A solubilidade das proteínas também pode ser alterada pela presença de sais. A capacidade dos sais
neutros de influenciar a solubilidade de muitas proteínas é uma função da força iônica (I). A força iônica de
uma solução salina é uma função tanto da concentração como da valência dos cátions e ânions que formam o
sal, sendo definida como:
I = ½ Mi x Zi2
Onde Mi é a molaridade do íon i, e Zi é a sua valência. A soma é feita para todos os íons. Para NaCl,
por exemplo, ZNa+=1 e ZCl- = -1, e uma vez que MNa+= MCl-, para uma solução de NaCl a força iônica é igual
a molaridade do sal, mas isto não ocorre quando íons divalentes ou de valência maior estão envolvidos. Estes
íons multivalentes conferem maior contribuição individual à atmosfera iônica do que os íons monovalentes,
uma vez que o quadrado da carga iônica é incluído no cálculo da força iônica e, neste caso, I > M.
Em baixa força iônica, os sais aumentam a solubilidade de muitas proteínas, um fenômeno
denominado “salting-in”. O efeito é atribuído a interação da proteína com o sal, causando diminuição na
interação proteína-proteína.
Um efeito oposto na solubilidade das proteínas é obtido na presença de um sal em elevada força
iônica. As proteínas podem ser precipitadas sem desnaturação por meio da adição de um sal em alta força
iônica. O fenômeno é conhecido como “salting out” e, embora envolva vários aspectos físico-químicos,
pode-se considerar que a adição do sal remove a água de hidratação das moléculas, resultando na
predominância de interações proteína-proteína.
Observa-se uma grande diferença entre os diferentes sais quanto ao seu efeito na solubilidade das
proteínas. Sais tri ou divalentes são mais eficientes para promover a precipitação por “salting out”, sendo o
(NH4)2SO4 o mais utilizado, por causa da sua alta solubilidade, permitindo obter soluções de elevada força
iônica. A força iônica requerida para a precipitação varia para as diferentes proteínas. Assim, uma mistura de
proteínas pode ser fracionada pela adição de concentrações crescentes de (NH4)2SO4.

Técnica

I- Reações de coloração

1- Reação da ninhidrina

Tubo 1: 2 ml de ninhidrina + 5 gotas da proteína 10%, banho-maria fervente por 5 min. Anotar o
resultado.

2- Reação do Biureto

Tubo 2: 1 ml de proteína 10% + 1 ml do reativo do biureto. Anotar o resultado.

Tubo 3: 1 ml água destilada + 1 ml do reativo do biureto. Anotar o resultado.

II - Reações de precipitação

1- Temperatura elevada
Tubo 4: 2 ml proteína 10%, aquecer em banho-maria fervente por 3 minutos. Anotar o resultado.

2- Ácido Forte
Tubo 5: 1 ml proteína 10% + 1 ml do ácido tricloroacético 10% (TCA). Anotar o resultado.

3- Sal de metal pesado

Tubo 6: 1 ml proteína 10% + 1 ml do acetato de chumbo 5%. Anotar o resultado.

4- Solvente orgânico
Tubo 7: 1 ml proteína 10% + 3 ml álcool etílico. Anotar o resultado.

III - Efeito da adição de sais sobre a solubilidade da proteína

 Tubo 8: 2 ml da solução contendo precipitado esbranquiçado de proteína + NaCl 1 mol/l gota a gota,
até o precipitado redissolver.

Tubo 9: 2 ml da solução anterior + aproximadamente 4 ml de solução saturada de sulfato de amônio.

Observar. Adicionar 4 a 6 ml de água destilada e observar o efeito.

EXERCÍCIOS

1- Em que se fundamenta a reação da ninhidrina e que classes de substancias reagem positivamente?

2- Em que se fundamenta a reação do biureto e que grupos nas proteínas são responsáveis por esta
reação?
3- Qual é a importância da reação do biureto?
4- Qual a importância das reações de precipitação de proteínas por sais de metais pesados? Explique o
mecanismo da precipitação.
5- Explique os mecanismos que levam uma proteína a dissolver-se em um pequeno aumento na força
iônica da solução e os mecanismos que levam uma proteína a precipitar por um grande aumento na
força iônica da solução.
6- Que mudanças ocorrem com uma proteína quando em contato com o etanol?
7- As solubilidades de duas proteínas em função da concentração de sulfato de amônio estão mostradas
no diagrama abaixo. Como esta observação pode ser usada para separar as proteínas A e B?

Concentração de sulfato de amônio (mol/l)

Informações complementares

Lista de reativos:

1. Solução de proteínas 10% (v/v)

2. Solução de ninhidrina 0,1% (p/v)
3. Reativo do biureto
4. Acido tricloroacético (TCA) 10% (p/v)
5. Acetato de chumbo 5% (p/v)
6. Alcool etílico absoluto
7. Solução contendo proteína precipitada
8. Cloreto de sódio 1 mol/l
9. Solução saturada de sulfato de amônio 75% (p/v)

Preparo dos reativos:

1- Solução de proteínas
Preparar uma solução de clara de ovo a 10% (v/v) em solução salina (NaCl 0,9 g/100ml) ou tampão
fosfato 10 mmol/l, pH 7,0.

2- Solução de ninhidrina
Dissolver 100 mg de ninhidrina em 100 ml de tampão fosfato 0,01 mol/l, pH 7,0. Conservar em
frasco escuro e em geladeira.

3- Solução contendo proteína precipitada

Adicionar água destilada a 15 ml de clara de ovo pura até a formação de precipitado esbranquiçado.