Um guia sobre CRISPR para iniciantes

Um guia sobre CRISPR para iniciantes

Introdução à edição Genética

A edição genética envolve a exclusão, inserção ou modificação de

sequências específicas de DNA no genoma. Por muitos anos, os
pesquisadores tentavam desenvolver ferramentas fáceis e econômicas de
edição de genoma para resolver problemas em um amplo espectro de
campos. Por exemplo, a terapia genética em humanos poderia progredir
rapidamente se alguém pudesse simplesmente eliminar o gene responsável
por um determinado distúrbio genético. Na agricultura, a manipulação do
DNA das plantas poderia ser usada para otimizar o rendimento das culturas
e controlar as doenças das plantas. Da mesma forma, os genomas
bacterianos podem ser ajustados para aumentar o rendimento de seus
produtos em várias aplicações industriais.

Finalmente, os esforços dos pesquisadores foram recompensados com o

desenvolvimento do CRISPR, uma ferramenta molecular robusta que pode
editar o DNA em praticamente qualquer lugar. A tecnologia CRISPR está
iniciando uma revolução nas ciências da vida e está rapidamente se
tornando uma ferramenta padrão em muitos laboratórios. Dada a sua
facilidade de uso e versatilidade, o CRISPR já está sendo usado para uma
variedade de aplicações e possui muitas promessas para o futuro.

2
O que é CRISPR?

CRISPR é um sistema de dois componentes simples que pode ser utilizado

para atingir uma sequência genómica específica e, em seguida, fazer um
corte no DNA. Esta poderosa ferramenta permite aos cientistas manipular
um gene específico de interesse. Por exemplo, pode realizar knock out em
um gene (tornando-o inativo) ou knock in numa sequência particular, que
repara uma mutação ou acrescenta uma característica. A seguir,
descrevemos como CRISPR foi descoberto e desenvolvido como uma
ferramenta de edição genética poderosa.

Como a proteína Cas9 reconhece o DNA alvo? É direcionado para a

A História da CRISPR
As descobertas fundamentais que levaram ao desenvolvimento da
tecnologia CRISPRCas9 podem ser rastreadas até 1993, quando
segmentos palindrômicos repetitivos de DNA intercalados com outros
fragmentos de material genético foram identificados em procariontes (1).
Esses segmentos repetidos do código genético foram denominados
Repetições Palindrômicas Curtas Regularmente Interpoladas em Cluster, ou
CRISPR. No entanto, os segmentos de DNA entre as repetições foram
realmente a parte interessante.
Em 2007, após anos de estudo, os pesquisadores concluíram que a função
do CRISPR está relacionada à imunidade procariótica (2). Foram
necessários esforços combinados de vários grupos de pesquisa nos
próximos 5 anos para elucidar o mecanismo molecular subjacente por trás
do sistema CRISPR.
Acontece que as bactérias e as arquéias usam o sistema CRISPR-Cas9
para se defender contra vírus invasores (chamados bacteriófagos). Ao
encontrar uma infecção viral, a célula procariótica emprega uma nuclease
especial associada ao CRISPR (Cas9) para cortar um pedaço de DNA viral,
criando uma quebra de fita dupla (DSB) em seus locais alvo.
sequência alvo por um pequeno fragmento de RNA conhecido como RNA
guia (gRNA). O RNA guia é complementar a um segmento do genoma viral,
que permite ao Cas9 clivar o DNA com um alto grau de especificidade.
A clivagem do DNA não apenas destrói o vírus, mas um fragmento de
DNA estranho, chamado de "espaçador", pode ser armazenado entre as
seqüências palindrômicas da matriz CRISPR como uma maneira de reter
a memória genética de infecções passadas. Se o vírus fosse invadido
novamente, o sistema CRISPR-Cas9 poderia atacar e destruí-lo
rapidamente. Portanto, essa biblioteca de fragmentos virais é
essencialmente equivalente ao nosso sistema imunológico, que
armazena antígenos para se preparar para futuras infecções.
Depois que os cientistas descobriram o mecanismo do CRISPR nos
procariontes, não demorou muito para que eles percebessem o potencial de
engenharia dos genomas de micróbios, plantas e animais. Hoje, o CRISPR
é utilizado para uma variedade de aplicações e sua adoção continua a
aumentar em laboratórios em todo o mundo.
CRISPR: um conjunto de sequências de DNA envolvidas no sistema
imunológico procariótico que foi adaptado para a engenharia do genoma.

3
Os componentes do CRISPR
O sistema CRISPR compreende dois componentes: um RNA guia (gRNA)
específico para a sequência de DNA alvo e uma endonuclease associada ao cas9
CRISPR (Cas). Para experimentos com CRISPR, o RNA guia e a
endonuclease Cas são combinados para formar um complexo de
ribonucleoproteína (RNP).

A proteína Cas funciona como uma tesoura molecular, enquanto o gRNA é o sgRNA
GPS que o guia até o local apropriado. Em procariontes, o gRNA guia a
nuclease para o DNA viral, mas como uma ferramenta biotecnológica, as
especificações de design do gRNA podem ser alteradas para atingir o

N
5' 3'

C
C
genoma de qualquer organismo em praticamente qualquer local. 3' 5'

G
G
N
DNA alvo PAM

Para muitas aplicações de engenharia genética, a proteína Cas9 (de

Streptococcus pyogenes) é usada. A ligação do gRNA ao alvo genômico
depende da presença de um motivo adjacente protospacer curto (PAM)
localizado diretamente a jusante do alvo (na cadeia de DNA oposta; Fig 1).
As proteínas Cas de diferentes espécies procarióticas reconhecem
Figura 1. O sistema CRISPR-cas9.
diferentes motivos de PAM. O PAM para Cas9 é 5'-NGG-3 ', onde N é
qualquer nucleotídeo. O sistema CRISPR-Cas9 compreende um RNA guia (gRNA) e nuclease Cas9, que juntos
formam um complexo de ribonucleoproteína (RNP). A presença de um motivo adjacente
protospacer específico (PAM) no DNA genômico é necessária para que o gRNA se ligue à
Se for feita uma correspondência correta com o PAM e se o gRNA se ligar
sequência alvo. A nuclease Cas9 então quebra uma fita dupla no DNA (indicado pela
com sucesso ao alvo, o Cas9 clivará os dois filamentos de DNA 3-4 tesoura). Mecanismos de reparo endógenos desencadeados pela quebra de fita dupla
nucleotídeos a montante do local do PAM. Na natureza, esse pequeno podem resultar em nocaute genético por meio de uma mutação de mudança de quadro ou
elemento genético ocorre apenas em vírus invasores (não no genoma nocaute de uma sequência desejada se um modelo de DNA estiver presente.
bacteriano) e, portanto, garante que o Cas9 não decida seu próprio locus
CRISPR.

RNA guia (gRNA): o componente de RNA da ferramenta de Proteína de endonuclease associada ao CRISPR (Cas): família Motivo adjacente protospacer (PAM): uma sequência curta de
engenharia do genoma CRISPRCas9. Contém uma sequência de de proteínas capazes de clivar ácidos nucleicos. Cas9 é a nucleotídeos que deve estar presente a jusante do local alvo para
~ 20 pares de bases que é complementar ao alvo genômico. proteína Cas mais comumente usada em experimentos CRISPR. que a nuclease faça uma quebra de fita dupla.

4
Guia RNA Formatos
Na sua forma natural, o RNAt consiste em dois segmentos distintos de
RNA: RNA CRISPR (crRNA) e RNA CRISPR transativador (tracrRNA). O
crRNA é uma sequência de 18 a 20 pb que se liga ao alvo genômico. O
tracrRNA funciona como um andaime para a interação crRNA-Cas9. Em
contextos naturais, os RNAs guia formam uma molécula duplex, com os
segmentos crRNA e tracrRNA recozidos juntos (denotados como cr:
tracrRNA). No entanto, os RNAs guia agora podem ser produzidos
sinteticamente com o crRNA e o tracrRNA conectados por um loop de
ligação. Essas moléculas sem costura são chamadas RNAs de guia único
(sgRNAs) (Fig 2).
Criar quebras de cadeia dupla (DSB)
Para muitas experiências de CRISPR-Cas, o Cas9 facilita o processo de
edição de genes criando um DSB no DNA (Fig 3), semelhante ao que
ocorre em bactérias e arquéias. Gerar um DSB é a etapa inicial no
caminho de edição do CRISPR. O mecanismo de reparo a seguir ditará o
tipo de edição de genes que ocorrerá e influenciará o resultado de edição
desejado. Na próxima seção, exploraremos dois tipos principais de reparo:
união final não homóloga (NHEJ) e reparo dirigido a homologia (HDR).

cas9

laço linker

sgRNA

tracrRNA tracrRNA

5' 3'

N
C
C
~ 20 nt crRNA ~ 20 nt crRNA 3' 5'

G
G
N
DNA alvo PAM

Sequência gRNA alvo Sequência gRNA alvo

Figura 2. Formatos de RNA guia de duas peças e único. Os RNAs guia podem ser
construídos em dois formatos. a) os componentes crRNA (verde) e tracrRNA (roxo)
podem ser recozidos juntos para formar um guia de duas peças (cr: tracrRNA) ou b) eles
podem ser conectados por um looper de ligação (azul) para formar uma molécula
contínua ( RNA guia único ou sgRNA).

DSB

5' 3'

3' 5'

Figura 3. Os componentes CRISPR-Cas criam uma quebra de fita dupla. O complexo

sgRNA e Cas9 forma uma ribonucleoproteína. O sgRNA se liga ao alvo genômico e Cas9
faz uma quebra de fita dupla (DSB) no DNA.

5
Reparando quebras induzidas por CRISPR
Como descrito acima, o CRISPR facilita a geração de DSBs em locais específicos no genoma. No entanto, essa ação por si só não faz com que um gene seja
editado. Em vez disso, o processo de reparação da quebra permite que sejam feitas alterações no gene alvo. Depois que um DSB é feito, mecanismos inatos
de reparo do DNA são automaticamente acionados dentro da célula. A seguir, discutiremos dois tipos principais de vias de reparo que são frequentemente
usadas para editar genes: junção de extremidade não homóloga (NHEJ) e reparo dirigido por homologia (HDR).

DSB
União final não homóloga (NHEJ)
5' 3'

3' 5'

Se o objetivo experimental é interromper permanentemente um gene

para que nenhuma proteína funcional seja produzida (um nocaute), homologia

então o mecanismo de reparo de união não-homóloga (NHEJ) pode Braços

5' 3'

ser explorado (Fig. 4, esquerda). O NHEJ liga as extremidades do 3' 5'

DNA novamente, mas é propenso a erros e pode inserir ou excluir Knock-in Sequência

Template Donor DNA

nucleotídeos (chamados indels) no processo. Se o número de
nucleotídeos inseridos ou excluídos não for divisível por três, induzirá
uma mutação de deslocamento de quadro e provavelmente encerrará Não homóloga End Homologia-Directed
Juntando (NHEJ) Repair (HDR)
a função da proteína resultante.
5' 3' 5' 3'

3' 5' 3' 5'

Reparo Direcionado à Homologia (HDR) Inserção Knock-in Sequência

Se o objetivo do experimento é substituir o elemento genético alvo OU

por uma sequência diferente (uma imitação), a célula pode ser 5' 3'

direcionada para a via de reparo direcionado por homologia (HDR) 3' 5'

Eliminação
(Fig 4b). Um modelo de doador de DNA contendo a sequência
desejada flanqueada por regiões de homologia deve ser
introduzido junto com os componentes CRISPR às células. As
Figura 4. Mecanismos de reparo do CRISPR. Os dois mecanismos de reparo mais comuns que facilitam a edição do
células usarão esse modelo para reparar a sequência interrompida
CRISPR-Cas são a junção final não-homóloga (NHEJ) e o reparo direcionado à homologia (HDR). O NHEJ resulta em
por meio de recombinação homóloga, incorporando as alterações inserções ou deleções de nucleotídeos para reparar o DSB. HDR repara o DSB incorporando um modelo de doador de DNA na
desejadas na região alvo (Fig. 4, à direita). sequência alvo.

Indels: inserção ou deleção de nucleotídeos no genoma. Freqüentemente Molde de DNA doador : uma sequência de DNA específica que deseja ser
causada por junção de extremidade não-homóloga após uma quebra de fita introduzida no genoma flanqueado por braços de homologia para facilitar a
dupla no DNA. recombinação homóloga.

6
Componentes e Mecanismo de Edição CRISPR-cas9
1. Componentes de CRISPR-cas9 2. Formação RNP

linker loop cas9

3' 5'

cas9
sgRNA
tracrRNA
crRNA: tracrRNA tracrRNA
OU
sgRNA RNP
~ 20 nt crRNA ~ 20 nt
5' 5' crRNA
3' 3'

Sequência de gRNA alvo Sequência de gRNA alvo

3. Quebra de fita dupla mediada por Cas9 4-A. Reparação NHEJ

5' 3'

3' 5'

Inclusão
cas9

DSB OU

5' 3'
sgRNA
5' 3'
3' 5'

3' 5'
N

5' 3'
C
C

3' 5'
G

eliminação de
G
N

DNA alvo PAM

4-B. Reparo Direcionado à Homologia

homologia
Braços 5' 3'

5' 3'
3' 5'
3' 5'

Knock-in Sequência Knock-in Sequência

Figura 5. Edição do genoma do CRISPR-Cas9. 1) Os componentes do CRISPR são um RNA guia (sgRNA ou cr: tracr) e uma endonuclease Cas9. 2) O RNA guia e Cas9 formam uma
ribonucleoproteína (RNP). 3) Dentro da célula, o RNP cria uma quebra de fita dupla (DSB) no alvo genômico. Um dos dois mecanismos de reparo endógenos pode reparar a interrupção.
4a) O reparo não-homólogo da junção de extremidade (NHEJ)) é uma via propensa a erros que frequentemente insere ou exclui nucleotídeos (indels). 4b) Se um modelo de DNA for
fornecido, a via de reparo direcionado à homologia (HDR) pode reparar a ruptura por meio de recombinação homóloga.

7
Um guia sobre CRISPR para iniciantes

O que podemos
conseguir usando
CRISPR?

Depois que os cientistas perceberam o potencial do Triagem CRISPRi / a knockouts

CRISPR, o campo da engenharia do genoma

Etiquetas de genes Anti-CRISPR Knock-ins
cresceu rapidamente. Desde então, o CRISPR tem
sido utilizado em uma ampla gama de células e
organismos, incluindo plantas, fungos e mamíferos.
A tecnologia tem sido usada para manipular genes
de diferentes maneiras, como alterar suas Figura 6. Usos atuais da tecnologia CRISPR. A tecnologia CRISPR agora está sendo usada em vários métodos além dos
tradicionais knockout e knock-ins de genes. Os avanços nos métodos e nas pesquisas do CRISPR deram origem a
seqüências de nucleotídeos ou alterar sua tecnologias como CRISPRi e CRISPRa, proteínas anti-CRISPR, telas CRISPR e uso do CRISPR para marcar genes para
rastreamento e visualização.
expressão. A Figura 6 mostra alguns dos usos
atuais da tecnologia CRISPR. Nesta seção,
discutiremos esses usos em mais detalhes.

8
knock-outs Knock-ins
Tornar um gene permanentemente inoperante (não codifica uma proteína
A incorporação de material genético no genoma de uma célula é chamada
funcional) é chamado de nocaute. A capacidade do CRISPR de interromper a
de knock-in. Essas edições são obtidas através da indução de células para
função do gene depende da natureza propensa a erros do mecanismo NHEJ.
reparar DSBs por HDR.
Como descrito acima, os indels que causam mudanças na estrutura de leitura
de um gene provavelmente terminarão a função do gene. Isto é Para experimentos em HDR, um modelo de DNA contendo a sequência de
especialmente verdade para turnos de quadros que causam códons de inserção flanqueada por regiões de homologia deve ser introduzido nas
parada prematuros. células juntamente com os componentes CRISPR. O modelo é usado para
reparar com precisão a sequência de destino cortada, incorporando a
Também é possível obter um nocaute usando o sgRNA multivias (vários
sequência de encaixe no processo. O HDR permite que inúmeras
gRNAs que têm como alvo o mesmo gene). Ao fazer vários cortes
aplicações de reescrita genômica introduzam mutações de ponto único e
simultâneos no DNA, os sgRNAs induzem uma ou mais grandes deleções de
inseram marcadores selecionáveis. Embora a técnica HDR exija mais
fragmentos nos genes-alvo. Como essas deleções removem vários
refinamento, os pesquisadores já empregaram o método para corrigir uma
aminoácidos, muitas vezes tornam o gene alvo completamente inoperante. O
mutação geneticamente codificada que causa catarata em camundongos
Gene Knockout Kit v2 e as bibliotecas de triagem da Synthego utilizam essa
(3), demonstrando a prova de conceito do HDR como um método para
abordagem de vários guias para eliminar genes de maneira robusta.
corrigir doenças geneticamente modificadas.
Ao interromper propositadamente a sequência de um gene (e o mRNA e a
proteína correspondentes), os pesquisadores podem elucidar o impacto do
nocaute no fenótipo de uma célula ou organismo. Esta técnica é, portanto, útil
para uma variedade de aplicações, incluindo a identificação e validação de
possíveis alvos de drogas, a análise de vias celulares e a validação de
anticorpos.

Knock-out: uma mutação em uma sequência genética Knock-in: a integração de uma sequência genética SgRNA multivias: múltiplos gRNAs projetados para
que faz com que seja inoperante (ou seja, nenhuma estranha no genoma de uma célula. atingir o mesmo gene e são introduzidos nas células
proteína funcional é produzida). simultaneamente.

9
CRISPR interference (CRISPRi) a)
CRISPRi
Embora o nocaute genético possa ser alcançado interrompendo uma
sequência genética, a expressão gênica pode ser reprimida sem alterar dCas9 inibidor gene Silenciado
o DNA correspondente. Em 2013, Qi et al. fez uma variante de Cas9
modificando os domínios da endonuclease para que a enzima não corta
mais o DNA (chamado Cas9 ou dCas9 morto) (4). Os pesquisadores
usaram o dCas9 para desenvolver uma técnica em que o complexo
Promotor
CRISPR se liga ao seu alvo de DNA, mas não o cliva. A ligação do
dCas9 impede que o mecanismo de transcrição da célula acesse o
promotor, inibindo assim a expressão do gene (Fig 7a). A fusão de um
domínio repressor transcricional (como KRAB) ao dCas9 permite uma b)
redução reversível e ajustada na expressão gênica. CRISPRa

Em um aceno à técnica precursora de silenciamento de genes, dCas9 Ativador gene Expresso

interferência de RNA (RNAi), a técnica de silenciamento de CRISPR foi
denominada interferência de CRISPR ou CRISPRi (4). Enquanto o RNAi
reprime os genes destruindo os transcritos do RNA, o CRISPRi reprime
os genes no nível do DNA. Comparado ao RNAi, o CRISPRi está
Promotor
associado a maior eficiência, maior versatilidade e menos efeitos fora do
alvo.
Figura 7. Mecanismos de interferência e ativação do CRISPR. Os métodos CRISPRi e
CRISPRa usam Cas9 morto cataliticamente (dCas9) para alterar a expressão gênica de
alvos sem alterar a sequência genética. Dependendo do regulador transcricional utilizado,
a expressão gênica pode ser a) inibida ou b) ativada.

CRISPR activation (CRISPRa)

Embora as endonucleases de dCas9 possam ser usadas para silenciar a
expressão gênica, elas também podem ser modificadas para ativar os genes RNA interference (RNAi): um processo biológico reversível e transitório pelo
qual o RNA de fita dupla pode inibir a expressão gênica.
alvo (chamados ativação de CRISPR ou CRISPRa). Ao fundir um ativador de
transcrição (como VP64 ou VP16) ao dCas9, os cientistas estão agora
desenvolvendo sistemas que podem superexpressar genes de interesse (Fig
CRISPR interference (CRISPRi): uma técnica que usa Cas9 inativo para silenciar
7b). Polstein e Gersbach (2015) criaram um desses sistemas ao fundir ou desativar a expressão gênica sem alterar a sequência de DNA.
proteínas induzíveis à luz à Cas9 mutada, fazendo com que a expressão
gênica seja ativada na presença de luz azul e reprimida na sua ausência (5).
Outras equipes de pesquisadores, como Zalatan et al. (2015), estão CRISPR activation (CRISPRa): uma técnica que usa Cas9 inativo para ativar ou
ativar a expressão gênica sem alterar a sequência de DNA.
construindo sistemas mais complexos para ativação e repressão gênica
multiplexada em até três locos simultaneamente (6).

10
Telas CRISPR Anti-CRISPR
Outra aplicação do CRISPR é a triagem funcional em todo o genoma. Até
Embora o sistema CRISPR-Cas9 permita o ajuste fino do DNA genômico, uma
recentemente, o RNAi era a abordagem principal para as telas de perda de
desvantagem é o risco de efeitos fora do alvo (cortar o DNA no lugar errado). Uma
função, onde os genes são sistematicamente inibidos em todo o genoma para
solução para esse problema é aproveitar as proteínas anti-CRISPR que inibem a
determinar sua função. No entanto, como mencionado anteriormente, o RNAi
atividade da Cas9. Na natureza, os bacteriófagos usam essas proteínas para evitar
é atormentado por problemas relacionados à baixa eficiência e altos efeitos
a maquinaria CRISPR dos procariontes. Pawluk et al. (2016) descobriram
fora do alvo. Agora, com o CRISPR, as bibliotecas de gRNA estão sendo
inibidores da proteína anti-CRISPR que eram eficazes contra a nuclease Cas9 de
desenvolvidas para eliminar centenas de genes em uma única tela com alta
Neisseria meningitidis (Nme). De fato, a equipe mostrou inibição da atividade do
eficiência (Fig. 8). A Synthego agora oferece várias bibliotecas de sgRNA com
Nme-Cas9 em células bacterianas e de mamíferos usando essas proteínas
matriz que têm como alvo um gene por poço de uma placa de múltiplos poços.
anti-CRISPR (7). Por fim, essa tecnologia pode ser usada para reduzir erros de
Essas telas podem ser usadas para várias aplicações, incluindo a
edição. Acontece que a adição de proteínas anti-CRISPR após a edição ocorre
identificação de possíveis alvos de drogas.
apenas parcialmente reduz a clivagem nos locais de destino, mas reduz bastante a
clivagem nos locais fora do alvo.

cas9 + gRNA
Visualizações de genes
biblioteca CRISPR
Aplicar droga /
O sistema CRISPR também pode ser usado para visualizar regiões
tratamento
genômicas. Isso é conseguido anexando proteínas fluorescentes (como a
Sistematicamente interromper uma

conjunto de genes utilizando um

proteína verde fluorescente; GFP) às proteínas dCas9 ou RNAs guia e
biblioteca CRISPR usando o sistema CRISPR para marcar as partes desejadas do genoma
(8,9). Essa tecnologia agora permite aos cientistas visualizar ácidos
nucleicos em tempo real, um processo que anteriormente era
extremamente difícil de executar.

Figura 8. Fluxo de trabalho de triagem em matriz

CRISPR. Um gRNA direcionado a cada gene é introduzido em cada
poço de uma placa de múltiplos poços. A aplicação de um tratamento ATGTCGTAGCGCCGTCGTGAG

(como um medicamento) às células permite identificar quais genes CTCCGCTGCGAGCTAAGCTGC Anti-CRISPR: Proteínas capazes de inibir a atividade da endonuclease Cas
GATCTGCGAGCCCCTATACTA bloqueando a ligação ou clivagem do DNA alvo
(quando inoperantes) fazem com que as células tenham uma

sensibilidade aumentada ou diminuída ao medicamento. Esse

processo pode ser usado para identificar possíveis alvos de drogas.

Identificar células com o fenótipo proteínas fluorescentes: proteínas com propriedades bioluminescentes
mutante e genótipo subjacente comunmente usadas para visualizar componentes celulares e moleculares.

11
 ETAPAS DE UM EXPERIMENTO CRISPR

O fluxo de trabalho CRISPR, envolve três etapas básicas: Design, Editar, e Analisar.

Design
A primeira etapa de um experimento CRISPR envolve o design dos componentes e
parâmetros necessários para o seu experimento específico. Você deve projetar seu
gRNA e escolher uma nuclease Cas apropriada. Em seguida, você precisará escolher
o formato dos componentes CRISPR, selecionar um método de transfecção e otimizar
as condições de transfecção para o seu tipo de célula. Essas etapas iniciais garantirão
que você obtenha uma edição genética bem-sucedida em seu experimento.

Editar
Depois de projetar seu experimento e otimizar suas condições de transfecção, você
estará pronto para entregar seu gRNA específico do alvo (e nuclease Cas) às suas
células. Transfecte suas células e permita que a edição do CRISPR ocorra.

Analisar
Após a edição, as sequências genômicas direcionadas devem ser analisadas para
avaliar a frequência e o tipo de edições feitas. Existem várias ferramentas de análise
que avaliam dados genômicos e determinam a eficiência da edição. A ferramenta de
análise gratuita da Synthego, Inference of CRISPR Edits (ICE), avalia os dados da
sequência Sanger. Ensaios proteicos e fenotípicos também podem ser usados para
avaliar o efeito da edição de genes.

12
Um guia sobre CRISPR para iniciantes

CRISPR no Futuro

O CRISPR recebeu muita atenção principalmente devido à sua

especificidade e viabilidade como uma ferramenta de edição de genes.
Consequentemente, o CRISPR revolucionou rapidamente o campo da
engenharia do genoma. Os avanços que o CRISPR facilitou nos últimos
anos são verdadeiramente notáveis. Agora, os pesquisadores começaram a
mexer com a tecnologia para desbloquear seus vastos potenciais que vão
além dos aplicativos discutidos até agora.

Agora, os cientistas estão usando uma versão modificada do CRISPR para

explorar a epigenômica - o conjunto de grupos químicos em todo o genoma
que adornam o DNA e suas proteínas associadas à embalagem de
histonas. Anteriormente, os pesquisadores eram apenas capazes de
catalogar a correlação entre marcadores epigenéticos e expressão gênica
nas células. Agora, um complexo CRISPR que é capaz de acetilar proteínas
histonas em locais precisos ditados pelo gRNA do complexo foi
desenvolvido (10). Tais tecnologias podem lançar luz sobre a relação causal
entre marcadores epigenéticos e expressão gênica no futuro.

O CRISPR também está permitindo a elucidação de grandes porções do

genoma humano, anteriormente com função desconhecida. Os cientistas há
muito tentam identificar a localização e a função dos elementos genéticos
de 'não-gene' que não codificam proteínas, mas acredita-se que tenham um
importante papel regulador na expressão. O CRISPR está permitindo que
os pesquisadores eliminem essas regiões previamente desconhecidas para
estudar seu papel na célula).

13
Um guia sobre CRISPR para iniciantes Referências
1. Mojica FJ, Juez G, Rodríguez-Valera F. (1993)
Transcription at different salinities of Haloferax mediterranei
sequences adjacent to partially modified PstI sites. Mol
Microbiol 9(3):613-21.

O CRISPR também está desempenhando um papel cada vez mais 2. Barrangou R1, Fremaux C, Deveau H, Richards M, Boyaval
P, Moineau S, Romero DA, Horvath P. (2007) CRISPR
importante na indústria biomédica. O processo de descoberta de provides acquired resistance against viruses in prokaryotes.
medicamentos é notoriamente longo, árduo e caro. É provável que o Science 315(5819):1709-12.

CRISPR acelere o estágio pré-clínico do desenvolvimento de
medicamentos. Por exemplo, as bibliotecas de triagem CRISPR estão
agora disponíveis para facilitar a descoberta de novos alvos de
medicamentos. O CRISPR também pode ser usado para desenvolver
modelos de doenças precisos para validar possíveis medicamentos.
Paralelamente, a pesquisa usando CRISPR para terapias in vivo e ex vivo
3. Wu Y, Liang D, Wang Y, Bai M, Tang W, Bao S, Yan Z, Li D,
Li J. (2013) Correction of a genetic disease in mouse via use
of CRISPR-Cas9. Cell Stem Cell 13(6):659-62.
4. Qi LS, Larson MH, Gilbert LA, Doudna JA, Weissman JS,
Arkin AP, Lim WA. (2013) Repurposing CRISPR as an
RNA-guided platform for sequence-specific control of gene
expression. Cell 152(5):1173-83.

está aumentando. Há um otimismo substancial de que a edição de genes 5. Polstein LR, Gersbach CA. (2015) A light-inducible
permitirá o desenvolvimento de melhores terapias e medicamentos mais CRISPR-Cas9 system for control of endogenous gene
activation. Nat Chem Biol 11(3):198-200.
personalizados em um futuro próximo.
6. Zalatan JG, Lee ME, Almeida R, Gilbert LA, Whitehead EH,
La Russa M, Tsai JC, Weissman JS, Dueber JE, Qi LS, Lim
O CRISPR não está apenas preparando o caminho para os pesquisadores WA. (2015) Engineering complex synthetic transcriptional
resolverem os problemas mais difíceis nas ciências biomédicas, mas programs with CRISPR RNA scaffolds. Cell
15;160(1-2):339-50.
também está permitindo avanços em outros campos científicos. A
tecnologia CRISPR promete proporcionar alguns avanços 7. Pawluk A, Amrani N, Zhang Y, Garcia B, Hidalgo-Reyes Y,
Lee J, Edraki A, Shah M, Sontheimer EJ, Maxwell KL,
verdadeiramente impressionantes nas próximas décadas, particularmente Davidson AR. (2016) Naturally Occurring Off-Switches for
em relação à terapêutica humana, biologia agrícola, biocombustíveis e CRISPR-Cas9. Cell 167(7):1829-1838.e9.

pesquisa científica básica. 8. Ma H, Naseri A, Reyes-Gutierrez P, Wolfe SA, Zhang S,

Pederson T. (2015) Multicolor CRISPR labeling of
chromosomal loci in human cells. Proc Natl Acad Sci U S A.
10;112(10):3002-7.

9. Ma H, Tu LC, Naseri A, Huisman M, Zhang S, Grunwald D,

Pederson T. (2016) Multiplexed labeling of genomic loci with
dCas9 and engineered sgRNAs using CRISPRainbow. Nat
Biotechnol 34(5):528-30.

10. Hilton IB, D’Ippolito AM, Vockley CM, Thakore PI,

Crawford GE, Reddy TE, Gersbach CA. (2015) Epigenome
editing by a CRISPR-Cas9-based acetyltransferase activates
genes from promoters and enhancers. Nat Biotechnol
33(5):510-7.

11. Ho TT, Zhou N, Huang J, Koirala P, Xu M, Fung R, Wu F,

Mo YY. (2015) Targeting non-coding RNAs with the
Sobre o Movimento Biotecnologia Brasil
CRISPR/Cas9 system in human cell lines. Nucleic Acids Res
Somos uma instituição que visa mobilizar os cidadãos em 18;43(3):e17.
favor de implementar planos, programas, projetos, ações e
atividades para o efetivo desenvolvimento da Biotecnologia
no Brasil. Defendemos a interação do Governo Federal com
o setor empresarial, academia, laboratórios públicos e
institutos de pesquisa, o que permite criar oportunidades para
os diversos setores que utilizam a biotecnologia no país. 14