Você está na página 1de 8

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL-REI

CAMPUS ALTO PARAOPEBA

Engenharia de Bioprocessos

–Cinética enzimática–

Turma: A

Relatório apresentado ao curso de


Engenharia de Bioprocessos na disciplina
Bioquímica experimental sob
responsabilidade do prof. Juliano Bicas.

Alto Paraopeba/MG
(04 de Dezembro de 2010)

1. Introdução

A cinética de reações enzimáticas analisa quantitativamente o efeito de cada um dos


fatores que influencia a atividade enzimática avaliada através do aumento ou redução da
velocidade da reação catalisada. É determinada pela concentração da enzima,
concentração de substratos, concentração e tipo de ativadores ou inibidores, pH,
temperatura, forca iônica e atividade de água.[1]

O efeito do pH sobre a afinidade pode ser eliminado utilizando-se altas


concentrações de substrato de modo a se saturar a enzima em todos os valores de pH; e
o efeito do pH sobre a enzima deve-se às variações no estado de ionização dos
componentes do sistema à medida que o pH varia. Como as enzimas são proteínas
contém muitos grupos ionizáveis, elas existem em diferentes estados de ionização, por
isso, a atividade catalítica é restrita a uma pequena faixa de pH. A atividade da enzima
deve ser então medido no pH ótimo.[2]

A atividade catalítica das enzimas é altamente dependente da temperatura. À medida


que se eleva a temperatura dois efeitos ocorrem simultaneamente: a taxa de reação
aumenta e a estabilidade da proteína decresce devido a desativação térmica. A
influência da temperatura sobre a atividade da enzima é geralmente, representada em
termos de atividade ou velocidade de reação em função da temperatura, ou seja, a
maioria das reações químicas se processa a uma velocidade maior à medida que a
temperatura aumenta. [2]

A concentração do substrato [S] é um dos parâmetros que alteram a velocidade de


uma reação catalisada por enzimas. Esse parâmetro é de difícil determinação, pois a [S]
se altera durante a reação à medida que o substrato é convertido em produto. Sendo
assim, utiliza-se medir a velocidade inicial, V 0, quando [S] é muito maior que a
concentração de enzima, [E], as mudanças de [S] é mantida constante como o mostrado
na figura 1. A região de V 0 parecida com um platô esta próxima da velocidade máxima,
Vmáx.[1]
Figura 1. Gráfico da velocidade de uma reação catalisada por enzima versus
concentração do substrato.

Em 1903 Leonor Michaelis e Maud Menten postularam a teoria geral da ação


enzimática, em que a enzima combina reversivelmente com seu substrato para formar o
complexo ES em uma etapa rápida. Logo após, o complexo se quebra em uma segunda
etapa mais lenta para produzir uma enzima livre e o produto da reação. Essas etapas são
mostradas na equação abaixo:

No modelo da cinética de Michaelis-Menten existe uma reação bimolecular


inicial entre a enzima e o substrato para formar o complexo ES. Embora o mecanismo

enzimático para a reação unimolecular possa ser bastante complexo,


há tipicamente um passo na determinação da velocidade que permite que se modele o
mecanismo como um passo catalítico simples de velocidade constante k2.[3]

k2 também é designado como kcat , o valor máximo de reações enzimáticas catalisadas


por segundo.

A equação de Michaelis-Menten descreve como a velocidade de reação v


depende da posição do equilíbrio ligado ao substrato e da constante de velocidade k2.
Michaelis e Menten mostraram que se k2 for bem menor que k-1, pode obter-se a
seguinte equação:

A constante de Michaelis Km é definida como a concentração para a qual a


velocidade da reação enzimática é metade de Vmax. Isto pode verificar-se ao substituir Km
= [S] na equação de Michaelis-Menten. Se o passo de determinação da velocidade for
lento, quando comparado com a dissociação do substrato (k2 << k-1), então a constante
de Michaelis Km é aproximadamente à constante de dissociação do complexo ES,
embora tal situação seja relativamente rara.[3]

A situação mais normal dá-se quando k2 > k-1 na por vezes chamada cinética de
Briggs-Haldane. A equação ainda se verifica em condições mais gerais, como provém
da aproximação ao estado estacionário. Durante o período inicial, a velocidade de
reação v é relativamente constante, indicando que [ES] é também aproximadamente
constante:

Assim, a concentração [ES] é dada pela fórmula:

em que a constante de Michaelis Km é definida por:

Em conjunto, a fórmula geral para a velocidade de reação V vem pela equação


de Michaelis-Menten:
A constante de especificidade é uma medida da eficiência de
conversão pela enzima do substrato em produto. Usando a definição da constante de

Michaelis , a equação escreve-se na forma:

sendo [E] a concentração de enzima livre. Assim, a constante de especificidade é um


modo eficaz de obter a constante de segunda ordem da velocidade para enzimas livres
na reação com substrato livre para formação de produto. A constante de especificidade é
limitada pela frequência com que o substrato e a enzima se encontram na solução,
podendo atingir 1010M−1s−1. Esta taxa máxima é amplamente não dependente da
dimensão do substrato ou da enzima. A razão entre constantes de especificidade para
dois substratos é uma comparação quantitativa da eficiência da enzima na conversão dos
substratos. O declive do gráfico de Michaelis-Menten com baixa concentração de
substrato [S] mostrado na figura 2.[3]

Figura 2. Gráfico do duplo recíproco.

O gráfico de Lineweaver-Burke ou do duplo recíproco mostra o significado dos


pontos de intercepção entre a reta e os eixos de coordenadas e do gradiente da
velocidade. Sendo esse a forma mais comum, e simples,de mostrar os dados cinéticos.
Para tal, tomam-se os valores inversos de ambos os lados da equação de Michaelis-
Menten. Como se pode apreciar na figura da direita, o resultado deste tipo de
representação é uma linha reta cuja equação é e = mx + c, sendo o ponto de intercessão
entre a reta e o eixo das ordenadas equivalente a 1/V max, e o ponto de intercessão entre a
reta e o eixo de abscissas equivalente a -1/Km.[2]

Evidentemente não se podem tomar valores negativos para 1/[S]; o mínimo valor
possível é 1/[S] = 0, que corresponderia a uma concentração infinita de substrato, e daí
1/v = 1/Vmax. O valor do ponto de intercessão entre a reta e o eixo x é uma extrapolação
de dados experimentais obtidos em laboratório. [3]

 Enzima invertase de Saccharomyces cerevisae

A levedura Saccharomyces cerevisae é uma das principais produtoras da enzima


invertase (-D-futofuranosídeo frutohidrolase E.C.3.2.1.26). Esta enzima é um produto
valioso devido a seu uso em provas analíticas, em confeitarias e na hidrólise de sacarose
para a produção de xarope invertido. A invertase, também, tem sido empregada para
melhorar a utilização de certos substratos tais como sacarose e melaço de cana-de-
açúcar por microorganismos, nos processos de fermentação alcoólica e produção de
alguns metabólitos. A sacarose é o substrato necessário para a produção de invertase,
sendo o melaço, um subproduto da manufatura de açúcar, rico em sacarose utilizado
para a produção de invertase por S. cerevisiae. O Brasil possui muitas usinas de açúcar e
álcool e, conseqüentemente, gera grandes quantidades de melaço de cana. [4]
No processo de liberação de proteínas, particularmente hidrolases, a parede
celular representa uma barreira na transferência destas moléculas para o exterior das
células. Vários métodos têm sido utilizados para a obtenção de produtos microbianos
intracelulares, sem inativá-los como o ultra-som, por exemplo.[5]

O experimento teve como objetivo estudar a cinética da reação catalisada pela


enzima invertase de Saccharomyces cerevisiae, e, assim determinar os valores de Km e
Vmáx das reações.
2. Materiais e Métodos

Foram enumerados onze tubos de ensaio, e um para o Branco (B). Pipetou-se em


cada um dos tubos, exceto tubo B, 4,0 mL de solução de sacarose nas diferentes
concentrações (tubo 1 = 4mL de sacarose 1g/L; tubo 2 = 4mL sacarose 2g/L; até o tubo
10 = 4mL sacarose 10g/L). Logo após incubou-se os onze tubos de ensaio a 40°C por
cinco minutos. Em seguida adicionou-se 1,0 mL de solução enzimática, diluído 1:30 em
relação ao extrato bruto, em cada um dos tubos em intervalos regulares de trinta
segundos. Feito isso manteve os onze tubos a 40°C por dez minutos. Após os dez
minutos adicionou-se 1,0 mL de água destilada no tubo B e transferiu-se 0,5mL de cada
tubo para onze tubos de ensaio grandes.

Em seguida para a determinação de açúcares redutores usou-se o método de


Somogyi-Nelson, para isso pipetou-se 0,5 mL de amostra mais 1,0 mL de reagente SNI
em tubos de ensaio numerados. Agitou-se os tubos e os colocou em banho-maria em
ebulição por seis minutos. Logo após, foram levados a um banho de gelo para esfriá-los
até temperatura ambiente. Adicionou-se 1,0 mL do reagente SNII, agitou-se os tubos e
colocou-os em repouso por cinco minutos. Após os cinco minutos adicionou-se 10 mL
de água destilada e misturou-se por inversão. Calibrou-se o espectrofotômetro com a
solução branco do tubo B e mediu-se a absorbância a 540 nm.

3. Resultado e discussões
Foi feita a linearização gráfico 1 através dos dados da tabela 1, a qual obteve-se a
equação que mostra a concentração de açúcares redutores.
4. Referência bibliográfica

[1]LEHNINGER, A. L.; NELSON, D. L.; COX, M. M. Principios de Bioquimica. 4ed.


São Paulo: Sarvier, 2006. 1202 p.

[2] Cinética enzimática .Disponível


em<http://www.enq.ufsc.br/labs/probio/disc_eng_bioq/lista_exerc/cinetica_enzimatica.
pdf> Acessado em 4 de Dezembro de 2010.

[3] Cinética enzimática. Disponível em <http://wapedia.mobi/pt/Cin


%C3%A9tica_enzim%C3%A1tica> Acessado em 4 de Dezembro de 2010.

[4] BARLIKOVA, A.; SVORE, J. E MIERTUS, S. (1991), Hybrid biosensor for


determinations of sucrose. Analytica Chimica Acta, Amsterdan, v. 247, p. 83-87.

[5] Bokossa, I. P. et al. (1993), Biosynthesis of invertase by Saccharomyces cerevisiae


with sugarcane molasses as substrate. World Journal of Microbiology and
Biotechnology, Oxford, v. 9, p. 662-663.

Você também pode gostar