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Influência da capacitação espermática e

fluidos do trato genital masculino e


feminino sobre a habilidade de ligação à
zona pelúcida de espermatozóides
bovinos

Topper, E.K.; Killian, G.J.; Way, A.; Engel, B.; Woelders, H.

Journal of Reproduction and Fertility, 115: 175-183, 1999


Introdução
• Após a IA, os espermatozóides de mamíferos permanecem algumas horas no
trato reprodutivo feminino antes de adquirirem capacidade fecundante
através de um processo denominado capacitação.

• Este processo envolve uma série de alterações celulares e moleculares, que


incluem mudanças na concentração iônica intracelular, ativação do sistema
AMP-adenilciclase e alterações na membrana plasmática.

• O oviduto fornece o ambiente ideal para a capacitação espermática. Em


bovinos, o istmo funciona como reservatório espermático, e tem sido
indicado como o local onde se dá a capacitação.

• GAGs e a proteína associada ao estro, secretada no trato genital da vaca,


são capazes de promover a capacitação in vitro.
Introdução
• Os efeitos das secreções do oviduto sobre a função espermática variam
conforme a região e o estágio do ciclo estral.

• A capacitação in vitro, utilizando a heparina, facilita a indução da reação


acrossômica (RA) por proteínas solubilizadas da zona pelúcida (ZP) ou
lisofosfatidilcolina (LPC).

• Apesar da capacitação induzida por heparina ou secreções do oviduto serem


semelhantes, ambas envolvendo aumentos de Ca2+ e pH, diferenças têm sido
demonstradas.

• Espermatozóides epididimais bovinos já possuem habilidade fertilizante.


Contudo, o fluido das glândulas acessórias (AGF) aumenta sua fertilidade.

• Entretanto, ainda não se demonstrou se a habilidade espermática de se ligar


à ZP é afetada pela capacitação.
Objetivo

• O objetivo desse trabalho foi determinar se a habilidade

de espermatozóides bovinos em se ligar à zona pelúcida é

alterada durante a capacitação in vitro, e se esta

habilidade é influenciada pelo fluido das glândulas sexuais

acessórias.
Materiais e Métodos
• Abordagem Experimental

– A habilidade de ligação à ZP foi determinado pelo cálculo do número médio

de espermatozóides ligados.

– Sêmen ejaculado de 3 touros foi agrupado, e alíquotas foram incubadas em

diferentes meios para verificar se a habilidade de ligação à ZP é

influenciada pela capacitação in vitro:

• 1) meio de Tyrode modificado (MTM)

• 2) MTM + heparina

• 3) MTM + fluido da ampola do oviduto em fase não luteal (50%)

• 4) MTM + fluido do istmo do oviduto em fase não luteal (50%)


Materiais e Métodos
• Abordagem Experimental

– Habilidade de ligação à ZP é influenciada pela capacitação in vitro:

• Às 0 e 4 horas de incubação, a habilidade de ligação à ZP foi determinada e o

ensaio com LPC foi realizado para se avaliar a capacitação.

– A habilidade de ligação à ZP de espermatozóides da cauda do epidídimo foi

comparada com espermatozóides da mesma coleta expostos ao fluido das

glândulas acessórias (AGF) para determinar se o AGF afeta a habilidade

de ligação.

• Às 0 e 4 horas de incubação em meio contendo heparina, avaliações foram

feitas para se avaliar a capacitação e habilidade de ligação à ZP.


Materiais e Métodos
• Isolamento de Oócitos Bovinos e Zonas Pelúcidas

– Ovários de novilhas (26 sem. de idade) foram coletados após o abate e armazenados

a -80°C. Os oócitos foram isolados (Dunbar et al., 1980) e homogeneizados.

– Fragmentos das ZP foram separados dos componentes celulares, coletando-os em

filtros (45 mm). Os fragmentos foram lavados e re-suspensos em bicarbonato de

amônio e SDS, e incubados por 30 min.

– A solução foi dialisada contra uréia (7 mol/L) e em seguida contra água destilada

para remover o SDS. Esta preparação protéica da ZP foi liofilisada e armazenada a

4°C.
Materiais e Métodos
• Biotinilação das Proteínas Solubilizadas da ZP

– As proteínas solubilizadas da ZP foram biotiniladas utilizando-se BcapNHS (0,2

mg/mg de proteína). Após 4 horas de incubação à temperatura ambiente, a reação

foi paralisada com cloreto de amônio e a biotina não ligada foi removida por lavagem

com PBS.

– A concentração protéica foi determinada (Bradford, 1976) utilizando albumina como

padrão.

– As proteínas biotiniladas foram armazenadas a -80°C.


Materiais e Métodos
• Coleta de Fluido do Oviduto

– O oviduto de vacas foi canulado através de laparotomia (Kavanaugh et al., 1992),

colocando-se cateteres na ampola e istmo, que foram exteriorizados por incisões no

flanco e ligados a frascos estéreis.

– Os frascos foram mantidos no interior de um saco, preso ao flanco dos animais com

fita adesiva. Os frascos foram trocados diariamente, e o fluido armazenado em

nitrogênio líquido.

– As concentrações séricas de progesterona foram avaliadas diariamente e utilizadas

para definir o estágio do ciclo (fase não luteal: P4 ≤ 1,5 ng/ml).

– As amostras do istmo e ampola foram agrupadas para determinação da concentração

protéica.
Materiais e Métodos
• Coleta de Espermatozóides Epididimais e AGF

– Os ductos deferentes de 2 touros foram canulados (Henault et al., 1995) para

obtenção de espermatozóides da cauda do epidídimo.

– Os espermatozóides foram coletados nos catéteres após a ejaculação, e o AGF

colhido em vagina artificial. O AGF só foi utilizado após não conter

espermatozóides.

– O AGF dos touros foi agrupado e centrifugado (2400 g; 15 min.).


Materiais e Métodos
• Preparação dos Espermatozóides e Capacitação Espermática
– Sêmen (1 ml) coletado de 3 touros adultos, por vagina artificial, foi
agrupado e os espermatozóides foram lavados (500 g; 10 min.) em MTM.

– Para indução da capacitação espermática, os espermatozóides foram


incubados por 4 horas (50 x 106/ml; 39°C; 5% CO2) em:
• 1) MTM + BSA

• 2) MTM + heparina (MTMH)

• 3) MTM + fluido da ampola (ANL)

• 4) MTM + fluido do istmo (INL)

– Espermatozóides da cauda do epidídimo de 2 touros foram coletados e re-


suspensos em MTM ou AGF (1:5), incubados por 15 min. Após a incubação,
os espermatozóides foram lavados em MTM e re-suspensos (50 x 106/ml)
em MTM ou MTMH.
Materiais e Métodos
• Ensaio com Lisofosfatidilcolina (LPC)

– Após 0 e 4 h de incubação, LPC foi utilizado para induzir a reação acrossômica dos

espermatozóides capacitados.

– Os espermatozóides foram corados com eosina-anilina azul, e a percentagem de

espermatozóides com acrossoma reagido foi avaliada por microscopia de contraste

de interferência diferencial.

• Ligação das proteínas biotiniladas aos espermatozóides


– À 0 e 4 h de incubação, a suspensão espermática foi incubada com as proteínas
biotiniladas. Os espermatozóides foram lavados em MTM e fixados em
glutaraldeído.

– A ligação das proteínas à superfície espermática foi visualizada segundo Yurewicz


et al. (1993).

– 100 espermatozóides de cada tratamento foram observados para ligação às


proteínas da ZP e status do acrossoma.
Materiais e Métodos
• Ensaio de ligação espermatozóides:oócitos

– Os ensaios foram conduzidos conforme Way et al. (1997).

– Os oócitos foram distribuídos em gotas de MTM (10/gota) e incubados

com 10.000 espermatozóides, incubados por 15 min.

– Em seguida, foram lavados em MTM e fixados em glutaraldeído.

– Os oócitos foram postos em uma lâmina e lamínula, e pressionados até

rompimento da ZP.

– Fragmentos das ZP foram colhidos e lavados com PBS para remover restos

dos oócitos. Os espermatozóides foram corados com Hoechst 33342 para

determinação do número de espermatozóides ligados.


Resultados
• A incubação de espermatozóides bovinos por 4 horas em MTMH, ANL ou INL resultou
em um número significativamente maior de espermatozóides ligados à ZP. À 0 horas, não
houve diferenças entre os grupos.

Figura 1: Efeito do tratamento para

capacitação in vitro pela heparina ou fluido

do oviduto sobre o número médio de

espermatozóides ligados por oócito.

( ■ = 0h; □ = 4h).
Resultados
• Após 4 h de incubação espermática em MTMH, ANL ou INL, o percentual de
espermatozóides com proteínas da ZP ligadas à crista apical ou no acrossoma inteiro foi
significativamente maior que à 0 h.

Figura 2: Efeito do tratamento para

capacitação in vitro pela heparina ou fluido

do oviduto sobre a percentagem de

espermatozóides ejaculados ligados às

proteínas da ZP.

( ■ = 0h; □ = 4h).
Resultados
• O percentual de espermatozóides com reação acrossômica após exposição ao LPC foi
significativamente maior após 4 h de incubação em MTMH e INL, comparado à 0 h.

Figura 3: Efeito do tratamento para

capacitação in vitro pela heparina ou fluido

do oviduto sobre a percentagem de

espermatozóides com reação acrossômica

após exposição ao LPC.

( ■ = 0h; □ = 4h).
Resultados
• A exposição dos espermatozóides epididimais ao AGF aumentou o número médio de
espermatozóides ligados à ZP. Este aumento pôde ser detectado imediatamente após a
exposição, à 0 h. Além disso, após 4 h de incubação em MTMH, apenas o grupo exposto
ao AGF aumentou o número de células ligadas.

Figura 4: Efeito do fluido das glândulas

acessórias (AGF) sobre o número médio de

espermatozóides epididimais ligados por

oócito no ensaio de ligação. CS =

espermatozóides epididimais. CSA =

espermatozóides expostos ao AGF.

( ■ = 0h; □ = 4h).
Resultados
• A adição de AGF aos espermatozóides epididimais influenciou a percentagem de
espermatozóides ligados às proteínas solubilizadas da ZP. Imediatamente após a
exposição ao AGF (0 h) já houve aumento significativo no número de células ligadas.

Figura 5: Efeito do fluido das glândulas

acessórias (AGF) sobre a percentagem de

espermatozóides epididimais ligados à

proteínas da ZP. CS = espermatozóides

epididimais. CSA = espermatozóides expostos

ao AGF.

( ■ = 0h; □ = 4h).
Discussão
• Evidências bioquímicas e estruturais mostram que a superfície espermática é

continuamente modificada durante a capacitação.

• Uma ferramenta bastante útil para monitorar essas alterações é o uso de lectinas para

mapear a distribuição de glicoproteínas e glicolipídeos.

• Entretanto, a implicação fisiológica exata dessas alterações não está completamente

elucidada. O uso de proteínas biotiniladas permitiu a monitoração das alterações na

superfície espermática durante a capacitação in vitro que podem estar relacionadas à

habilidade espermática de ligação.

• Os resultados mostram (fig. 1) que a capacitação in vitro induzida por heparina ou fluido

do oviduto aumentou o número de espermatozóides ligados à ZP. Esta habilidade é

influenciada pelo AGF. Esta maior habilidade em se ligar à ZP após a capacitação se deve

à maior capacidade destas células em ligar-se às proteínas solubilizadas.


Discussão
• O uso destas proteínas permitiu a visualização e localização dos sítios de ligação na
superfície espermática, e a avaliação da condição acrossômica das células com maior
habilidade de ligação. Estas células, em sua maioria, apresentavam acrossoma intacto, de
modo que os sítios de ligação para as proteínas da ZP se localizam na superfície do
acrossoma intacto.

• Entre os mecanismos através dos quais a capacitação aumenta a habilidade de ligação à


ZP, podemos citar:
– A capacitação induzida por heparina reduz a proporção de ácido siálico na superfície
espermática, levando a redução na carga líquida negativa da membrana. Uma vez que a ligação à
ZP envolve interações hidrofóbicas e iônicas, esta redução pode facilitar a ligação das proteínas
da ZP aos espermatozóides.

– Além disso, alterações na fluidez e permeabilidade da membrana espermática que ocorrem


durante a capacitação, leva a re-organização de lipídeos e proteínas. Estas alterações são
mediadas por GAGs presentes no fluido do oviduto, através da interação com proteínas do
plasma seminal denominadas (BSPs).
Conclusões
• Os resultados do ensaio de ligação a oócitos sugerem que os efeitos do fluido do oviduto

sobre a função espermática variam conforme a região de origem. A exposição ao fluido

do istmo aumentou a habilidade de ligação à ZP, em comparação com o fluido da ampola,

apoiando o conceito de que o istmo funcione como reserva para uma população de

espermatozóides capacitados no local de fertilização.

• Além disso, o AGF é importante no aumento da habilidade de ligação à ZP de

espermatozóides durante a capacitação.

• O estímulo direto da adição do AGF sobre a capacidade de ligação à ZP de

espermatozóides epididimais mostra que as alterações de membrana envolvidas no

processo ocorrem bastante rápido em, pelo menos, um subgrupo de espermatozóides.

Proteínas, como as espermadesinas, podem estar envolvidas neste aumento inicial da

habilidade de ligação.