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Estrutura Molecular

dos Ácidos Nucléicos e


Replicação do DNA
1953 – Watson e Crick (segredo da vida)
Descobrem a estrutura de dupla-hélice do DNA: “Notamos
que o pareamento específico que postulamos sugere um
possível mecanismo de cópia para o material genético”.

Há 50 anos...
Início da década de 1940 –
Chargaff (na foto em 1963)
descobre a proporção 1x1
entre adenina e timina, e
guanina e citosina,
fundamental para o
desvendamento da
estrutura do DNA
A dupla hélice é realmente uma molécula
extraordinária. O homem moderno tem talvez 50
mil anos, a civilização existe há apenas 10 mil
anos. Mas o DNA e o RNA existem há pelo
menos vários bilhões de anos. Durante todo esse
tempo, a dupla hélice esteve por aí, ativa. No
entanto, somos as primeiras criaturas sobre a
Terra a nos tornarmos conscientes da sua
existência.
Decifrando o genoma - A corrida para Francis Crick
desvendar o DNA humano (Kevin
Davies) Ed. Companhia das Letras,
2001
O termo Biologia Molecular até recentemente
vinha sendo aplicado quase que exclusivamente
à
Química de Ácidos Nucleicos

Ácido Desoxiribonucleico - DNA


Ácido Ribonucleico - RNA
A Biologia Contemporânea está dirigida para o
entendimento da interação de moléculas dentro das
células e das interações entre células que permitem a
construção de um organismo multicelular.

No atual milênio duas grandes forças irão remodelar a


Biologia Celular Molecular:

Genomas: o conhecimento da seqüência completa de


DNA de muitos organismos

Proteomas: o conhecimento de todas as possíveis


formas e funções das proteínas
Início da década de 90 - ambicioso
programa internacional - o Projeto Genoma
Humano (3 bilhões de dólares), para determinar o
completo manual de instruções do homem pela
leitura da seqüência precisa de bases químicas
(A, C, G e T) no DNA humano.
Término - junho de 2000
Desenvolvimento da bioinformática tem sido
absolutamente essencial para a Biologia
Molecular
As técnicas
envolvendo a
identificação de
moléculas de
ácidos nucleicos
tornou-se a
maneira mais
fácil de se chegar
a uma dada
proteína
Os ácidos nucleicos são moléculas muito mais
simples que as proteínas

Os ácidos nucleicos são formados de apenas


4 tipos de monômeros
(alfabeto de 4 letras)

Proteínas - alfabeto de 20 letras

Atualmente, a Química dos Ácidos Nucleicos é


fácil e muito bem padronizada
Nucleotídeos: Unidades constitutivas dos ácidos
nucléicos com função de armazenamento da
Informação Genética
DNA RNA
Bases Nitrogenadas

2o anel de 5 carbonos fundido Anel de 6 carbonos


ao anel de 6 carbonos
Nucleotídeos do DNA

5'

4’ 1’

3’ 2’

Base Nucleoside Nucleotide


Adenine adenosine adenylic acid (dAMP)
Guanine guanosine guanylic acid (dGMP)
Cytosine cytidine cytidylic acid (dCMP)
Thymine thymidine thymidylic acid dTMP
Uracil uridine uridylic acid (UMP)
O DNA sempre tem duas fitas de ácidos
nucleicos enroladas em hélice
• As duas fitas se mantêm juntas por PONTES DE
HIDROGÊNIO
• Para que o pareamento ocorra, ambas as FITAS têm que
ser ANTIPARALELAS
• O pareamento G-C tem 3 pontes de hidrogênio
• O pareamento A-T tem 2 pontes de hidrogênio
Pareamento de Bases
Pirimidinas com Purinas

A estabilidade da dupla hélice resulta em parte do grande


número de pontes de hidrogênio entre os pares de bases
As fitas da
molécula de DNA
(dupla hélice)
podem ser
separadas. Esse
processo é
denominado
desnaturação.
A renaturação
ocorre quando se
volta às condições
físico químicas
iniciais.
Desnaturação e Renaturação do DNA
(1961 - Marmur e Doty descobriram a RENATURAÇÃO do DNA)

• As duas fitas da dupla hélice podem ser


reversivelmente separadas quando as PONTES DE
HIDROGÊNIO são rompidas:

Aumento de
temperatura ou
Extremos de pH
(usamos pH
alcalino para
separar as fitas)
Separação das fitas é denominada “FUSÃO”
da molécula de DNA - “MELTING”

MELTING POINT:

TEMPERATURA NA QUAL É
DESFEITA METADE DA ESTRUTURA
EM HÉLICE DO DNA
Tm e % de GC

Quanto maior a
porcentagem de
pares GC, mais
difícil é a
desnaturação
As cadeias dos ácidos nucleicos são sintetizadas a partir de
nucleotídeos trifosfatados - dNTPs (ricos em energia),
por reações de
polimerização
(liberando
pirofosfato
inorgânico) durante
a formação da
LIGAÇÃO
FOSFODIÉSTER
As ligações fosfodiésteres ligam covalentemente os
nucleotídeos e conferem uma polaridade química às
fitas de DNA = extremidades 3’ e 5’

CADEIAS ANTIPARALELAS
Cada par de bases
(purina x pirimidina) 3,34 nm =
corresponde
apresenta uma largura a 10 pares
de bases por
semelhante, mantendo volta (360°)
da dupla
os esqueletos fosfato- hélice

açúcar com uma mesma


distância ao longo da
molécula de DNA.
As fendas MAIOR e
MENOR são geradas pela
posição de rotação das
bases em torno do eixo da
hélice.
Estruturas de
dupla-hélice
determinadas
por
Dextrógira Dextrógira
Levógira
cristalografia
(a) 10 bases (b) RNA/DNA (c) Zig-Zag de raio X
por volta ou RNA/RNA purina/pirimidina
completa 11 bases/volta alternadas (GC)
~12 bases/volta (d) C e T em uma
fita; A e G na outra
“targeted by
poly(C+T)”
1,9 nm 2,3 nm, 1,8 nm

Único sulco
profundo

B-DNA = sob condições fisiológicas (Sol. com baixa concentração de sal), maioria
do DNA das células; A-DNA = sob altas concentrações de sais ou em estado
parcialmente desidratado. Hélice mais curta e larga. Não existe “in vivo”; Z-DNA =
polímeros ricos em G:C, com purinas e pirimidinas alternadas na mesma fita, hélice
menos torcida com movimento em zig-zag do esqueleto fosfato-açúcar. Forma
encontrada “in vitro”.
O DNA no núcleo:

• Um cromossomo : uma molécula de DNA


• Genoma: o conjunto de cromossomos de
uma dada espécie
• Genoma Humano: 46 cromossomos
• 22 CROMOSSOMOS AUTOSSÔMICOS (X2)
• 2 CROMOSSOMAS SEXUAIS
• Total: 6 x 109 pares de nucleotídeos
Composição química dos Cromossomos Eucarióticos
Cromatina = DNA e Proteínas associadas (Histonas e não-
Histonas). As histonas têm um papel estrutural importante (H1, H2a,
H2b, H3 e H4) no empacotamento do DNA nos cromossomos.

2 H2a : 2H2b
2H3 : 2 H4

Subunidade estrutural
básica da cromatina
Modelo da Dupla Hélice do DNA
alguns postulados...
8 A complementaridade dos 2 filamentos torna o DNA unicamente
adequado a ESTOCAR e TRANSMITIR a informação genética
8 Cada fita de DNA contém uma cópia desta informação (codificada
pela seqüência de nucleotídeos complementares)
8 Importante para a REPLICAÇÃO DO DNA
8 Os GENES carregam a informação biológica que deve ser
precisamente COPIADA e TRANSMITIDA durante a divisão celular
8 A seqüência linear de nucleotídeos em um gene codifica a ordem
de aminoácidos em uma proteína
8 GENOMA = conjunto completo de informações no DNA de um
organismo. A cada divisão, a célula deve copiar o seu genoma para
transmiti-lo a ambas as células filhas
Demonstração experimental da Replicação Semi-
Conservativa (Meselson & Stahl, 1958)
• Após várias gerações de crescimento em meio contendo
Nitrogênio pesado (N15), células de E.coli foram
transferidas para meio contendo o isótopo normal “leve”
(N14)

• Periodicamente amostras foram removidas das culturas e


analisadas por centrifugação de equilíbrio em gradiente de
CsCl2 separação dos duplexes em bandas distintas

• Os padrões de bandas observados foram consistentes com


o mecanismo semi-conservativo da duplicação do DNA
Meselson & Stahl,
1958
A enzima DNA-polimerase sintetiza a nova
fita de DNA na direção 5’ 3’
DNA pol III de E. coli envolvida no processo de
elongação da cadeia - catalisa a adição de nucleotídeos à
extremidade 3’-OH da fita de DNA em crescimento
DUPLICAÇÃO DO DNA NA CÉLULA:

• Os genes que regulam o ciclo celular


ativam os elementos que irão iniciar a
REPLICAÇÃO
• Cada “REPLICON” é ativado uma
única vez durante a fase S da Intérfase
Local denominado “origem de replicação”, em
bactérias, leveduras e alguns vírus, é uma seqüência
de nucleotídeos com ~ 300 pb (ricas em A - T)

Helicase +
Primase =
Primossomo
(Procariotos)
Genoma bacteriano (1 ori ); Genoma humano (~10.000 ori ),
o que permite a célula humana replicar seu DNA
relativamente rápido

forquilhas replicação
1 2

2
1
Forquilha de Replicação é Assimétrica

Fita Líder
ou Leading
strand

Fita Tardia
ou Lagging
strand
Replicação Bidirecional
Primase sintetiza o RNA iniciador

~10
nucleotídeos

RNA
polimerase
Fragmentos de Okazaki: Remoção dos primers de
RNA e ligação dos segmentos de DNA

DNA polimerase de reparo


Papel das diferentes DNA polimerases no
processo de duplicação

Síntese da fita Líder


E. coli = pol III

Síntese da fita Tardia


E. coli = Primase

pol III
Procariotos: Três Eucariotos: 5 Polimerases (α,β,γ,δ,ε)
Polimerases ( I e II de γ = replicação nas mitocôndrias
reparo; pol III) β , ε = reparo do DNA nuclear
Proteínas acessórias da
Polimerase: aumentam
junção
a sua atividade e primer +
template

estabilizam a ligação
ao DNA “template”
Sliding-clamp protein
proteína β (E. coli)
Proteína
PCNA (eucariotos) dímera da
e E.coli
Brace protein sliding-
complexo γ (E. coli) clamp
fator de replicação C ou
RFC (eucariotos)
Forquilha de replicação em
procariotos

Replication factor A
(RFA) nos eucariotos

A estrutura detalhada
ainda não é totalmente
conhecida em eucariotos
Complexo multienzimático da forquilha de
replicação: ativado pela hidrólise de ATP
Forquilha de replicação dos eucariotos

PCNA

(RFA)
Brace protein
(RFC)
À medida que as fitas de DNA se desenrolam, o DNA a
frente da forquilha é forçado a enroscar, eventualmente
bloqueando a replicação

TOPOISOMERASES - catalisam a quebra e a re-ligação


das fitas de DNA
Fidelidade da Replicação
A acurácia da replicação do DNA é crítica para a
reprodução celular.
Se a polimerase não pudesse corrigir erros haveria a inserção
de 1 base errada a cada 104 nucleotídeos incorporados.
Atividade proof-reading
das enzimas pol I e III de
E. coli; pol δ e ε de
eucariotos

(exonuclease 3’ ->5’):

Reduz a taxa de erro para


1 base errada a cada 109.
Sistema de reparo reduz
a taxa de erro para 1 base
errada a cada 1010.
Telômeros e Telomerases
Seqüências repetidas
em tandem
Mecanismos especiais são
necessários para replicar as
seqüências terminais dos
cromossomos.
Telomerase é uma transcriptase
reversa: uma classe de DNA
polimerase que sintetiza DNA a
partir de um “template” de RNA.

A telomerase carrega seu próprio


“template” de RNA, que é
complementar à seqüência repetida
nos telômeros, fazendo parte do
complexo enzimático.