13/02/2011

PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATOLICA DE CHILE

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS
CARRERA DE BIOQUIMICA

FORMULARIO PARA LA PRESENTACION

DE “AVANCE DE MEMORIA ………………………..”
DATOS DEL ALUMNO/A
Nombres / Apellidos: Jorge Zúñiga H.
Número Alumno:04607325
Correo Electrónico: jmzuniga@uc.cl Teléfono: (02)6862348

DATOS DEL SUPERVISOR DE LA MEMORIA

Nombres / Apellidos: Rafael Vicuña E.
Correo Electrónico: rvicuna@bio.puc.cl Teléfono: (02)6862666

DATOS DEL CENTRO, INSTITUCION O EMPRESA

Nombre: PUC
Dirección: Alameda 340
Teléfono:

DATOS DEL CO-DIRECTOR DE LA MEMORIA (OPCIONAL)

Nombres / Apellidos:
Correo Electrónico: Teléfono:

DATOS DEL PATROCINADORDE LA MEMORIA (OPCIONAL)

Nombres / Apellidos:
Correo Electrónico: Teléfono:

TITULO DE LA MEMORIA

Caracterización inicial de una cianobacteria del desierto de Atacama.

Supervisor Memoria Alumno (a)

Santiago,..............................................de......
13/02/2011
INFORME DE AVANCE MEMORIA INVESTIGACIÓN

I. Cumplimiento de los objetivos planteados para el período que se

informa.

¿Cumplido? Fundamentación para el

Objetivos Si Parcial N cumplimiento parcial o
o incumplimiento

Aislamiento de una cepa de X  

cianobacteria

Caracterización molecular:  X  No hemos conseguido el equipo

Genes ribosomales que mide si el cultivo fija
Genes nitrogenasa (y functional) nitrógeno molecular.

Desarrollar protocolos óptimos

para medir tasa de crecimiento. X 

Determinar tasas de crecimiento Las cepa crece lento. Se tuvo

en diferentes condiciones, que construir un incubador
evaluar la optima.  X  adecuado antes de empezar.


 

  
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II. RESULTADOS OBTENIDOS

Aislamiento: Se usaron dos técnicas consecutivas para lograr un buen aislamiento. La

primera consiste en hacer diluciones seriadas de un cultivo de biofilm hasta 10^-6. En un
microscopio inverso se analizan gotas de 1uL, se seleccionan las gotas que tienen una sola
cianobacteria. Porteriormente se rescata y se reubica en un pocillo con 200uL de medio de
cultivo adecuado.
Una vez crecidas, cuando el pocillo tome un color verde, se traspasa a un volumen más
grande. Y se hacen soluciones seriadas, plaqueando en medio sólido BG-11 para
cianobacterias con agar.

1 2 1 2

A B C

Figura 1: A) Pocillos en los que se crece una sola célula de cianobacteria: los de la izquierda corresponden a
un medio MLA, mientras que los de la derecha medio BG-11. B) Ensayos de DGGE: el de la izquierda
corresponde a un ensayo realizado con partidores universales para procariontes. En la derecha se corrieron
productos con partidores específicos para cianobacterias. Carriles 1 y 2 corresponden al cultivo aislado y al cultivo
inicial. C) DGGE perpendicular , la reacción PCR fue realizada con partidores para cianobacterias con DNA
extraído del cultivo. Se puede observar una sola línea, que indica que hay sólo un tipo de producto de DNA,
correspondiente a la cianobacteria aislada. En la zona superior se expone el porcentaje de la capacidad
denaturante del gel, e indica que el amplicón se denatura en un rango de 50% a 70%.

El éxito del aislado se puede comprobar mediante la técnica de DGGE (Figura 1B).
Que consiste en separar productos de PCR por su denaturación, en función de su secuencia.
Usando partidores universales para procariontes, se realizó un ensayo DGGE (figura 1B,
izquierda). Comparando el carril del cultivo aislado con el del cultivo inicial (figura 1B) se
puede observar que se mantiene el mismo patrón, pero desaparecieron las bandas inferiores,
probablemente porque se eliminaron durante el proceso de aislamiento. A la derecha se
expone un ensayo DGGE, cuya reacción de PCR fue realizada con partidores específicos
para cianobacterias. Sólo se ve una sola banda en ambos, lo que quiere decir que
corresponde a una única cianobacteria dominante en el cultivo.
En ambos ensayos de DGGE, las bandas fueron cortadas y el DNA se aisló, luego
ese DNA se envió a secuenciar, cada secuencia obtenida fue analizada con BLAST. En los
ensayos de PCR con partidores universales, sólo uno dio match para cianobacterias, con
97% de identidad, correspondiente a “Chroococcales cyanobacterium LEGE 16S”.
La otra banda proveniente del cultivo aislado correspondería a la secuencia de una bacteria
del género “Bosea”, con un 99% de identidad, aparentemente, es la bacteria que está en
mayor cantidad.
Debido a estos resultados, se puede confirmar que se tiene un cultivo proveniente de una
sola célula.

Filogenia: hasta el momento se tiene el gen ribosomal 16S secuenciado casi en su totalidad,
también se dispone de una secuencia parcial de 23S.
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Nitrógeno: un buen elemento para hacer estudios de filogenia en cianobacteria son los genes
nif (nitrogenasa). A menudo se utilizan los genes nifH y nifD, que forman parte de un operón
de fijación de nitrógeno. Para intentar tener las secuencias de los genes se hicieron
reacciones de PCR con varios pares de partidores, obtenidos por bibliografía y por
generación en programas en el mismo laboratorio. Todos los ensayos dieron negativo. La
eficacia de los partidores se comprobó realizando reacciones de PCR con DNA extraído de
cepas de dos cianobacterias que se sabe que fijan nitrógeno y de otra que se tiene registro
que no fija, ni tiene los genes. Si bien, los ensayos de pcr resultan negativos, no es prueba
suficiente de que los genes no están en el genoma. Para ello debemos realizar un ensayo
que verifica que la enzima está presente, este ensayo no se ha podido realizar por falta de
equipos, pero se están realizando las gestiones para hacerlo.

Tasa de crecimiento: para tener una idea de cuáles son las mejores condiciones de
crecimiento de esta especie, dentro de lo que se puede lograr en el laboratorio, se tuvo que
adaptar un protocolo de extracción de clorofila, la cual es un buen indicador de la biomasa de
la cianobacteria presente. Después de muchos intentos, se hicieron adaptaciones: como
incorporar ruptura de las células con nitrógeno líquido, y cambiar el medio de extracción. Los
resultados más significativos en cuanto a mejora de la eficiencia de extracción se obtuvieron
utilizando metanol como solvente de extracción (figura 2a). En la figura 2b se observa,
mediante tres técnicas diferentes, las tasas de crecimiento de la cianobacteria en tres
intensidades distintas de luz, la menor intensidad de luz (10uE) da un menor ritmo de
crecimiento que en las otras dos condiciones, las cuales tienen una biomasa parecida (peso
seco, 2b). Por otra parte, la cantidad de clorofila es la misma en las tres condiciones de luz,
esto puede interpretarse como un límite en la maquinaria fotosintética.
En 2c puede observarse que el sodio aumenta significativamente la cantidad de clorofila
generada.

Figura 2: tasas de crecimiento con distintas técnicas en paralelo. En A se observa que las técnicas de
turbidez (OD 750nm) y peso seco correlacionan bastante bien y representan un aumento lineal, distinto de
las mediciones con clorofila, que se observa un crecimiento exponencial. Además, la eficiencia de extracción
de pigmentos es notoriamente mejor con metanol (verde oscuro) que con etanol (verde claro). En B se midió
la tasa de crecimiento en tres intensidades de luz (10uE, 30uE, 70uE). En C se testeó la tasa de crecimiento
con dos concentraciones de NaCl, añadidas al medio de cultivo (10mM y 25mM), el aumento de la clorofila es
notorio. 1uE= micromoles de fotones/ segundo* m2 .