VIII.
- Capítulo 13 biótico que permita evolucionar hacia una
Aproximación biotecnológica
integrada para un manejo sustentable
del estrés biótico en frutilla
Castagnaro, Atilio Pedro;
Salazar, Sergio Miguel; Zembo, Juan Carlos
Díaz Ricci, Juan Carlos
Introducción
La frutilla cultivada (Fragaria x ananassa:
2n=8x=56) es un poliploide con 56
cromosomas resultante de la hibridación
interespecífica entre dos especies de frutillas
silvestres, también octoploides. Una de es-
tas frutillas es originaria del sur (F. chiloensis:
2n=8x=56) y la otra del norte de América (F.
virginiana: 2n=8x=56). La x en el nombre
científico hace referencia a su condición de
híbrido. Se trata de un importante fruto que
se consume en fresco o industrializado y que
es muy apreciado en prácticamente todo el
mundo. Su cultivo involucra dos actividades
agronómicas bien diferenciadas: la produc-
ción de frutas y la viverística, las cuales gene-
ran una gran demanda de mano de obra
(alrededor de 500 jornales /Ha /año), por lo
cual en muchos países es considerado tam-
bién como un cultivo social.
Si bien se realiza mejoramiento genético
en distintos lugares de Asia, Europa y Norte
América, el mercado de variedades está do-
minado por empresas estadounidenses. En
Argentina, a partir de 1996 comenzó a fun-
cionar, en forma organizada, el Programa
Nacional de Mejoramiento Genético de la
Frutilla (Pro\Frutilla) a través de una iniciativa
interinstitucional (sectores público y privado)
e interdisciplinaria (combina el mejoramien-
to genético convencional con los métodos
surgidos de la biotecnología molecular), que
en 1999 representó a nuestro país en la ex-
posición «Flanders Technology International-
Technoland», en Gante, Bélgica.
El objetivo general del Pro\Frutilla es ob-
tener cultivares argentinos adaptados a por
lo menos dos agroecosistemas o ambientes
de selección (el subtropical de Lules en
Tucumán y el templado del cinturón hortícola
del Gran La Plata, en Buenos Aires), con re-
sistencia incrementada a estrés de origen
Biotecnología y Mejoramiento Vegetal
agronomía menos reñida con la salud huma-
na y ambiental (principalmente sin bromuro
de metilo) y para que empresas viveristas lo-
cales puedan aprovechar las ventajas com-
parativas de exportación de plantines de
genética nacional en contraestación con los
países del hemisferio norte.
Reconocimientos
En este capítulo se describen en forma
resumida los trabajos realizados y los logros
obtenidos con este programa donde, ade-
más de los autores, participaron los siguien-
tes investigadores (en orden alfabético):
Marta Arias, Elsa Camadro, Nadia Chalfoun,
Paula Filippone, Gabriela García, Hugo Lázaro,
Cecilia Lemme, Alicia Inés Mamaní, Gustavo
Martínez Zamora, Luis Mroginski, Marta
Ontivero, Graciela Terada, Ursula Tonello y
Gabriel Vellicce.
1 Mejoramiento genético
El Pro\Frutilla se basa en un esquema de
selección recurrente (Fig. 1) delimitado por
tres niveles de domesticación:
1) Poblaciones Comerciales, representa-
das en la Figura 1;
2) Poblaciones Intermedias o Tampones,
donde se intenta llevar a cabo hibridaciones
interespecíficas;
3) Poblaciones Silvestres, en las cuales se
realizan cruzamientos dentro de cada espe-
cie y/o nivel de ploidía.
En una primera etapa, se realizaron reco-
lecciones y se estableció un Banco de
Germoplasma activo, constituido por
genotipos de especies silvestres (Fragaria
vesca: 2n=2x=14; F. chiloensis: 2n=8x=56;
Duchesnea indica: serie poliploide 2n=8x y
10x=56 y 70, respectivamente) y de la culti-
vada F. x ananassa. Estudiando caracteres
citogenéticos, morfológicos y anatómicos
pudo identificarse una nueva especie silves-
tre, Potentilla tucumanensis (2n=2x=14), que
es endémica del Noroeste Argentino y se
encuentra en peligro de extinción. Esta es-
pecie fue clasificada de manera errónea a
principios del siglo XX como Potentilla
367
norvegica, especie decaploide típica de los
países nórdicos.
Paralelamente a la caracterización botá-
Figura1. Esquema de selección recurrente seguido en las poblaciones comerciales (mayor nivel de domesticación)
nica, en el marco de las mencionadas Pobla-
ciones Intermedias (2) y siguiendo un esque-
ma dialélico incompleto, se realizaron 500 cru-
zamientos interespecíficos entre accesiones
silvestres de Fragaria vesca, Duchesnea in-
dica, Potentilla tucumanensis y 9 genotipos
de la cultivada F. x ananassa. Este estudio
permitió detectar barreras pre y poscigóticas
de aislamiento reproductivo entre estas es-
pecies. A fin de conocer la naturaleza de las
barreras, se investigó el crecimiento del tubo
polínico en el pistilo utilizando microscopia
de fluorescencia (Fig. 2) y se realizaron estu-
dios histológicos de aquenios. Este conoci-
miento permitirá diseñar estrategias que
posibiliten la transferencia de genes de inte-
rés agronómico desde los genotipos silves-
tres a los domesticados.
Figura 2. Compatibilidad del cruzamiento. Incompatible:
el grano permanece sin germinar en el estigma (izda.).
Compatible: varios granos de polen crecen a través del
estilo (centro). Medianamente compatible: Sólo unos
pocos granos de polen atraviesan el estilo (dcha.).
368 CASTAGNARO, A.P.; SALAZAR, S.M.;ZEMBO J.C.;DÍAZ RICCI, J.C.
En la actualidad, se dispone de dos
genotipos promisorios en etapas avanzadas
de evaluación y selección clonal, llamados 96/
6-5 y 96/6-6, donde el número anterior a la
barra, indica el año de cruzamiento (en este
caso 1996), el que le sigue indica la familia o
cruza, en este caso cv. Chandler x cv. Oso
Grande) y el último número es arbitrario y
responde a un ordenamiento interno del
programa.
2 Cultivo in vitro de meristemas,
micropropagación y evaluación de la
variación somaclonal
Debido a que el cultivo de meristemas po-
sibilitaría sanear la mayor parte de las virosis,
no se ha profundizado demasiado en el es-
tudio y caracterización de los virus que afec-
tan a la frutilla y desde un punto de vista agro-
nómico estas enfermedades no están den-
tro de los principales pro-
blemas del cultivo. Este
mismo razonamiento
podría aplicarse para la
enfermedad sistémica
(bacteriosis) provocada
por Xanthomonas
fragariae.
Se estudiaron las condiciones de cultivo
in vitro para sanear y multiplicar diferentes
genotipos de frutilla, entre ellos el cultivar
Camarosa, que es la variedad más cultivada
en el mundo. A su vez y mediante caracteri-
zación fenotípica y marcadores genotípicos
del tipo RAPD (del inglés Randomly Amplified
Polymorphic DNA), se investigó la eventual
inducción de variación somaclonal en ciclos
sucesivos de multiplicación de este cultivar.
La tasa de multiplicación de las plantas in
vitro fue evaluada utilizando dos formu-
laciones salinas en el medio de cultivo (N30K
y MS) y diferentes concentraciones de Figura 3. La previa inoculación con un patógeno
cinetina (0,25, 0,5 y 0,75 mg/L). La mejor tasa avirulento desencadena una respuesta defensiva
de multiplicación se obtuvo en el medio N30K de protección cruzada contra el patógeno virulento
suplementado con 0,25 mg/L de cinetina, sin (izda.). Planta control infectada con un patógeno
que se detectara variación somaclonal des- virulento (dcha.).
pués de tres ciclos sucesivos multiplicación.
Este resultado nos permitió proponer por 2) Se caracterizaron los hongos
primera vez el uso de un procedimiento para patógenos del género Colletotrichum rela-
el saneamiento y la micropropagación comer-
cionados con la enfermedad de la
cial de la variedad Camarosa.
antracnosis. Esto permitió detectar una res-
puesta sistémica de protección cruzada des-
3 Interacción planta-patógeno
encadenada por un patógeno avirulento,
que además puede ser inducida por el mi-
A diferencia de otros productos agroa-
croorganismo (patógeno) inactivado y/o por
limentarios, las hortalizas se consumen
extractos del mismo, lo que puede tener tan-
mayoritariamente en fresco, lo que implica
to implicancias conceptuales como biotecno-
que no pueden llevar residuos de pesticidas.
lógicas (Fig. 3). Los estudios histopatológicos
Por otro lado, la práctica agronómica deberá
evolucionar, indefectiblemente, hacia nuevos Tabla1:
sistemas productivos que minimicen la utili-
zación de agroquímicos sintéticos. El proble- ESPECIE EC50 (uM)
ma principal del cultivo de la frutilla son
las enfermedades fúngicas. El manejo de Bacterias
estas enfermedades, donde una de las más Gram positivas
importantes es la antracnosis Clavibacter michiganensis 0.07
Staphylus aureus 0.14
(Colletotrichum sp.), involucra el uso masivo
Enterococcum faescium CRL 35 0.20
de pesticidas contaminantes como el Bacillus subtilis 0.25
bromuro de metilo, que además de ser tóxi- Listeria monocytogenes 0.28
co destruye la capa de ozono, y cuya elimina- Gram negativas
ción ya fue pautada desde Naciones Unidas. Xanthomonas fragariae 0.06
En este contexto el Pro\Frutilla está lle- Xanthomonas axonopodis pv citri 0.07
vando a cabo una investigación básica que Pseudomona auruginosa 0.12
permita desarrollar estrategias de biocontrol. Pseudomona siringae pv. gladiolii 0.27
Para ello: Erwinia carotovora 0.95
Salmonella newport 3.25
1) En primer lugar, se aislaron los agentes E.coli D21 4.00
etiológicos locales de las enfermedades más Hongos
importantes (especies pertenecientes a los Colletotrichum fragariae 8.92
géneros: Colletotrichum, Botrytis, Colletotricum acutatum 7.91
Colletotrichum gloeosporioides 9.37
Micophaerella, Xanthomonas, etc.) y se
optimizaron metodologías de infección con- EC50 = concentración efectiva para el 50 % de inhibición

trolada que posibilitaron la evaluación

en plantas que manifiestan la respuesta de
fenotípica certera de la resistencia/ suscepti-
defensa revelaron la presencia de cristales no
bilidad de los materiales fitotécnicos del Ban-
característicos de la especie F. x ananassa, un
co de Germoplasma del Pro\Frutilla.
incremento en la síntesis de almidón (activi-

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 369

dad metabólica), un mayor número de
cloroplastos y un engrosamiento de las pa-
redes celulares, lo que contribuye a aumen-
tar el espesor de la semilámina.
Por otra parte, se purificaron y caracteri-
zaron compuestos antimicrobianos prefor-
mados (fitoanticipinas, para diferenciarlos
de las fitoalexinas, cuya formación en la
planta es inducida por un microorganismo)
que fueron llamados Fragarinas. Uno de és-
tos, llamado Fragarina 1, cuando es aplicado
en forma exógena, desencadena además
una respuesta defensiva en la planta. Esto
implicaría que más allá de su efecto como an-
tibiótico (Tabla 1), que permeabiliza la mem-
brana plasmática, estaría de alguna manera
participando en la señalización de la respues-
ta de defensa. Actualmente, se analiza la po-
tencialidad de extractos o compuestos de
este tipo como principios activos en la for-
mulación de agroquímicos naturales de bajo
impacto ambiental.
4 Marcadores moleculares
Aprovechando la versatilidad de la técni-
ca de RAPD lo primero que se planteó fue
investigar la similitud genética entre las es-
pecies silvestres relacionadas con la frutilla
cultivada y se desarrollaron los primeros mar-
cadores moleculares específicos de especie,
que permitieran la detección de híbridos
interespecíficos putativos. Del mismo modo,
pero usando electroforesis en geles de
poliacrilamida de alta resolución, se genera-
ron 37 marcadores genotípicos actualmente
Figura 4. Marcadores moleculares. A. Perfiles diferenciales de RAPD
indican diversidad genética entre distintas accesiones de un mismo
cultivar de frutilla. B. Marcador AFLP asociado a la resistencia a C.
acutatum, presente en Progenitor (PR) e híbridos resistentes (HR) y
ausente en progenitor (PS) e híbridos susceptibles (HS).
370 CASTAGNARO, A.P.; SALAZAR, S.M.;ZEMBO J.C.;DÍAZ RICCI, J.C.
disponibles para la identificación inequívoca
de las 8 principales variedades de frutilla cul-
tivadas en la Argentina. Utilizando esta
aproximación pudieron diferenciarse tres ac-
cesiones distintas del cultivar Pájaro, que ha-
bían sido multiplicadas en forma indepen-
diente, confirmando la importancia del aná-
lisis del ADN para evitar errores en la identifi-
cación de cultivares (Fig. 4a).
Sobre la base de la información obtenida
en los experimentos donde se evaluó la re-
sistencia/ susceptibilidad de los genotipos del
Banco de Germoplasma frente a diversos
patógenos fúngicos, se diseñaron cruzamien-
tos para obtener poblaciones segregantes
que posibilitaran investigar el control genético
de la resistencia. Así, para la principal enfer-
medad del cultivo, la antracnosis, se propu-
so un modelo basado en una interacción gen
a gen en un fondo genético octoploide, que
asume que la resistencia está determinada
por diferentes variantes alélicas de un gen R,
donde la susceptibilidad es parcialmente do-
minante sobre la resistencia y la respuesta
defensiva sería modulada por la dosis alélica
y por otros genes que interactuarían
epistáticamente con el gen R. Mediante BSA
(del inglés Bulked Segregant Analysis) se de-
tectaron marcadores AFLP (del inglés
Amplification Fragment Length Polymor-
phisms) ligados a la resistencia que pueden
contribuir a hacer más eficiente la selección
en el Pro\Frutilla (Fig. 4b).
5 Transgénesis
En virtud de las ventajas
que ofrece la transformación
genética mediada por
Agrobacterium tumefaciens,
preliminarmente se desarrolló
un protocolo de regeneración
de brotes a partir de discos de
hojas, con el que se conseguía
que el 70% de los explantos
cultivados regeneraran plantas
de frutilla. Este sistema de re-
generación fue utilizado para
optimizar una metodología de
transformación con la cepa de
Agrobac-terium tumefaciens
LBA 4404, portadora del
plásmido binario pBI121,
Figura 5. Transgénesis: A, Construcciones génicas portadoras de genes que
codifican proteínas antifúngicas (quitinasa, glucanasa y Ap24). B, Hojas
desprendidas de frutilla no transgénica (izda.) y transgénica resistente a Botrytis
(dcha.).
lográndose una eficiencia del 6,6 plantas
transgénicas por cada 100 discos de hojas
infectados con la bacteria.
Basados en este procedimiento, se obtu-
vieron 16 líneas transgénicas de frutilla cv
Pájaro, que expresaban uno o una combina-
ción de dos de los siguientes genes
heterólogos (Fig. 5a) que codifican proteínas
antifúngicas del grupo de las PR (proteínas
relacionadas con la patogénesis vegetal):
ch5B (codifica para una quitinasa de
Phaseolus vulgaris), gln2 (codifica para una
glucanasa de Nicotiana tabacum) y ap24 (co-
difica para una proteína del tipo de las
taumatinas de Nicotiana tabacum). Sola-
mente dos de estas líneas transgénicas, am-
bas portadoras de una copia simple del gen
ch5B, mostraron resistencia incrementada a
la enfermedad del moho gris (causada por
Botrytis cinerea, de gran incidencia en
agrosistemas subtropicales), aunque ningu-
na de las 16 evidenció cambios en su com-
portamiento frente a Colletotrichum
acutatum, una de las especies más agresivas
causante de la antracnosis.
De este modo, queda demostrada la uti-
lidad del gen ch5B para introducir resistencia
a Botrytis en frutilla (Fig. 5b), un patógeno
para el cual todavía no se han encontrado
fuentes de resistencia genética en la especie
F. x ananassa.
6 Caracterización molecular de genes de
interés
Actualmente se está aprovechando el
conocimiento que se tiene, tanto de los ma-
teriales fitotécnicos como de los sistemas de
compatibilidad, incompatibilidad y de protec-
ción cruzada caracterizados, para aislar genes
implicados en los mecanismos defensivos, si-
Biotecnología y Mejoramiento Vegetal
guiendo al menos dos aproximaciones distin-
tas:
i) Mediante la técnica de visualización de
la expresión diferencial de ARNms y la cons-
trucción (y posterior análisis) de genotecas
de ADNc por hibridación sustractiva.
ii) El clonado y caracterización de análo-
gos de genes de resistencia (RGA).
En el primer caso (i), se clonaron numero-
sos fragmentos de ADNc que codifican pro-
teínas relacionadas con la defensa vegetal
como quitinasas de tipo III o PR 8, proteínas
quinasas con un dominio de unión a calcio,
reguladores transcripcionales con dominios
homeóticos, miembros de la familia de las
enoil-CoA-hidratasa /isomerasa, etc. De es-
tos genes que están siendo analizados al
momento de escribir este capítulo, se desta-
ca uno que presenta una alta homología con
una glutation S tranferasa (GST) de zapallo
(Cucurbita maxima). Esta familia génica que
actúa en la detoxificación de compuestos al-
tamente oxidantes (especies reactivas de oxí-
geno) generados durante estrés tanto biótico
como abiótico, en Arabidopsis presenta
miembros que sólo se expresan en interac-
ciones planta /patógeno de tipo incompati-
bles (cuando no se produce enfermedad).
Respecto de la segunda aproximación (ii),
se utilizaron oligonucleótidos cebadores de-
generados diseñados a partir de secuencias
conservadas de la región NBS (del inglés
«Nucleotide Binding Site») de genes de resis-
tencia (R) clonados de otras plantas, para
amplificar por PCR, análogos de genes de re-
sistencia en genotipos silvestres y cultivados
de frutilla. Se identificaron al menos siete fa-
milias distintas de RGAs, de las cuales la ma-
yoría pertenecía a genes R de tipo TIR (del
inglés «Toll Interleukin Receptor»), similares
a los ya caracterizados en Arabidopsis, taba-
co y lino.
371
7 Conclusiones
En general, se podría decir que el caso del
Pro\Frutilla es un claro ejemplo de
complementación, interacción, integración y
coordinación, entre el mejoramiento
genético convencional y la biotecnología
molecular, para buscar soluciones a proble-
mas de estrés biótico asociados a un cultivo
de interés comercial, en un marco de
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