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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARA

PHABLO SÁVIO ABREU TEIXEIRA

CARACTERIZAÇÃO DO TREINAMENTO FÍSICO


EXPERIMENTAL DE ENDURANCE EM ESTEIRA ADAPTADA
ATRAVÉS DE MARCADORES METABÓLICOS ENERGÉTICOS

FORTALEZA – CEARÁ
2010
PHABLO SÁVIO ABREU TEIXEIRA

CARACTERIZAÇÃO DO TREINAMENTO FÍSICO EXPERIMENTAL


DE ENDURANCE EM ESTEIRA ADAPTADA ATRAVÉS DE
MARCADORES METABÓLICOS ENERGÉTICOS

Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado Acadêmico


em Ciências Fisiológicas do Centro de Ciências da Saúde
da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial
para obtenção do grau de Mestre em Ciências Fisiológicas.

Orientadora: Profa. Dra. Vânia Marilande Ceccatto

FORTALEZA – CEARÁ
2010
PHABLO SÁVIO ABREU TEIXEIRA

CARACTERIZAÇÃO DO TREINAMENTO FÍSICO EXPERIMENTAL


DE ENDURANCE EM ESTEIRA ADAPTADA ATRAVÉS DE
MARCADORES METABÓLICOS ENERGÉTICOS

Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado Acadêmico


em Ciências Fisiológicas da Universidade Estadual do
Ceará, como requisito parcial para obtenção do grau de
Mestre em Ciências Fisiológicas.

Aprovada em:____/____/____

BANCA EXAMINADORA

____________________________
Profª. Drª Vânia Marilande Ceccatto (Orientadora)
Universidade Estadual do Ceará - UECE

____________________________
Prof. Dr José Henrique Leal Cardoso
Universidade Estadual do Ceará - UECE

____________________________
Prof. Dr Carlos Alberto da Silva
Universidade Federal do Ceará - UFC
A minha querida mãe Gerli e as
minhas irmãs Ludimila e Thalyta
AGRADECIMENTOS

Em primeiro lugar a DEUS e por todos os mensageiros de luz que me auxiliaram na


construção desta pesquisa.

Agradeço a minha mãe por sua inspiração, diante das dificuldades que nos esbarraram durante
o percurso. Agradeço também ao meu pai pela contribuição de vida e enorme incentivo. Ao
meu Sensei Rogério e Elizete, pelos pais que são pra mim. As minhas queridas irmãs
Ludimila e Thalyta e a minha namorada Priscila, por todo carinho e compreensão. A minha
grande amiga Cláudia.

A Dra Vânia Marilande Ceccatto, minha orientadora, por acreditar no meu trabalho e
contribuir para execução de minha missão neste mestrado.

A todos que fazem o mestrado, em especial ao Dr. José Henrique Leal Cardoso e à Dra. Aline
Alice Cavalcante Albuquerque, coordenadores do Mestrado. Meus sinceros agradecientos
também aos funcionários, Ecila, secretária, Lindalva, auxiliar de secretária, ao Pedro, técnico
de laboratório e ao Franck.

A todos os professores do mestrado que me auxiliaram a conquista da formação acadêmica,


Dra Sandra, Roselí, Cristiane Calado, Cláudia e ao Dr. Krishinamurt.

O meu muito obrigado ao Dr. Bruno Cardi, ex-orientador, pela contribuição a obtenção deste
título.

Aos meus colegas Tanes e Gustavo, que se esforçaram junto comigo na execução e sucesso
deste trabalho. Ao meu amigo Igor por nossas longas horas de discussão e aprimoramento
deste Projeto. Aos colegas de inciação científica Flavinho, Morgana, Howard e aos de
mestrado Luís Jr, Walber, Kerli, Tiago, Patrick, Joca, Soujanya, Eder, Fleury, Bete, Rafael,
Rômulo.

Aos professores da USP-SP na qual tive a excelente oportunidade de conhecê-los e


principalmente colaborarem para os resultados colhidos nesta Dissertação: alunos Júlio,
Bianco, Max e Aline pertencentes à Escola de Educação Física e Esporte (EFFE-USP), ao
Carlos Hermano, Kaio, Renato, Haroldo, Ronaldo alunos de doutorado do Instituto de
Ciências Biomédicas da Universidade Estadual de São Paulo (ICB-USP); e aos professores
Doutores: Rui Curi, Fábio Bessa, José Cipolla e Lisete Compagno (ICB-USP) e a Patrícia
Brum (EEFE-USP). Amigos estes que prestaram colaboração fundamental e de extrema
importância neste projeto.

Aos meus colegas André Aciolly e Alex Ferraz, pioneiros na área da pesquisa do esforço em
nosso laboratório, pela confiança na obtenção dos resultados satisfatórios encontrados neste
estudo.

E por fim ao Instituto Superior de Ciências Biomédicas (ISCB), a Universidade Estadual do


Ceará (UECE), a toda colaboração finançeira da FUNCAP durante o período de mestrado e ao
auxilio financeiro as passagens aéreas cedidas pela CAPES/ CNPQ.
Embora nínguem possa voltar atrás e
fazer um novo começo, podemos
começar agora e fazer
um novo
fim.

Chico Xavier
ÍNDICE

1 INTRODUÇÃO .............................................................1Erro! Indicador não definido.


2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ................................................................................. 22
2.1. TREINAMENTO FÍSICO ................................................................................... 22
2.2. SINALIZADORES ENERGÉTICOS METABÓLICOS .................................... 24
2.3. LIMIARES METABÓLICOS ............................................................................. 25
2.3.1. Vias Metabólicas envolvidas na produção de ATP ....................................... 27
2.3.2. Prescrição do Treinamento Físico pela concentração de Lactato sanguíneo 29
2.3.3. Testes Exaustivos com coletas sanguíneas para dosagem de Lactato e
análise de Glicemia ................................................................................................. 30
2.3.4. Determinação do Máximo Estado Estável do Lactato através de Testes
contínuos com cargas independentes e análise de Glicemia ................................... 30
2.4. ATIVIDADE MÁXIMA ENZIMÁTICA: CITRATO SINTASE ....................... 32
2.5. COTEÚDO DE GLICOGÊNIO .......................................................................... 33
2.6. CONTRATILIDADE E ATIVIDADE ATPase .................................................. 35
2.7. MARCADORES MOLECULARES PROTÉICOS AO TREINAMENTO
FÍSICO ........................................................................................................................ 37
2.7.1. Quantificação protéica de PGC-1α no Músculo Esquelético ........................ 37
2.7.2. Quantificação protéica de PDK 4 no Músculo Esquelético e Fígado ........... 40
2.7.3. Quantificação protéica de Hexoquinase II no Músculo Esquelético............. 42
2.7.4. Quantificação protéica de ACCp no Fígado ................................................. 43
2.7.5. Quantificação protéica de Citocromo C no Fígado ....................................... 44
2.8. CONCENTRAÇÃO DE NITRITO: ÓXIDO NÍTRICO ..................................... 45

3 OBJETIVOS .............................................................................................................. 47
3.1 GERAL ................................................................................................................. 47
3.2 ESPECÍFICOS: ..................................................................................................... 47
4 MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 49
4.1. DELINEAMENTO EXPERIMENTAL: ............................................................. 49
4.1.1. Materiais Biológicos ..................................................................................... 49
4.1.2. Grupos Experimentais ................................................................................... 49
4.1.3. Treinamento Físico ........................................................................................ 51
4.1.4. Laboratórios .................................................................................................. 52
4.2. AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE FÍSICA: ..................................................... 54
4.2.1.Teste Exaustivo ............................................................................................. 54
4.2.2. Análise do Limiar Anaeróbio e concentração de Glicemia........................... 55
4.2.3. Determinação da concentração de Lactato e Glicemia no Repouso ............. 56
4.2.4. Teste Progressivo com incremento de Carga até a Exaustão ........................ 56
4.2.5. Determinação do Máximo Estado Estável do Lactato através de Testes
contínuos com cargas independentes e análise de Glicemia ................................... 57
4.3. SACRIFÍCIO DOS ANIMAIS: ........................................................................... 59
4.3.1.Laboratórios .................................................................................................. 59
4.4. AVALIAÇÃO DA COMPOSIÇÃO CORPORAL: ............................................ 60
4.4.1. Massa Corporal ............................................................................................. 60
4.5. AVALIAÇÃO BIOQUÍMICA DO MÚSCULO ESQUELÉTICO: .................... 60
4.5.1. Dosagem Máxima da enzima Citrato Sintase ............................................... 60
4.6. COTEÚDO DE GLICOGÊNIO .......................................................................... 61
4.7. CONTRATILIDADE E ATIVIDADE ATPase .................................................. 62
4.8. QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNA: WESTERN BLOTTING ...................... 63
4.9. CONCENTRAÇÃO DE NITRITO: ÓXIDO NÍTRICO .................................... 64
4.10. TRATAMENTO ESTATÍSTICO ...................................................................... 65

5 RESULTADOS .......................................................................................................... 66
5.1. AVALIAÇÃO DA MASSA CORPORAL: ......................................................... 70
5.2.1. Testes Exaustivos com coletas sanguíneas para dosagem de Lactato e
análise de Glicemia ................................................................................................. 72
5.2.2. Determinação do Máximo Estado Estável do Lactato através de Testes
contínuos com cargas independentes e análise de Glicemia ................................... 77
5.3. ATIVIDADE MÁXIMA ENZIMÁTICA: CITRATO SINTASE ....................... 86
5.4. COTEÚDO DE GLICOGÊNIO .......................................................................... 91
5.5. CONTRATILIDADE E ATIVIDADE ATPase .................................................. 93
5.6. MARCADORES MOLECULARES PROTÉICOS AO TREINAMENTO
FÍSICO ........................................................................................................................ 94
5.6.1. Quantificação protéica de PGC-1α no Músculo Esquelético ........................ 94
5.6.2. Quantificação protéica de PDK 4 no Músculo Esquelético e Fígado ........... 96
5.6.3. Quantificação protéica de Hexoquinase II no Músculo Esquelético............. 98
5.6.4. Quantificação protéica de ACCp no Fígado ............................................... 100
5.6.5. Quantificação protéica de Citocromo C no Fígado ..................................... 101
5.7. CONCENTRAÇÃO DE NITRITO: ÓXIDO NÍTRICO ................................... 102
5.8. RESUMO DOS RESULTADOS ....................................................................... 105

6 DISCUSSÃO ............................................................................................................ 108


7 CONCLUSÃO.......................................................................................................... 144
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................... 145
LISTA DE QUADROS

QUADRO 1: Resumo da metodologia executada para o desenvolvimento deste projeto pré e pós

Sacrifício ..................................................................................................................................... 48

QUADRO 2: Protocolo de familiarização e adaptação a Esteira ................................................ 52

QUADRO 3: Protocolo de treinamento dos animais .................................................................. 53

QUADRO 4: Esquema de execução para determinação do limiar de lactato ............................. 57

QUADRO 5: Esquema de coletas durante execução de teste para determinação do máximo estado

estável do lactato ......................................................................................................................... 58

QUADRO 6: Massa dos órgãos .................................................................................................. 66

QUADRO 7: Correlação do lactato com a glicemia nos testes de determinação do máximo estado

estável do lactato sanguíneo ........................................................................................................ 86


LISTA DE FOTOS

FOTO 1: Imagem detalhada das raias adaptadas na esteira ergométrica utilizada para o treinamento

dos animais .................................................................................................................................. 51

FOTO 2: Ilustração dos procedimentos de manuseio durante período de repouso (caixa = 6), local de

treinamento (raias = 6) e luz vermelha utilizada com comprimento de onda não visível .......... 52

FOTO 3: Ilustração do processo de calibração do capilar com heparina para leitura da Glicemia (10

µL), marcação, corte da cauda e mensuração da Glicemia sanguinea ........................................ 55

FOTO 4: Ilustração do processo de calibração do capilar com heparina para leitura do Lactato (25 µL),

marcação, corte da cauda e mensuração da Lactato sanguinea ................................................... 55

FOTO 5: Lâmina colhida em análise histoquímica de músculo gastrocnêmio de rato, apresentando

diferentes fibras do tipo I (lentas oxidativas), IIa (intermediárias glicolíticas-oxidativas) e IIb (rápidas

glicolíticas), departamento de Educação Física da USP, em julho/2009 ................................... 63


LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

Abreviatura Nome

ACCp Acetil CoA carboxilase fosforilada


Acetil-Coa Acetil coenzima A
ADP Adenosina difosfato
AG Ácidos Graxos
AGIM Ácidos Graxos Intramusculares
AGL Ácidos Graxos Lívres
AMP Adenosina monofosfato
AMPK Adenosina Monofosfato Quinase
ATP Adenosina trifosfato
ATPase Adenosina trifosfatase
CEUA Comitê de Ética para o Uso de Animais
CFMV Conselho Federal de Medicina Veterinária
Cit C Citocromo C
CK Creatina kinase
cm Centímetro
CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
Coa Coenzima A
CS Citrato Sintase
dl Microlitro
DNA Adenina dinucleotídeo
Ex A. Int Exercício de alta intensidade
Ex B. Int Exercício de baixa intensidade
g Gramas
GB Gastrocnêmio Porção Branca
GV Gastrocnêmio Porção Vermelha
HE Hematoxilina e eosina
HK Hexoquinase
ISCB Instituto Superior de Ciências Biomédicas
LA Limiar Anaeróbio
LAC Lactato sanguíneo
LAN Limiar anaeróbio
LL Limiar de Lactato
M Molar
m/min Metros por minuto
MCT Transportadores Monocarboxilatos
MFEL Máxima fase estável de lactato
mg Miligrama
mg Miligrama
mg/mL Miligramas por mililitro
MHC Cadeia pesada de miosina
mL Mililitro
NADH Nicotinamida adenina dinucleotideo
ºC Celsius
PBS Tampão fosfato
PCr Creatina fosfato
PDC Complexo Piruvato Desidrogenase
PDK Piruvato desidrogenase quinase
PGC-1α Proliferador de peroxissoma gama ativado coactivator receptor alfa
pH Potencial hidrogenionico
Pi Fosfato inorganico
RNAm Acido ribonucleico mensageiro
SED Sedentário
TCA Ácido tricarboxílico
TE Teste Exaustivo
TG Triacilglicerol
UECE Universidade Estadual do Ceará
UFC Universidade Federal do Ceará
μg Micrograma
RESUMO

Ratos vêm sendo utilizados como modelo experimental em estudos que avaliam o efeito do
treinamento físico na melhoria da performance e no comportamento de doenças crônicas
degenerativas. Dessa forma, a padronização de protocolos que avaliam a capacidade física
dos animais torna-se extremamente importante para obter um controle fidedigno desta
variável. A realização de testes com velocidade progressiva até a exaustão tem como objetivo
identificar o limiar anaeróbio ou de lactato, importante indicador da capacidade de realização
de exercícios de endurance. O máximo estado estável do lactato sanguíneo torna-se também
um excelente indicador de performance, representando a equalização da máxima capacidade
de entrada e remoção do lactato sanguíneo. Objetivou-se caracterizar o método para medida
de lactato sanguíneo em ratos durante teste com velocidade progressiva e teste com
velocidade contínua para identificar o máximo estado estável do lactato sanguíneo para ratos
em esteira adaptada e analisar marcadores metabólicos energéticos ao treinamento físico.
Foram utilizados inicialmente 20 animais, dos quais 12 ratos foram selecionados pelo teste de
esforço (TE), exercitados (n=6) e sedentários (n=6), com idade de 60 dias. Os animais foram
submetidos nas duas primeiras semanas que antecederam ao TE, ao processo de adaptação e
adaptação a esteira. A prescrição do treinamento a 60% foi baseado no teste exaustivo,
velocidade inicial de 0,3 km/h e incremento de velocidade (0,2 km/h) a cada 3 min, durante 6
semanas. Ao final do treinamento foram novamente realizados os testes exaustivos, para
análises de velocidade total, distância percorrida e tempo final de exaustão. Nos testes com
velocidades progressivas, no repouso e a cada 3 minutos, e nos testes com velocidades
contínuas, no repouso e a cada 7 minutos, amostras de sangue (25µL) para dosagem de lactato
(Yellow Springs 1500) e (10 µL) para análise do comportamento da glicemia (glicosímetro
Accu-chek Active) foram coletadas via artéria caudal durante realização do esforços.
Verificou-se o limiar anaeróbio e o máximo estado estável do lactato nos animais do estudo e
a melhora da performance quanto a metabolização do lactato para os animais exercitados.
Observou-se também, uma boa correlação da glicemia com o lactato com o ganho de aptidão
física no teste de velocidade progressiva. Foi verificado aumento da atividade enzimática da
citrato sintase no músculo esquelético, coração e fígado. Encontrou-se maior conteúdo de
glicogênio na musculatura esquelética dos animais treinados. Aumento da atividade ATPase
da fibra muscular tipo I, indicadora de elevação de fibras oxidativas nos animais exercitados.
Foi observado elevação da expressão protéica de PGC-1α, indicadora de biogênese, de PDK4,
HKII, ACCp e Citocromo C no músculo esquelético e fígado dos animais submetidos ao
protocolo de treinamento. Foi analisado também aumento da concentração de nitrito,
indicadora da presença de óxido nítrico no coração e músculo esquelético dos animais
exercitados. Concluiu-se que a prescrição do treinamento a 60%, obtido no teste exaustivo
inicial sem coleta sanguínea, corresponde ao máximo estado estável do lactato, sendo por
tanto um método confiável de prescrição de exercício aeróbio ou de endurance. A
padronização dos protocolos de avaliação foram eficientes em avaliar o limiar anaeróbio e a
performance ao treinamento. A intensidade empregada no treinamento foi satisfatória em
causar adaptações funcionais e estruturais, observadas pela elevação das atividades
enzimáticas e pela expressão de proteínas pertencentes ao metabolismo energético.

Palavras-chave: Desempenho, Treinamento, Lactato, Metabolismo, Músculo Esquelético.


ABSTRACT

Rats have been used, as an experimental model, in studies that evaluate the effects of exercise
training in improving performance and in degenerative diseases behavior. Thus,
standardization protocols that evaluates animal physical capacity is extremely important to get
a reliable control of this variable. Increasing speed tests until exhaustion aims to identify the
anaerobic threshold or lactate, an important indicator of ability to perform endurance
exercises. The blood lactate maximum steady state also becomes an excellent performance
indicator, representing the equalization of the maximum input capacity and blood lactate
removal. This study aimed to characterize the method for measuring blood lactate in rats
during increasing speed test and continuous speed test in order to identify the blood lactate
maximal steady state for rats on adapted treadmill and analyze energy metabolic markers of
physical training. Were initially used 20 animals, of which 12 rats were selected by the stress
test (TST), exercised (n = 6) and sedentary (n = 6), aged 60 days. The animals underwent to
the process of treadmill habituation and adaptation in the first two weeks till TE. The training
prescription of 60% was based on exhaustive testing, initial speed of 0.3 km / h increase in
speed (0.2 km / h) every 3 min for 6 weeks. At the end of training, exhaustive tests for
analysis of total speed, distance traveled and total exhaustion time was, again, conducted. In
progressive speeds tests, at rest and every three minutes, and in continuous velocities tests, at
rest and every seven minutes, blood samples were collected (25μl) for lactate ratio analysis
(Yellow Springs 1500) and (10 l) behavior of blood glucose analysis (glucometer Accu-chek
Active) via the caudal artery during completion of efforts. It was detected the anaerobic
threshold and maximum lactate steady state in the studied animals, the performance
improvement as well the lactate metabolism of exercised animals. There was also expressive
correlation with blood glucose and lactate in physical fitness improvement at increasing speed
test. Higher levels of citrate synthase enzyme activity in skeletal muscle, heart and liver were
detected. Higher glycogen content in trained animals skeletal muscles also were found.
Indicating elevated oxidative fibers in exercised animals, was found an ATPase activity
increased in muscle fiber type I. An elevated PGC-1α protein expression was detected,
indicating mitochondrial biogenesis. Levels of PDK4, HKII, ACC and cytochrome C in rats
skeletal muscle and liver were also elevated in the trained animals. Increased nitrite
concentrations were also founded in the heart, indicating nitric oxide concentration in the
exercised animal hearts. It was concluded that the training prescription up to 60% obtained
from the exhaustive test without blood collection corresponds to the maximum lactate steady
state, and therefore being a reliable method for aerobic or endurance exercise prescription.
The standardization of assessment protocols was effective in assessing the anaerobic
threshold and performance of training. The training intensity used was satisfactory in causing
functional and structural adaptations, observed by enzyme activity elevation and energy
metabolism proteins expression.

Keywords: Performance, Training, Lactate, Metabolism, Skeletal Muscle.


19

1 INTRODUÇÃO

A atividade física é considerada como uma das tônicas do século XXI. Longe dos
modismos e discussões paralelas, a atividade física pode ser conceituada como uma condição
na qual ocorre uma elevação da exigência de diversos sistemas orgânicos com subsequente
ativação de mecanismos de mobilização de substratos energéticos, através das vias aeróbias
ou anaeróbias. A atividade física não é sinônima de exercício físico, sendo este, definido
como toda atividade física planejada, estruturada e repetitiva que tem por objetivo a melhoria
e a manutenção de um ou mais componentes da aptidão física (NOAKES, 2006). Os
benefícios do treinamento regular à saúde humana são inúmeros. Sabe-se que o treinamento
regular induz a diversas adaptações homeostáticas em diferentes sistemas fisiológicos como,
por exemplo, os de ordem cardiorrespiratório, muscular, etc. (COGGAN; WILLIAMS, 1995)
que por sua vez, são determinantes da performance para os seus usuários. As respostas
regulatórias desses sistemas frente ao treinamento físico variam de acordo com a intensidade,
duração, tipo de exercício e progressões empregadas.

O estudo da fisiologia do exercício e do treinamento físico vem deixando a sua


adolescência e se tornando uma ciência à parte, amadurecendo e propondo novos desafios
para o conhecimento fisiológico. Tanto que a principal agência de fomento à pesquisa
científica no Brasil, o Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico,
CNPq, discrimina atualmente, na sua tabela de áreas, dentro da Fisiologia especificamente, a
fisiologia do exercício. Em relação às principais áreas de interesse dentro desta disciplina,
vêm se destacando o estudo dos marcadores energéticos metabólicos em atividades aeróbias e
seus efeitos adaptativos na musculatura esquelética. A musculatura esquelética depende,
predominantemente, do metabolismo oxidativo para a manutenção das contrações necessárias
a continuidade do desempenho físico. Este requer a utilização de uma determinada taxa de
energia, através da hidrólise do ATP e que, consequentemente, necessita ser ressintetizada
constantemente (COGGAN; WILLIAMS, 1995).

As alterações moleculares e celulares ao exercício físico de endurance


resultam do aumento da disponibilidade de oxigênio, aumento da densidade mitocondrial
(biogênese mitocondrial), da atividade de enzimas oxidativas e transporte de substratos
20

metabólicos, como por exemplo, a melhora da cinética do lactato. Pode-se destacar também o
aumento a oxidação de gorduras, do transporte e utilização de glicose, além de alterações
morfológicas, incluindo maior proporção de fibras tipo I por área muscular, e aumento da
capilaridade (HANSEN et al. 2005). As adaptações crônicas, caracterizadas como sessões
repetidas de atividade contrátil, resultam na ativação de vias especificas de sinalização que
regulam a síntese ou degradação de proteínas específicas ao metabolismo energético frente ao
esforço físico (COFFEY e HAWLEY, 2007).

Os marcadores bioquímicos do treinamento são uma área de intenso interesse e


significativo avanço nas últimas décadas, em evolução com o aumento da importância da
atividade física na saúde humana. Podemos destacar a atividade da enzima citrato sintase, a
qual receberá destaque neste estudo, uma vez que é uma importante marcadora do
metabolismo oxidativo ao treinamento (BASSET; HOWLEY, 2000). Trabalhos vem
demonstrando que a adaptação músculo-esquelética funciona com a transição de fibras aos
quais caracterizam o uso predominante da via oxidativa frente ao treinamento de endurance
(HADDAD, 2001). Dessa forma, a transição efetuada pelas fibras musculares, revelada em
colorações específicas em cortes histoquímicos, também vêm sendo utilizada pelos
fisiologistas para determinar as adaptações crônicas ao treinamento (TAKEKURA et al.,
2001). A produção de lactato ocorre internamente no músculo esquelético, onde a
mensuração sanguínea durante exercício fornece informações precisas acerca do fornecimento
energético para execução do mesmo, implicando na utilização desse parâmetro como uma
ferramenta na prescrição e obtenção de treinamento (PYNE et al., 2001).

Desta forma este trabalho quer estabelecer uma análise comparativa entre os
parâmetros apresentados, utilizando ratos treinados em esteira adaptada. É importante
ressaltar que os protocolos de exercícios físicos experimentais apresentam resultados
contraditórios e algumas vezes inconsistentes quanto aos parâmetros orgânicos adaptativos ao
esforço (KRAEMER, 1999). Detre as inúmeras variáveis do treinamento, não é consenso na
literatura, à utilização de um determinado protocolo de exercício experimental ou
determinado marcador bioquímico padrão (BENEKE , 2003).

O Laboratório de Bioquímica e Cultura de Células, do Instituto Superior de


Ciências Biomédicas, vem testando diferentes protocolos e marcadores de exercício
21

experimental, tendo obtido alguns avanços neste campo. Estes parâmetros de treinamento
experimental ainda não foram otimizados. Este trabalho busca analisar parâmetros , utilizando
ratos em exercício, em esteira ergométrica adaptada, avaliando modificações fisiológicas,
como a atividade enzimática, histoquímica e o conteúdo protéico de enzimas envolvidas no
metabolismo energético.

Espera-se obter, pela caracterização destes parâmetros, uma diretiva objetiva, em


termos de treinamento experimental, buscando assim, padronizar e otimizar os protocolos de
exercício, assim como os marcadores bioquímicos e fisiológicos utilizados para os futuros
trabalhos que utilizam o treinamento aliado ao diabetes mellitus, a osteopenia ou osteoporose
em ratas, a insuficiência cardíaca, imobilização e outras linhas de pesquisa.
22

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 TREINAMENTO FÍSICO

Em decorrência da repetição de séries de exercícios durante dias, semanas ou


meses, surgem adaptações fisiológicas e bioquímicas, o que leva à melhora no desempenho de
tarefas específicas. A natureza e a magnitude da resposta adaptativa dependem da intensidade
e da duração dos exercícios, do tipo de treinamento, da frequência de repetição da atividade,
das limitações genéticas e do nível anterior de atividade do indivíduo. A sobrecarga adequada
a determinado indivíduo pode ser obtida por combinações variadas de intensidade, duração,
frequência e modo de treinamento. As adaptações ao treinamento são essencialmente
transitórias e reversíveis, bastanto somente alguns dias de interrupção para que ocorra redução
da capacidade metabólica (WILMORE, 2003).

As adaptações fisiológicas e metabólicas ao treinamento são específicas à


natureza da sobrecarga. Isso significa que o treinamento de velocidade e força, por exemplo,
produz alterações diferentes das geradas pelo treinamento de resistência ou endurance. Os
principais efeitos desse último sobre o músculo esquelético relacionam-se à sua capacidade
oxidativa (WILMORE, 2001). Torna-se necessário também programar um tempo suficiente
de recuperação regenerativa dentro de um programa de treinamento para permitir que as
adaptações ocorram, embora os fatores genéticos sejam determinantes da plasticidade
muscular de um indivíduo não treinado. A característica adaptativa do tecido muscular
permite que o treinamento produza alterações consideráveis em sua funcionalidade e
morfologia (HAWLEY, 2008).

Tem sido cada vez mais investigado a forma pela qual a atividade física atua e
interage de maneira a induzir adaptações estruturais e funcionais que aprimorem o
desempenho físico e propiciem resultados desejáveis à aquisição e manutenção de bons níveis
de aptidão física relacionada à saúde. Desta forma, o homem nem sempre pode ser utilizado
para tais investigações e as pesquisas experimentais de laboratório quase sempre lançam mão
do estudo da prática de exercícios em modelos animais, mais especificamente em ratos
MIYASAKA et al., 2003).
23

Encontra-se atualmente na literatura inúmeras possibilidades de exercícios físicos


utilizados para o treinamento de ratos em laboratório, desde exercícios voluntários em
ambiente de confinamento mais amplo ou rodas para caminhada voluntária (NOVELLI et al.,
2004), caminhadas e corridas com o uso de esteiras (CARVALHO et al.,2005; LIU et al.,
2002), natação em piscina funda com ou sem uso de sobrecarga (MEDEIROS et al., 2000) até
protocolos de levantamento de peso com estimulação elétrica (BARAUNA et al., 2005) ou
métodos de estimulação elétrica da contração muscular simulando o exercício (BOLSTER et
al., 2003).

O trabalho experimental com animais revela-se um importante instrumento para a


observação do organismo frente ao esforço físico, elaborados para simular aplicações em
treinamento físico (OLIVEIRA et al., 2005). O grupo de pesquisa do laboratório de cultura de
células e bioquímica vem, recentemente, testando e padronizando protocolos de avaliação, na
tentativa de melhor prescrever esforços crônicos a esses animais, em distintas condições
fisiológicas, submetidas ao exercício de corrida em esteira rolante adaptada. Devido à
facilidade de utilização e excelente resposta dos ratos frente ao treinamento fisico nesse
ergômetro, realizou-se um estudo de caracterização de marcadores fisiológicos adaptativos ao
treinamento. Em síntese, os resultados obtidos nesse estudo confirmam a padronização e a
utilização de protocolos invasivos e não invasivos para avaliação aeróbia e anaeróbia de ratos
submetidos ao exercício de corrida em esteira rolante adaptada, bem como a determinação de
intensidade de esforço para o controle rígido do treinamento adotado em modelos
experimentais.

Ratos vêm sendo utilizados como modelo experimental em estudos que avaliam o
efeito da atividade física no comportamento de doenças crônicas degenerativas, como
insuficiência cardíaca (KEMI et al., 2002), diabetes (OLIVEIRA et al., 2005), dentre outras.
Desta forma, a padronização de protocolos que avaliam a capacidade física dos animais torna-
se extremamente importante para obter um controle fidedigno desta variável. É de extrema
importância oferecer ferramentas capazes de avaliar a evolução dos parâmetros aeróbios e
anaeróbios, cujo treinamento físico seja abordado como condição funcional. Na literatura
científica observa-se que algumas investigações têm utilizado com sucesso avaliações
fisiológicas em ratos para identificação de intensidades alvo, como por exemplo, em
treinamento contínuo (SOUZA et al., 2003; VOLTARELLI et al., 2004), treinamento
24

intervalado (BRAGA et al., 2006) e periodizado (PAPOTI et al., 2007); além de respostas de
performances decorrentes de manipulações dietéticas (GOBATTO et al., 2005); obesidade
(SOUZA et al., 2003), diabetes experimental (OLIVEIRA et al., 2005); em diferentes
condições ambientais (MANCHADO et al., 2007) e destreinamento (CHIMIN et al., 2007).

2.2 SINALIZADORES ENERGÉTICOS METABÓLICOS

A ação muscular é consolidada na literatura científica como resultante de uma


série complexa de eventos fisiológicos e a incapacidade de manutenção do maquinário
contrátil durante uma determinada tarefa é definida como exaustão (St CLAIR GIBSON et
al., 2001). Durante testes de esforço máximo, como por exemplo, nos estágios finais de testes
progressivos realizados em esteira, frequentemente é observado o maior valor de captação,
transporte e utilização de O2 pelo organismo, designado como consumo máximo de oxigênio
ou VO2 max (BASSET; HOWLEY, 1997). A elevação na captação do O2 tem por objetivo
atender à elevação da demanda energética imposta pelos exercícios físicos durante testes
exaustivos, ao passo que a redução da oferta desse gás induz ao processo de anaerobiose, que
por sua vez, influencia na redução da tensão gerada pelos músculos (HARMS, 2000). Esse
comportamento foi inicialmente caracterizado por Taylor et al., (1955), quando atribuíram um
aumento inferior a 2,1 ml.kg-1.min-1 na captação de O2 com o incremento de carga,
estabelecendo assim, a presença do fenômeno denominado de platô.

Dessa forma, a presença do platô tem sido atribuída ao aumento da participação


do sistema glicolítico, que por sua vez, promoveria a exaustão pela depleção dos substratos
energéticos, ou especialmente, pela elevação da concentração dos íons de hidrogênio (H+),
oriundos do ácido lático (HARMS, 2000). A contribuição relativa de cada substrato para a
manutenção da demanda energética durante o exercício é determinada pela intensidade e
duração do esforço, como por exemplo, em estímulo agudo (GOEDECKE et al., 2000), em
adaptação crônica ao treinamento (COGGAN et al., 2000), pela dieta (BERGMAN e
BROOKS, 1986), dentre outras.

Nas fases iniciais do exercício de intensidade progressiva (~ 45% do VO2max) a


demanda energética é satisfatoriamente suprida por mecanismos oxidativos (ciclo de Krebs e
fosforilação oxidativa), através da degradação preferencial de ácidos graxos. No entanto, a
25

produção de energia por estes mecanismos é dependente da contínua conversão de glicogênio


a oxaloacetato condensada a acetil-CoA para formar citrato, uma vez que esta controla
diretamente a oxidação do acetil-CoA derivado tanto do piruvato de fontes de carboidratos
como de ácidos graxos (GOEDECKE et al., 2000). A depleção dos estoques hepático e
muscular de glicogênio, possível de ocorrer durante o exercício prolongado, limita a produção
de oxaloacetato e da atividade oxidativa (ODLAND et al,. 2000).

Com o aumento da intensidade do exercício (~ 45% a 70% do VO2 max) a


oxidação de ácidos graxos em relação à oxidação de glicogênio diminui progressivamente,
inibida principalmente pelo maior fluxo de substratos através da via glicogenolítica/glicolítica
e pelo aumento da atividade da enzima piruvato desidrogenase (PDH) (ODLAND et al.,
2000). Após a transição exercício moderado-intenso (~ 75% do VO2max), a demanda
energética passa a ser suprida predominantemente pela glicogenólise e pela glicólise hepática
e muscular com subsequente acúmulo sanguíneo de lactato e íons H+. A alteração do pH
intramuscular afeta a atividade das enzimas glicogenolíticas e glicolíticas, como
consequência, observa-se a diminuição da produção de energia pela via glicolítica, gerando
fadiga ou exaustão (COLLINS et al., 2000).

2.3 LIMIARES METABÓLICOS

As crescentes investigações nos últimos anos, buscando uma melhor compreensão


dos vários aspectos que interferem no treinamento físico e que são utilizados como
parâmetros de prescrição do exercício, tem sido tema de questionamentos que buscam
identificar outras variáveis que podem ser de grande importância para o desenvolvimento
desta área de estudo (AVELAR et al., 2007).

Indicadores de aptidão aeróbia como o consumo máximo de oxigênio (Vo2 máx)


(HOWLEY et al., 1995) e o limiar anaeróbio (LA)(SVEDAHL et al., 2003) têm sido
frequentemente utilizado na avaliação funcional em diferentes populações. O LA, por
apresentar alta correlação com a performance aeróbia, destaca-se no campo da avaliação
funcional, sendo aplicado como marcador de adaptação ao treinamento. O termo limiar
anaeróbio (LA) representa a fase do exercício onde ocorre um aumento brusco de CO2 e de
26

lactato sanguíneo, refletindo uma mudança nas vias produtoras de ATP em direção à via
metabólica anaeróbia (WASSERMAN e MCILROY, 1964).

Outro método tem se destacado, visando identificar o LA, que é o da resposta da


glicemia durante o exercício progressivo (SIMÕES et al., 1998). A distribuição de glicose
para a contração do músculo esquelético, segundo o autor, parece sofrer um aumento durante
o exercício como consequência de um grande aumento do fluxo sanguíneo, embora isto não
possa explicar totalmente uma maior captação de glicose (HAYASHI et al., 1997). A
amplitude do aumento da captação de glicose induzida pelo exercício está relacionada com a
duração e intensidade da atividade. Esse é o resultado do aumento progressivo do transporte
de glicose nos sarcolemas e do aumento do metabolismo devido à menor quantidade de
glicose-6-fosfato, já que o nível de glicogenólise muscular cresce à medida que o exercício
continua (WASSERMAN e FUEGER, 2006). Estudos têm demonstrado que, no exercício
anaeróbio, a glicemia pode elevar-se a níveis superiores ao estado de repouso. A maior
produção de lactato, nesta modalidade de exercício, aumenta a atividade neoglicogênica,
resultando em um aumento da glicemia (SILVA et al., 2006).

A resposta da glicemia tem sido foco de recentes estudos buscando a sua relação
com os outros parâmetros já existentes. Avelar et al., (2007), buscaram comparar o limiar
anaeróbio determinado por variáveis ventilatórias e o limiar glicêmico individual em ciclistas,
encontrando uma relação entre as duas variáveis, o que referencia a ideia da adoção do limiar
glicêmico individual para determinar o limiar anaeróbio em ciclistas. Outro estudo, onde se
realizaram testes em esteira ergométrica buscando comparar protocolos diretos de lactato,
glicose e consumo máximo de oxigênio (VO2), e protocolos indiretos (velocidade crítica e
velocidade média em 3 km) para avaliar a aptidão aeróbia, verificou-se que os autores
encontraram uma alta correlação entre as variáveis estudadas (SILVA et al., 2005).

O conhecimento da intensidade correspondente ao limiar de lactato e ao


comportamento da glicemia sanguínea pode ter importância prática na prescrição de
intensidades, quer seja para indivíduos fisicamente ativos, ou portadores de algum distúrbio
metabólico, como no caso da diabetes. Os raros estudos dessa natureza têm sido conduzidos
em atletas (RIBEIRO et al., 2004) e em indivíduos fisicamente ativos (não-atletas) (SIMÕES
et al., 2003). A identificação do LA, utilizando-se o lactato, parece delimitar, pelo menos em
27

indivíduos saudáveis, domínios de intensidade com predomínio de captação e produção de


glicose sanguínea. Entretanto, aspectos como nível de aptidão funcional, estado de
treinamento, presença ou não de outros fatores de risco como obesidade e hipertensão, podem
modificar tanto as intensidades absolutas como as relativas de ocorrência do LA (MATTERN
et al., 2003).

A realização de teste progressivo máximo até a exaustão tem como objetivo


identificar o ponto onde ocorre mudança no comportamento metabólico, pois que o limiar
anaeróbio é um importante indicador da capacidade de realização de exercícios de endurance
(PILIS et al., 1993). O teste de máximo estado estável do lactato sanguíneo torna-se também
um excelente indicador da performance de endurance (BALDARI e GUIDETTI, 2000),
representando a equalização da máxima capacidade de entrada e remoção do lactato
sanguíneo (JONES e CARTER, 2000; BILLAT, 2003). A padronização da curva de lactato
sanguíneo durante os testes progressivos e os testes de máxima estabilização do lactato, com e
sem coleta de sangue, foram de grande valia para esta pesquisa e para o desenvolvimento de
um protocolo de treinamento físico.

2.3.1 Vias metabólicas envolvidas na produção de ATP

A energia consumida durante o exercício físico, gerada pelas diferentes vias


metabólicas, torna-se um dos principais fatores limitantes da atividade física. Dessa forma, a
otimização deste sistema pode levar à melhora da capacidade de realizar exercício físico
(PILIS et al., 1993).

A oxidação da glicose e a produção de ATP estão associadas à redução de NAD+.


Como o NAD+ existe nas células em concentrações limitantes, a manutenção do
funcionamento da glicólise depende da reoxidação do NADH. A disponibilidade de NAD+
ocorre através de dois processos diferentes, segundo a disponibilidade de oxigênio. Em
aerobiose, em que se utiliza o oxigênio para oxidar o NADH; e em anaerobiose, onde o
piruvato produzido pela glicólise serve como aceptor dos elétrons do NADH, sendo reduzido
a Lactato (PILEGAARD et al., 2005).
28

A produção de ATP pela via aeróbia apresenta melhor eficiência em relação à via
anaeróbia, pois a via aeróbia é capaz de produzir maior número de ATPs por molécula de
glicose degradada. Dessa maneira, quanto menor a ativação da via anaeróbia, maior é a
otimização de energia. A hiperativação da via metabólica anaeróbia traz também como
consequência uma série de alterações sistêmicas e locais causadas pelo aumento da
concentração de lactato sangüíneo, prejudicando a continuidade do exercício físico e
tornando-se então, um fator limitante na realização da atividade física. A proporção de
ativação da via metabólica responsável pela geração de energia está diretamente relacionada à
intensidade do exercício. De maneira geral, exercícios físicos realizados em intensidades
baixas utilizam predominantemente energia produzida pela via aeróbia, ativando o ciclo de
Krebs na produção de NADH e utilizando oxigênio como aceptor final de elétrons na
regeneração do NAD+ (SVEDAHL et al., 2003).

Com o aumento da intensidade do exercício físico, há uma maior ativação do


sistema e maior demanda de oxigênio, porém existe uma intensidade ideal onde a captação e
utilização de oxigênio pela musculatura esquelética alcança um patamar, ou ativação ótima. A
partir deste ponto o oxigênio torna-se um elemento limitante na produção de energia pela via
aeróbia. Dessa forma, a ativação da via metabólica anaeróbia age com o intuito de compensar
a ineficiência da via aeróbia em regenerar NAD+, pois a constância na regeneração de NAD+
em NADH é primordial na manutenção da oferta energética. Assim sendo, quanto maior a
intensidade do exercício físico, maior a ativação da via metabólica anaeróbia para a
manutenção da oferta energética, causando como consequência o aumento das concentrações
de lactato tanto local quanto circulante, levando à fadiga muscular (GOEDECKE et al.,
2000).

O ácido lático é capaz de promover a redução do pH devido sua rápida


dissociação (aumento de íons H+), promovendo algumas alterações não compatíveis com a
atividade física. Dentre elas podemos citar a inibição da atividade enzimática glicolítica-
glicogenolítica, o deslocamento de Ca+ do complexo troponina-tropomiosina impedindo a
formação do complexo actinomiosina e, ainda, a estimulação de receptores de dor, resultando
em manifestação de fadiga (PLISK, 1991). Os músculos esqueléticos produzem lactato
durante o exercício físico, o qual é liberado na corrente sanguínea ou acumulado nas fibras
musculares.
29

Não se conhece efeito inibitório direto do ácido lático no metabolismo energético


intramuscular, assim como nos processos de contração (PILEGAARD et al., 2003). Porém, o
aumento da concentração de lactato no tecido muscular eleva a osmolaridade, acumulando
água no interior das células. Este da pressão intramuscular pode reduzir a circulação
sanguínea local, assim como promover a diluição iônica (ROBERTS e SMITH, 1989).

Como citado anteriormente, a concentração intramuscular elevada de ácido lático


promove aumento de íons H+ com redução do pH, o que deprime as propriedades contráteis
das miofibrilas musculares e a atividade de algumas enzimas-chave dos sistemas energéticos,
das vias glicolíticas e oxidativas. A acidose, portanto, reduz a utilização do glicogênio e da
glicose intramusculares, assim como a liberação de lactato em músculos estimulados (ROTH,
1991). Dessa maneira, a eficiência pela qual as fibras musculares controlam a liberação do
lactato produzido para o sangue deve desempenhar um importante papel na resistência
muscular à fadiga (PILEGAARD et al., 2003).

2.3.2 Prescrição de treinamento físico pela concentração de lactato sanguíneo

Concentrações de lactato sanguíneo têm sido utilizadas como índice de prescrição


de exercício físico devido à grande capacidade de expressar tanto as atividades centrais, como
oferta de oxigênio e substratos, quanto às atividades periféricas na musculatura específica em
determinado esforço, sendo que as concentrações de lactato circulante são melhores
indicadores de adaptações ao treinamento físico de endurance quando comparados com VO2
máx (ROBERTS et al., 1989).

Em humanos, a concentração de lactato sanguíneo aumenta exponencialmente


com a intensidade do exercício. O ponto onde ocorre a perda da exponencialidade da curva do
lactato sanguíneo versus a carga durante o exercício progressivo é considerado o limiar de
lactato sanguíneo ou limiar anaeróbio (LA), embora a anaerobiose como causa da produção
acelerada de lactato vem sendo questionada (BROOKS, 1986). O LA ocorre numa frequência
entre 50 e 80% da máxima carga, numa concentração de lactato sanguíneo em
aproximadamente 4 mmol/L (MADER e HECK, 1986).
30

A determinação do limiar anaeróbio tem grande aplicabilidade na avaliação da


capacidade de endurance (VOLTARELLI et al., 2002). Atualmente, as medidas de limiar
anaeróbio são muito populares para a avaliação da eficiência do treinamento para o atleta,
assumindo que quanto maior o LA, maior a capacidade de endurance do indivíduo (JONES e
CARTER, 2000).

2.3.3 Testes exaustivos com coletas sanguíneas para dosagem de lactato e análise da
glicemia

As concentrações circulantes de lactato são relativamente proporcionais à


intensidade do exercício físico realizado, sendo que após o limiar anaeróbio ou limiar de
lactato, ponto onde ocorre um aumento brusco da razão de produção e remoção do lactato, as
concentrações de lactato se elevam rapidamente, resultado de uma maior participação da via
anaeróbia na produção de ATP (BROOKS, 1986). Desta forma, a realização de exercícios
progressivos máximos até a exaustão, utilizando incrementos constantes, torna-se
extremamente importante na análise do comportamento do lactato sanguíneo, possibilitando
apontar a fase em que ocorre a descompensação entre produção e remoção do lactato.

Heck e colaboradores (1985) descreveram sucintamente a cinética do lactato em


humanos, padronizando a concentração de 4 mmol/L como o limiar anaeróbio. Dessa forma, o
lactato pode contribuir como parâmetro fisiológico para a prescrição de treinamento físico,
pois se acredita que as maiores adaptações ao treinamento físico de endurance estão
diretamente relacionadas a exercícios físicos realizados na intensidade do LA. Stegmann e
colaboradores (1981) observaram que o LA pode variar numa escala de 2 a 7,5 mmol/L.
Dessa maneira, definiu-se como limiar a maior intensidade de exercício físico que pode ser
mantida sem um aumento da concentração de lactato durante 30 minutos de exercício físico.

2.3.4 Determinação do máximo estado estável do lactato sanguíneo através de testes


contínuos com cargas independentes e análise da glicêmia

Segundo La Fontaine et al., (1981), o máximo estado estável do lactato representa


a intensidade máxima de exercício onde a capacidade de remoção do lactato sanguíneo
permite compensar sua produção, sendo considerada a intensidade de esforço que promove
maiores adaptações fisiológicas ao treinamento aeróbio.
31

Tendo em vista a importância da determinação do LA para a prescrição do


treinamento físico para ratos, buscou-se através deste experimento conhecer e padronizar a
curva de lactato sanguíneo durante testes físicos exaustivos e do máximo estado estável do
lactato durante o exercício físico em ratos (BILLAT, 2003). Para avaliação aeróbia de animais
corredores, o máximo estado estável do lactato, é interpretado como o método padrão ouro,
embora os testes de lactato mínimo e de duplos esforços não exaustivos propostos na
literatura são capazes de estimar a máxima intensidade com predominância aeróbia de
maneira muito satisfatória, haja vista sua padronização com base no máximo estado estável do
lactato (VOLTARELLI et al., 2002). Observa-se ainda em caso de impossibilidade de análise
lactacidêmica, a utilização do modelo exaustivo de potência crítica para avaliação aeróbia e
anaeróbia de ratos, já que esse método necessita apenas de um ergômetro e um cronômetro.

Beneke (1995) determinou a lactacidemia sanquínea, onde definiu o máximo


estado estável do lactato como a mais alta intensidade na qual o metabolismo aeróbio ainda
prepondera sobre o anaeróbio, sendo considerada atualmente, o método padrão-ouro para a
determinação da intensidade de transição dos substratos energéticos, que entram na via do
metabolismo aeróbio. A resposta lactacidêmica para mensuração da intensidade é dependente
do ergômetro, ou mesmo do tipo de exercício utilizado por esses indivíduos, o que implica
cuidados na generalização da prescrição do treinamento pela concentração de lactato
sanguíneo (MANCHADO et al., 2006). Dessa forma, é considerado um método seguro para
identificação da capacidade aeróbia, o que justifica em muitos estudos a utilização desse
procedimento na avaliação de indivíduos ativos e atletas de alto rendimento.

A padronização de protocolos de avaliação experimental em laboratório


envolvendo exercício em circuitos de esteira ou em piscina adaptada pode ser determinada por
avaliações de esforços físicos ao comportamento da lactato (VOLTARELLI et al., 2004).
Avaliações ergométricas através de esteira rolante em circuito adaptado foram utilizadas para
detecção do LA, objetivando observar a resposta lactacidêmica para mensurar o nível de
aptidão física em animais e humanos (PILIS et al., 1993). Animais realizaram teste com
aumento progressivo de velocidade em esteira, com coletas de sangue a cada cinco minutos,
com posterior determinação do LA por análise do comportamento exponencial da curva de
lactacidêmica. O LA foi obtido a 25 m/min com concentração de lactato a 4 mM. A
32

concentração de lactato encontrada nos animais assemelha-se a concentração encontrada em


seres humanos. Não foi encontrado comportamento exponencial da curva de lactato sanguíneo
em exercício envolvendo natação (GOBATTO et al., 2001), o que sugere a necessidade de
maior preocupação acerca dos estudos e validação dos protocolos utilizados com animais e
consequente distinção das respostas do lactato em diferentes ergômetros.

2.4 ATIVIDADE MÁXIMA ENZIMÁTICA: CITRATO SINTASE

A enzima citrato sintase é uma enzima transferase que controla o primeiro passo
ciclo de krebs também conhecido como ciclo do ácido cítrico ou tricarboxílico. A citrato
sintase (CS) está localizada no interior das células, mais especificamente na matriz
mitocondrial, na qual é codificada pelo DNA nuclear. É sintetizada utilizando-se dos
ribossomos do citoplasma sendo posteriormente transportada para a matriz mitocondrial. É
comumente utilizada como marcador quantitativo da enzima pela presença intacta da
mitocôndria. A enzima cataliza a reação de condensação de um resíduo de acetato contendo
dois carbonos de uma acetil coenzima A com uma molécula de oxaloaceto contendo quatro
carbonos para formar um citrato de seis carbonos (WILMORE, 2001). O oxaloacetado será
regenerado após completada uma volta no ciclo de Krebs. Exemplo: Acetil-CoA +
Oxaloacetato + H2O - Citrato sintase – Citrato + CoA-SH.

Vários estudos têm utilizado a atividade de enzimas mitocondriais para confirmar


ou não a influência do exercício físico na adaptação oxidativa do músculo esquelético de
ratos. Porém, alguns estudos têm demonstrado respostas inconsistentes quanto à atividade da
citrato sintase (CS) submetidos a treinamento de endurance. Em (2006), Ricardo e
colaboradores, encontraram um aumento significativo na atividade da CS no músculo sóleo
de ratos, após o programa de treinamento. Da mesma forma, o clássico estudo de Alessio e
Goldfarb (1988), verificou que o treinamento em esteira aumentou a atividade da CS no
músculo gastrocnêmio dos animais duas vezes a mais do que o grupo controle sedentário. Em
outro estudo, foi demonstrado um importante aumento na atividade da CS em diferentes
músculos esqueléticos de ratos jovens e de meia-idade, após nove semanas de treinamento em
protocolo de natação (RÁDAK et al., 1999).
33

No entanto, Pereira et al., (1994) observou atividade da CS diminuída após


estímulo crônico. As diferenças analisadas entre os estudos estão possivelmente relacionadas
aos diferentes tipos de fibras musculares utilizadas; aos diferentes protocolos de treinamento
variando quanto aos aspectos de intensidade, duração, tipo de exercício e parâmetros de
progressão de treinamento; ou a diferentes métodos para determinação da atividade CS; ou
ainda, com as adaptações moleculares diferenciadas (modificações translacional e/ou pós-
translacional) na adaptação da CS durante e após treinamento físico (LEEK et al., 2001).

A escolha do músculo sóleo, na maioria das investigações, deve-se ao fato deste


músculo possuir uma grande quantidade de fibras vermelhas (aproximadamente 95%), as
quais caracterizam o uso predominante da via oxidativa. A atividade da enzima CS foi
determinada a partir da quantificação do complexo formado. O treinamento físico de natação
levou a um aumento de 52% na atividade máxima da enzima citrato sintase (103,75±2,57 vs.
157,81±2,2 nmol/ mg.proteína) nos ratos sedentários e treinados, respectivamente (SILVA et
al., 1997). Com relação à adaptação músculo esquelética crônica ao treinamento físico de
natação, observou-se que os ratos aumentaram a atividade máxima da CS (VIEIRA et al.,
1988). De fato, outros autores já haviam demonstrado que o treinamento físico aeróbio com
natação é eficiente em aumentar a atividade máxima enzimática (LANCHA, 1991).

Vários estudos têm sido realizados para determinar a influência do treinamento


físico na adaptação das enzimas mitocondriais no músculo cardíaco (OSCAI et al., 1971;
POWERS et al., 1998). Embora a maioria dos estudos sugira que o treinamento não induza
alterações enzimáticas mitocondriais perceptíveis no músculo cardíaco (ABDELMALKI et
al., 1996; ZONDERLAND et al., 1999). A análise das respostas crônicas da CS na atividade
enzimática na musculatura esquelética, cardíaca e no fígado, torna-se importante uma vez que
possibilita confirmar e esclarecer possíveis melhoras adaptativas ao desempenho em testes
físicos.

2.5 CONTEÚDO DE GLICOGÊNIO

O exercício físico demanda intenso consumo de trifosfato de adenosina (ATP) que


pode aumentar em dezenas de vezes dependendo da intensidade e duração do esforço. Nos
34

músculos esqueléticos, há sistemas muito eficientes que possibilitam a ressíntese constante do


ATP que está sendo utilizado para a contração muscular. Estes sistemas são os da
fosfocreatina, glicólise e o da fosforilação oxidativa. O glicogênio é preservado havendo
maior utilização de ácidos graxos (AG) como substratos energéticos (WEGENER et al.,
1996).
Essa preferência dos músculos esqueléticos pelos AG é muito importante em
exercícios físicos de longa duração ou endurance, já que os lipídios armazenados no
organismo na forma de triacilglicerol (TG) representam o principal estoque de energia
disponível (NEWSHOLME e LEECH, 1983). Por outro lado, o glicogênio, imprescindível
durante o exercício físico, possui um estoque relativamente limitado, que necessita ser
preservado para continuar sendo utilizado concomitantemente aos AG, porém, em menor
proporção, até o final do esforço.

O total de energia estocado na forma de TG é cerca de 60 vezes maior que aquele


como glicogênio. Desta forma, o aprimoramento da oxidação dos AG durante o exercício
possibilita manter a atividade física por períodos mais prolongados e retarda a depleção do
glicogênio e a hipoglicemia. Por exemplo, no homem, uma massa aproximada de 9.000 g de
lipídios é suficiente para fornecer 81.000 Kcal. Este estoque permitiria um homem adulto
andar 259 horas ou correr durante 67 horas. Por outro lado, o estoque de glicogênio muscular
(350 g) fornece 1.400 Kcal, o que permitiria caminhar por apenas 4,8 horas ou correr durante
1,2 horas (WEGENER et al., 1996). Outra vantagem dos AG é sua eficiência energética (9
Kcal.g-1 ), mais que 2 vezes a do glicogênio/glicose (4 Kcal.g-1). Pelos motivos acima e de
acordo com a lei da conservação de energia, todo excesso de energia proveniente da
alimentação, incluindo gorduras, carboidratos e proteínas, é armazenado na forma de TG.

O estoque de glicogênio muscular é suficiente para pouco mais de uma hora de


esforço de intensidade moderada, fazendo com que os músculos dependam também da
captação de glicose circulante para manter a contração. Por sua vez, a manutenção da
glicemia é fundamental, principalmente para preservar a função cerebral, uma vez que sua
depleção esta diretamente ligada à exaustão (IVY et al., 1980). Por isso, analisar os ajustes
que ocorrem com o treinamento quanto ao aumento da eficiência na mobilização dos AG e a
elevação dos estoques de glicogênio muscular, tornam-se importantes para explicar os
mecanismos de melhoria da performance.
35

2.6 CONTRATILIDADE E ATIVIDADE ATPase

No decorrer de décadas, estudiosos vem se debruçando em pesquisas objetivando


esclarecer os reais mecanismos funcionais da musculatura esquelética quando submetidas a
aumento de intensidade durante exercício, visto que estes promovem aumento da tensão
muscular esqueletal, tornando o tecido muscular suscetível a adaptações quanto a habilidade
contrátil rápida e lenta (mATPase) (TAKEKURA et al., 2001).

As fibras musculares têm a capacidade de alterar suas propriedades morfológicas e


bioquímicas de acordo com os estímulos a que são submetidas, refletindo na quantidade ou
tipo de proteína muscular. Esta capacidade adaptativa (plasticidade muscular) envolve
diferentes componentes da fibra. O músculo de mamíferos é composto por uma população
heterogênea de tipos de fibras musculares. Esta diferença constitui a base da variedade e
eficiência na funcionalidade do músculo. As formas para a classificação das fibras musculares
que oferecem maior fidelidade baseiam-se no perfil protéico da cadeia pesada da miosina,
sendo que as técnicas mais utilizadas são: o método histoquímico (tipagem de fibras) através
de análise da atividade ATPase (STARON, 2000). O fundamento da análise histoquímica
baseia-se no fato de que a enzima ATPase tem como função hidrolisar o ATP durante o
processo de contração muscular. A análise da atividade ATPase na cadeia de miosina pesada
(MHC) em diferentes pHs, permite que as fibras sejam classificadas como sendo de contração
lenta as do tipo I e contração rápida as do tipo II (PETTE; STARON, 2000).

Alterações no predomínio de um ou outro tipo de fibra servem como base


fisiológica para as numerosas intervenções destinadas a aumentar o desenvolvimento da força
e da sustentação do músculo, por outro lado, alterações na composição do tipo de fibra de um
músculo também podem ser responsáveis por algumas das alterações ou disfunções vistas em
indivíduos que ficaram sujeitos a grandes períodos de imobilidade, inatividade, ou
desnervação do músculo, indicando a capacidade de resposta muscular a um estímulo,
decorrente de alterações das isoformas manifestadas pelas alterações na expressão das
isoformas da Cadeia Pesada de Miosina. São vários os estímulos que atuam sobre o músculo
esquelético promovendo alterações fisiológicas e moleculares. Dentre elas utilizaremos em
nosso estudo o treinamento com exercício físico em esteira adaptada. Pois que analisaremos
através deste estímulo as modificações ocorridas à atividade contrátil do músculo. Dentre as
várias alterações decorrentes dos diversos estímulos aplicados sobre o músculo, temos a
36

transição das fibras rápidas (tipo II) para lentas (tipo I), no exercício aeróbio (HADDAD,
2006).

Definida como aumento do número de fibras, a hipertrofia, sendo uma resposta


regulatória ao exercício, é encontrada principalmente no decorrer das fases mais adiantadas do
exercício, dado que o maior sobrepeso promove uma adaptação regenerativa notável nas
fibras musculares esqueléticas, de acordo com trabalhos de (ARGAW et al., 2004),
corroborando dessa forma com os estudos realizados por (JACKSON et al., 1990), quando
encontraram respostas hipertróficas em músculo quadríceps submetidos a treinamento de
resistência e força.

O treinamento físico causa adaptação metabólica às fibras musculares


esqueléticas, de forma que como essas miofibrilas não proliferam, a única maneira de elevar
positivamente o tecido muscular é elevando a espessura das mesmas, isso ocorre com o
surgimento de novas miofibrilas. De modo geral, o estresse mecânico causado pelo exercício
intenso ativa a expressão do RNA mensageiro (RNAm) e conseqüentemente a síntese protéica
muscular. As proteínas, estruturas contráteis do músculo, principalmente actina e miosina, são
necessárias para que as fibras musculares produzam mais miofibrilas. A célula muscular é
multinucleada, mas esses núcleos não proliferam, fazendo-se necessária a fusão de núcleos
provenientes de outras células com a fibra muscular. As células responsáveis por esta fusão
são as células satélites, onde estas se localizam entre a lâmina basal e o sarcolema das fibras
musculares e possuem o mesmo tamanho de um núcleo da célula muscular. Estas células são
células-tronco e desempenham um papel importante na regeneração do músculo
(ANDERSEN et al., 2000).

As células satélites possuem um núcleo que pode proliferar em resposta às micro-


lesões causadas pelo exercício no músculo esquelético. Estas micro-lesões atraem as células
satélites que se fundem e dividem o seu núcleo com a fibra muscular, dando o suporte
necessário para a transição do metabolismo energético dessas fibras. Como o número de
núcleos novos é maior do que o necessário para preencher o espaço deixado pelas micro-
lesões, a fibra muscular produz um número maior de miofibrilas, resultando em adaptação
muscular (LIEBER, 2002).
37

Existem basicamente dois tipos de hipertrofia, a aguda e a crônica. A hipertrofia


aguda, sarcoplasmática e transitória, pode ser considerada como um aumento do volume
muscular durante uma sessão de treinamento, devido principalmente ao acúmulo de líquido
nos espaços intersticial e intracelular do músculo. Outra teoria seria a do aumento no volume
de líquido e conteúdo do glicogênio muscular no sarcoplasma. Já a hipertrofia crônica pode
ocorrer durante longo período de treinamento de força, e está diretamente relacionada com as
modificações na área transversa muscular. Considera-se também o aumento de miofibrilas, do
número de filamentos de actina-miosina, conteúdo sarcoplasmático, tecido conjuntivo ou
combinação de todos estes fatores (ANDERSEN et al., 2000).

Sabe-se atualmente da existência de inúmeros tipos de fibras esqueléticas, mas


basicamente a estrutura esquelética é formada por tecido conjuntivo e por três tipos de fibras
musculares: do tipo I (lentas oxidativa), IIa (intermediárias oxidativa-glicolítica) e IIb (rápidas
glicolítica). Quando observadas individualmente, em resposta ao treinamento, as fibras
musculares adaptam-se, regenerando o estresse causado por micro-lesões, ocorrendo
alterações na velocidade de contração, oxidação, capilarização, resistência à fadiga, número e
no tamanho de mitocôndrias. (CROWTER et al., 2002). Por efeito da resposta ao treinamento,
as adaptações regulatórias do sistema neuromuscular sofrem mudanças no recrutamento de
unidades motoras, de forma que se tornam importantes fatores relacionados ao ganho de
aptidão física e desenvolvimento de força. Dessa maneira, a adaptação ao treinamento aeróbio
e anaeróbio, altera o padrão de recrutamento de unidades motoras relacionadas à contração
máxima voluntária (MCCARTHY et al., 2002).

2.7 MARCADORES MOLECULARES PROTÉICOS AO TREINAMENTO FÍSICO

2.7.1 Quantificação protéica de PGC-1α no músculo esquelético

A PGC-1α foi descrita inicialmente como uma co-ativadora dos receptores


proliferadores ativados de peroxissomo (PPAR), sendo uma proteína chave na
regulação do metabolismo energético celular; na termogênese; biogênese mitocondrial; na
oxidação de ácidos graxos; e gliconeogênese hepática (SCARPULLA, 2002; ANDERSSON e
SCARPULLA, 2001).
38

No decorrer de alguns anos, estudos realizados por pesquisadores na área do


metabolismo energético vêm analisando a participação de diferentes tecidos na homeostase
metabólica e as respostas da PGC-1α principalmente no músculo esquelético. Desde sua
descoberta, a PGC-1α representou um marco na compreensão da base molecular da adaptação
induzida pelo exercício físico na biogênese mitocondrial muscular e consequente função na
regulação do metabolismo do músculo esquelético envolvidas no metabolismo das gorduras
(PUIGSERVER et al., 1998; SCARPULLA, 2002). A expressão da PGC-1α tem sido relatada
em tecidos com alta atividade metabólica, incluindo o tecido adiposo, fígado, cérebro, coração
e principalmente músculo esquelético (ESTERBAUER et al., 1999). É comum observar a
todos estes tecidos uma elevação no número e diâmetro das mitocôndrias por motivo das
elevadas exigências energéticas frente ao esforço físico, sendo, portanto, capazes de responder
a um aumento da necessidade metabólica através da biogênese mitocondrial. Nos músculos
esqueléticos de ratos, a expressão da proteína PGC-1α está altamente correlacionada com a
elevação da densidade mitocondrial e capacidade oxidativa. A expressão da proteína PGC-1α
também difere marcadamente entre as fibras musculares, sendo mais elevadas em fibras tipo
IIa (Intermédiárias Glicolíticas-oxidativas) em relação as fibras tipo I (Oxidativas) e tipo IIb
(Glicolíticas), respectivamente, (IIa> I> IIb) (RUSSEL et al., 2003).

Apresenta-se bem caracterizado na literatura científica atualmente, os efeitos do


exercício físico crônico sobre a expressão protéica da PGC-1α (IRRCHER et al., 2003) e
sobre os efeitos agudos do exercício (TERADA et al., 2002, 2005; TERADA e TABATA,
2004). Normalmente, as alterações fisiológicas induzidas pela expressão da proteína PGC-1α
no músculo de roedores é de (1,5 para 2,8 vezes) em uma única sessão de exercício (2,0 a 2,5
vezes); (WRIGHT et al., 2007), e ao treinamento (de 1,5 para 2,5 vezes); (AKIMOTO et al.,
2005; SRIWIJITKAMOL et al., 2006).

As contrações musculares levam a um aumento rápido da ativação dos fatores de


sinalização dentro do músculo esquelético e a ativação dessas moléculas de sinalização serve
como o passo inicial para a expressão do gene e proteínas. Duas quinases particularmente
relevantes para regulação da expressão de PGC-1α induzida pelo exercício são ativadas por
mitógeno p38 proteína quinase (MAPK) e 5-AMP proteína quinase ativada (AMPK). A
AMPK é ativada nas células do músculo esquelético durante a contração, e parece ser um
39

estímulo para o aumento da PGC-1α no músculo (LEE et al., 2006). A AMPK fosforila
diretamente a PGC-1α, um processo que é essencial para a expressão desta proteína,
tornando-se um evento fundamental na promoção da biogênese mitocondrial em resposta a
contração muscular durante exercício físico . (JAGER et al., 2007).

Algumas análises levaram a hipóteses sobre a influência da PGC-1α sobre o


metabolismo dos carboidratos e dos lipídios. A expressão da PGC-1α aumentou a quantidade
de glicogênio intramuscular e apresentou um efeito poupador de glicogênio durante o
exercício físico (WENDE et al., 2007). Estes efeitos foram atribuídos ao transporte de
glicose, em que ocorreu redução do fluxo de fosforilação da via glicolítica e uma diminuição
na mobilização do glicogênio. No entanto, o aumento da taxa de oxidação do palmitoil
carnitina sugeriu que a oxidação lipídica aumentou e que pode também ter contribuído para as
mudanças no metabolismo dos carboidratos, resultando na afirmação de que a PGC-1α
aumentou tanto o transporte de glicose quanto de ácidos graxos para a oxidação no músculo
esquelético (BENTON et al., 2008b).

Em camundongos transgênicos que super expressam a PGC-1α, observou-se que


houve uma conversão entre 10% a 20% de fibras glicolíticas (tipo II) em fibras musculares
esqueléticas do (tipo I) oxidativas (LIN et al., 2002a). Em outro estudo com camundongos
KO, as modificações apresentaram respostas inversas, ou seja, mudanças oxidativas do tipo I
e tipo IIa para fibras tipo IIx e IIb, além de uma capacidade de resistência reduzida, danos nas
fibras, e elevada quantidade de marcadores de inflamação após corrida, porém neste estudo
faltou esclarecimento sobre a intensidade de esforço a que os animais foram submetidos
(HANDSCHIN et al., 2007a). Concluindo que o perfil metabólico do músculo esquelético é
alterado por PGC-1α. Aém da elevação da capacidade de utilização do substrato mitocondrial,
alguns estudos sugerem um necessário acréscimo da oferta de substrato, o que sugere que as
proteínas transportadoras de substrato também podem ser reguladas por PGC-1α. Pesquisas
mostraram que GLUT4, MCT1 e FAT/CD36, as quais regulam respectivamente o transporte
de glicose, lactato e ácidos graxos, foram aumentadas pela contração muscular em resposta ao
treinamento (BENTON et al., 2006b; BONEN et al., 1999, 2000).

O papel da PGC-1α na regulação do metabolismo tem sido bastante estudado, no


entanto, como regulador da utilização de glicose, durante a após avaliação funcional de
40

esforço, ainda não foi muito bem investigada. O papel da PGC-1α na captação de glicose é
conflitante, uma vez que foi relatado um possível papel na indução ou repressão da expressão
de transportadores de glicose (GLUT 4) no músculo esquelético. Dado que existem
mecanismos de controle recíproco da oxidação dos ácidos graxos e da glicose, é provável que
a PGC-1α exerça um papel regulatório direto, influenciando ambas as vias (BENTON et al.,
2006b).

2.7.2 Expressão proteica de PDK 4 no músculo esquelético e fígado.

O exercício físico de endurance induz uma série de adaptações no músculo


esquelético, incluindo o aumento da expressão das principais enzimas metabólicas e um
aumento global no conteúdo mitocondrial. A fosforilação oxidativa é crucial para o
metabolismo muscular esquelético, principalmente durante o exercício. Os hidratos de
carbono entram na mitocôndria através da descarboxilação do piruvato a acetil-CoA em uma
reação catalisada pelo complexo piruvato desidrogenase (PDC) (HOOD, 2001).

Esta reação enzimática irreversível desempenha um papel fundamental no


metabolismo muscular, pois representa o único ponto de entrada de carboidratos (resultante
da glicose na circulação sanguínea e do glicogênio intramuscular) na mitocôndria para
oxidação completa. Assim, é provável que a PDC desempenhe um papel fundamental na
regulamentação metabólica quanto ao destino da glicose, bem como a seleção do substrato a
ser utilizado pelo músculo esquelético. A PDC é composta de duas enzimas reguladoras; a
piruvato desidrogenase quinase (PDK) e a piruvato desidrogenase fosfatase (PDP). (HARRIS
et al., 2001; SUGDEN e HOLNESS, 2003).

Trabalhos pioneiros revelaram que a PDK é inibida alostericamente por elevadas


concentrações de piruvato gerados pela glicólise, considerando-se que a quinase é ativada por
uma alta concentração mitocondrial de acetil-CoA: CoA e NADH: NAD + (normalmente
decorrentes das elevadas taxas de ácido graxo da β-oxidação) (ROCHE et al., 2001). Estudos
revelaram a existência de quatro isoformas distintas de PDK (PDK 1 - 4) em tecidos de
mamíferos. A PDK1 é expressa predominantemente no coração, a PDK2 é expressa no estado
alimentado, PDK3 é encontrada nos testículos, rins e cérebro e a PDK4 é expressa
41

principalmente no coração e no tecido muscular esquelético (BOWKER-KINLEY et al.,


1998).

Observações sobre a importância da fosforilação-desfosforilação na regulação da


atividade da piruvato desidrogenase (PDC), foram realizadas há mais de três décadas atrás.
Hagg e colaboradores em 1976, afirmaram que essa interconversão parece desempenhar um
papel importante na regulação da oxidação do piruvato através do exercício físico, por vários
estados hormonais e nutricionais em trabalhos com roedores, resultando em aumento da
atividade da PDH (HENNING et al., 1975; BROZINICK et al., 1988) e em humanos (WARD
et al., 1982; PUTMAN et al., 1993).

WU et al., (1999) foram os primeiros a demonstrar a regulação da PDK4 no


músculo esquelético, durante período de jejum e durante diabetes induzida por
estreptozotocina, onde observou-se um aumento significativo da expressão gênica de PDK4
no RNAm e elevação de proteínas PDK4 em músculo esquelético. Mais tarde estudos
posteriores confirmaram estes achados em músculo de ratos (HOLNESS et al., 2002) e em
humanos (PILEGAARD et al., 2003a).

O primeiro estudo que investigou a regulação da transcrição de PDK4 em resposta


ao exercício físico (PILEGAARD et al., 2000) mostrou que a transcrição de PDK4 é
marcadamente induzida em exercício exaustivo, mostrando elevação no final do exercício e
mantendo-se elevada ao longo de 4 h de recuperação após protocolo. A constatação de que a
transcrição de PDK4 e a expressão desta proteína são elevadas no final do exercício indica
que a transcrição de PDK4 é induzida já durante o exercício. Esta possibilidade foi avaliada
investigando-se o padrão de indução, realizando-se múltiplas biópsias durante teste físico em
cicloergômetro de baixa intensidade até a exaustão (média de 3,5 h), (MOURTZAKIS et al.,
2002). Observou-se que a PDK4 foi aumentada depois das primeiras 2 h de exercício, mas o
mais marcante aumento ocorreu durante a recuperação. Estes achados mostram que a
atividade de PDK4 foi marcadamente aumentada no músculo esquelético de humanos, tanto
durante teste físico moderado de longa duração como durante a recuperação ao exercício,
provocando a fosforilação e inativação do complexo PDH, bloqueando a entrada de
carboidratos para a mitocôndria durante oxidação (NORDSBORG et al., 2003).
42

Os efeitos da intensidade e duração do exercício físico sobre a regulação da PDK4


sobre o tipo de fibra específica em músculo esquelético têm sido investigada em ratos. A
corrida de baixa intensidade em esteira durante 45 min induziu a ativação de PDK4 em
gastrocnêmio vermelho e branco, observando-se uma resposta maior na porção branca.
Quando a duração do exercício foi estendida por 3 h, observou-se novamente uma maior
ativação de PDK4 no gastrocnêmio branco. (HILDEBRANDT et al., 2003).
Tal efeito da duração do exercício sobre a PDK4 em ratos foi observado em seres humanos
durante a recuperação.

2.7.3 Expressão protéica de hexoquinase II no músculo esquelético.

Tem sido relatado que uma única sessão de exercício aumenta a taxa de insulina e
consequentemente à captação de glicose pelo metabolismo esquelético muscular por 24-48 h
(DEVLIN et al., 1987; DEVLIN e HORTON, 1985). Este aumento tem sido atribuído a um
efeito do exercício na translocação de transportadores de glicose GLUT4 (GAO et al., 1994;
PHILLIPS et al., 1996), a atividade da hexoquinase (O’DOHERTY et al., 1996), ou
glicogênio sintase (DEVLIN et al., 1987). Perseghin e colaboradores (1996) usando técnica
de ressonância magnética nuclear, combinada com situações de hiperglicêmia,
hiperinsulinemia, mostraram que uma única sessão de exercício aumentou o conteúdo de
insulina, a concentração de glicose-6-fosfato (G-6-P) no músculo de indivíduos resistentes à
insulina e concluiu que o exercício exerce um potente efeito sobre o transporte de glicose ou
fosforilação da glicose.

A hexoquinase catalisa a fosforilação da glicose e a sua atividade é aumentada


pelo treinamento físico em humanos (PHILLIPS et al., 1995, 1996) e pelo treinamento físico
(crônico) ou atividade contrátil em animais experimentais (REN et al., 1994). Em seres
humanos, foram registrados aumentos de atividade da hexoquinase no músculo esquelético
em cinco dias de treinamento físico (PHILLIPS et al., 1995). Investigações no músculo
esquelético em relação à atividade da hexoquinase II (HK II) permitiram aos pesquisadores
examinar os mecanismos bioquímicos e moleculares pelos quais o exercício aumenta a
atividade da hexoquinase no músculo com maior detalhe. O'Doherty et al., (1994) mostraram
que, dentro de 3 h, o exercício aeróbio (moderado) aumentou a atividade da HK II no músculo
esquelético de ratos antes de um aumento na expressão de GLUT4.
43

Expressão crônica desta proteína, após 36h da ultima sessão de treinamento,


serviu para elucidar o comportamento da glicemia durante testes exaustivos (TE) e do
máximo estado estável de lactato nos animais mantidos sedentários e animais submetidos ao
programa de treinamento físico de endurance.

2.7.4 Expressão proteica de ACCp no fígado.

Em ratos, níveis de 3-hidroxibutirato encontram-se elevados durante e


após exercícios submáximos, na qual se observa um declínio de malonil-CoA no fígado
(BEATTIE e WINDER, 1985; 1984). A malonil-CoA é o primeiro intermediário da via
lipogênica, sendo um inibidor da carnitina palmitoyl transferase-1 (CPT1) (McGARRY e
BROWN, 1997). A atividade da CPT1 é um fator limitante para a oxidação dos ácidos graxos
e da cetogênese no fígado. O declínio de malonil-CoA no fígado tem sido postulado como
responsável pelo aumento da produção de corpos cetônicos no sangue durante e após o
exercício (ELAYAN e WINDER, 1991).

A malonil-CoA é sintetizada pela acetil-CoA carboxilase (ACC) que estão sujeita


a regulações tanto alostéricas quanto covalentes. Alostericamente, a citrato é um ativador da
ACC, enquanto palmitoil-CoA é um inibidor (HARDIE, 1989). A isoforma hepática principal
da ACC pode ser fosforilada e inativada pela proteína quinase dependente de AMPc e pela
proteína quinase ativada (AMPK) (KIM et al., 1989). No fígado, a ACC é ativada pelos
hormônios da insulina e glucagon e tem sido inibida pela adrenalina. Em células isoladas de
fígado, tem sido demonstrado que a insulina aumenta a atividade da ACC. Enquanto isso, o
glucagon e a epinefrina diminuem a atividade da ACC hepática. No entanto, os mecanismos
de inativação da ACC no fígado pelo glucagon ainda não são claramente definidos. No
músculo esquelético, o declínio de malonil-CoA induzido pelo exercício físico é
acompanhado por um aumento da atividade da adenosina monofosfato quinase (AMPK) e
diminuição na atividade da ACC (SIM e HARDIE, 1988).

A participação da AMPK, da malonil-CoA e a relação com a expressão protéica


de ACC não tem sido muito bem elucidada quanto à adaptação crônica ao treinamento físico
de endurance no fígado. Embora se tenha previamente demonstrado que ocorre diminuição da
44

malonil-CoA no fígado e no músculo esquelético durante exercício de baixa intensidade


(McGARRY e BROWN, 1997), os mecanismos da diminuição da ACC no fígado ainda não
são bem entendidos e confirmados. Dentre os marcadores energéticos adaptativos ao
treinamento utilizados nesta investigação, objetivamos determinar se ocorre de fato o aumento
ou a diminuição da atividade da ACC no fígado após treinamento de endurance, na
intensidade do limiar anaeróbio.

2.7.5 Expressão proteica de citocromo C no fígado.

O papel da mitocôndria em relação ao exercício físico tem sido estudada em


diferentes tecidos, como no músculo esquelético (ROBINSON et al., 1994), no coração
(FARRELL et al., 1991), no tecido adiposo (STALLKNECHT et al., 1991), e em diversos
organismos como em peixes, ratos e em humanos (HUERTAS et al., 1992b; KOLOK, 1992).
Alguns dos efeitos encontrados foram relacionados às mudanças no número, volume e
distribuição das mitocôndrias aumento da atividade de determinadas enzimas do ciclo do
ácido tricarboxílico, do transporte de ácidos graxos e em algumas das enzimas da cadeia
respiratória, como por exemplo, o citocromo C (CC) (PAPA, 1996).

Verificou-se que em ratos, o crescimento da capacidade de transporte de elétrons


torna-se necessário para suportar o aumento da demanda muscular de energia, com a
concomitante elevação do VO2max resultantes de esforço físico. As adaptações do sistema
de transporte de elétrons em relação o tipo de suplementação na dieta também tem sido
amplamente noticiada, porém em relação às adaptações ao exercício de endurance durante o
repouso no fígado, ainda não foram bastante investigadas. A importância dos ácidos graxos
reside na constatação de que as membranas mitocondriais se adaptam a composição lipídica
da dieta e ao que tudo indica, a seleção do substrato a ser metabolizado preferencialmente
pelo fígado durante o repouso e em atividades físicas de baixa intensidade (QUILES et al.,
1999).
Yamaoka et al., (1988), observou que a composição de ácidos graxos no coração
de ratos mudou drasticamente após suplementação com óleo de peixe (sardinha). As
mitocôndrias apresentaram diminuição da função respiratória devido a uma diminição da
atividade da citocromo C. Em outro trabalho, verificaram-se alterações no fígado, quanto à
atividade da CC na mitocôndria, após o tratamento com adriamicina em ratos alimentados
45

com uma dieta à base de azeite ou óleo de milho (HUERTAS et al., 1991b). À luz desses
estudos anteriores, investigamos a influência do treinamento físico sobre expressão protéica
da citocromo C, uma vez que esta proteína faz parte da cascata de reações que acontecem a
nível mitocondrial na cadeia respiratória, passo este imprescindível a fosforilação oxidativa
para fornecimento de ATP aerobiamente ao metabolismo energético. Como critério de
avaliação crônica da performance obtida com o treinamento, os animais foram sacrificados 36
horas após a ultima sessão de exercício e seus tecidos congelados a -80 graus para posterior
quantificação da proteína no fígado.

2.8 CONCENTRAÇÃO DE NITRITO: ÓXIDO NÍTRICO

As primeiras evidências sobre a presença de óxidos de nitrogênio no metabolismo


vieram de experimentos que demonstraram produção de nitratos em camundongos (GREEN
et al., 1981). Stuehr e Marletta, (1985), demonstraram que macrófagos ativados por
lipopossacárides bacterianos eram capazes de levar à produção de nitritos e nitratos. Dois
anos mais tarde, evidenciou-se que a L-arginina era o substrato e a L-citrulina era formada
como co-produto. Em 1988, Marletta e seus colaboradores identificaram o óxido nítrico (NO)
como o produto da reação de oxiredução da L-arginina 4. Nesta mesma década, estudiosos
investigavam um fator vasodilatador associado ao endotélio vascular (endothelium-derived
relaxing factor) - EDRF5 e poucos anos mais tarde concluiu-se ser o NO responsável pela
atividade biológica do EDRF6 (FURCHGOT et al., 1984). Cada vez mais pesquisas se
somaram na década seguinte, aprofundando investigações nesta direção e adicionando
importantes conhecimentos sobre o NO como mensageiro (ou sinalizador inter e intracelular)
e como toxina, atuando em inúmeros processos patológicos (IGNARRO et al., 1987).

Considerada uma molécula gasosa simples, o NO é habitualmente encontrada no


ar atmosférico em pequenas quantidades, altamente tóxica devido à presença de radical livre
(elétron extra) que a torna um agente químico altamente reativo. Quando diluído, o NO tem
uma meia vida de menos de 10 segundos devido à sua rápida oxidação a nitrito e nitrato. O
NO liga-se à hemoglobina e outras proteínas que contém o núcleo heme levando ao término
de sua atividade biológica (SNYDER e BREDT, 1992). A liberação continuada de NO no
endotélio vascular, torna-se responsável pela manutenção do fluxo sangüíneo tecidual e
46

controle do extravasamento tecidual. O NO-mensageiro produzido no endotélio tem função


vasodilatadora fisiológica.

Assim, durante o exercício físico ocorre aumento do débito cardíaco e


redistribuição do fluxo sangüíneo para musculatura esquelética e circulação coronariana. Este
mecanismo é mediado pela cNOS (eNOS ou isoforma III) cuja expressão genética pode ser
potencializada com exercícios aeróbios regulares (SHEN et al., 1995). Entretanto, a função
principal do NO é exercida no controle de adesão dos elementos sanguíneos (leucócitos e
plaquetas) ao endotélio (KUBES et al., 1991). Por este mesmo mecanismo, o NO diminui a
permeabilidade vascular. A expressão da isoforma III ou eNOS também se dá no miocárdio,
determinada por estudos de imunohistoquímica e técnicas de biologia molecular. A eNOS é
encontrada nos miócitos, células endoteliais e músculo liso vascular sendo a nNOS achada
nos neurônios. O NO-mensageiro atua como inotrópico negativo levando a aumento da
dilatação diastólica, sem influenciar os índices de contractilidade miocárdica (HARE e
COLUCCI et al., 1995).

Um aspecto marcante desta molécula é a sua capacidade de ser benéfica ou


potencialmente tóxica dependendo da concentração ou depuração tecidual. Várias pesquisas
afirmam que o exercício físico está associado à estimulação da produção de NO (HIGASHI,
YOSHIZUMI, 2004). Estudos experimentais em animais e humanos têm sugerido que
aumentos na produção de óxido nítrico podem contribuir para a hipotensão observada após
exercício aeróbico. Da mesma forma, observou-se aumento drástico da pressão arterial (PA)
em modelos animais submetidos à inibição da produção endógena de óxido nítrico (NAVA,
LUSCHER, 1995). O óxido nítrico é uma molécula importante para o controle metabólico
durante o exercício, pois que a deficiência de sua produção, particularmente pelo sistema
vascular endotelial, contribui para as limitações no treinamento físico associadas às doenças
cardiovasculares (KINGWELL, 2000).
47

3 OBJETIVOS

3.1 GERAL

Analisar o treinamento físico experimental de endurance através de marcadores metabólicos


energéticos em testes com velocidades progressivas até a exaustão e testes com velocidades
contínuas para análise do máximo estado estável do lactato em esteira adaptada.

3.2 ESPECÍFICOS

- Padronizar a prescrição do treinamento de endurance em esteira adaptada através do TE.


- Identificar o limiar anaeróbio dos animais após período de treinamento através de teste
funcional com velocidades progressivas até a exaustão.
- Determinar o máximo estado estável do lactato após treinamento através de teste funcional
com velocidades contínuas.
- Verificar o comportamento da glicose sanguínea e do lactato durante testes funcionais.
- Avaliar a atividade da enzima citrato sintase no músculo esquelético, no fígado e coração.
- Análisar o conteúdo de Glicogênio no músculo esquelético.
- Mensurar a distribuição dos tipos de fibra muscular esquelética através de método
histoquímico.
- Avaliar a expressão protéica de PGC-1α, indicadora de biogênese mitocondrial.
- Quantificar o conteúdo protéico de enzimas regulatórias energéticas, PDK4, HKII, ACCp e
citocromo C no músculo esquelético e fígado.
- Mensurar a concentração de nitrito, um indicador de óxido nítrico, no coração e músculo
esquelético.
48

Quadro 1 – Resumo da metodologia executada para o desenvolvimento deste projeto.

Procedimentos que - Procriação dos animais do experimento;


antecederam o sacrifício - Desmame dos animais e transporte ao laboratório;
- Período de familiarização e adaptação a esteira;
- Teste exaustivo e seleção dos animais em grupos
controle (n=6) e exercício (n=6) aleatóriamente;
- Período de treinamento de 6 semanas;
- Controle semanal do peso dos animais;
- Controle da ingesta alimentar e hídrica;
- Teste progressivo com coleta de lactato e glicemia;
- Teste do máximo estado estável do lactato e análise
da glicemia;
- Sacrifício e dissecação dos tecidos para análise;

Procedimentos após o - Peso de órgãos, gordura e músculos (porção branca


sacrifício e vermelha), regulados pelo comprimento da tíbia;
- Avaliação da atividade citrato sintase;
- Mensuração do conteúdo de glicogênio;
- Análise Histoquímica, atividade ATPase;
- Verificação através de concentração protéica, a
ocorrência de biogênese mitocôndrial (PGC-1α);
- Quantificação do conteúdo protéico de enzimas
metabólicas energéticas (HK II, ACCp, PDK 4 e
citocromo C);
- Análise da concentração de nitrito: óxido nítrico.
49

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

4.1.1 Materiais Biológicos

A presente pesquisa foi realizada de acordo as normas de ética na experimentação


animal: o projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética para o Uso de Animais (CEUA), sob o
protocolo de n˚ 10030319-6, Universidade Estadual do Ceará (UECE). Foram utilizados ratos
machos (Rattus norvegicus) da raça Wistar, com idade de 60 dias e peso médio de 190
gramas, proveniente do biotério da Universidade Estadual Ceará (UECE) e mantidos no
centro de aclimatação de animais situado no Instituto Superior de Ciências Biomédicas
(ISCB) da Universidade Estadual do Ceara (UECE). Aos 21 dias de idade, período de
desmame, os animais foram transferidos para as dependências do laboratório e aos 60 dias,
deram-se inicio ao período de testes e de treinamento físico. Os animais permaneceram no
laboratório durante todo período de experimento, sob temperatura de 22 a 25 ºC, com ciclo 12
horas claro e 12 horas escuro, recebendo ração e água ad libitum.

4.1.2 Grupos Experimentais

A padronização preliminar serviu como base para os dados collhidos neste estudo,
que foram confirmadas pela análise da glicose sanguínea e as dosagnes de lactato nos testes
funcionais, pela atividade enzimática, pelo conteúdo de glicogênio, pela distribuição de fibras,
pelas proteínas indicadoras de biogênese mitocondrial e reguladoras do metabolismo
energético, além da concentração de óxido nítrico.

Como critério de confiabilidade quanto à idade ideal para início do experimento,


os animais tiveram sua procriação programada, sendo retirados do biotério e levados ao
laboratório no período de desmame aos 21 dias de idade. Os animais foram ambientados as
caixas e ao contato humano até o 60˚ dia de vida, principalmente em períodos noturnos,
habituando a condições em que os mesmos foram exercitados posteriormente. Inicialmente
procurou-se diminuir o estresse do animal aos testes e ao treinamento realizados na esteira
50

adaptada, realizando no sexagésimo dia de idade, o período de familiarização dos animais a


esteira por 5 à 10 minutos de duração diariamente a uma velocidade de 0,3 km/h durante uma
semana. Na segunda semana, foi realizado adaptação dos animais a esteira por 10 minutos
diariamente a velocidades de 0,3 à 0,7 km/h. Este período foi utilizado para a observação
comportamental dos animais e possíveis pré-exclusões do estudo devido a não adaptação ao
meio onde ocorrerá os testes e o treinamento físico.

Após 48h de repouso da ultima sessão de adaptação, todos os animais (n=20)


foram submetidos ao protocolo de teste exaustivo (TE) sem coleta sanguínea, para a
determinação da capacidade máxima de realização de corrida ou VO2max, adaptado de
Ferreira et al., (2004). Todos os animais, inclusive os ligeiramente pré-excluidos participaram
do TE, como critério de real exclusão. A velocidade inicial do teste foi a 0,3 km/h e a cada 3
minutos eram acrescidos 0,2 km/h de velocidade, de modo que a progressão das velocidades
finalizava junto à exaustão da capacidade de corrida do animal. Este teste serviu como critério
de seleção dos animais corredores (n=12), divididos aleatoriamente em grupo sedentário
(n=6) e grupo exercitado (n=6), e para prescrição do treinamento. A seleção dos animais para
a realização dos testes com coletas sanguíneas objetivou garantir uma homogeneidade da
capacidade física dos mesmos.

Foram incluídos no estudo os (n=12) animais que apresentaram valores médios no


TE, excluindo os 25% abaixo e os 75% acima da média (velocidade, distância e tempo de
exaustão). O resultado do TE possibilitou a análise dos animais realmente corredores e a
construção de grupos (exercitados e sedentários) possivelmente idênticos. Este procedimento
buscou garantir que o estimulo físico aplicado tivesse o mesmo efeito fisiológico em todos os
animais quando fossem analisados após período de treinamento. Durante os testes foram
utilizados leves estímulos mecânicos, sempre com os mesmos manipuladores, para que de
fato os animais só recusassem correr quando alcançassem a real exaustão física. Os testes
sempre iniciaram após as 18:30 h.

Para que não ocorresse nenhuma adaptação crônica ao TE, os animais


permaneciam em repouso por 48h para que fosse realizado os testes com velocidades
progressivas até a exaustão com coletas sanguíneas para dosagem de lactato e análise da
glicose sanguínea. Após o período de treinamento de 6 semanas, foi dado início aos testes
51

funcionais. No teste com velocidades progressivas até a exaustão, foram realizadas coletas
sanguíneas, objetivando encontrar o limiar anaeróbio através de dosagens de lactato, além de
verificar o comportamento da glicose sanguínea. Passadas 48h de repouso, os mesmos
animais participaram do teste com velocidades contínuas, com o objetivo de encontrar o
máximo estado estável do lactato e novamente verificar o comportamento da glicose
sanguínea. Todas as análises de intensidades foram realizadas com os mesmos animais (dados
pareados), garantindo a fidelidade dos resultados. Os animais experimentados partiparam de
todos os testes propostos no presente trabalho e as intensidades do teste com velocidades
contínuas sempre eram aleatórias para que não houvesse tendência adaptativa crônica.

4.1.3 Treinamento Físico

Os animais foram submetidos ao treinamento físico em esteira humana adaptada


por Ferraz (2007), modelo Atletic Speed 2 (Foto 1).

Foto 1 – Imagem detalhada das raias adaptadas na esteira ergométrica utilizada para o
treinamento dos animais (FERRAZ, 2007).

O grupo submetido ao protocolo de treinamento físico a intensidade de 60% do


TE, velocidade correpondente ao limiar anaeróbio, realizou sessões diárias, 5 dias por
semana, com durações de 60 minutos diariamente, por um período de 6 semanas.

O protocolo mostrado (Quadro 2) retrata os procedimentos iniciais para diminuir


o estresse dos animais a esteira durante período anterior ao TE. Durante a 1ª semana os
animais realizaram o processo familiarização a esteira, a velocidade de 0,3 km/h por 5 a 10
52

minutos diariamente. Na 2ª semana, realizou-se o período de adaptação dos animais a esteira


rolante, percorrendo velocidades de 0,3 a 0,7 km/h durante 10 minutos diários.

Quadro 2: Protocolo de familiarização e adaptação a esteira

Familiarização Velocidade Tempo


1 ª dia 0,3 km/h 5 min
2 ª dia 0,3 km/h 5 min
3 ª dia 0,3 km/h 5 min
4 ª dia 0,3 km/h 10 min
5 ª dia 0,3 km/h 10 min

Adaptação Velocidade Tempo


1 ª dia 0,3 km/h 10 min
2 ª dia 0,4 km/h 10 min
3 ª dia 0,5 km/h 10 min
4 ª dia 0,6 km/h 10 min
5 ª dia 0,7 km/h 10 min

Durante período de treinamento físico, os animais foram submetidos inicialmente


a uma velocidade de 0,3 km/h, a qual foi aumentada progressivamente até atingir a velocidade
final de 1,2 km/h, intensidade de 60% obtida no TE, durante todo o programa de treinamento
por 6 semana. Encontra-se na tabela seguinte, os períodos de Aquecimento por 5 min, as
velocidades iniciais a 1,0 km/h, correspondente a 50% do TE e em seguida a velocidade de
1,2 km/h, seguindo uma progressão no volume de treinamento até 60 minutos. Durante todo o
período de testes e treinamento dos animais, foi utilizada uma luz vermelha, na qual o
comprimento de onda não era visível aos animais. Todo o período de testes e treinamento foi
realizado durante o período noturno.

Foto 2: Ilustratração dos procedimentos de manuseio durante período de repouso (caixa n=6),
local de treinamento (raias n=6) e luz vermelha (comprimento de onda não visível).
53

Quadro 3: Protocolo de treinamento dos animais

1º TESTE EXAUSTIVO
Semanas e Tempo Aquecimento Endurance Endurance Recuperação
Dias Total min 50% máx. 60% máx. min
1 2 2 1 1 2 1
min min km/h min km/h
Semana 1 km/h km/h
22/03/10 30 0,4 0,6 0,8 15 1,0 05 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4
23/03/10 30 0,4 0,6 0,8 10 1,0 10 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4
24/03/10 35 0,4 0,6 0,8 10 1,0 15 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4
25/03/10 35 0,4 0,6 0,8 10 1,0 15 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4
26/03/10 40 0,4 0,6 0,8 10 1,0 20 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4
Semana 2
29/03/10 40 0,4 0,6 0,8 10 1,0 20 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4
30/03/10 45 0,4 0,6 0,8 10 1,0 25 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4
31/03/10 45 0,4 0,6 0,8 10 1,0 25 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4
01/0410 50 0,4 0,6 0,8 10 1,0 30 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4
02/0410 50 0,4 0,6 0,8 10 1,0 30 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4
Semana 3
05/0410 55 0,4 0,6 0,8 10 1,0 35 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4
06/04/10 55 0,4 0,6 0,8 10 1,0 35 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4
07/04/10 60 0,4 0,6 0,8 10 1,0 40 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4
08/04/10 60 0,4 0,6 0,8 10 1,0 40 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4
09/04/10 60 0,4 0,6 0,8 05 1,0 45 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4
Semana 4 1 1 1 2
12/04/10 60 0,4 0,6 0,8 1,0 05 1,0 45 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4
13/04/10 60 0,4 0,6 0,8 1,0 00 1,0 50 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4
14/04/10 60 0,4 0,6 0,8 1,0 00 1,0 50 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4
15/04/10 60 0,4 0,6 0,8 1,0 00 1,0 50 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4
16/04/10 60 0,4 0,6 0,8 1,0 00 1,0 50 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4
Semana 5
19/04/10 60 0,4 0,6 0,8 1,0 00 1,0 50 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4
20/04/10 60 0,4 0,6 0,8 1,0 00 1,0 50 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4
21/04/10 60 0,4 0,6 0,8 1,0 00 1,0 50 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4
22/04/10 60 0,4 0,6 0,8 1,0 00 1,0 50 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4
23/04/10 60 0,4 0,6 0,8 1,0 00 1,0 50 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4
Semana 6
26/04/10 60 0,4 0,6 0,8 1,0 00 1,0 50 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4
27/04/10 60 0,4 0,6 0,8 1,0 00 1,0 50 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4
28/04/10 60 0,4 0,6 0,8 1,0 00 1,0 50 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4
29/04/10 60 0,4 0,6 0,8 1,0 00 1,0 50 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4
30/04/10 60 0,4 0,6 0,8 1,0 00 1,0 50 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4
01/05/2010 2º TESTE EXAUSTIVO
54

4.2 AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE FÍSICA

4.2.1 Teste Exaustivo (TE)

A capacidade máxima de realização do esforço foi estimada pelo teste progressivo


até a exaustão em esteira humana adaptada. A velocidade inicial da esteira foi de 0,3 km/h, a
0˚ de inclinação. A cada 3 minutos, a velocidade da esteira sofria um acréscimo de 0,2 km/h
até a exaustão do animal, ou seja, o teste terminava quando o animal não conseguia manter o
padrão de deambulação mecânica da corrida após estímulos suaves dos manipuladores. As
variáveis medidas foram a: velocidade final alcançada (km/h); o tempo total em (minutos) e a
distância total percorrida em (metros) para cada animal durante o teste máximo.

De acordo os critérios estabelecidos nos experimentos preliminares ao da


dissertação. Nesta etapa do estudo, utilizamos 20 animais, sendo selecionados para o estudo
(n=12) animais corredores, grupo exercitado (n=6) e grupo sedentário (n=6). Ao sexagésimo
dia de idade dos animais, foi iniciado o período de familiarização durante uma semana e logo
em seguida o período adaptação por mais uma semana. Passadas 48 h de repouso da ultima
sessão de adaptação, realizamos os testes exaustivos (TE) para seleção dos animais corredores
do experimento. Para prescrição do treinamento, foi estabelecida a intensidade de 60% do TE,
carga esta que coincide com o máximo estado estável do lactato, velocidade de 1,2 km/h,
encontrado em estudo prévio no grupo padronização (artigo em conclusão).
55

4.2.2 Análise do limiar anaeróbio e concentração de glicemia

Foto 3: Ilustração do processo de calibração do capilar com heparina para leitura da glicemia
(10 µL), marcação, corte da cauda e mensuração da glicemia sanguinea.

Foto 4: Ilustração do processo de calibração do capilar com heparina para leitura do lactato
(25 µL), marcação, corte da cauda e mensuração da lactato sanguinea.
56

4.2.3 Determinação da concentração de lactato e glicemia sanguínea em repouso

Encontrou-se na literatura uma infinidade de metodologias para dosagens de


lactato sangüíneo em ratos. Em estudo precedente realizado na presente pesquisa para
determinar a concentração de lactato e glicemia sanguínea de repouso em ratos, optou-se pela
coleta via artéria caudal, uma vez que a coleta de lactato sanguíneo pela artéria carótida
causava extremo estresse ao animal, sobretudo nas condições deste estudo com exercício
físico.

A técnica de coleta de sangue via artéria caudal consistiu na realização de um


pequeno corte na extremidade da cauda do rato, para coleta do sangue e dosagem do lactato e
glicose sanguínea. Inicialmente foram calibrados todos os capilares (individualmente) com
25µL de heparina para realização da dosagem de lactato sanguíneo e 10 µL para dosagem de
glicose sanguínea. Coletavam-se amostras de 25 µL e 10 µL de sangue através da artéria
caudal. Essas amostras de sangue foram retiradas por um tubo capilar peviamente
heparinizado e, em seguida, transferidas para um tubo eppendorf (1,5 mL) contendo fluoreto
de sódio (1%), sendo congeladas para ulterior dosagem em lactímetro (Yellow Spring,
modelo 1500). As amostras de glicemia coletadas eram imediatamente trasferidas as fitas de
glicemia para leitura em glicosímetro (Accu-Chek Active Kit, modelo Roche).

4.2.4 Teste Progressivo com incremento de velocidade até a Exaustão

As concentrações circulantes de lactato são relativamente proporcionais à


intensidade do exercício físico realizado, sendo que após o limiar anaeróbio ou limiar de
lactato, ponto onde ocorre um aumento brusco da razão de produção e remoção do lactato, as
concentrações de lactato se elevam rapidamente, resultado de uma maior participação da via
anaeróbia na produção de ATP (BROOKS, 1986). Desta forma, a realização de exercícios
progressivos máximos até a exaustão, utilizando incrementos constantes, torna-se
extremamente importante na análise do comportamento do lactato sanguíneo, possibilitando
apontar a fase em que ocorre a descompensação entre produção e remoção do lactato.

Amostras de 25 µL e 10 µL de sangue foram retiradas por um tubo capilar


previamente heparinizado e, em seguida, as amostras de 25 µL eram transferidas para um tubo
eppendorf (1,5 mL) contendo fluoreto de sódio (1%), sendo congeladas para ulterior dosagem
57

em lactímetro (Yellow Spring, modelo 1500). Durante a fase inicial de testes progressivos
máximos, o metabolismo aeróbio supre as demandas musculares de energia. Com o aumento
da intensidade do exercício, torna-se cada vez maior a ativação de um grande número de
músculos da via glicolítica e, portanto, aumento da concentração de lactato sanguíneo. Assim,
o acúmulo de lactato no sangue observado durante teste ergométrico graduado é geralmente
interpretado como indicativo do aumento da participação do metabolismo anaeróbia como
fonte de energia (SPIRDUSO, 1995; SIMÕES et al., 1999).

Quadro 4: Esquema de execução para determinação do limiar de lactato.

Esquema de coletas: Repouso 3 min 6 min 9 min (...) min

1 2 3 4

1. Corte da cauda.
2. Deambulação por 10 minutos para circulação e remoção do lactato produzido devido
ao estresse do corte da cauda.
3. Repouso de 10 minutos com coleta de sangue ao final para determinação da
concentração de lactato em repouso.
4. Teste de velocidade progressiva até a exaustão, protocolo escalonado com incrementos
de 0,2 km/h a cada 3min (velocidade inicial 0,3 km/h). A coleta do sangue foi
realizada aos 20 segundos finais de cada carga até a exaustão do animal.

4.2.5 Determinação do máximo estado estável do lactato através de testes contínuos com
velocidades independentes

Foram realizados após os testes com velocidades progressivas, os testes com


velocidades contínuas para a determinação do máximo estado estável do lactato sanguíneo
com o intuito de verificar a maior concentração de lactato possível de ser mantida em steady-
state. Embasado nos resultados obtidos durante TE e do limiar anaeróbio, durante o teste com
velocidade progressiva até a exaustão, foi verificado o comportamento do lactato e da glicose
58

sanguínea nas velocidades submáximas, com o objetivo de encontrar a velocidade na qual o


rato mantivesse o maior estado estável de lactato. Cada teste teve duração total de 28 minutos
e as amostras sanguíneas foram coletadas no repouso e a cada 7 minutos de teste através da
artéria caudal.

Quadro 5: Esquema de coletas durante execução de teste para determinação do máximo


estado estável do lactato.

Esquema de coletas: Repouso 7 min 14 min 21 min 28 min

1 2 3 4 4 4 4

1. Corte da cauda.
2. Deambulação por 10 minutos a 0,3 km/h para remoção do lactato produzido devido ao
estressse produzido pelo corte da cauda.
3. Repouso de 10 minutos com coleta de sangue ao final para determinação da concentração
de lactato em repouso.
4. Testes de intensidades independentes com velocidades contínuas, com duração de 28
minutos e coleta de sangue a cada 7 minutos. A coleta do sangue foi realizada aos 20
segundos finais de cada tempo.

As intensidades de 45%, 60% e 75%, correspondem respectivamente as


velocidades de 0,9 km/h, 1,2 km/h e 1,5 km/h, utilizadas durante os testes, sendo estipuladas
de acordo com a velocidade máxima, intensidade de 100%, correspondente a velocidade de
2,0 km/h encontrada no teste exaustivo (TE) inicial.

Todos os animais participaram de todas as intensidades, seguindo uma ordem


aleatória para que não ocorressem adaptações orgânicas aos testes funcionais. Os animais
permaneciam em repouso por 48 horas entre cada carga dos testes. O objetivo deste teste foi o
de verificar a velocidade em que ocorre a máxima estabilização do lactato sanguíneo, para
prescrição da melhor intensidade de treinamento com predominância do metabolismo aeróbia
para ratos em esteira. A máxima estabilização do lactato foi identificada como a velocidade
59

em que não houvesse variação na concentração de lactato maior que 1 mM do 7ª ao 28ª


minuto de teste. Amostras de glicose saguínea foram colhidas no repouso e a cada 7 minutos,
para verificar o comportamento glicêmico durante funcionais executados e observar possíveis
variações adaptativas ao treinamento entre os grupos exercitados e sedentários.

Procurou-se verificar neste estudo se a intensidade empregada ao treinamento,


velocidade de 1,2 km/h, foi de fato satisfatória, resultando em adaptações funcionais causadas
pelo exercício de endurance. Todos os animais tiveram suas capacidades funcionais avaliadas
antes do treinamento, através do TE, e após o treinamento, através da reavaliação do TE, do
teste com velocidades progressivas até a exaustão, e teste com velocidades contínuas para
avaliação do máximo estado estável do lactato sanguíneo nos grupos exercitados e
sendentários. A realização das avaliações funcionais buscou verificar as melhoras no
desempenho físico (performance) dos animais.

4.3 SACRIFÍCIO DOS ANIMAIS

Passadas 36 h do término do protocolo experimental de treinamento, os animais


foram anestesiados com thiopental sódico 1g de marca cristalia, na dose de 3 mg/kg de peso
do animal. Em seguida, os mesmos foram sacrificados por decaptação, de acordo com a
resolução do Conselho Federal de Medicina Veterinária - CFMV/CRMVs - No 714,
20/06/2002, método rápido e livre de sofrimentos prolongados. A pesquisa foi aprovada pela
Comissão de Ética para o Uso de Animais da Universidade Estadual do Ceará (CEUA-
UECE), registrada sob o 10030319-6/16. Foram coletado sangue, os pulmões, o fígado,
coração, os músculos gastrocnêmio (porção branca e vermelha), músculo sóleo, a gordura
epididimal, gordura retroperitoneal e a tíbia. Todos os órgãos tiveram seus pesos regulados
pelo comprimento da tíbia.

4.3.1 Laboratórios

As análises foram conduzidas no laboratório de Bioquímica e Cultura de Células


nas dependências do Instituto Superior de Ciências Biomédicas (www.uece.br/cmacf)
60

pertencentes à Universidade Estadual do Ceara (UECE) e em colaboração com os laboratórios


da Dra. Patrícia Chackur Brum, pertencente à Escola de Educação Física e Esporte (EEFE) e
no laboratório do Dr. Rui Curi, Instituto de Ciências Biomédicas (ICB), ambos da
Universidade Estadual de São Paulo (USP).

4.4 AVALIAÇÃO DA COMPOSIÇÃO CORPORAL

4.4.1 Massa Corporal

O controle ponderal foi realizado por balança GENHAKA durante o período do


estudo, uma vez por semana até a data que antecedeu ao sacrifício.

4.5 AVALIAÇÃO BIOQUÍMICA DO MÚSCULO ESQUELÉTICO

4.5.1 ATIVIDADE MÁXIMA ENZIMÁTICA: CITRATO SINTASE

O aumento da atividade das enzimas oxidativas presentes na mitocôndria é um


indicativo da otimização do metabolismo aeróbio. A citrato sintase é uma enzima importante,
pois ela catalisa a primeira reação do ciclo de krebs, onde ocorre a condensação do acetil
coenzima A (acetil-Coa) com o oxaloacetato para formar citrato e coenzima A (Coa). É uma
enzima reguladora, e muitos tipos de células, a reação por ela catalisada é o passo limitante na
velocidade de todo o ciclo de krebs, e consequentemente na formação de energia via
metabolismo aeróbio (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 1998).
A enzima catalisa a reação:
OXALOACETATO + ACETIL-CoA + ÁQUA ---- CITRATO + CoA + H

Após homogeneização individual do músculo gastrocnêmio de todos os animais


com tampão fosfato (PBS), as amostras foram centrifugadas a 3000 rotações por minuto,
durante 10 minutos a 4ºC. Em seguida, o sobrenadante foi retirado para a dosagem da
atividade da enzima citrato sintase.
61

As dosagens enzimáticas das porções branca e vermelha do músculo


gastrocnêmio, músculo sóleo, coração e fígado foram determinados através de ensaio
colorimétrico realizado em espectrofotômetro, segundo método descrito por (SRERE, 1969).
A atividade foi medida a partir da quantificação do complexo formado entre a Coenzima A
(CoA) liberada com o DTNB do meio e oxaloacetato. O tampão utilizado no ensaio consistirá
em Tris-aminometano 50 mM, EDTA 1 mM e DTNB 0,2 mM. Acetil CoA (0,1 mM) será
preparada através da adição de 1 mg de Acetil CoA, 1 mL de água deionizada, 25 µL de
K2HCO3 e uma gota de anidrido acético. Após 10 minutos de descanso no gelo, 1 mL de
Acetil CoA será misturado com 1 mL de Triton X-100 0,05% (v/v) e 10 mL de tampão de
ensaio, constituindo a mistura de ensaio. O volume total do ensaio será de 1 ml e o pH 8,1. A
leitura será realizada a 25ºC, durante um intervalo de 160 segundos, em 412 nm. A
determinação da proteína será feita pelo método de (BRADFORD, 1976), utilizando como
padrão albumina bovina (BSA, 1 mg/ml).

4.6 CONTEÚDO DE GLICOGÊNIO

Como método de extração foram pesados 250 mg do músculo (porção vermelha e


porção branca) e colocados em tubo de ensaio de 1 mL solução de KOH 30%. Após isso, os
tubos foram colocados em banho-maria fervente durante 60min. Em seguida foram agitados
intensamente até que a coloração observada estivesse esverdeada. Foram adicionados 0,1mL
de Na2SO4 saturado e agitado, em seguida foram adicionados 3,0 mL de álcool bidestilado
70% (Zulu), foram agitados e levados em banho-maria fervente até a ebulição do álcool. A
centrifugação realizada foi de 2000 rpm por 5 minutos. Mais tarde o foi desprezado o
sobrenadante. A diluição do corpo de fundo com 1mL de água quente foi agitado fortemente.
Pouco mais tarde, foram adicionados álcool bidestilado, colocados em banho-maria e
centrifugados novamente a 2000 rpm. Novamente o sobrenadante foi desprezado e diluído o
precipitado com água destilada.

Neste ponto os músculos foram guardados em freezer para posterior dosagem


colorimétrica (SJORGREEN et al., 1938). Para colorimetria foi utilizado o método fenol
sulfúrico (solução de fenol) (DUBOIS et al., 1956). Após a colorimetria foram realizadas as
preparações padrões.
62

4.7 CONTRATILIDADE E ATIVIDADE ATPase

Após a última sessão de treinamento, os animais foram sacrificados e retirados


os músculos gastrocnêmio para a análise histoquímica. Os músculos foram congelados em N-
hexana, resfriada a -70ºC em N212. Após tal procedimento, os blocos foram transferidos para a
câmara do micrótomo criostato (Cryocut 1850 - Reichert-Young) e assim mantidos durante 20
a 30 minutos. Os blocos foram fixados perpendicularmente aos suportes metálicos, usando-se
para isso o adesivo (OCT - Tissue Tek Compound). A microtomia será realizada a -20ºC, com
espessura de 7µm.
Os cortes foram submetidos aos seguintes métodos:
a) Hematoxilina e eosina (HE), para avaliação das características morfológicas
do tecido muscular (MCMANUS; MOWRY, 1960).
b) Nicotinamida adenina dinucleotídio tetrazólio reductase (NADH-TR), para
avaliar a habilidade metabólica oxidativo-glicolítica dos tipos de fibras musculares
(DUBOWITZ et al., 1972) e;
c) ATPase miofibrilar (mATPase), em pH 9,4, após incubação em meio
alcalino (pH 10,4) e nos meios ácidos (pH 4,2; 4,4 e 4,6) para avaliar a habilidade contrátil
rápida e lenta dos tipos de fibras musculares (PETER et al., 1972).

A seguir, foram efetuadas a análise e a descrição da morfologia e das


características de cada reação histoquímica das fibras musculares. Estas foram classificadas e
nomeadas em SO, FOG e FG, conforme os critérios adotados por (PETER et al., 1972)
considerando, para tanto, seus diâmetros em cortes transversais, a intensidade e distribuição
citológica do produto da reação para metabolismo oxidativo e glicolítico à reação NADH-TR,
e a reatividade à reação para ATPase miofibrilar, após pré-incubação em meio alcalino e nos
meios ácidos, para avaliar a habilidade contrátil dos tipos de fibras musculares.

Utilizando-se um microscópio óptico, foram amostradas as freqüências (%) dos


tipos de fibras, em amostras de no mínimo 200 fibras. Na reação NADH-TR, as fibras escuras
representavam as fibras oxidativas (SO e FOG) e as claras, as fibras glicolíticas (FG); na
reação mATPase ácida (pH4,4), as escuras representavam as fibras de contração lenta (SO) e
63

as claras, as fibras de contração rápida (FOG e FG). O inverso, escuras para as de contração
rápida e claras para as de contração lenta, na mATPase alcalina (pH 10,4).

Foto 5: Lâmina colhida em análise histoquímica de músculo gastrocnêmio de rato,


apresentando diferentes fibras do tipo I (lentas oxidativas), IIa (intermediárias glicolíticas-
oxidativas) e IIb (rápidas glicolíticas), departamento de Educação Física da USP, em
julho/2009.

4.8 QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNA: WESTERN BLOTTING

As porções branca e vermelha do músculo gastrocnêmio, o músculo sóleo e o


fígado foram utilizados através de técnica de western blotting para quantificar o conteúdo
protéico. Os tecidos foram homogeneizados em tampão de lise hipotônico contendo tampão
de fosfato de potássio 50mM (pH 7,0), sucrose 0,3M, DTT 0,5mM, EDTA 1mM (pH 8,0),
PMSF 0,3mM, NaF 10mM e coquetel de inibidor de fosfatase (1:100). O sobrenadante foi
transferido para tubos de 1,5ml e a concentração de proteína das amostras analisada por meio
do método de Bradford (1976). Alíquotas serão armazenadas em freezer -80ºC até o momento
de serem utilizadas.

Inicialmente foi realizada uma Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (SDS-PAGE


10%), que consiste na migração de moléculas com carga, numa solução, decorrente da
aplicação de um campo elétrico em uma cuba de eletroforese. Posteriormente, as proteínas
foram transferidas do gel para uma membrana de nitrocelulose (Amersham Biosciences,
Piscataway, NJ), também por eletroforese. As membranas foram coradas com Ponceau S, para
a verificação das bandas proteicas obtidas pela eletroforese.
64

A fim de bloquear ligações inespecíficas, a membrana foi incubada em solução


contendo caseína, proteína que compete com os sítios de ligação e reduz a absorção
inespecífica de conjugados da peroxidase. A membrana de nitrocelulose foi, então, incubada
com o anticorpo primário da Hexoquinase II (HK II), PGC-1α, PDK 4, ACCp e Citocromo C,
que se liga à proteína que se pretende detectar, formando um complexo anticorpo-proteína.
Depois de enxaguar a membrana para remover o anticorpo não ligado, ela foi exposta ao
anticorpo secundário conjugado a horseadish peroxidase (HRP), direcionado a porções
espécies-específicas do anticorpo primário. Posteriormente visualizadas e quantificadas
(número de pixels) pelo sistema Image, fornecido gratuitamente pela NIH (EUA) via internet.
O gliceroldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) foi utilizado como normalizador.

Quantificação de Proteína: Bradford

A quantificação de proteína no homogenato foi realizado segundo método de


(BRADFORD, 1976). Neste ensaio, as proteínas da amostra foram complexadas com o
corante azul de comassie brilhante G-250. A reação é colorimétrica e a absorbância é medida
a 595 nm. Os resultados de absorbância obtidos foram lançados na equação de reta de uma
curva padrão de albumina sérica bovina (1 a 10g/ml), repetida a cada determinação
enzimática. A concentração da solução padrão de albumina foi aferida antes da preparação de
cada curva, dividindo-se o valor de absorbância obtido em 280 nm por 0,66. O resultado da
atividade da enzima foi expresso em nmol. min-1. Mg de tecido e por nmol. min-1. Prot-1.

4.9 CONCENTRAÇÃO DE NITRITO: ÓXIDO NÍTRICO

Para dosagem da concentração de nitrito como forma de inferência de uma


variação da função endotelial, o músculo gastrocnêmio (porções branca e vermelha) e o
coração foram utilizados para fornecer um parâmetro diretamente ligado a performance obtida
com o treinamento de endurance. Foram realizadas análises nos 6 animais de cada e em cada
animal foram feitas três medidas. Os valores encontrados foram normalizados pela quantidade
de proteínas dosadas a partir do método de Bradford (1976).

Os tecidos foram congelados e macerados a pó e posteriormente homogeneizados


em recém-preparado tampão de extração para óxido nítrico pH 7,5 (Tris 50 mmol/L, EDTA 1
65

mmol/L, glicerol 10% e água destilada qps 100mL). As amostras foram centrifugadas em
10.000 rotações por minuto durante 10 min a 10ºC. Para determinar os níveis de nitrito das
amostras foi utilizado o reagente de Griess (Ácido hipofosforoso 2,5mL, Sulfanilamida 1g, N-
(1-Naftil) Etilenodiamina Dihidrocloreto 0,1 g e água Mili-Q 100mL qps). Foi estabelecida a
curva padrão de absorbância/concentração em espectrofotômetro a 540 nm com solução de
estoque de Nitrito de Sódio (69mg de NaNO2 e 100mL qps de água Mili-Q). Algumas
metodologias fundamentaram este estudo quanto a concentração de nitrito, indicador de óxido
nítrico (ROSS et al., 2007; MACKERETH et al., 1978).

4.10 TRATAMENTO ESTATÍSTICO

Para a análise estatística foi utilizado inicialmente o teste de Komolgorov-


Smirnov, para verificar a normalidade dos dados. A análise estatística utilizada para os testes
funcionais de esforço físico com velocidades progressivas até a exaustão e de velocidades
contínuas foi a análise de variância ANOVA two way e “post hoc” de Bonferroni de
comparações múltiplas para comparação entre os grupos. O Teste t para amostras dependentes
dentro do mesmo grupo. A significância estatística foi considerada para p < 0,05. A
correlação dos valores de glicemia e lactato do grupo sedentário e exercitado durante teste
com velocidades progressivas até a exaustão e teste com velocidades contínuas, foram
calculadas pelo teste de Spearman (r).

Os dados estão expressos como a média ± desvio padrão da média, com n


indicando o número de experimentos. A expressão das proteínas energéticas, da atividade
enzimática, do conteúdo de glicogênio e da concentração de óxido nítrico foram comparadas
através do teste t de Student. As médias foram consideradas diferindo significativamente entre
si se o valor de p para a ocorrência da hipótese nula for menor ou igual a p < 0,05. Todas as
análises serão feitas utilizando o programa GraphPad Prism 5.0, GraphPad Software, San
Diego California USA, (www.graphpad.com).
66

5 RESULTADOS

5.1 AVALIAÇÃO DA MASSA CORPORAL

A massa (g) dos órgãos estudados estão dispostos no Quadro 6. O teste t foi
utilizado para análise estatística entre os grupos sedentários e exercitados e as diferenças
significativas foram dispostas com (*) para o (P<0.05). Todos os dados foram normalizados
pelo comprimento da tíbia (cm).

Quadro 6: Massa (g) dos orgãos

Sedentários Média±DevPad Exercitados Média±DevPad

Coração 0,24±0,04 Coração 0,26±0,26

Pulmão 0,57±0,11 Pulmão 0,92±0,92(*)

Fígado 2,32±0,23 Fígado 2,45±1,45

Tíbia 0,17±0,00 Tíbia 0,15±0,15(*)

Gastro. E 0,43±0,04 Gastro. E 0,46±0,43

Gastro. D 0,46±0,03 Gastro. D 0,46±0,46

Sóleo E 0,04±0,21 Sóleo E 0,04±0,04

Sóleo D 0,04±0,01 Sóleo D 0,04±0,73

Teste t = (*) P<0,05. Gastro E e D = gastrocnêmio Esquerdo e Direito.

Outro parâmetro direto de avaliação da composição corporal consistiu na


mensuração da massa (g) dos tecidos adiposos epididimal e retroperitoneal, normalizados pelo
comprimento da tíbia (cm). Os resultados nas Figuras 1 e 2, apresentaram respectivamente, a
diminuição estatisticamente significante da massa tanto do tecido adiposo retroperitoneal
quanto epididimal para os animais submetidos ao treinamento físico quando comparados ao
grupo sedentário.
67

Gordura Retroperitoneal
0.8

0.6
gramas (g)
*
0.4

0.2

0.0
Sedentário Exercitado

Figura 1: Avaliação da gordura retroperitoneal dos animais mantidos sedentários (n=6) e dos animais exercitados
(n=6). Observou-se diminuição de 35% da massa de gordura. Os dados são apresentados como média ± erro
padrão da média. Os dados foram comparados através de teste t, apresentando diferença estatística (*) (P<0,05).

Gordura Epididimal
1.2

1.0 **
0.8
gramas (g)

0.6

0.4

0.2

0.0
Sedentário Exercitado

Figura 2: Avaliação da gordura epididimal dos animais mantidos sedentários (n=6) e dos animais exercitados
(n=6). Observou-se diminuição de 17% da massa de gordura para os animais exercitados. Os dados são
apresentados como média ± erro padrão da média. Os dados foram comparados através de teste t, apresentando
diferença estatística (**) (P<0,005).
68

Observou-se uma tendência a redução no peso corporal dos animais exercitados


em relação ao peso dos animais mantidos sedentários no decorrer de 6 semanas (Figura 3).

Peso Corporal
280 Sedentários
Exercítados
260
gramas (g)

240

220

200

0 1 2 3 4 5 6
Semanas

Figura 3: Avaliação do peso corporal dos animais mantidos sedentários (n=6) e dos animais submetidos ao
exercício (n=6) durante período de 6 semanas de treinamento físico. Os dados são apresentados como média ±
erro padrão da média. Não ocorreu diferença significante entre os grupos (P<0,05).

Não foi observado diferença significante na ingesta alimentar e hídrica dos


animais ao londo das 6 semanas de treinamento. Porém, foi observada uma tendência a maior
ingesta alimentar (Figura 4) e hídrica (Figura 5) do grupo submetido ao treinamento físico
quando comparado ao grupo sedentário.
69

Consumo de Ração
235
Sedentários
230 Exercítados
gramas (g)

225

220

215

210
1 2 3 4 5 6
Semanas

Figura 4: Avaliação do consumo alimentar dos animais mantidos sedentários e dos animais exercitados no
decorrer de seis semanas. Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média. Não ocorreu diferença
significante entre os grupos (P<0,05).
.

Consumo de Água
600
Sedentários
Exercícitados
580
mililitros (ml)

560

540

520
1 2 3 4 5 6
Semanas
70

Figura 5: Avaliação da ingestão hídrica dos animais exercitados e mantidos sedentários no decorrer de seis
semanas. Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média. Não ocorreu diferença significante
entre os grupos (P<0,05).

.
5.2 TESTES EXAUSTIVOS

Como já mencionado na metodologia (ver detalhes), nesta etapa do estudo, foram


utilizados 20 animais, dos quais 12 animais corredores foram selecionados através do TE
inicial e distribuídos aleatoriamente em grupo exercitado (n = 6) e grupo sedentário (n = 6). A
prescrição do treinamento foi efetuada a partir de velocidade (60%) encontrada neste teste.

Nas (Figuras 6, 7 e 8) foram apresentados os resultados avaliados, pós período de


treinamento, quanto a distância total percorrida, velocidade final alcançada e tempo total em
que os animais entraram em exaustão durante TE. O experimento consistiu de período de
familiarização durante a primeira semana, período de adaptação durante a segunda semana.
Passadas 48 h da ultima sessão de adaptação foram realizados os testes exaustivos (TE) que se
caracterizaram por incrementos de velocidades de 0,2 km/h a cada 3 minutos, com velocidade
inicial a 0,3 km/h.

Foram descartados do experimento os animais acima (> 75% do TE) e abaixo (<
25% do TE) para evitar uma possível tendência nos resultados, sendo considerados para o
estudo somente os animais com capacidades homogêneas. Neste protocolo não houve coleta
de sangue. As figuras mostram a performance alcançada pelos animais submetidos ao
treinamento físico.
71

Distância Total
1500 ***
1250

1000
metros (m)

750

500

250

0
Sedentários Exercitados

Figura 6: Comparação da distância total percorrida entre os diferentes grupos, durante o teste com velocidade
progressiva até a exaustão, grupo mantido sedentário (n = 6) e grupo dos animais exercitados (n = 6). Observou-
se um aumento significativo de 190, 28% na distância total percorrida para o grupo exercitado. Os dados são
apresentados como média ± erro padrão da média. Analisados através de teste t. (***) diferença significativa
entre o grupo exercitado e os demais grupos (P<0,0001).

Velocidade Total
3.5 ***
3.0
kilometros/ hora (km/h)

2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
Sedentários Exercitados

Figura 7: Comparação entre a velocidade total alcançada entre os diferentes grupos, durante o teste com
velocidade progressiva até a exaustão, grupo mantido sedentário (n = 6) e grupo dos animais exercitados (n = 6).
Observou-se um aumento significativo de 74,98% na velocidade máxima obtida no grupo exercitado. Os dados
72

são apresentados como média ± erro padrão da média. Analisados através de teste t. (***) diferença significativa
entre o grupo exercitado e os demais grupos (P<0,0001).

Tempo Total
50 ***
40
minutos (min)

30

20

10

0
Sedentários Exercitados

Figura 8: Comparação do tempo total alcançado entre os diferentes grupos durante teste de velocidade
progressiva até a exaustão, grupo mantido sedentário (n = 6) e grupo dos animais exercitados (n = 6). Observou-
se um aumento significativo de 78, 62% do tempo total percorrida pelo grupo exercitado. Os dados são
apresentados como média ± erro padrão da média. Analisados através de teste t. (***) diferença significativa
entre o grupo exercitado e os demais grupos (P<0,0001).

5.2.1 Testes Exaustivos com coletas sanguíneas para dosagem de Lactato e análise de
Glicemia.

A análise do comportamento glicêmico, quando comparada entre os dois grupos,


não houve diferença significativa durante os testes com velocidades progressivas até a
exaustão com coletas sanguíneas (10 µL), embora tenha existido uma tendência ao aumento
da glicemia ao longo do tempo durante a elevação do esforço para o grupo sedentário e uma
diminuição da concentração de glicemia para o grupo submetido ao protocolo de treinamento
físico (Figura 9) (P<0,05). A análise dos dados foi verificado pelo teste ANOVA two way
bidimencional seguida de pós-teste de Bonferroni. Os resultados de repouso foram
normalizados a cem porcento, sedentários e exercitados, objetivando uma melhor observação
73

do comportamento glicêmico ao longo do teste com o incremento de velocidade em relação


ao tempo, finalizando o teste quando os animais se exauriam. De acordo com os dados brutos
de repouso, observou-se, respectivamente, aos animais sedentários e exercitados (138,33 ±
11,72 e 129,30 ± 4,89), aos 24 minutos (150,2 ± 10,55 e 131,0 ± 12,99), aos 27 minutos 144,5
± 9,19 e 127,5 ± 14,69). Para os animais exercitados foram encontrados ainda aos 42 minutos
(123,8 ± 8,53), aos 45 minutos (116,75 ± 12,28), aos 48 minutos 115,33 ± 13,01) e finalmente
aos 51 minutos (110,0 ± 28,28).

Curva Glicêmica
Velocidades Progressivas até a Exaustão

120
Glicemia (% relativa ao inicial)

Sedentários
Exercitados
110

100

90

0 6 12 18 24 30 36 42 48
Tempo (min)

Figura 9: Valores de glicemia ao longo do tempo durante o teste com velocidades progressivas até a exaustão
para o grupo mantido sedentário (n = 6) e grupo dos animais exercitados (n = 6). Os dados são apresentados
como média ± erro padrão da média. Não houve diferença estatísticamente significante (P<0,05). Os dados
foram analisados através do ANOVA two way bidimencional seguida de pós-teste de Bonferroni.

Foi observado que os animais sedentários tiveram tempo máximo de exaustão aos
27 minutos à velocidade de 2,1 km/h, enquanto que os animais exercitados só chegaram à
exaustão no tempo máximo de 51 minutos a velocidade de 3,7 km/h, havendo uma diferença
de tempo para se atingir a exaustão de 24 minutos quando comparados os dois grupos
estudados.
74

Também foi observado que o grupo sedentário alcançou o limiar anaeróbio aos 24
minutos do teste exaustivo à velocidade de 1,7 km/h, entretanto os animais submetidos ao
protocolo de treinamento físico atingiram o limiar anaeróbio aos 42 minutos do teste à
velocidade de 2,9 km/h (Figura 10), havendo uma diferença de tempo para se atingir o limiar
anaeróbio de 18 minutos quando comparados os dois grupos estudados. O limiar anaeróbio é
definido como uma intensidade de exercício associada a um valor sanguíneo de lactato que
ultrapassa uma variação normal de repouso, ou perda do estado estável. Estatisticamente este
foi identificado como o valor da curva de lactato significativamente maior do que o valor de
lactato que o precede. Foi observado também que os animais sedentários resistiram apenas
por mais um incremento de velocidade (de 1,9 km/h para 2,1 km/h) logo após ter sido
observado o limiar anaeróbio. Os animais exercitados resistiram mais três incrementos de
velocidade após ter sido identificado o limiar anaeróbio (de 3,1 km/h para 3,7 km/h) para
valores mais altos de lactato quando comparados ao grupo sedentário.

Os valores obtidos no presente estudo, quanto ao limiar anaeróbio, caracterizado


neste estudo como perda da estabilização (produção = remoção) dos animais sedentários e
exercitados foram semelhantes (2,96 ± 1,36 mM). O início do acúmulo de lactato (PILIS et
al., 1993), foram observados nos valores médios de concentração a (3,89 ± 1,46 mM) aos 27
minutos para os animais sedentários e (3,73 ± 1,23 mM) aos 45 minutos para os animais
submetidos ao protocolo de treinamento aeróbio.

Foram observadas diferenças estatísticamente significantes, analisadas através do


A NOVA two way seguida de pós-teste de Bonferroni entre os valores médios das
concentrações de lactato dos animais sedentários e exercitados aos 21 minutos (2,80 ± 1,56
mM vs 2,41 ± 1,78 mM, respectivamente), aos 24 minutos (2,96 ± 1,06 mM vs 2,44 ± 1,23
mM ) e aos 27 minutos (3,89 ± 1,46 mM vs 2,38 ± 1,28 mM ).

Verificou-se que nos animais sedentários ocorreu diferença estatística


significativa quando comparadas as concentrações de lactato no repouso (1,79 ± 0,14 mM) e
ao ponto de exaustão (3,89 ± 1,46 mM). Nos animais exercitados, ocorreu diferença
significativa quando comparada as concentrações de lactato no repouso (1,80 ± 0,13 mM) aos
45 minutos (3,73 ± 2,31 mM), aos 48 minutos (4,70 ± 2,03 mM) e aos 51 minutos (5,52 ±
1,23 mM) para os animais submetidos ao treinamento de endurance.
75

10

Lactato
Velocidades Progressivas até a Exaustão

6
Sedentários
***
5 Exercitados
# ***
milimols mM

4 ***
***
# #
3

1
0 6 12 18 24 30 36 42 48
Limiar lactato Limiar lactato
Sedentários Exercitados
Tempo (min)

Figura 10: Valores de lactato ao longo do tempo durante teste com velocidade progressiva até a exaustão. Grupo
mantido sedentário (n = 6) e grupo dos animais exercitados (n = 6). O limiar anaeróbio foi alcançado aos 24 min
nos animais sedentários e aos 42 min nos animais exercitados. Os dados foram analisados através do ANOVA
two way não pareado e pós-teste de Bonferroni para comparação entre grupos e para comparação dos valores de
lactato dentro do mesmo grupo. (#) indica diferença entre os grupos (P<0,05). (***) indica diferença com
relação ao tempo anterior dentro do mesmo grupo (P<0,0001).

Durante teste com velocidades progressivas até a exaustão, foi observado uma
positiva correlação de 0,761, quando comparado os valores de glicemia e lactato do grupo
sedentário (Figura 11) e uma negativa correlação de - 0,722 entre a glicemia e lactato do
grupo exercitado (Figura 12).
76

11

Correlação Glicemia Lactato


Velocidades Progressivas até a Exaustão
5

4
Lactato mM

1
r = 0,671
0
130 140 150 160 170
Glicemia (mg/dL)

Figura 11: Correlação dos valores de glicemia e lactato do grupo sedentário durante teste com velocidades
progressivas até a exaustão, calculadas pelo teste de Spearman (r). (*) (P<0,02).

12

Correlação Glicemia Lactato


Velocidades Progressivas até a Exaustão
4.0

3.5
Lactato mM

3.0

2.5

2.0
r = - 0,861
1.5
100 110 120 130 140 150
Glicemia (mg/dL)

Figura 12: Correlação dos valores de glicemia e lactato do grupo exercitado durante teste com velocidades
progressivas até a exaustão, calculadas pelo teste de Spearman (r). (***) (P<0,0001).
77

5.2.2 Determinação do Máximo Estado Estável do Lactato sanguíneo através de Testes


contínuos de Cargas Independentes e análise da Glicemia.

Após avaliações de testes com velocidades máximas até a exaustão em esteira


rolante, iniciou-se o estudo do comportamento do lactato e da glicemia sanguínea durante
testes com velocidades contínuas, baseadas em percentuais das intensidades alcançadas
durante testes exaustivos (TE) iniciais (sem coleta sanguínea). Analisou-se através da
correlação entre diferentes percentuais de velocidades contínuas (45%, 60% e 75%) dentro do
mesmo grupo sedentário (Figura 13) e do grupo submetido ao protocolo de treinamento físico
(45%, 60%, 75% e 90%) (Figura 14), o comportamento da glicemia sanguínea. Os dados
foram analisados através do ANOVA two way, para (P<0,05). Não houve diferença
estatisticamente significante em relação ao tempo e ao treinamento, porém ocorreu alta
correspondência entre os diferentes percentuais para o grupo sedentário. Para o grupo
exercitado, não houve diferença estatisticamente significante em relação ao treinamento, mas
uma leve relação ao tempo e uma forte correspondência entre os diferentes percentuais. Nos
animais sedentários foi verificada uma leve tendência a elevação da glicemia ao longo do
tempo e com a duração do esforço para as diferentes intensidades, enquanto que para os
animais exercitados, visualiza-se uma discreta tendência a diminuição da glicemia ao longo
do teste.

13

Curva Glicêmica - Sedentários


Velocidades Contínuas

130
45%
Glicemia (% relativa a inicial)

120 60%
75%
110

100

90

80
0 7 14 21 28
Tempo (min)
78

Figura 13: Valores de glicemia do grupo sedentário (n = 6), durante diferentes velocidades percentuais a 45%,
60% e 75%, realizados no decorrer dos testes com velocidades contínuas com cargas independentes. Os dados
são apresentados como média ± erro padrão da média, calculado pelo teste ANOVA two way, para (P<0,05).

14

Curva Glicêmica - Exercitados


Velocidades Contínuas

110
45%
Glicemia (% relativa a inicial)

105 60%
75%
100 90%

95

90

85
0 7 14 21 28
Tempo (min)

Figura 14: Disposição dos valores de glicemia do grupo exercitado (n = 6), durante diferentes velocidades
percentuais a 45%, 60%, 75% e 90%, realizados no decorrer dos testes com velocidades contínuas com cargas
independentes. Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média, calculado pelo teste ANOVA
two way, para (P<0,05).

Observam-se nas figuras seguintes o comportamento da glicemia entre os grupos


sedentário e o exercitado nos diferentes percentuais de velocidades contínuas com
intensidades independentes. À velocidade de 45% do TE, verificou-se uma significativa
relação de correspondência entre os dois grupos e nenhuma diferença estatística entre os
diferentes grupos a um dado tempo (Figura 15); na velocidade de 60% houve uma
significativa relação de correspondência entre os dois grupos e diferença estatística
significante entre os diferentes grupos a um dado tempo , observado aos 14 min, 21 min e aos
28 minutos (Figura16). Na velocidade a 75%, ocorreu uma significativa relação de
correspondência entre os dois grupos e diferença estatísticamente significante entre o tempo e
o treinamento, observado aos 21 min e aos 28 min (efeito do treinamento) (Figura17).
79

15

Curva Glicêmica - 45%


Velocidades Contínuas

110
Sedentários
Glicemia (% relativa a inicial)

Exercitados
105

100

95

90
0 7 14 21 28
Tempo (min)

Figura 15: Disposição dos valores de glicemia do grupo sedentário (n = 6) e exercitado (n = 6), durante testes
com velocidade contínua a (45%). Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média, calculado
pelo teste ANOVA two way, para (P<0,05).

16

Curva Glicêmica - 60%


Velocidades Contínuas

120
Sedentários
Glicemia (% relativa a inicial)

Exercitados
110

100
* **
*
90

80
0 7 14 21 28
Tempo (min)
80

Figura 16: Valores de glicemia do grupo sedentário (n = 6) e exercitado (n = 6), durante testes com velocidade
contínua a (60%). Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média, calculado pelo teste ANOVA
two way. (*) Efeito da Interação aos 14 min e 21 min, (P<0,03); (**) diferença estatisticamente significante em
relação ao treinamento aos 28 min, (P<0,001)

17

Curva Glicêmica - 75%


Velocidades Contínuas

110
Sedentários
Glicemia (% relativa a inicial)

105 Exercitados

100

95 *
*
90

85
0 7 14 21 28
Tempo (min)

Figura 17: Valores de glicemia do grupo sedentário (n = 6) e exercitado (n = 6), durante testes com velocidade
contínua a (75%). Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média, calculado pelo teste ANOVA
two way. (*) diferença estatisticamente significante em relação ao treinamento aos 21 e 28 min, (P<0,01).

Os resultados de lactato sanguíneo obtidos durante teste de velocidade


progressiva máxima até a exaustão verificou-se o comportamento do lactato através de testes
contínuos com velocidades independentes submáximas. Objetivou-se encontrar através deste
teste a velocidade em que os grupos estudados mantivessem o máximo estado estável do
lactato. Nestes testes foram verificadas as cargas em que ocorreu a estabilização do lactato
sanguíneo.
81

Nas figuras que seguem, observa-se através da comparação entre diferentes


percentuais de velocidades contínuas (45%, 60% e 75%) dentro do mesmo grupo sedentário
(Figura 18) e do grupo submetido ao protocolo de treinamento físico (45%, 60%, 75% e 90%)
(Figura 19), o comportamento do lactato sanguíneo. Utilizou-se o ANOVA two way seguida
de pós teste de Bonferroni, (P<0,001). Os dados analisados mostraram que houve uma
significativa interação entre os percentuais de velocidade analisados nos grupos, ocorrendo
diferença estatísticamente significante entre o tempo e o treinamento aos 75% em relação a
velocidade de 45% e 60% nos tempos de 7 min, 14 min, 21min e 28 min nos animais
sedentários. Entre 45% e 60% ocorreu diferença estatística somente aos 28 min (Figura 18).

Nos animais exercitados foram observadas diferenças estatísticamente


significantes entre o tempo e o treinamento a velocidade 90% em relação a todas as demais
intensidades de 45%, 60% e 75% nos tempos aos 7 min, 14 min, 21 min e 28 min. O mesmo
ocorreu à velocidade de 75% em relação às intensidades de 45%, 60% nos tempos aos 7 min,
14 min, 21 min e 28 min. Naõ foi verificado diferença alguma entre as intensidades de 45% e
60% (Figura 19).

18

Lactato - Sedentários
Velocidades Contínuas

6 ***
45%
5 *** 60%
75%
4 ***
Lactato mM

3 *** ***
2

0
0 7 14 21 28
Tempo (min)
82

Figura 18: Valores de lactato do grupo sedentário (n=6) durante testes com velocidades contínuas com
intensidades independentes. Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média, calculado pelo teste
ANOVA two way e pós-teste de Bonferroni. (***) diferença estatisticamente significante entre as intensidades
(45% vs 60%), aos 28 min (P<0,001). (***) diferença estatisticamente significante entre as diferentes
intensidades (45% vs 75%) e (60% vs 75%), aos 7, 14, 21 e 28 min, (P<0,001).

19

Lactato - Exercitados
Velocidades Contínuas

6 ***
45%
*** 60%
***
4 *** *** 75%
Lactato mM

*** 90%
***
***
2

0
0 7 14 21 28
Tempo (min)

Figura 19: Disposição dos valores de Lactato do grupo dos animais exercitados (n = 6), durante testes com
velocidades contínuas com cargas independentes Os dados são apresentados como média ± erro padrão da
média, calculado pelo teste ANOVA two way e pós-teste de Bonferroni. (***) diferença estatisticamente
significante entre tempos de diferentes intensidades (45% vs 75%), (45% vs 90%), (60% vs 75%), (60% vs
90%), (75% vs 90%), (P<0,001).

Como se pode observar na (Figura 20, 21 e 22), a máxima velocidade onde ocorre
a estabilização da concentração do lactato sanguíneo ocorre a 60% correspondente a
velocidade de 1,2 km/h, numa concentração de lactato sanguíneo de 2,13 mM. Quando
intensidades supra limiares são aplicadas, como por exemplo, a 75%, constata-se um aumento
da concentração do lactato em relação ao tempo, sugerindo uma exacerbada produção de
lactato e a descompensação da capacidade remoção. Observa-se ainda o efeito positivo do
83

treinamento físico nas concentrações de lactato que tenderam a ser mais baixas que os valores
observados do grupo sedentário.

Nas velocidades de 45% e 60% não foi verificada diferença estatisticamente


significante sobre os tempos nos diferentes grupos, porém os fatores entre as curvas
analisadas foram considerados significantes. Na intensidade de 75%, a interação entre as
curvas analisadas apresentaram substanciosa correlação e diferença estatística em relação ao
tempo aos 21 e 28 min, uma vez que estes tempos apresentaram forte significância entre os
grupos. Para análise dos dados foi utlizado o ANOVA two way seguida de pós-teste de
Bonferroni, (P<0,001). Observa-se que aos 21 e 28 minutos ocorre uma estabilização da
concentração de lactato para os animais exercitados em relação aos animais sedentários,
indicando, por tanto, um novo limiar anaeróbio para os animais submetidos ao protocolo de
treinamento de endurance, porém com valores mais elevados de lactato, sugerindo maior
metabolização desse substrato pelo metabolismo oxidativo.

20

Lactato - 45%
Velocidades Contínuas

2.20
Sedentários
2.15 Exercitados
Lactato mM

2.10

2.05

2.00

0 7 14 21 28
Tempo (min)

Figura 20: Valores de lactato do grupo sedentário (n = 6) e exercitado (n = 6), durante testes com velocidade
contínua a (45%). Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média, calculado pelo teste ANOVA
two way e pós-teste de Bonferroni, (P<0,05).
84

21

Lactato - 60%
Velocidades Contínuas

2.3
Sedentários
Exercitados
2.2
Lactato mM

2.1

2.0

0 7 14 21 28
Tempo (min)

Figura 21: Valores de lactato do grupo sedentário (n = 6) e Exercitado (n = 6), durante testes com velocidade
contínua a (60%). Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média, calculado pelo teste ANOVA
two way e pós-teste de Bonferroni, (P<0,05).

22

Lactato - 75%
Velocidades Contínuas

6 ***
Sedentários
5 *** Exercitados
Lactato mM

1
0 7 14 21 28
Tempo (min)
85

Figura 22: Disposição dos valores de lactato do grupo sedentário (n = 6) e exercitado (n = 6), durante testes com
velocidade contínua a (75%). Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média, calculado pelo
teste ANOVA two way e pós-teste de Bonferroni. (***) diferença estatisticamente significante entre os tempos e
os diferentes grupos estudados aos 21 e 28 min, (P<0,001).

Durante testes de velocidades continuas com dosagens de lactato e análises da


glicose, foram realizadas as correlações entre as variáveis (Quadro 7). Utilizou-se o teste de
Spearman, (alpha=0,05). Observou-se uma baixa correlação entre os diferentes percentuais de
intensidade dentro do mesmo grupo (n=6) animais sedentários e (n=6) exercitados.

Quadro 7: Correlação do lactato com a glicemia nos testes de determinação do máximo estado
estável do lactato sanguíneo nas diferente intensidades, entre os diferentes grupos.
(r) relação de Spearman.

Grupos Intensidades (r) relação de Spearman


Exercitados 45% r = 0,191
Sedentários 45% r = 0,063
Exercitados 60% r = 0,212
Sedentários 60% r = 0,216
Exercitados 75% r = - 0,224
Sedentários 75% r = 0,286
Exercitados 90% r = 0,019

5.3 ATIVIDADE MÁXIMA ENZIMÁTICA: CITRATO SINTASE

A atividade da citrato sintase, enzima passo limitante do ciclo de krebs, foi


utilizada como marcador de adaptação ao treinamento físico. Utilizou-se o teste t, (P<0,05).
Os resultados do músculo sóleo (S), composto por fibras predominantemente vermelhas, estão
expressos na (Figura 23). Observou-se aumento médio de 52,8% da atividade da citrato
sintase no músculo dos animais exercitados.
86

23

Citrato Sintase
Sóleo
300
*
(nmol/min/mg de proteína)
200

100

0
Sedentário Treinado

Figura 23: Avaliação da atividade máxima da citrato sintase dos animais sedentários (n=6) e dos animais
exercitados (n=6). Observou-se aumento 52,8% no músculo (S). Os dados são apresentados como média ± erro
padrão da média, comparados através de teste t, apresentando diferença estatística (*) (P<0,05).

Os resultados do músculo gastrocnêmio vermelho (GV), estão expressos na


(Figura 24). Observou-se aumento médio de 58% da atividade da citrato sintase neste
músculo dos animais exercitados.
87

24

Citrato Sintase
Gatrocnêmio Porção Vermelha

200
(nmol/min/mg de proteína)
*
150

100

50

0
Sedentário Treinado

Figura 24: Avaliação da atividade máxima da citrato sintase dos animais sedentários (n=6) e dos animais
exercitados (n=6). Observou-se aumento 58% no músculo (GV). Os dados são apresentados como média ± erro
padrão da média, comparados através de teste t, apresentando diferença estatística (*) (P<0,05).

Na porção branca do músculo gastrocnêmio (GB) (Figura 25). Observou-se


aumento médio de (79%) da atividade da citrato sintase para o grupo exercitado em relação ao
grupo sedentário.
88

25

Citrato Sintase
Gatrocnêmio Porção Branca

60 *
(nmol/min/mg de proteína)

40

20

0
Sedentário Treinado

Figura 25: Avaliação da atividade máxima da citrato sintase dos animais sedentários (n=6) e dos animais
exercitados (n=6). Observou-se aumento 79% no músculo (GB). Os dados são apresentados como média ± erro
padrão da média Os dados foram comparados através de teste t, apresentando diferença estatística (*) (P<0,05).

Não se observou qualquer alteração da atividade da citrato sintase no músculo


cardíaco (C) (Figura 26) para o grupo exercitado em relação ao grupo sedentário.
89

26

Citrato Sintase
Coração

400
(nmol/min/mg de proteína)
300

200

100

0
Sedentário Treinado

Figura 26: Avaliação da atividade máxima da citrato sintase dos animais sedentários (n=6) e dos animais
exercitados (n=6). Não se observou aumento no (C). Os dados são apresentados como média ± erro padrão da
média, comparados através de teste t.

No fígado (F), observou-se aumento médio de 57% da atividade da citrato sintase


neste órgão (Figura 27) para os animais submetidos ao protocolo de exercício físico.
90

27

Citrato Sintase
Fígado
30
(nmol/min/mg de proteína)
*
20

10

0
Sedentário Treinado

Figura 27: Avaliação da atividade máxima da citrato sintase dos animais sedentários (n=6) e dos animais
exercitados (n=6). Observou-se aumento 57% no (F). Os dados são apresentados como média ± erro padrão da
média, comparados através de teste t, apresentando diferença estatística (*) (P<0,05).

5.4 CONTEÚDO DE GLICOGÊNIO

À avaliação do conteúdo de glicogênio na porção branca do músculo


gastrocnêmio (GB) (Figura 28) não foi observada diferença estatística entre os grupos
estudados, porém se observou tendência ao aumento para o grupo submetido ao exercício
quando comparado ao grupo sedentário. Quanto à porção vermelha do gastrocnêmio (GV)
(Figura 29), também não se observou diferença estatística entre os grupos analisados quanto
ao conteúdo de glicogênio.
91

28

Glicogênio
Gastrocnêmio Porção Branca

0.20
(nmol/min/mg de proteína)

0.15

0.10

0.05

0.00
Sedentarios Exercitados

Figura 28: Avaliação do conteúdo de glicogênio na porção branca do músculo gastrocnêmio dos animais
sedentários (n=6) e dos animais exercitados (n=6). Os dados são apresentados como média ± erro padrão da
média, não ocorrendo diferença estatística entre os grupos. Os dados foram comparados através de teste t,
(P<0,05).

29

Glicogênio
Gastrocnêmio Porção Vermelha

0.15
(nmol/min/mg de proteína)

0.10

0.05

0.00
Sedentários Exercitados

Figura 29: Avaliação do conteúdo de glicogênio na porção vermelha do músculo gastrocnêmio dos animais
sedentários (n=6) e dos animais exercitados (n=6). Os dados são apresentados como média ± erro padrão da
92

média, não ocorrendo diferença estatística entre os grupos. Os dados foram comparados através de teste t
(P<0,05).

5.5 CONTRATILIDADE E ATIVIDADE ATPase

A determinação da tipagem de fibra, através de análise histoquímica para miosina


ATPase, foi realizada no músculo gastrocnêmio, análise do ventre muscular de toda porção do
músculo, nos animais sedentários e nos submetidos ao protocolo de exercícios físicos. Foi
avaliada a proporção dos diferentes tipos de fibras, tipo I (oxidativas) e tipo II (glicolíticas)
como marcador de adaptação ao treinamento físico. Os valores percentuais do número de
fibras tipo I (oxidativas) nos animais exercitados apresentaram aumento significativo de 43%
quando comparados com os animais do grupo sedentário, e uma diminuição das fibras tipo II
(glicolíticas) em 20% (Figura 30), sendo as diferenças estatisticamente significativas (p <
0,05) quando analisadas pelo teste t.

30

Distribuição Tipos de Fibras


Gastrocnêmio

80
* Fibras tipo I

60
* Fibras tpo II
percentual (%)

40

20

0
Sedentário Treinado Sedentário Treinado

Figura 30: Avaliação histoquímica do músculo gastrocnêmio dos animais sedentários (n=6) e dos animais
exercitados (n=6). Observou-se aumento de 43% nas fibras tipo I (oxidativas) e diminuição de 20% nas fibras
93

tipo II (glicolíticas). Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média. Para análise estatística foi
utilizado teste t (*) (P<0,05).

5.6 MARCADORES MOLECULARES PROTÉICOS DO TREINAMENTO FÍSICO

5.6.1 Quantificação Protéica de PGC-1α no Músculo Esquelético

A quantificação de proteínas através de western blotting foi utilizada para


determinar se houve modificações moleculares adaptativas ao treinamento físico no músculo
esquelético, na porção branca do gastrocnêmio (GB), porção vermelha do gastrocnêmio (GV)
e sóleo (S) dos animais sedentários e submetidos ao protocolo de treinamento físico.
Observou-se que ocorreu aumento de 143% na atividade do proliferador de peroxissoma
gama ativado coactivator receptor alfa (PGC-1α) no músculo gastrocnêmio vermelho (Figura
31) e aumento de 77% na expressão protéica da enzima no músculo sóleo (Figura 32) dos
animais treinados em relação aos animais mantidos sedentários. Não se observou diferença
estatisticamente significante na porção branca do músculo gastrocnêmio (Figura 33). As
análises estatísticas foram realizadas através de teste t.

31

PGC1-
Gastrocnêmio Porção Vermelha

0.4
***
0.3
unidades arbitrárias

0.2

0.1

0.0
Sedentários Exercícios
94

Figura 31: Quantificação de PGC-1α através de técnica western blotting. Os dados do músculo gastrocnêmico
vermelho (GV) do grupo sedentário (n=6) e grupo dos animais exercitados (n=6). Os dados são apresentados
como média ± erro padrão da média, comparados através de teste t, apresentando diferença estatística (***)
(P<0,0005) vs. sedentários. Verificou-se aumento de 143% em relação aos sedentários.

32

PGC1-
Sóleo

1.5 *
*
unidades arbitrárias

1.0

0.5

0.0
Sedentários Exercícios

Figura 32: Quantificação de PGC-1α através de técnica western blotting. Músculo sóleo (S) do grupo sedentário
(n=6) e grupo dos animais exercitados (n=6). Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média,
comparados através de teste t, apresentando diferença estatística (*) (P<0,02) vs. sedentários. Verificou-se
aumento de 77% em relação aos sedentários.
95

33

PGC1-
Gastrocnêmio Porção Branca

0.6
unidades arbitrárias

0.4

0.2

0.0
Sedentários Exercícios

Figura 33: Quantificação de PGC-1α através de técnica western blotting. Músculo gastrocnêmico porção branca
(GB) do grupo sedentário (n=6) e grupo dos animais exercitados (n=6). Os dados são apresentados como média
± erro padrão da média, comparados através de teste t.

5.6.2 Quantificação proteica de PDK 4 em músculo esquelético e fígado.

A análise através de western blotting foi utilizada para determinar se houve


modificações moleculares adaptativas ao treinamento físico no músculo esquelético, porção
vermelha do gastrocnêmio (GV), sóleo (S), porção branca do gastrocnêmio (GB) e no fígado
(F) dos animais submetidos ao protocolo de treinamento físico. Observou-se que ocorreu
aumento de 41% na atividade da piruvato desidrogenase quinase 4 (PDK 4) no músculo
gastrocnêmio porção vermelha (Figura 34) e aumento de 179% na expressão protéica da
enzima no músculo sóleo (Figura 35) dos animais treinados em relação aos animais mantidos
sedentários. Não se observou diferença estatisticamente significante na porção branca do
músculo gastrocnêmio (Figura 36), nem no fígado (Figura 37). As análises estatísticas foram
realizadas através de teste t, (P<0,05).
96

34

PDK 4
Gastrocnêmio Porção Vermelha

*
0.0012
unidades arbitrárias

0.0008

0.0004

0.0000
Sedentários Exercitados

Figura 34: Quantificação de PDK 4 através de técnica de western blotting. Músculo gastrocnêmico porção
vermelha (GV) do grupo sedentário (n=6) e grupo dos animais exercitados (n=6). Os dados são apresentados
como média ± erro padrão da média, comparados através de teste t. (*) (P<0,05) vs. sedentários. Verificou-se
aumento de 41% em relação aos sedentários.

35

PDK4
Sóleo
0.6 *
unidades arbitrárias

0.4

0.2

0.0
Sedentários Exercitados

Figura 35: Quantificação de PDK 4 através de técnica de western blotting. Músculo sóleo (S) do grupo
sedentário (n=6) e grupo dos animais exercitados (n=6). Os dados são apresentados como média ± erro padrão da
97

média, comparados através de teste t, (*) (P<0,05) vs. sedentários. Verificou-se aumento de 179% em relação
aos sedentários.

36

PDK4
Gastrocnêmio Porção Branca

0.60
unidades arbitrárias

0.45

0.30

0.15

0.00
Sedentários Exercitados

Figura 36: Quantificação de PDK 4 através de técnica de Western blotting. Músculo gastrocnêmico porção
branca (GB) do grupo sedentário (n=6) e grupo dos animais exercitados (n=6). Os dados são apresentados como
média ± erro padrão da média, comparados através de teste t, (P<0,05).

37

PDK4
Fígado

1.2
unidades arbitrárias

0.9

0.6

0.3

0.0
Sedentários Exercitados
98

Figura 37: Quantificação de PDK 4 através de técnica de western blotting. Fígado (F) do grupo sedentário (n=6)
e grupo dos animais exercitados (n=6). Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média,
comparados através de teste t, (P<0,05).

5.6.3 Quantificação proteica de HK II no músculo esquelético.

O estudo através da quantificação do conteúdo proteíco de hexoquinase II (HK II)


pela técnica de western blotting foi utilizado como marcador de adaptação ao exercício físico.
Foram avaliadas a porção branca do gastrocnêmio (GB), porção vermelha do gastrocnêmio
(GV) e o sóleo (S) dos animais sedentários e submetidos ao protocolo de treinamento físico.
Observou-se aumento de 28% na atividade de hexoquinase II (HK II) em (28%) (Figura 38)
no músculo gastrocnêmio porção branca. Na porção vermelha do gastrocnêmio (Figura 39) e
no sóleo (Figura 40), não se observou diferença estatisticamente significante dos animais
treinados em relação aos animais mantidos sedentários. As análises foram realizadas através
de teste t.

38

HK II
Gastrocnêmio Porção Branca

0.8 *
0.6
unidades arbitrárias

0.4

0.2

0.0
Sedentários Exercitados
99

Figura 38: Quantificação de HX II através de técnica western blotting. Músculo gastrocnêmico porção branca
(GB) do grupo sedentário (n=6) e grupo dos animais exercitados (n=6). Os dados são apresentados como média
± erro padrão da média, comparados através de teste t, (*) (P<0,05) vs. sedentários. Verificou-se aumento de
28% em relação aos sedentários.

39

HK II
Gastrocnêmio Porção Vermelha

0.8

0.6
unidades arbitrárias

0.4

0.2

0.0
Sedentários Exercitados

Figura 39: Quantificação de HX II através de técnica western blotting. Músculo gastrocnêmico porção vermelha
(GV) do grupo sedentário (n=6) e grupo dos animais exercitados (n=6). Os dados são apresentados como média
± erro padrão da média, comparados através de teste t, (P<0,05) vs. sedentários.
100

40

HK II
Sóleo
1.0

0.8
unidades arbitrárias

0.6

0.4

0.2

0.0
Sedentários Exercitados

Figura 40: Quantificação de HX II através de técnica western blotting. Músculo sóleo (S) do grupo sedentário
(n=6) e grupo dos animais exercitados (n=6). Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média,
comparados através de teste t, (P<0,05) vs. sedentários.

5.6.4 Quantificação protéica de ACCp no fígado.

A análise através da técnica de western blotting foi utilizada para determinar o


conteúdo protéico de marcadores relacionados à adaptação ao exercício aeróbio no fígado (F)
dos animais submetidos ao protocolo de treinamento físico. Observou-se que ocorreu aumento
significativo da expressão protéica da acetil CoA carboxilase fosforilada (ACCp) (Figura 41)
no fígado de (326%) nos animais exercitados em relação aos animais mantidos sedentários. A
expressão da proteína de interesse foi normalizada pelo conteúdo total de proteína da amostra.
As análises foram realizadas através de teste t.
101

41

ACCp
Fígado
600000
*
unidades arbitrárias

400000

200000

0
Sedentários Exercitados

Figura 41: Quantificação do conteúdo protéico de ACCp através de técnica de western blotting. Fígado (F) do
grupo sedentário (n=6) e grupo dos animais exercitados (n=6). Os dados são apresentados como média ± erro
padrão da média, comparados através de teste t, (*) (P<0,05) vs. sedentários. Verificou-se aumento de 326% em
relação aos sedentários.

5.6.5 Quantificação proteica de citocromo C no fígado.

Componente da cadeia de transportadora de elétrons mitocondrial, sua expressão


protéica esta relacionada à capacidade oxidativa e biogênese mitocondrial do tecido. A
quantificação de proteínas através de western blotting foi utilizada para determinar se houve
modificações moleculares adaptativas ao treinamento físico no fígado (F) dos animais
submetidos ao protocolo de treinamento físico comparado aos sedentários. Observou-se que
ocorreu acréscimo de 25% do conteúdo de citocromo C no fígado (Figura 42) dos animais
treinados em relação aos animais mantidos sedentários. As análises estatísticas foram
realizadas através de teste t.
102

42

Citocromo C
Fígado

unidades arbitrárias 0.8 *


0.6

0.4
*
0.2

0.0
Sedentarios Exercítados

Figura 42: Quantificação de citocromo C através de técnica western blotting. Fígado (F) do grupo sedentário
(n=6) e grupo dos animais exercitados (n=6). Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média,
comparados através de teste t, (*) (P<0,05) vs. sedentários. Verificou-se aumento de 25% nos animais
exercitados em relação aos sedentários.

5.7 CONCENTRAÇÃO DE NITRITO: ÓXIDO NÍTRICO

Uma vez que os animais exercitados apresentaram uma melhor a performance


durante os testes, foi investigado se a melhora estava associada a uma maior produção dos
derivados de óxido nitrico (NO). Como demonstrado na (Figura 43), o nitrito apresentou
concentração 61% maior no músculo cardíaco dos animais submetidos ao protocolo de
exercícios físicos quando comparados aos mantidos sedentários. Quando avaliada a porção
vermelha do músculo gastrocnêmio (GV) foi verificado aumento significativo de 39% (Figura
44), porém não houve diferença estatisticamente significante para a porção branca do músculo
gastrocnêmio (Figura 45).
103

43

Óxido Nítrico
Coração

125
**
100
nitrito (ug)

75

50

25

0
Sedentários Exercítados

Figura 43: Concentração de nitrito no músculo cardíaco do grupo sedentário (n=6) e grupo dos animais
exercitados (n=6). Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média, a significância da diferença
entre as concentrações foi analisada através de teste t, (**) (P<0,003) vs. sedentários. Verificou-se aumento de
61% nos animais exercitados.

44

Óxido Nítrico
Gastrocnêmio Porção Vermelha

2.0 *
1.5
nitrito (ug)

1.0

0.5

0.0
Sedentários Exercitados

Figura 44: Concentração de nitrito no músculo gastrocnêmio porção vermelha (GV) do grupo sedentário (n=6) e
grupo dos animais exercitados (n=6). Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média, a
104

significância da diferença entre as concentrações foi analisada através de teste t (P<0,05) vs. sedentários.
Verificou-se aumento de 39% nos animais exercitados.

45

Óxido Nítrico
Gastrocnêmio Porção Branca

1.5

1.2
nitrito (ug)

0.9

0.6

0.3

0.0
Sedentários Exercitados

Figura 45: Concentração de nitrito no músculo gastrocnêmio porção branca (GB) do grupo sedentário (n=6) e
grupo dos animais exercitados (n=6). Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média,
comparados através de teste t. Não foi observada diferença significante entre as concentrações.
105

5.8 RESUMO DOS RESULTADOS

1. Foi realizada a pesagem dos órgãos coração, pulmões, fígado, e dos músculos gastrocnêmio e
sóleo, das gorduras retroperitoneal e epididimal, e da tíbia dos animais sedentários e
exercitados. Os resultados mostraram que houve diferença significativa quanto ao peso dos
pulmões e da tíbia nos animais exercitados. Nos outros tecidos não houve diferença estatística.
Verificou-se diminuição significativa da massa de tecido adiposo retroperitoneal e epididimal
nos animais treinados.

2. Foi acompanhado durante as seis semanas de treinamento o peso corporal, a ingesta alimentar
e hídrica dos animais experimentados. Não foi observada diferença estatística entre os dois
grupos estudados.

3. Foram realizados inicialmente testes exaustivos sem coletas sanguíneas para prescrição do
treinamento físico dos animais, e reproduzidos ao final do período de treinamento para análise
da performance. Observaram-se aumentos significativos da distância total percorrida,
velocidade final alcançada e do tempo total de exaustão nos animais exercitados.

4. Após período de treinamento, os animais foram submetidos a testes com velocidades


progressivas até a exaustão, onde foram realizadas coletas de glicose sanguínea. Não foi
verificada diferença estatística entre os grupos com relação à glicemia.

5. Foram realizadas dosagens de lactato sanguíneo através dos testes com velocidades
progressivas até a exaustão. Foi verificado que os animais sedentários atingiram o limiar
anaeróbio aos 24 minutos e os animais exercitados aos 42 minutos. O tempo de exaustão dos
animais sedentários foi aos 27 minutos, com valor de lactato a (3,89 +- 1,46 mmol/L), já os
animais exercitados, entraram em exaustão aos 51 minutos com concentração de
lactato a (5,52 +- 1,23 mmol/L).

6. Foram verificadas as correlações da glicemia sanguínea com o lactato, mostrando-se positiva


para o grupo sedentário (r = 0,671) (quanto maiores os valores de lactato, maiores os de
glicemia) e negativa para o grupo exercitado (r = - 0,861) (quanto maiores os valores de
lactato, menores os de glicemia).

7. Após período de testes com velocidades progressivas até a exaustão, foram aplicados os testes
com velocidades contínuas para observação da glicose sanguínea nas intensidades a 45%, 60%
106

e 75%. Não foi verificada diferença significativa entre as diferentes velocidades empregadas
para os animais sedentários e nem para os animais exercitados.

8. Quando comparadas as intensidades de 45%, 60% e 75% entre o grupo sedentário e exercitado
no teste de velocidades contínuas, foram observadas diminuições significativas da glicemia
sanguínea para os animais treinados a 60% e a 75%.

9. Dosagens de lactato foram realizadas nos testes de velocidades contínuas para determinação
do máximo estado estável do lactato. Verificou-se diferença significativa quando comparadas
as diferentes intensidades para os animais sedentários a 45%, 60% e 75% e exercitados 45%,
60%, 75% e 90%.

10. A comparação das intensidades de 45%, 60% e 75% entre os animais sedentários e exercitados
mostrou diminuição significativa do lactato à velocidade de 75% nos animais submetidos ao
treinamento. Foi observada tendência a menores concentrações de lactato sanguíneo durante o
repouso e nas velocidades a 60% e a 75%. Observou-se ter ocorrido modificação quanto ao
máximo estado estável do lactato nos animais exercitados, verificando-se estabilização do
lactato a velocidade de 75%, correspondente a 1,5 km/h.

11. Após testes funcionais, foi verificada a atividade da citrato sintase como marcador do
desempenho físico nos animais. Foram obtidos aumentos significativos no músculo sóleo, na
porção vermelha e branca visível, do músculo gastrocnêmio, no fígado dos animais
exercitados, porém não se verificou nenhuma diferença significante no coração.

12. Foram analisadas nas porções branca e vermelha do músculo gastrocnêmio o conteúdo de
glicogênio. Apesar da tendência aumentada na porção branca, não se observou aumento
significante.

13. Quanto a atividade da enzima ATPase na distribuição de fibras do músculo gastrocnêmio,


através de método histoquímico. Foi observado aumento significante de fibras tipo I
(oxidativas) e diminuição de fibras tipo II (glicolíticas) nos animais participantes do programa
de treinamento de endurance.

14. Através da expressão de proteínas moleculares energéticas, foram verificadas modificações


ocorridas com o treinamento aeróbio. A análise da PGC-1α, indicadora de biogênese
107

mitocondrial, apresentou aumento significativo no sóleo e gastrocnêmio vermelho dos animais


exercitados. Não se verificou qualquer alteração na porção branca do gastrocnêmio.

15. A expressão protéica aumentada de PDK4, reguladora da oxidação de ácidos graxos, na


porção branca do gastrocnêmio e no músculo sóleo dos animais submetidos ao protocolo de
treinamento foi significativo. Não se observou diferença estatística na porção branca e no
fígado dos animais experimentados.

16. Foi observado aumento significativo na porção branca do músculo gastrocnêmio, quanto à
quantificação proteína da enzima hexoquinase, reguladora chave da entrada de glicose na via
glicolítica. Nenhuma diferença significativa foi verificada na porção vermelha do
gastrocnêmio e no sóleo.

17. Foi quantificada a expressão protéica de ACCp no fígado, proteína regulatória da oxidação dos
ácidos graxos, na qual se mostrou aumentada após período de treinamento físico nos animais
exercitados. Este resultado demonstra a atividade lipogênica aumentada no fígado.

18. O estudo quantificou a expressão protéica de Citocromo-C no fígado, na qual se mostrou


significativamente aumentada nos animais treinados. Esta é uma proteína transportadora chave
de elétrons para a fosforilação oxidativa e produção aeróbia de ATPs.

19. Foi verificado nos animais exercitados aumento significativo da função vasodilatadora
endotelial através da concentração de nitrito, indicador da presença óxido nítrico, no músculo
cardíaco e na porção vermelha do músculo Agastrocnêmio. Não foi encontrada diferença
estatística na porção branca do gastrocnêmio.
108

6 DISCUSSÃO

Durante seis semanas os animais foram submetidos a um programa de


treinamento físico de endurance em esteira humana adaptada. Os animais passaram por uma
bateria de testes físicos, com o intuito de investigar a exaustão física dos animais e o limiar
anaeróbio. O teste exaustivo (TE) inicial serviu como critério de seleção dos 12 animais
corredores, (n=6) sedentários e (n=6) exercitados e para prescrição do treinamento a
intensidade de 60% do valor máximo encontrado no TE. Foram utilizadas 48h de repouso
entre os testes como critério de minimizar qualquer efeito agudo, ganho de aptidão física, aos
testes.

Ao final do período de treinamento, foi investigado a performance de todos os


animais participantes do estudo: 1- Reproduziu-se o teste exaustivo (TE) para verificar os
ganhos de funcionalidade adaptativa ao treinamento, dentre as variáveis velocidade final
alcançada, tempo total até a exaustão e a distância total percorrida; 2- Passadas 48h ao TE, de
posse de dados pareados (mesmos animais), reproduzimos o mesmo TE, só que agora com
coletas sanguíneas para dosagem de lactato e análise de glicemia, afim de investigar o limiar
anaeróbio e a correlação da glicemia com o lactato diante do ganho de aptidão física dos
animais exercitados; 3- Passadas mais 48h entre os testes, foram realizadas as avaliações
físicas de velocidades contínuas, onde as intensidades empregadas nesse teste foram colhidas
no TE inicial. O intuito da realização desse teste foi o de verificar o máximo estado estável do
lactato, uma vez que este corresponde ao platô de utilização predominante do metabolismo
aeróbio, além de analisar a correlação do lactato com a glicemia sanguínea (dados pareados).

O comportamento da glicemia, a cinética do lactato, os mecanismos que medeiam


a exaustão física e o metabolismo energético no músculo esquelético e em alguns orgãos
(coração e fígado) dos animais sedentários e exercitados submetidos ao estudo, serviram de
base para explicar os resultados funcionais investigados. Os tópicos seguintes dessa
dissertação discutem os ganhos de funcionalidade metabólica energética a intensidade
prescrita para o treinamento de endurance a 60% do TE inicial.
109

Avaliação da Composição Corporal

A avaliação da composição corporal através do peso dos orgãos e o


acompanhamento do peso dos animais mantidos sedentários e submetidos ao treinamento ao
longo do experimento, através de parâmetros diretos de pesagem, é uma forma clássica de
avaliação do desenvolvimento orgânico dos animais submetidos à experimentação
(BELLAVER et. al., 2001; BOAVENTURA et al., 2003). Possíveis alterações hipoplásicas e
atróficas dos tecidos causam comprometimento de sua massa e estrutura, resultando em
diminuição acentuada do tamanho e peso corporal frente a diversas situações de estresse
(GUZMAN-SILVA et. al., 2004).

A pesagem dos animais acontecia uma vez por semana ao longo do período do
treinamento (Figura 3), regulados pelo comprimento da tíbia (OLIVEIRA et al., 2002). As
curvas de evolução do peso corporal dos grupos estudados se mostraram bastante similares,
dessa forma, pode-se afirmar que o treinamento não ocasionou situações de estresse danoso
ao seu desenvolvimento normal. Os ratos treinados não demonstram alteração na sua massa
corporal em relação aos ratos do grupo sedentário, apesar de observa-se nas últimas três
semanas uma leve tendência a elevação do peso dos animais sedentários (Figura 3)
(BOTELHO et. al., 2005). De forma semelhante, não ocorreram alterações na massa dos
órgãos, com excessão do peso dos pulmões e da tíbia que apresentaram diferença estatística,
demonstrando que o treinamento não alterou o desenvolvimento normal do animal. Apesar de
ser esperado um possível aumento na massa muscular, vários trabalhos que utilizam o
treinamento aeróbico não apresentam alterações na massa corporal e muscular (ISHIHARA et
al., 2003).

Em relação ao consumo de ração (Figura 4) e água (Figura 5), podemos observar


que ocorreu aumento não estatisticamente significante do consumo de ração e água dos
animais exercitados (NOVELLI et al., 2004). Do contrário observou-se diminuição
estatíticamente significante dos pesos de Gordura Epididimal (Figura 2) com redução de (-
17%) e de Gordura Retroperitoneal (Figura 3) com redução de (-35%) nos animais
exercitados . A leve tendência observada ao maior consumo de ração e água dos animais
exercitados e a discreta tendência a diminuição do peso corporal ao longo do protocolo de
treinamento físico dos animais exercitados, corrobora com os dados de diversos outros
110

estudos, onde o peso dos animais submetidos a diferentes protocolos de exercícios físicos
também se apresentavam mais baixo em relação ao peso dos animais sedentários (ALESSIO
et al., 2005; MISAIAKA et al., 2003).

A reposta dos dados colhidos no presente estudo confirma os efeitos positivos do


treinamento físico no controle de doenças metabólicas, como por exemplo, no caso da
obesidade. Constatando ainda os efeitos adaptativos do exercício físico quanto à seleção do
substrato energético a ser preferencialmente utilizado durante o repouso e atividades de baixa
intensidade, uma vez que as gorduras, provindas dos adipócitos, fornecem uma fonte quase
inesgotável de energia (KIRAN et al., 2004).

Testes com incrementos progressivos de carga até a exaustão

O primeiro teste utilizado para avaliar a capacidade física dos animais quanto à
velocidade final alcançada, tempo de exaustão e distância total foi o teste exaustivo (TE). O
TE também foi utilizado, para selecionar os animais corredores para participação no estudo e
para prescrição da intensidade para realização do treinamento. O TE consistiu de incrementos
de velocidade de (0,2 km/h) a cada 3 minutos, sendo a velocidade inicial (0,3 km/h).

Nesta etapa inicial do trabalho não houve a manipulação do animal durante o


teste, ou seja, não houve coleta de sangue para dosagem de lactato sangüíneo e análise da
glicemia. Através desse teste foi encontrado o percentual de 60% do esforço máximo, que
correspondeu à velocidade de (1,2 km/h) utilizada para o treinamento. Ferreira et al., (2007)
considerou esta velocidade como intensidade máxima de predominância do metabolismo
aeróbio. As análises posteriores ao teste tentaram confirmar os ganhos de aptidão física
através de marcadores metabólicos no musculo esquelético e em alguns órgãos como o
fígadoe e coração.

Ao final da ultima sessão de treinamento, o grupo exercitado (n=6) e sedentário


(n=6) foi novamente submetido ao protocolo de TE para avaliação do nível de aptidão física.
As variáveis analisadas nesse teste mostraram um aumento de (190, 28%) quanto à distância
total percorrida, (75,28%) quanto à velocidade final alcançada e por fim, um aumento de (78,
111

62%) no tempo total, dos animais submetidos ao treinamento físico de endurance.


Respectivamente nas (Figuras 6, 7 e 8).

A importância em se determinar com precisão a intensidade de exercício não está


resumida apenas a trabalhos nos quais seres humanos são objetos de estudo. Uma ferramenta
que se tem mostrado interessante para a observação do organismo frente ao esforço é a
utilização de modelos experimentais com animais, elaborados para simular situações,
fisiopatológicas ou relacionadas ao treinamento e solucionar os eventuais problemas
decorrentes das alterações observadas (BERNSTEIN, 2003). A esteira rolante é um ergômetro
bastante utilizado para o treinamento de ratos, entretanto é de extrema importância a detecção
da intensidade de esforço ideal para verificar a melhora do nível de Aptidão Física esperada
(CARVALHO et al., 2005).

A tolerância a realização de esforço pode ser definida como a quantidade máxima


de atividade física realizada em teste progressivo até a exaustão. E segundo Bernstein, (2003),
a capacidade de realização de exercício físico pode ser quantificada através de teste exaustivo
(TE), utilizado neste estudo como ferramenta inicial para seleção dos animais e prescrição do
treinamento. E ao final do período de treinamento como marcador de performance
(GOBATTO et al., 1991). Observou-se que o treinamento foi eficaz em melhorar o
desempenho nas variáveis analisadas: distância (Figura 6), velocidade (Figura 7) e tempo
(Figura 8). Os ganhos de aptidão observados nos animais exercitados confirmam a velocidade
ótima prescrita para o treinamento com base no TE inicial.

A padronização deste protocolo de tolerância ao esforço permitiu que fosse dada


continuidade as investigações com os mesmos incrementos de velocidade só que com
dosagens sanguíneas de lactato e glicemia. O aumento observado no nível de aptidão física
com o treinamento nas variáveis, tempo total, distância percorrida e velocidade total
alcançada pelo grupo exercitado, proporcionou mais tarde, nos testes seguintes um maior
número de coletas de sangue. A cada 3 minutos no teste progressivo com incremento de
velocidade até a exaustão e a cada 7 minutos no teste de máximo estado estável com dosagens
de lactato e análises da glicemia (AVELAR et al., 2007).
112

Teste Exaustivo com coletas sanguíneas para dosagem de Glicemia e Lactato

Diante dos resultados de ganho de aptidão física dos animais exercitados, colhidos
durante TE, foi dado inicio ao teste progressivo máximo até a exaustão no intuito de observar
o limiar anaeróbio. Nesta etapa do trabalho ocorreu a coleta de sangue nos animais durante a
realização do teste, com o objetivo de estudar o comportamento do lactato sangüíneo e da
glicemia. Estabeleceu-se o período de repouso mínimo de 48h entre as etapas dos testes, para
que fossem desprezadas as adaptações agudas ao teste precedente (CHIMIN et al., 2007).

As concentrações de glicemia apresentadas na (Figura 9) e as de lactato sangüíneo


na (Figura 10) foram obtidas a partir de protocolo de teste progressivo em esteira rolante,
caracterizado pelo incremento de velocidade de 0,2 km/h a cada 3 minutos com coleta nos 20
segundos finais de cada carga através da cauda, sem a interrupção do teste. Os resultados
obtidos mostram que a curva de lactato dos ratos apresenta semelhança à encontrada em seres
humanos, diferenciando apenas nas concentrações de lactato sangüíneo na exaustão, onde os
ratos parecem apresentar concentrações mais baixas que em humanos (FERREIRA et al.,
2007).

Estudos pioneiros na década de 60 estabeleceram o conceito de limiar de lactato


(LL), definido como a intensidade onde a atividade oxidativa máxima promove a manutenção
do exercício de endurance. Do ponto de vista conceitual o LL representa um nível de
exercício (rendimento de potência, Vo2 ou dispêndio de energia) onde a hipoxia tecidual
desencadeia um desequilíbrio entre a formação de lactato e sua eliminação, com um aumento
subsequente na concentração sanguínea de lactato. Observa-se o desequilíbrio entre a
produção de lactato e sua remoção na (Figura 10) aos 24 minutos nos animais sedentários e
aos 42 minutos nos exercitados, caracterizado como limiar de lactato (PILIS et al., 1993).

A identificação deste limiar no presente trabalho foi baseado no consumo mais


alto de oxigênio ou a intensidade do exercício alcançada com um aumento inferior a 1,0 mM
na concentração sanguínea de lactato acima do nível pré-exercício. Todos os termos a seguir
se referem essencialmente ao mesmo fenômeno de LL: limiar de compensação expiratória,
limiar anaeróbio, início do acúmulo de lactato no sangue, eficiência ventilatória, limiar
113

aeróbio-anaeróbio, início do acúmulo de lactato no plasma, limiar anaeróbio individual e


ponto de acidose metabólica (WASSERMAN e MCILROY, 1964).

A mensuração do LL desempenha três funções importantes, pois que proporciona


um indicador sensível do estado do treinamento aeróbio e permite prescrever o desempenho
de endurance, o mais das vezes com maior exatidão que o Vo2max, conforme relatado por
Wasserman e Mcilroy, (1964). Além de outras variáveis, o LL estabelece uma intensidade
efetiva do treinamento relacionada à dinâmica metabólica aeróbica dos músculos ativos. De
acordo com os autores o conceito baseia-se na relação causa-efeito entre limiares distintos,
quer sejam metabólicos ou ventilatórios, determinada pelo aumento da hipóxia tecidual local.

Os resultados encontrados na presente investigação diferem dos resultados obtidos


por Simões et al., (1998), que objetivaram determinar o limiar anaeróbio (LA) por meio de
dosagens de glicemia e lactato em teste de pista. Em nosso estudo, constatou-se haver uma
alta correlação entre os níveis de lactato sanguíneo e de glicemia em intensidades submáximas
e máximas. Nossos resultados demonstram ter ocorrido uma melhora adaptativa ao
treinamento físico quanto à utilização da glicose, pois que se observa forte correlação positiva
da glicemia com o lactato para os animais sedentários (Figura 11), indicando que ocorre uma
espécie de platô de captação, transporte e metabolização desse substrato, coincidindo ainda
com a depleção dos estoques de glicogênio muscular e hepático (AVELAR et al., (2007).

Já nos animais exercitados, observou-se uma boa correlação negativa (Figura 12),
pois à medida que a intensidade do exercício aumentava, ocorria a consequente diminuição da
razão produção/remoção de lactato, resultando em menores taxas de glicemia sanguínea. Tais
observações evidenciam um fino mecanismo de aperfeiçoamento ao metabolismo da glicose,
quanto à melhor captação, a presença aumentada de transportadores e de enzimas metabólicas
energéticas para utilização tanto de glicose, com ativação da via glicolítica em intensidades
elevadas (>75%), quanto à metabolização de ácidos graxos em intensidades submáximas
(<60%), resultando em efeito poupador de glicose e elevação dos estoques de glicogênio
muscular nas fibras glicolíticas e no tecido hepático (WEGENER et al., 1996).

Segundo Simões et al., (2003), há um aumento da glicemia a partir de


intensidades acima do LA, ocorrendo uma elevação da ativação glicogenólitica hepática. Tal
114

afirmação vem explicar o fenômeno observado na (Figura 9), quanto a constante elevação da
disposição de glicemia sanguínea a medida que a velocidade do exercício aumentava para os
animais sedentários. Em outro estudo, foi realizada uma análise comparativa entre as
respostas de lactato e glicemia em teste de 12 minutos em esteira rolante na qual foi
constatado que em intensidades acima do LA ocorre uma correlação estatisticamente
significativa entre estas duas variáveis (RIBEIRO et al., 2004).

No presente estudo ocorreu uma correlação glicêmica e lactacidêmica


significativa de 76% para os animais sedentários e de 72% para os animais exercitados. Os
limiares de lactato ocorreram aos 24 min para o grupo sedentário, com os valores de
velocidade de 1,7 km/h+-0,98 e com valor sanguineo de Lactato médio de 2,96 mmol/dL e
aos 42 min para o grupo exercitado, a velocidade de 2,5 km/h+-1,21 e valor de lactato médio
de 2,95 mmol/dL em teste de esforço máximo. Pilis et al., (1993) encontrou valor de limiar de
lactato a velocidade de (15 m/min) e uma concentração de Lactato no limiar anaeróbio de
(4.12 +- 1,36 mmol/L), em protocolo de exercício em esteira.

Este é o primeiro estudo realizado, na qual se verifica a correlação da glicemia


sanguínea com o lactato do mesmo animal em diferentes protocolos de avaliação física em
esteira rolante, no intuito de investigar o limiar de lactato e o platô de estabilidade do lactato,
diante de desempenho ao exercício de endurance. A análise do lactato e da glicemia vem
sendo alvo de investigação em alguns estudos encontrados na literatura, que buscam
estabelecer uma comparação entre esses dois substratos com a utilização de diferentes
protocolos (CANTANHEDE et al., 2005; SIMÕES et al., 1999).

Simões et al., (1998) buscou comparar, através de vários protocolos de pista, as


respostas da glicemia e do lactato objetivando validar a utilização da glicemia e do limiar
glicêmico para a prescrição do exercício assim como o é feito com o limiar de lactato. Nesse
estudo, não houve diferença significativa entre as curvas de lactato e glicemia, porém ocorreu
uma alta correlação entre ambas em velocidade do teste acima do limiar anaeróbio.

No presente estudo não houve controle da ingestão alimentar, os animais recebiam


água e ração à vontade, no entanto De Marco et al., (1999), relatou que a ingestão pré-
exercício de refeições à base de carboidratos pode influenciar no desempenho e, também, nas
115

respostas glicêmicas, sendo que tanto a ingestão de refeições de baixo índice glicêmico
quanto as refeições de alto índice glicêmico podem influenciar de forma positiva e negativa,
respectivamente nestas duas varáveis. Sapata et al., (2006), constatou que apesar da influência
nas respostas glicêmicas ao Exercício, a ingestão de carboidratos pré-exercício não afetou o
desempenho.

Souza et. al., (2007), buscando observar os efeitos da suplementação de


carboidratos em exercício de alta intensidade, não encontrou diferença significativa nas
respostas da Glicemia em comparação feita entre teste com carboidratos e teste placebo,
porém houve um aumento nas respostas glicêmicas no teste placebo devido à maior ativação
da glicogenólise hepática em comparação com o teste com carboidratos, em que os indivíduos
tinham maior estoque de glicogênio muscular.

Com o avanço e aprimoramento das técnicas empregadas nas investigações


científicas, estas têm de ser constantemente reapropriadas. Stainsby, (1986), verificou
pioneiramente que ao induzir a redução de aproximadamente 22% do consumo de oxigênio
(VO2) nas fibras musculares estimuladas eletricamente, observou que as concentrações de
lactato eram mantidas semelhantes à situação controle. Pouco mais tarde, Stainsby em (1991),
demonstrou que, em alguns estudos realizados com animais, foram observados aumentos da
produção de lactato sem a alteração da pressão de O2 no fluxo sangüíneo muscular.

O início do acúmulo de lactato observado no presente estudo demonstra


correlação signifcativa entre a produção de lactato e epinefrina, uma vez que esta é liberada
em atividades que demandam energia (BROOKS, 1986), reforçando ainda a possibilidade da
formação de lactato independentemente da oferta de O2. Outro estudo manteve a hipótese de
relação causal entre o aumento de epinefrina e o aumento da produção de lactato, ao
observarem que o músculo gastrocnêmio de cães, estimulado eletricamente em conjunto com
a infusão de epinefrina, elevava a produção de lactato em nível superior à situação controle.
Como conseqüência da ação da epinefrina, haveria a ativação de toda a via glicolítica.

Foram verificados também na literatura que outros fatores também podem


interferir na produção do lactato, tais como o aumento da produção de insulina (JUEL et al.,
2004), o que pode explicar em parte o mecanismo de diminuição do conteúdo de glicose
116

sanguínea, durante teste progressivo exaustivo nos animais exercitados, devido a eficiência
aprimorada da insulina pelo treinamento físico na captação da glicose a medida que a
velocidade do teste era elevada e o conteúdo de lactato aumentava na corrente sanguínea.
Apresenta-se por tanto um maior conteúdo de glicogênio muscular e uma adaptação positiva
ao consumo agudo de glicose (JACOBS, 1986) nos animais treinados. Os achados sugerem
que a captação de glicose pelo músculo esquelético mediante a ação da insulina está
positivamente correlacionada com aumento dos níveis de lactato. A atividade enzimática e os
mecanismos de transporte da glicose no músculo, respectivamente a Citrato Sintase e o GLUT
4, mostram-se acrescidos após treinamento físico (BENTON et al., 2006), esclarecendo
possivelmente o decréscimo da glicemia sanguínea observado nos animais exercitados.

Nesta perspectiva, o estudo de Robergs e colaboradores (2004), propôs que pela


interação de múltiplos eventos bioquímicos que a mitocôndria não seria capaz de oxidar todos
os piruvatos que são produzidos durante o esforço intenso, o que resultaria na sua conversão
em lactado pela enzima lactato desidrogenase (LDH). Devido ao fato de que algumas enzimas
chaves do processo glicolítico, dentre elas, a glicogênio fosforilase, a hexoquinase e a
fosfofrutoquinase, terem os seus respectivos desempenhos alterados na presença de algumas
substâncias químicas que atuam como sinalizadores. Por exemplo, a elevação das
concentrações de Pi e de cálcio oriundas da contração muscular aumenta a atividade
enzimática da glicogênio fosforilase, ao passo que a sua inibição pode ser provocada pelo
aumento de H+. Já a fosfofrutoquinase aumenta sua atividade com a diminuição de ATP, bem
como a elevação da amônia, epinefrina, AMP, ADP, Pi, pH e da frutose 1,6 difosfato
(BROOKS, 1986).

O limiar de lactato para o grupo submetido ao programa de treinamento físico (42


min) ocorreu 18 minutos após o limiar observado no grupo sedentário (24 min). Verificou-se
também que o grupo exercitado resistiu permanecer no teste progressivo por mais tempo em
quantidades mais elevados de acidez metabólica. O valor máximo de lactato que coincidiu
com a exaustão, ocorreu aos 27 minutos (3,89 +- 1,46 mmol/L) para os animais sedentários e
aos 51 minutos (5,52 +- 1,23 mmol/L) para os animais exercitados. O mecanismo aprimorado
de melhor utilização do lactato sanguíneo com o treinamento aeróbio, certamente
disponibilizou um maior percentual de energia através da metabolização desse substrato por
fibras musculares esqueléticas vizinhas e pelo fígado (SJODIN et al., 1981).
117

Por sua vez, a utilização do lactato como substrato energético pelo músculo
esquelético ou por outros órgãos é possível graças ao seu transporte no meio intra e
extracelular. Supõe-se que durante o exercício físico, sobretudo de intensidade elevada, o
lactato produzido se desloque do meio intra para o extracelular mediante os transportadores
monocarboxilatos (MCT1 e MCT4) (THOMAS et al, 2005). Sugere-se que a isoforma MCT1
está presente em maior quantidade nas fbras de contração lenta, ao passo que a isoforma
MCT4 está em maior quantidade nas fibras de contração rápida (JUEL et al, 2004).

Foi sugerido que a concentração de MCT1 era estatisticamente diferente entre


grupos com diferentes níveis de aptidão aeróbia e que ela também estava positivamente
correlacionada com a taxa de remoção do lactato. Além disso, já se demonstrou o aumento de
aproximadamente 32% do MCT4 em sujeitos saudáveis após 6 semanas de treinamento
resistido (JUEL et a.l, 2004) ao passo que nove semanas de treinamento aeróbio resultaram no
acréscimo de, aproximadamente, 78% do MCT1 de indivíduos sedentários (DUBOUCHAUD
et al., 2000). Há evidências neste mesmo estudo que demonstraram a presença da LDH e da
MCT1 na mitocôndria, fato que levaria a possibilidade de transporte e da conversão do lactato
em piruvato nessa organela.

Determinação do máximo estado estável do lactato sangüíneo através de testes contínuos de


cargas independentes e sua correlação ao comportamento da glicemia sanguinea.

Após as dosagens sanguíneas realizadas em protocolo de teste com velocidades


progressivas até a exaustão, foi iniciado o estudo do comportamento do lactato sanguíneo
durante testes com velocidades contínuas com cargas independentes, no intuito de observar a
intensidade em que ocorre o platô de estabilização do lactato e a relação da glicemia nestas
velocidades.

O máximo estado estável do lactato é definido como a maior intensidade de


esforço físico na qual a concentração de lactato sanguíneo não aumenta além do transiente
inicial durante a execução da atividade (TEGTBUR et al., 1993). Isto é, o estado estável do
lactato representa o equilíbrio entre o transporte de lactato no sangue e sua remoção (HECK et
al., 1985). Assim, o esforço supralimiar parece indicar uma intensidade de exercício na qual a
118

taxa de atividade glicolítica excede a taxa de utilização do piruvato mitocondrial, causando


formação e acúmulo de lactato.

As observações feitas do comportamento da glicemia nas diferentes intensidades


para o grupo sedentário e grupo exercitado, respectivamente nas (Figuras 13 e 14), evidencia
a diminuição da glicemia sanguinea ao longo da duração do teste de velocidade constante para
os animais exercitados. Confirmando o efeito aumentado da captação de glicose pelo músculo
esquelético dos animais treinados. Em todas as figuras analisadas do comportamento
glicêmico, os valores de repouso foram relativos a cem porcento, para que assim fossem
observadas curvas mais fieis ao esforço, partindo de um único ponto.

A velocidade da glicólise deve ser regulada, para garantir que o supremento de


ATP seja coordenado com a velocidade da hidrólise do ATP e com a disponibilidade de
outras fontes energéticas. Entre os passos fundamentais está a entrada da glicose no interior
da célula, que é regulada pela fosforilação inicial da hexoquinase, no caso da glicose
sanguínea, ou pela fosforilase no caso do glicogênio, que aprisina efetivamente a molécula de
glicose no interior da célula muscular (O’DOHERTY et al., 1996). A investigação do
presente estudo quanto à atividade da hexoquinase aumentada na musculatura esquelética dos
animais treinados (Figura 38, 39 e 40), possibilita o entendimento da diminuição da glicose
sanguínea durante a realização dos testes em intensidades supralimiares nos animais
submetidos ao exercício de endurance. No entanto, em intensidade abaixo do limiar
anaeróbio, como por exemplo, nas velocidades de 45% e 60%, sugere-se uma maior
participação dos ácidos graxos, que pode ser justificada pela atividade aumentada da piruvato
desidrogenase quinase (PDK 4) no músculo esquelético, observado nas (Figuras 34, 35 e 36) e
no fígado (Figura 37) dos animais exercitados.

Na curva de glicemia da (Figura 15), onde foi utilizada uma velocidade abaixo do
limiar anaeróbio, considerada um exercício de baixa intensidade, observa-se o nítido nível
mais baixo de glicemia para os animais submetidos ao treinamento de endurance durante as
seis semanas. Durante o teste com velocidade a 60% (Figura 16), velocidade essa prescrita
para o treinamento, observou-se que ocorreu diferença estatisticamente significante nos três
últimos pontos, aos 14, 21 e 28 minutos de teste. A diminuição da utilização de glicemia
verificada neste teste confirma a eficiência do treinamento de endurance em adaptar o
119

metabolismo a utilização dos ácidos graxos (COGGAN et al.,2000). Curva de glicemia


similar foi observada pelos animais exercitados quando submetidos à intensidade supralimiar,
velocidade a 75% (Figura 17). Observou-se diferença estatisticamente significante nos três
últimos pontos, aos 21 e 28 minutos de teste.

À medida que as coletas de glicemia ocorriam, as coletas de sangue para dosagem


de lactato eram realizadas também a cada intensidade. Quando comparadas as três
intensidades no grupo sedentário, observou-se que ocorreu diferença estatística nos pontos de
coleta aos 7, 14, 21 e 28 minutos a velocidade de 75% em relação às velocidades de 60% e
45% (Figura 18). A única diferença entre as intensidades de 45% e 60%, ocorrreu no ultimo
ponto aos 28 minutos. Confirmando a máxima estabilização do lactato a 60%, correspondente
a velocidade 1,2 km/h, utilizada durante todo o período de treinamento (BILLAT, 2003).

Apesar de não ter sido bservado diferença estatística quanto a atividade da citrato
sintase no coração (Figura 22), uma vez que este órgão já possue uma atividade oxidativa
extremamente elevada e uma baixa capacidade glicolítica, o músculo cardíaco utiliza o lactato
como combustível para a oxidação. Dado o aumento do débito cardíaco pelo treinamento de
endurance, sugere-se uma elevação do transporte de lactato pelo sangue ao coração para
oxidação deste metabólito nos animais exercitados (KAINULAINEN et al., 1990). O fígado
possui um papel fundamental na homeostase da glicose, pois atua como um reservatório de
glicogênio. A alta capacidade de gliconeogênese permite que o fígado tenha papel importante no
fornecimento de glicose para o cérebro e outros tecidos, confirmando seu papel de fornecimento de
energia durante o exercício. O fígado removerá grande parte do lactato sanguíneo e o utilizará para
ressíntese de glicose (HARDIE e CARLING, 1997). O aprimoramento desse sistema pode ser
indentificado pelo aumento da expressão protéica de acetil CoA carboxilase nos hepatócitos (Figura
41) e pela elevação de citocromo c também nesse orgão (Figura 42). A otimização da funcionalidade
desses órgãos e tecidos vem esclarecer sobre os menores valores de lactato observado durante os testes
com velocidades progressivas e velocidades contínuas.

Para os animais exercitados, observou-se diferença estatisticamente significante


entre a intensidade de 90% e as demais velocidades de 45%, 60% e 75% nos pontos de coleta
aos 7, 14, 21 e 28 minutos. O mesmo se repetiu com a intensidade a 75% quando comparada
as velocidades 60% e 45%, nos pontos de coleta aos 7, 14, 21 e 28 minutos. Nenhuma
diferença estatística foi observada entre as intensidades 45% e 60% (Figura 19). Ainda na
120

mesma figura verificou-se diferença estatísticamente significante entre os tempos 14, 21 e 28


minutos, na intensidade de 90%, em relação ao tempo de repouso. Verificou-se que valores
médios de lactato foram menores quando comparados aos animais sedentários e que os
valores absolutos de lactato nas velocidades 75% para os animais sedentários e 90% para os
exercitados foram similares, confirmando os efeitos melhorados de metabolização do lactato
pelo treinamento de endurance (BENEKE, 2003).

O músculo esquelético é um bom exemplo de tecido que obtém a maior parte de


sua demanda metabólica a partir tanto do metabolismo oxidativo quanto anaeróbio. A
conversão de glicose a lactato ocorre mesmo quando o oxigênio se encontra disponível
livremente para o músculo e a liberação de lactato não implica necessariamente a inadequação
do suprimento de oxigênio (HARMS, 2000). O treinamento aprimora o trasporte de O2
durante testes de esforço, pois se observou menores valores de lactato nas (Figuras 20, 21 e
22) para os animais exercitados durante intensidades de 45%, 60% e 75%. Durante velocidade
a 75%, verificou-se menores valores de lactato estatísticamente significante nos tempos de
coleta aos 21 e 28 minutos para os animais exrcitados.

Nos testes com velocidade progressiva observou-se uma boa correlação entre as
variáveis lactato e glicemia para o grupo sedentário (Figura 11) e para o grupo exercitado
(Figura 12), porém não se observou a mesma boa correlação quando realizados os testes com
velocidades contínuas (Tabela 6).

Os resultados encontrados no teste com velocidades contínuas confirma que a


velocidade a 60%, concentração de lactato sanguíneo a 2,5 ± 0,4 mmol, empregada no
treinamento em esteira foi satisfatória, pois que essse percentual correspondeu ao máximo
estado estável do lactato ou limiar anaeróbio, sendo capaz de aperfeiçoar todo o mecanismo
metabólico energético dos animais exercitados.O treinamento de endurance esteve associado
à melhor regulação da produção de lactato e remoção, além do aprimoramento da utilização
como combustível por fibras musculares oxidativas, uma vez que a atividade ATPase das
fibras tipo I foram aumentadas (Figura 29), também pelo fígado e coração (RONDON et al.,
2006).
121

A remoção do piruvato, lactato e H+ produzidos é realizada pelos transportadores


de monocarboxilato (MCTs). Existem, descritos na literatura, 14 isoformas de MCTs, das
quais grande parte ainda não apresenta função determinada e específica, ao passo que outras
já estão bem descritas. No músculo esquelético, as isoformas MCT1 e MCT4 são dominantes.
A isoforma MCT1 tem sido correlacionada com o conteúdo mitocondrial muscular, sendo
encontrada em maior proporção na membrana sarcolemal das fibras oxidativas.
Antagonicamente, a isoforma MCT4 encontra-se predominantemente expressa na membrana
sarcolemal das fibras glicolíticas (HASHIMOTO et al., 2005). No presente estudo não houve
investigação do conteúdo de MCTs, porém observou-se a expressão protéica elevada de PGC-
1α, indicadora de biogênese mitocondrial (Figura 32 a 34), e aumento do conteúdo de fibras
oxidativas (Figura 30) nos animais submetidos ao exercício de endurance.

O tipo de treinamento influencia a expressão das proteínas MCTs e pode


favorecer a regulação do pH e consequente manutenção da contração muscular. Acreditou-se,
por muito tempo, que a produção de lactato produzisse acidose e, consequentemente, fadiga;
mas atualmente sabe-se que essa produção consome dois H+ e, por consequência, retarda a
acidose (ROBERGS et al., 2004). Recentemente, Lamb (2006) mostraram que o acúmulo de
lactato não é o responsável pela diminuição da performance muscular. O MCT1 tem relação
com o conteúdo mitocondrial muscular, sendo encontrado em maior proporção na membrana
sarcolemal das fibras oxidativas, por conseguinte, essa isoforma pode exercer um importante
papel em situações de demanda energética aumentada, auxiliando no influxo de lactato pelas
fibras musculares (BONEN, 2001). Nesse sentido, foi demonstrado que a captação de lactato
sanguíneo está diretamente correlacionada com a expressão gênica da isoforma MCT1 no
músculo esquelético, com características predominantemente oxidativas. O que explica o
conteúdo de lactato sanguíneo reduzido no repouso e em velocidades abaixo e supralimiares,
observado nos animais treinados (Figura 20, 21 e 22), pelo possível aumento da remoção e
metabolização do lactato produzido.

Dubouchaud et al., (2000) verificaram, em indivíduos sedentários, que o


treinamento de endurance de nove semanas, realizado em cicloergômetro, com seis sessões
semanais de uma hora a 75% do VO2 pico, aumentou a expressão de MCT1 em ~90%,
provavelmente devido à sua localização nas membranas sarcolemal e mitocondrial. Essa
localização facilitaria as trocas de lactato entre as células, tecidos e órgãos, promovendo,
122

dessa forma, sua captação e oxidação em células com alta densidade mitocondrial. Após sete
a oito dias de treinamento em cicloergômetro, com duração de duas horas a 60% do VO2máx,
foi observado aumento de 18% na expressão de MCT1. A alta afinidade com o lactato
apresentada pelo MCT1, presente nas fibras musculares tipo I e coração, favorece sua
remoção e o direciona para a oxidação como substrato energético nestas fibras (YOSHIDA et
al., 2004).

Atividade Máxima Enzimática: Citrato Sintase

Para verificar a eficácia do protocolo de treinamento aeróbio, avaliamos a


atividade máxima da enzima citrato sintase no músculo esquelético sóleo (Figura 23),
gastrocnêmio porção vermelha (Figura 24) e porção branca (Figura 25) e nos órgãos coração
(Figura 26) e fígado (Figura 27). A atividade da citrato sintase é considerada um marcador de
adaptação oxidativa do músculo esquelético ao treinamento aeróbio, no entanto a literatura
ainda é inconsistente quanto ao aumento da atividade dessa enzima em uma única sessão de
treinamento, ou durante vários dias de exercício (crônico) (MOLE et al., 1973). Ren et al.,
(1994) relatou um aumento rápido de transportadores protéicos de glicose após um dia de
exercício exaustivo de natação e um aumento na atividade da citrato sintase no músculo
esquelético após dois dias de treinamento de natação (DURANTE et al., 2002). No entanto,
em estudos envolvendo treinamento em esteira com roedores, a mudança aprimorada da
atividade enzimática da citrato sintase ocorreu somente no décimo segundo dia de exercício; .
(TAYLOR et al., 2005). Holloszy em (1967), observou um significativo aumento dos níveis
de citrato sintase no músculo esquelético em onze dias de treinamento.

É consenso na literatura que a natureza e a magnitude da resposta adaptativa


dependem da intensidade e da duração dos exercícios, do tipo de treinamento, da freqüência
de repetição da atividade, das limitações genéticas e do nível de aptidão física precedente do
indivíduo. Para adaptação efetiva, deve ser aplicada uma carga de exercício específica e
repetida, em outras palavras, a um nível de atividade superior ao seu habitual. Outros
princípios também devem ser respeitados, como o da especificidade, da resposta individual e
o da reversibilidade (COGGAN et al.,2000).

A porção vermelha do gastrocnêmio e o sóleo em ratos, são preferencialmente


selecionados por sua composição de fibras do tipo I que correspondem a 84% do total de
123

fibras deste músculo e que por tanto se adaptam ao treinamento de endurance (DELP e
DUAN, 1996). No presente estudo foi encontrada uma maior predominância de fibras tipo I
(Figura 29) nos animais exercitados, o que corrobora para o aumento da atividade oxidativa
muscular e elevação da resistência a fadiga. O aumento da densidade capilar com o
treinamento, já bem confirmado na literatura, permite que o músculo treinado obtenha uma
alta extração de oxigênio, uma vez que o fluxo sanguíneo muscular é aumentado com o
exercício (WILMORE, 2001).

A escolha da enzima citrato sintase se deu devido ao seu papel de enzima


reguladora da entrada de carbono no ciclo de krebs e, portanto, pela manutenção da atividade
aeróbia (NEWSHOME e LEECH, 1989). No ciclo não ocorre acúmulo de intermediários e as
mudanças na atividade máxima enzimática pode ser um indicativo de aprimoramento do fluxo
de substratos pelo ciclo e, logo, adaptação ao treinamento (HENRIKSSON, 1992). Assim, o
aumento da atividade máxima dessa enzima é considerado um indicador qualitativo do
metabolismo oxidativo ao exercício crônico.

Pode-se constatar neste trabalho que houve um aumento de 52,8% da atividade


desta enzima no músculo sóleo dos animais exercitados (Figura 23). Para o gastrocêmio
porção vermelha houve aumento de 58% (Figura 24). No músculo gastrocêmio porção branca,
onde há predominantemente fibras tipo II (fibras glicolíticas), observou-se aumento da
atividade oxidativa deste músculo em 79%, indicando modificação metabólica da fibra a
intensidade empregada durante o treinamento físico. A expressão protéica aumentada da
hexoquinase na porção branca do músculo esquelético (Figura 39), enzima esta reguladora da
via glicolítica, reflete a atividade aprimorada pelo treinamento de endurance tanto do
metabolismo anaeróbio quanto aeróbio (RÁDAK et al., 1999).

Na análise da atividade enzimática no coração não se observou mudanças com o


treinamento físico, uma vez que foi sugerido que esse órgão possui capacidade oxidativa
suficiente para suprir a demanda de energia durante o exercício (ZONDERLAND et al.,
1999). O presente resultado corrobora com maioria dos dados publicados, indicando que a
atividade da citrato sintase não é alterada no músculo cardíaco após treinamento em ratos
(NOBLE et al., 1999 ZONDERLAND et al., 1999).
124

Quanto ao fígado, o aumento registrado de 57% na atividade da enzima citrato


sintase parece ter sido um indicador qualitativo do metabolismo oxidativo ao exercício
crônico, uma vez que este órgão participa diretamente da disponibilidade de substratos
energéticos ao esforço. Não foi encontrado na literatura dados consistentes quanto a atividade
máxima dessa enzima no fígado, o que sugere novas investigações, pois que foi encontrado
aumento estatisticamente significante de 57%. Foi verificado aumento da expressão protéica
de acetil CoA carboxilase (ACC) (Figura 42) e de citocromo C (Figura 43) no fígado dos
animais submetidos ao treinamento físico.

Os dados investigados nesse estudo são consistentes com a literatura (HICKSON


et al., 1976), o que indica que efetivas adaptações crônicas ocorreram no músculo esquelético
submetidos ao treinamento de intensidade aeróbia em esteira.

Conteúdo de Glicogênio

Análisamos o conteúdo de glicogênio no músculo gastrocnêmio, porcões branca e


vermelha, dos animais submetidos ao treinamento físico e comparamos aos animais mantidos
sedentários. Observamos que ocorreu discreto aumento do nível de glicogênio na porção
branca do músculo analisado, porém sem diferença estatistica (Figura 28) no repouso,
indicando adaptação crônica ao exercício. Não foi verificada nenhuma diferença estatística na
porção vermelha do gastrocnêmio (Figura29). Os resultados sugerem que ocorreu elevação da
atividade lipolítica do tecido adiposo (Figuras 2 e 3), uma vez que se observou diminuição
estatisticamente significante no peso de gordura epididimal e retroperitoneal nos animais
treinados (WOLFE et al., 1990). Já esta bem estabelecido que o treinamento aeróbio resulta
em um aumento significativo no número e na atividade das mitocôndrias, além de um
aumento na oxidação de ácidos graxos livres (AGL).

O fator mais importante que influência a seleção do sustrato a ser utilizado para o
trabalho muscular é a intensidade do exercício. Por exemplo, em corrida de 100m em 10
segundos, aproximadamente 90% da energia provém de fontes anaeróbias. Para uma
maratona, correr uma distância de 42,2 km em apenas 127 minutos, 99% da energia gasta é
proveniente de fontes aeróbias (VOLTARELLI et al., 2004). Por tanto, o suprimento de
oxigênio para os músculos, que depende da intensidade do exercício e de sua duração, é uma
125

fator determinante para o uso de substratos. As adaptações ao treinamento de endurance


podem afetar a utilização do substratos. O aumento observado neste estudo da PGC-1α
(Figura 31, 32 e 33), indica elevação da densidade mitocondrial, além da forte correlação com
o aperfeiçoamento do substrato a ser utilizado durante o exercício. A elevação da atividade
ATPase da fibra tipo I (Figura 29), é um indicador de que ocorreu aumento do conteúdo
intramuscular de triacilglicerol e da capacidade de usar lipídeos como fonte de enrgia durante
as intesidades submáximas de exercício. O treinamento também garante aumento quanto à
segurança do lipídeo intramuscular ser uma fonte de energia durante a atividade física
(SCARPULLA, 2002).

Turcotte et al., (1992) mostraram que a captação de AGL do plasma, após 3 horas
de Exercício, é significativamente maior em homens treinados do que em não treinados. Esses
dados são sugestivos de que a captação de AGL pelo músculo esquelético é mediada por um
transportador saturável e que o treinamento aumenta a capacidade máxima para o transporte
de AGL no músculo esquelético, possivelmente por elevar o conteúdo de carreadores de AG
na membrana da célula muscular.

Foi observado também que o conteúdo de ácidos graxos intramusculares (TGIM)


aumenta com o treinamento (BROUNS e VAN DER VUSSE, 1998) e pode diminuir de 25%
a 50% durante o exercício prolongado de intensidade de 55% a 75% do VO2 máx. (RICHTER
et al., 1996). Uma vantagem significativa da utilização do TGIM é que as etapas de transporte
dos AG no plasma e sua passagem pela membrana da célula muscular não são necessárias e,
portanto, a sua oxidação é mais rapidamente disparada. Comprovando os efeitos benéficos do
exercício aeróbio realizado regularmente no controle de doenças metabólicas, como a
obesidade.

Romijn et al., (1993) estudaram a mobilização e utilização de carboidratos e


lipídios durante exercícios de diferentes intensidades (25%, 65% e 85% do VO2 máx) em
homens treinados. Como esperado, a captação de glicose pelos músculos e a glicogenólise
intramuscular aumentaram proporcionalmente com a intensidade do esforço. A lipólise e a
conseqüente liberação de AG para a circulação foram mais elevadas durante o exercício de
menor intensidade. Por outro lado, a lipólise do TGIM foi elevada com o aumento da
intensidade do exercício. Resultados semelhantes foram encontrados em mulheres treinadas
126

(ROMIJN et al., 2000). Confirmando o efeito poupador de glicogênio no repouso e em


atividades de moderada intensidade, sugerindo uma maior disposição do conteúdo de
glicogênio muscular para exercícios de alta intensidade como o observado no presente
experimento durante os testes com velocidades progressivas e contínuas.

Postula-se que a reserva mais importante de AGL não plasmáticos disponível para
a oxidação durante exercício moderado e prolongado é o TGIM. Esses são encontrados em
concentrações diferentes conforme o tipo de fibra muscular, sendo armazenados em maior
quantidade nas fibras musculares de contração lenta (Figura 29) do que em fibras musculares
de contração rápida. Além disso, o treinamento, por si só, faz com que a deposição de TG seja
diferente entre os tipos de fibra muscular (ABERNETHY et al., 1990).

Contratilidade e Atividade ATPase

A tipagem de fibras, foi determinada pela análise histoquímica através de reação


mATPase. Os dados apresentados neste estudo se referem a valores médios das fibras do
músculo gastrocnêmio dos animais do grupo mantido sedentário e dos animais submetidos ao
protocolo de treinamento físico. Os animais exercitados apresentaram maior percentual de
fibras tipo I (oxidativas), acréscimo de 43%, e menor quantidade de fibras tipo II (glicolíticas)
quando comparados com os do grupo mantido sedentário (Figura 30). Os dados confirmam
que o programa de treinamento de endurance melhorou o desempenho dos animais nos testes
exaustivos, quanto ao aumento da velocidade alcançada, do tempo final e da distância total
percorrida. Nos testes com incrementos progressivos de velocidade e testes de velocidades
contínuas para verificação da máxima estabilização do lactato, observou-se que ocorreu
melhor metabolização do lactato produzido e melhor utilização da glicemia sanguínea em
percentuais submáximos de velocidade, conforme as observações realizadas por Crowther et
al., (2002).

As análises histoquímicas mostraram que a expressão morfológica de fibras


oxidativas do grupo treinado em intensidade aeróbia foi mais elevado, corroborando com os
estudos na área do treinamento desportivo, em que estímulos mais elevados geram maiores
ganhos funcionais (KRAEMER, 1999). Foram demonstrados através dos resultados que as
adaptações que ocorrem em atletas parecem ter a mesma validade para o treinamento de
127

animais (BOMPA, 2002). Dessa maneira podemos afirmar que o exercício de endurance, em
intensidade do limiar anaeróbio, foi suficiente para gerar a síndrome geral de adaptação
observada pelo ganho de tônus da fibra muscular. Porém, Bacurau (2007), estudando em ratos
um modelo de intolerância ao exercício físico, observou menores diâmetros de fibra muscular
para ratos com cardiomiopatia induzida. Em outro estudo com animais, onde eram
administradas doses de testosterona, verificou-se que a resposta hormonal pós-treinamento,
havia aumentado a área das fibras musculares para grupo exercitado em relação a animais do
grupo controle (ISAYAMA et al., 2006).

Camargo Filho et al. (2005), verificou após treinamento experimental em esteira


adaptada, sob diversas condições de treinamento, que ocorreu aumento do diâmetro das fibras
musculares do músculo sóleo e um maior percentual de fibras oxidativas e glicolíticas, sendo
portanto um indicativo de hipertrofia muscular. Um ano mais tarde, (CAMARGO FILHO et
al., 2006), avaliaram as alterações histológicas do músculo sóleo de ratos submetidos a um
programa de natação durante nove semanas, cinco vezes por semana, com aumento
progressivo de carga e administração do esteróide anabólico Decanoato de Nandrolona, duas
vezes por semana sob a dose de 5 mg/kg. Os autores puderam observar que os animais
submetidos a treinamento físico sob administração de esteróide ou óleo mineral apresentaram
fibras musculares com maior diâmetro e relativamente maior percentual de fibras tipo I,
quando comparados com os animais controle.

As fibras musculares existem sob formas moleculares diferentes (isoformas), e a


atividade miofibrilar ATPase é regulada pelos níveis de pH. A ATPase da miosina da fibra
tipo II é desativada em pH baixo (menor que 4,5), na qual a atividade ATPase da fibra tipo I
não é afetada. Com o pH acima de 9, a situação se reverte, pois a atividade ATPase da
miosina tipo II é estável, enquanto a ATPase da miosina tipo I é desativada (MCCARTHY et
al., 2002). Observa-se no presente estudo que houve expressão elevada da atividade ATPase
na proteína contrátil tipo I, o que corrobora com a intesidade do exercício a que foi submetido
os animais. Quanto ao aspecto observado de menor produção de lactato durante intensidades
submáximas e melhor metabolização deste metabólito em velocidades supralimiares, a
atividade aumentada da ATPase da fibra tipo I resultou em maior resistência dos animais
treinados em pH baixo, durantes os testes com velocidades progressivas e contínuas.
128

Expressão proteica de PGC-1α e PDK 4 em músculo esquelético e fígado.

A PGC-1α é rapidamente expressada em tecidos metabolicamente ativos, como


por exemplo, no músculo esquelético, resultando na mudança de fibras de contração rápida,
(tipo II) para fibras de contração lenta (tipo I) oxidativas. Fibras de contração lenta são
caracterizadas por sensibilidade à insulina, por um maior conteúdo mitocondrial e elevada
capacidade oxidativa (LEONE et al., 2005). No presente estudo foi realizada a expressão
protéica do coativador PGC-1α no músculo gastrocnêmio (porções vermelha e branca) e sóleo
dos animais exercitados e sedentários. Os resultados encontrados corroboram com os dados
da literatura, uma vez que a concentração proteíca de PGC-1α encontrada foi maior nas fibras
musculares oxidativas, porção vermelha do gastrocnêmio (Figura 31) e no sóleo (Figura 32)
dos ratos exercitados. A avaliação crônica da proteína ao exercício seguiu um critério na qual
a extração dos tecidos foi realizada 36h após a ultima sessão de treinamento.

Foi escolhida a corrida em esteira adaptada por ser eficaz como modelo de
exercício para esses animais. Os valores percentuais observados para os animais avaliados,
indicam aumento de 143% do conteúdo protéico de PGC-1α na porção vermmelha do
gastrocnêmio e elevação de 77% no músculo sóleo nos animais exercitados. Nenhum valor
estatisticamente significante foi encontrado no músculo gastrocnemio porção branca. Baar e
colaboradores, (2002), encontraram valores aumentados da expressão de PGC-1α, após
exercício de natação em músculo esquelético oxidativo de ratos machos Wistar. Observou-se
aumento de PGC-1α em músculo esquelético oxidativo de fêmeas de camundongos ICR após
exercício em roda de atividade voluntária (IKEDA et al., 2006).

Estudos pioneiros demonstraram que a PGC-1α é um dos alvos mais importantes


na via de sinalização do AMPc em camundongos durante o jejum e em modelos animais de
diabetes tipo 1 ou 2, fato este que lhe confere um importante papel na gliconeogênese
hepática e nas enzimas deste processo (PARKER e JARRETT, 1985). Na presente
investigação observou-se um mecanismo melhorado de utilização celular de glicose nos
animais submetidos ao protocolo de treinamento físico durante as avaliações funcionais com
velocidades progressivas até a exaustão e nos testes com velocidades contínuas. Esta
captação melhorada se dá rigorosamente em vários níveis, incluindo a captação por parte dos
transportadores de glicose (GLUT 4), melhor fluxo da via glicolítica e a elevação da entrada
129

do piruvato no ciclo do ácido cítrico através da complexo piruvato desidrogenase (PDC).

No músculo, o PDC regula a etapa onde ocorre limitação da velocidade na via


oxidativa da glicose por catalisar a descarboxilação irreversível de piruvato a acetil-coenzima
A. As evidências indicam que os caminhos múltiplos de regulação convergem para o PDC,
incluindo a regulação alostérica de intermediários da oxidação de ácidos graxos e por um
controle da família das quinases da piruvato desidrogenase (PDK1 a 4) e fosfatases
correspondentes. A fosforilação reversível do PDC inativa este complexo, poupando a glicose
e favorecendo a oxidação de ácidos graxos. A PDK4 provou ser particularmente importante
no músculo em resposta ao exercício físico (HILDEBRANDT et al., 2003), o que pode
explicar a elevação do conteúdo de glicogênio muscular observado para o grupo exercitado
(Figura 28) além de um melhor desempenho nos testes de velocidades contínuas no que se
refere a ulilização aprimorada dos ácidos graxos nas intensidades abaixo do limiar anaeróbio e
(Figuras 15 e 16) e supralimiares (Figura 17).

O músculo esquelético é capaz de ajustamentos rápidos na produção de ATP e no


combustível a ser utilizado em conformidade com as diversas condições fisiológicas, no
entanto, a fim de corresponder as necessidades energéticas, a utilização dos substratos
musculares deve ser rigorosamente controlada. Durante estímulos intensos de contração
muscular pelo exercício, a maior parte da demanda de energia pelo músculo é satisfeita pela
glicose (WRIGHT et al., 2007). Os dados do presente estudo confirmam a tendência a um
melhor armazenamento no repouso ou mesmo a um efeito poupador de glicogênio em
atividades submáximas na musculatura, porção branca do gastrocnêmio, e a uma mudança em
direção a oxidação mitocondrial de ácidos graxos.

A base molecular para a plasticidade metabólica do músculo envolve rápidas


mudanças na atividade das enzimas através do controle alostérico e modificações pós-
tradução, bem como mudanças crônicas através da regulação de numerosos genes e na
expressão de proteínas específicas, controlando o conteúdo mitocondrial e a preferência do
substrato a ser metabolizado (WENDE et al., 2007). O Traçado dos mecanismos envolvidos
na expressão gênica e no conteúdo protéico torna-se fundamental para compreender a
patogênese molecular da doença nos estados onde a utilização do substrato é cronicamente
130

desequilibrada, como na insuficiência cardíaca, na obesidade e diabetes (BENTON et al.,


2006).

Neste estudo, foi investigada a expressão protéica da PDK4 na musculatura


esquelética, gastrocnêmio porção vermelha (Figura 34), sóleo (Figura 35), gastrocnêmio
porção branca (Figura 36) e no fígado (Figura 37), como um importante regulador negativo da
oxidação da glicose do músculo, aprimorado pelo treinamento físico de endurance
(PILEGAARD et al., 2000). A identificação da expressão protéica aumentada de PDK4 na
porção muscular vermelha do gastrocnêmio e no músculo sóleo dos animais treinados em
termos percentuais foram respectivamente, 41% e 179% maior quando comparados aos
animais mantidos sedentários. Com critério de avaliação crônica do conteúdo protéico, os
animais do experimento foram dissecados 36 h após a ultima sessão de exercícios.

Nordsborg et al., (2003), verificou que a PDK4 foi aumentada depois das
primeiras 2 h de exercício, mas o mais marcante aumento ocorreu durante a recuperação.
Estes achados mostram que a atividade de PDK4 foi marcadamente aumentada no músculo
esquelético, tanto durante teste físico moderado de longa duração como durante a recuperação
ao exercício, provocando a fosforilação e inativação do PDC, bloqueando a entrada de
carboidratos para a mitocôndria durante oxidação. A PGC-1α é identificada como um
regulador chave do ATP de múltiplas vias geradoras de energia no músculo esquelético,
através da sua influência sobre a regulação de genes envolvidos na biogênese mitocondrial,
respiração oxidativa e oxidação de ácidos graxos (KELLY e SCARPULLA, 2004). No
entanto, investigamos o papel potencial da PGC-1α no controle nas vias de utilização de
substratos energéticos pelo músculo após adaptação crônica ao treinamento, possibilitando
compreender os possíveis mecanismos do comportamento da glicemia durante testes físicos
com velocidades progressivas até a exaustão e velocidades contínuas, propostos nesse estudo
como meio de prescrição e avaliação funcional ao treinamento.

Os estudos pioneiros de Randle e colaboradores, (1964), demonstraram que a


oxidação da glicose é diminuída coincidentemente com aumento da oxidação de ácidos
graxos no músculo cardíaco, sendo que esta inibição da oxidação da glicose ocorre a nível do
complexo piruvato desidrogenase (PDC), através dos efeitos alostéricos dos produtos e por
mudanças no estado redox celular.
131

Os carboidratos e as gorduras são o combustível dominante para a produção de


ATP durante o exercício aeróbio ou de endurance e os caminhos que metabolizam estes
combustíveis devem ser fortemente regulados para atender à demanda crescente de energia.
Embora ambos sejam importantes durante o exercício, a proporção dos dois combustíveis a
serem oxidados são determinados por muitos fatores. Por exemplo, estudos pioneiros
relataram que o aumento da intensidade do exercício agrava a dependência do carboidrato e
que o aumento da duração do exercício de baixa a moderada intensidade eleva a dependência
das gorduras. Tem sido argumentado também que o aumento da oxidação das gorduras e a
diminuição da utilização dos carboidratos sejam desejáveis durante o exercício. O carboidrato
é o combustível mais versátil, disponibilizando energia tanto aeróbia quanto anaeróbia. No
entanto, podem ser esgotados após 1-2 h de exercício intenso (HERMANSEN et al., 1967).

Numerosos estudos documentam as mudanças na proporção de utilização da


gordura e dos carboidratos, no entanto, os mecanismos que regulam essas mudanças na
utilização dos combustíveis não foram ainda completamente elucidados. Como por exemplo,
qual o comportamento da glicemia sanguínea em animais sedentários e exercitados
aeróbiamente durante testes progressivos de velocidade até a exaustão e testes com
velocidades contínuas? Que mecanismos crônicos estariam envolvidos na regulação a nível de
transporte, reações enzimáticas, oxidação da glicose pós período de treinamento nos animais
exercitados e mantidos sedentários? Já é sabido que situações que cronicamente diminuem a
disponibilidade de carboidratos e elevam a dependência do músculo esquelético as gorduras,
produzem aumentos do RNAm e de proteínas PDK (isoforma 4) (PETERS et al., 2001).
Dessa forma esta relação acaba por conduzir a uma diminuição da fração de PDC na forma
ativa e consequentemente a oxidação de carboidratos durante repouso.

Constatou-se que o aumento da disponibilidade de glicose exógena pré-exercício,


reduz a oxidação das gorduras durante exercício de baixa/ moderada intensidade, mas não no
exercício de intensidades acima 75% do VO2max. Parece que a redução do metabolismo das
gorduras após a ingestão de glicose é devido a coordenados efeitos da diminuição da
disponibilidade de ácidos graxos derivados da diminuição da lipólise dos adipócitos e
oxidação de ácidos graxos no músculo. Aumentar a potência do exercício é outra situação
onde ocorre mudanças no fluxo glicolítico, uma vez que alteram a oxidação das gorduras
132

aumentando a utilização destas durante o repouso e em exercícios de baixa a moderada


intensidade, respectivamente 40 a 65% do VO2max (SIDOSSIS et al., 1997).

Os resultados apresentados nesse estudo indicam que a PGC-1α pode também


contribuir para este efeito de contra-regulação ao nível da expressão protéica no músculo
esquelético através da modulação da PDK4 (HERZIG et al., 2001), um regulador negativo do
complexo PDC. Alguns estudos encontrados têm demonstrado a influência da PGC-1α sobre
a glicose hepática através da regulação gliconeogênica (PUIGSERVER et al., 2003). O
mecanismo descrito pelos autores nos esclarece que a regulação da PGC-1α eleva a expressão
de PDK4 muscular, repondo os níveis de glicogênio no músculo através da redução da
oxidação da glicose. Curiosamente, também foi demonstrado que a PGC-1α ativa a expressão
de transportadores de glicose insulino-sensíveis (GLUT4) no músculo (MICHAEL et al.,
2001), que também serviria para aumentar os estoques de glicogênio no contexto do aumento
dos níveis PDK4.

Em resumo, nossos resultados confirmam os efeitos da PGC-1α no metabolismo


energético celular, sugerindo um possível mecanismo pela qual a PGC-1α seja capaz de
suprimir a oxidação da glicose muscular, em resposta ao treinamento físico observado nesse
estudo através dos testes funcionais, aumentando a expressão de proteínas, analisadas através
de técnica de western blotting, envolvidas na oxidação mitocondrial dos ácidos graxos. Os
ganhos de funcionalidade mecânica observados refletem o desempenho durante testes
exaustivos e testes com intensidades contínuas.

As investigações demonstram, por tanto, maiores demandas de energia pelo


músculo esquelético e um melhor aproveitamento dos ácidos graxos, mediado em parte pela
ativação da PGC-1α e expressão protéica de PDK4. O resultante aumento da expressão de
PDK4 leva a fosforilação e inativação do PDC, que catalisa a etapa limitante de oxidação da
glicose (SUGDEN e HOLNESS, 2003). Dessa forma, em resposta ao treinamento de
endurance, ocorre adaptação orgânica a capacidade oxidativa dos ácidos graxos através dos
efeitos da biogênese mitocondrial, quanto a supressão da oxidação da glicose. Nesse contexto,
essas investigações podem expandir o papel da PGC-1α como um complexo regulador da
seleção do substrato muscular, levando a uma melhor compreensão dos mecanismos de
expressão protéica envolvidas na manutenção da homeostase energética.
133

No presente estudo foi observada uma constante elevação dos níveis sanguíneos
de glicemia durante os testes funcionais nos animais mantidos sedentários, supondo uma
maior atividade glicogenolítica nos testes com velocidades progressivas (Figuras 9 e 11) e nos
testes com velocidades contínuas (Figuras 13, 15, 16 e 17). Porém, diferente comportamento
glicêmico se verificou nos animais submetidos ao programa de exercícios de endurance, em
que quanto maiores as velocidades durante os testes com velocidades progressivas (Figura 9 e
12) e durante os testes com velocidades contínuas (Figuras 14 a 17), menores eram os valores
glicêmicos, confirmada pela tendência ao armazenamento melhorado do glicogênio muscular
(Figura 28) nos animais exercitados, a um aumento no numero de transportadores de glicose e
da atividade enzimática além de uma participação melhorada dos ácidos graxos (Figura 34 e
35) e otimização do fluxo glicolítico (Figura 38) (HOWLETT et al., 1998).

Sugere-se que o aumento da oxidação de carboidratos eleva o conteúdo de


malonil-CoA, que pode inibir a oxidação de ácidos graxos durante atividades intensas. A
diminuição do pH observado no exercício intenso, fornece forte ligação entre o aumento do
fluxo glicolítico e reduzida oxidação de gorduras. Estudos em mitocôndrias isoladas de
músculo esquelético humano em repouso mostraram que pequenas diminuições no pH
provocam grandes reduções na atividade da carnitina palmitoil transferase (CPT1)
(STARRITT et al., 2000). Em vista do pH reduzido durante atividades moderadas a intensa
observa-se que esta conduz a um decréscimo de potência durante exercício, diminuição de
CPT1 e oxidação de ácidos graxos (HOWLETT et al., 1998).

Como mencionado anteriormente, a CPT1 parece desempenhar um papel


importante na interação entre o metabolismo das gorduras e carboidratos no músculo
esquelético. A CPT1 está localizada na membrana mitocondrial externa e converte acil-CoA
para acilcarnitina, que depois é transportada através da membrana mitocondrial interna
através de uma acilcarnitina translocase em troca de carnitina livre. A acilcarnitina é, então,
reconvertida para acil-CoA e se faz disponível para β-oxidação nas mitocôndrias
(MCGARRY e BROWN 1997).

A malonil-CoA é produzida no citoplasma por acetil-CoA carboxilase (ACC) e é


o primeiro intermediário produzido durante a síntese de ácidos graxos. A ACC é um
134

regulador da oxidação dos ácidos graxos nos tecidos lipogênicos como no fígado (Figura 41)
e tecido adiposo. Quando a oferta de carboidrato é abundante, os lipídios são sintetizados
nestes tecidos, produzindo altos níveis de malonil-CoA que inibem a atividade da CPT1 e o
transporte de lipídios na mitocôndria. Quantidades mensuráveis de malonil-CoA têm sido
detectadas em músculo esquelético de ratos (SAHA et al., 1995), em humanos (DEAN et al.,
2000) e uma isoforma muscular de ACC (ACCb ou ACC2) que parece ser regulada de forma
diferente da ACC hepática foi também descoberto no músculo esquelético (HÁ et al., 1996).

Os tecidos musculares em situações de exercício exigem aumentos simultâneos da


oxidação de carboidratos e gorduras para atender ao grande aumento da demanda de energia.
Esta estabelecido que os níveis de malonil-CoA diminuem durante as contrações musculares
em roedores (WINDER et al., 1989). E que esta diminuição de malonil-CoA pode ser
importante em desativar a inibição de CPT1, que normalmente existe em repouso do músculo
esquelético e durante o exercício aeróbio de leve a moderada intensidade, onde ocorre
aumento do transporte de ácidos graxos livres na mitocôndria. A diminuição de malonil-CoA
induzida pelo exercício é provavelmente devido a AMP kinase (AMPK), fosforilação esta
mediada por ACCb, que diminui a atividade da ACC. A AMPK é ativada durante o exercício,
pelo aumento da AMP livre e diminuição de fosfocreatina. Isto sugere que a diminuição de
malonil-CoA é certamente consistente com a ativação de AMPK e diminuição da atividade da
ACC (DEAN et al., 2000).

Embora o aumento do conteúdo de malonil-CoA redutase fossem diretamente


relacionadas à diminuição da taxa de oxidação de acidos graxos livres no músculo cardíaco,
apenas dados correlacionais estam atualmente disponíveis em relação ao papel do malonil-
CoA em músculos esqueléticos de roedores. Medições de malonil-CoA no músculo
esquelético de humanos durante exercício demonstrou que o conteúdo foi pouco afetado em
diferentes intensidades (DEAN et al., 2000). Trabalhos de Dyck et al., (1993) e de Howlett et
al., (1998), mostraram que o conteúdo aumentado de acetil-CoA pode ser resultado de
aumento do transporte de citrato no citoplasma e conversão a acetil-CoA via citrato liase, ou
ainda o transporte de acetilcarnitina para conseqüente conversão a Acetil-CoA através da
carnitina aciltransferase.
135

É possível que o aumento de acetil-CoA possa estimular a atividade de ACCb,


uma vez que esta é o substrato primário para esta enzima. Além disso, acredita-se que o
aumento de citrato no citosol (um ativador alosterico de ACCb) possa compensar o potencial
de fosforilação-redução da atividade induzida em ACC e malonil-CoA durante o exercício.
Embora estes dados preliminares não confirmem um papel regulador de malonil-CoA na
oxidação de gordura durante o exercício, futuros estudos são necessários para elucidar o papel
de regulação da CTP1 e malonil-CoA no controle do metabolismo das gorduras durante o
exercício.

Quantificação protéica de Hexoquinase II no músculo esquelético.

A investigação da expressão protéica de hexoquinase II (HK II) nos músculo


esquelético serviu para elucidar o comportamento glicêmico observado nos testes funcionais,
uma vez a glicose é o principal substrato envolvido no metabolismo energético. A velocidade
da glicólise deve ser regulada, para garantir que o suprimento de ATP seja coordenado com a
velocidade da hidrólise do ATP e com a disponibilidade de outras fontes energéticas. Assim,
com essa regulação local no interior de cada célula, há necessidade de uma resposta coerente
dos diferentes tecidos envolvidos no metabolismo dos carboidratos, além de uma coordenação
com as vias do metabolismo das gorduras e das proteínas. Portanto, a regulação é complexa,
sendo obtida pela integração de vários fatores (NEWSHOLME e NEWSHOLME, 1989).

Entender os efeitos adaptativos do treinamento quanto ao mecanismo poupador de


glicogênio (Figura 28) e a melhor captação, transporte e metabolização da glicose observada
nas intensidades empregadas no presente estudo (Figuras 9, 15, 16 e 17), torna-se necessário
uma vez que a reorganização homeostática exercida pelo exercício físico assume diversos
aspectos em resposta a inúmeras variações. Entre os passos fundamentais do metabolismo dos
carboidratos, está à entrada da glicose no interior da célula. A fosforilação inicial pela
hexoquinase aprisiona efetivamente a molécula de glicose no interior da célula muscular,
sendo esta enzima a primeira dentre as três enzimas reguladoras envolvidas na captação de
glicose. A atividade da hexoquinase é estimulada pelo fosfato inorgânico, um dos substratos
da reação, e inibida pelo produto da reação, a glicose-6-fosfato (ARDAWI e NEWSHOLME,
1982).
136

A formação de metabólitos, como o glicerol-3-fofato, pode ser desviado para a


síntese de triacilgliceróis e fósfolipídios, importantes constituintes da membrana celular. A
glicose também pode ser desviada para a via das pentoses, que fornece NADPH e ribose-5-
fosfato, que é utilizada na síntese de purinas e pirimidinas, formando RNA, utilizado para a
síntese de proteínas (O’DOHERTY et al., 1996). Neste estudo a utilização da glicose no
metabolismo celular foi quantificada através de técnica de western blotting no gastrocnêmio
porção branca (Figura 38), porção vermelha (Figura 39) e no músculo sóleo (Figura 40).
Verificou-se diferença estatísticamente significante na porção branca do músculo
gastrocnêmio, uma vez que esta porção múscular é constituída preferencialmente por fibras
glicolíticas.

Pesquisa realizada por Kochan e colaboradores (1979), verificou aumento da


velocidade de fracionamento do glicogênio sintase, confirmando que o exercício moderado
possui efeitos profundos sobre a bioquímica no músculo esquelético. Observou-se que uma
hora de exercício havia aumentado o (RNAm) da hexoquinase (HK II) em 2,1 vezes e a
atividade da enzima em 1,8 vezes no músculo sóleo, na porção branca do gastrocnêmio e no
músculo vasto em ratos. (O’DOHERTY et al., 1994). Porém, não ocorreram alterações da
(RNAm) na HK I e nem na atividade.

Os resultados do presente estudo mostraram que o treinamento aeróbio aumentou


a expressão protéica de HK II na porção branca do músculo gastrocnêmio em 28% (Figura
39) e que não ocorreu o mesmo acréscimo nas porções vermelha e no músculo sóleo dos
animais submetidos ao programa de treinamento. Os resultados colhidos favorecem a
compreensão do possível mecanismo de decréscimo da glicemia sanguínea durante os testes
com velocidades progressivas e nos testes com velocidades contínuas nos animais treinados.
Observou-se nos animais mantidos sedentários, uma constante elevação da glicemia
sanguínea à medida que os acréscimos de intensidade eram aplicados, elucidando um possível
fornecimento de energia através da glicose que não era eficientemente captada e transportada
para o meio intracelular, ocorrendo à fadiga pelo baixo influxo de glicose na via glicolítica,
dado a diminuição do pH sanguíneo e o aumento da descompensação produção/ remoção do
lactato.
137

Possivelmente, a presença aumentada da captação e do transporte de glicose, além


da elevação da atividade enzimática do ciclo glicolítico e oxidativo, vem esclarecer nos
animais exercitados o decréscimo da glicemia inversamente proporcional ao aumento da
intensidade e duração do esforço (Figura 12). Confirmando ainda que o treinamento prescrito
foi eficiente em trazer reais adaptações crônicas aos animais experimentados e que os
protocolos de avaliação física foram satisfatórios em verificar a performance funcinal dos
ratos.

O’Doherty et al., (1996), verificou após 3 horas da ultima sessão de exercício,


que a expressão de HK II no músculo mostrou-se aumentada, porém as observações foram
específicas a musculatura utilizada durante o exercício, mais particulamente ao tipo de fibra,
onde ocorreu uma maior expressão no músculo sóleo (3,82 vezes) e menor no vasto (1,95
vezes). Estudos anteriores com seres humanos, em que foram infundidas insulina, observou-se
elevação do RNAm da HK II, da quantidade de proteína e da atividade enzimática no músculo
utilizado (MANDARINO et al., 1995). Os autores concluiram ainda que o período utilizado
no estudo de 4 h (1 h de exercício, acrescido de 3 h de descanso), foi suficiente para que
ocorre-se síntese de novas proteínas neste sistema. A investigação de Mandarino e seus
colaboradores em (1995), vem trazer esclarecimento ao mecanismo comportamental da
glicose nos animais treinados quanto à possível menor resistência a insulina e melhor
captação de glicose durante os testes em intensidades supralimiares (~75%) (Figura 17)

É possível que mudanças na concentração de metabólitos possam afetar a


atividade da HK II in vivo. O metabólito mais provável é a glicose-6-fosfato (G-6-P), que
quando elevada diminui a atividade da HK II (PERSEGHIN et al., 1996). Este inibidor,
apesar de não ter sido estudado, poderia ainda explicar o possível acréscimo de glicose
sanguínea observado nos animais sedentários durante os testes funcionais, uma vez que o
baixo fluxo da via glicolítica pode ser explicado pela inativação da HK II no músculo
esquelético, devido à ausência de coenzimas oxidadas para dar continuidade ao fornecimento
de energia, consequentemente verifica-se um alto conteúdo de glicose no meio extracelular. O
acúmulo de lactato pode ainda confirmar a ausência de coenzimas oxidadas que coincide com
a fadiga física precoce dos animais sedentários nos testes de velocidades progressivas em
relação aos animais exercitados (Figura 9 e 10).
138

Diferente dos efeitos agudos (única sessão) do exercício físico, os resultados da


presente investigação revelam uma resposta crônica da proteína ao treinamento físico no
músculo esquelético. Foi verificado em alguns artigos analisados que os efeitos do
treinamento físico de intensidade moderada, ou seja a 60% do VO2max, aumentava a
atividade da hexoquinase II em indivíduos saudáveis (PHILLIPS et al., 1995 e 1996) e em
ratos (REN et al., 1994; TURCOTTE et al., 1991).

Foi verificado que o efeito do exercício sobre a expressão da HK II é semelhante


ao efeito da insulina (MANDARINO et al., 1995). O exercício e a insulina exercem seus
efeitos sobre a translocação de GLUT4 (GAO et al., 1994; GOODYEAR et al., 1995 e 1996;
YEH et al., 1995). Estes achados podem justificar o comportamento da glicose durante os
testes físicos, uma vez que é sabido que o treinamento eleva a traslocação de GLUT4 na
musculatura esquelética em resposta ao exercício de endurance. Embora as vias de
sinalização utilizadas pelo exercício no aumento da expressão de HK II sejam ainda
desconhecidas, os efeitos da insulina na expressão de HK II são dependentes de
fosfatidilinositol 3-quinase e são independentes das proteínas ativadas por mitógeno (MAP)
quinase. É possível que o exercício também use um caminho diferente a partir da insulina
para o acréscimo da expressão de HK II, e apenas um grupo de pesquisadores sugeriu um
aumento da expressão de HK II via MAP quinase no rato (GOODYEAR et al., 1996). No
entanto, a forma pelos quais o exercício modifica a atividade enzimática ou a expressão da
proteína é relativamente indefinida, em comparação com a insulina e outros caminhos de
sinalização hormonal, na qual merecem mais estudos.

O exercício aumenta a sensibilidade à insulina (DEVLIN et al., 1987; GARETTO


et al., 1984; ZORZANO et al., 1986), o transporte de glicose (GLUT 4) no tecido muscular e
a atividade da hexoquinase favorecendo a captação de glicose no músculo esquelético
(KELLEY et al., 1996). A influencia do treinamento no aumenta da expressão protéica da
hexoquinase fornece uma possível explicação para o fenômeno do aumentado da insulina,
uma vez que esta é uma das principais responsáveis pela captação de glicose durante e após
atividade física aeróbia, e pode pelo menos parcialmente, explicar a aumento da insulina e as
concentrações de G-6-P em indivíduos resistentes à insulina que se exercitam (DEVLIN e
HORTON, 1985). O entendimento da expressão reduzida de HK II e a regulação de sua
atividade em pacientes com diabetes mellitus não insulino-dependente (VESTERGAARD et
139

al., 1995), torna-se importante para determinar se o exercício melhora a atividade da insulina
quanto a captação de glicose pelo aumento da expressão de HK II em indivíduos insulino-
resistentes.

Expressão protéica de ACCp no Fígado.

A quantificação desta proteína no fígado se deu devido à indispensável


participação deste órgão no metabolismo energético, sendo ainda pouco investigado quanto a
sua reorganização adaptativa ao treinamento físico e seleção do substrato a ser metabolizado.
Estudos com a acetil CoA carboxilase (ACC) no fígado demonstraram que a fosforilação in
vitro pela adenosina monofosfato quinase (AMPK) e pela proteína quinase A (PKA) causa
uma diminuição da atividade da ACC e um aumento da ativação de citrato (HARDI e
CARLING, 1997). No músculo esquelético a ACC é fosforilada tanto pela AMPK como pela
a PKA, mas apenas a fosforilação da AMPK causa diminuição da atividade da ACC
(WINDER et al., 1997).

As alterações crônicas observadas no presente estudo com o treinamento de


endurance provocou aumento estatisticamente significante da proteína ACC no fígado (Figura
41), confirmando a participação ativa deste órgão na seleção do substrato a ser utilizado
durante o repouso e a contribuição regulatória para o fornecimento de energia. Como critério
de avaliação crônica da performance ao treinamento, os fígados foram dissecados 36h após a
ultima sessão de exercício.

Foi observado em trabalhos envolvendo exercícios físicos submáximos em um


único teste exaustivo, que a malonil-CoA foi significativamente diminuída e a concentração
sanguínea de 3-hidroxibutirato foi elevada em comparação com os valores pré-exercicio.
Parece provável que a diminuição da malonil-CoA em testes físicos nestas condições foi
causada por fosforilação e inativação da ACC aos 15 minutos pós-exercício. Nestes trabalhos,
verificou-se que o glucagon e a insulina estiveram ativas, o que levou a observar uma
tendência ao aumento da AMPK e uma diminuição da ACC ao final do exercício, não
ocorrendo significância estatística. Existem alguns mecanismos que parecem diminuir a
malonil-CoA no fígado, como por exemplo, em uma única sessão de exercícios prolongados,
na qual se verifica a elevação de palmitoil-CoA nos hepatócitos. A palmitoil-CoA é um
140

inibidor alostérico de ACC e, portanto, da síntese de malonil-CoA (HARDI e CARLING,


1997; KIM, 1983).

Estudos precedentes demonstraram que a proteína quinase dependente de AMPc


aumenta no fígado durante exercício prolongado (WINDER, 1883), observa-se também a
ativação da PKA que fosforila a fosfofrutocinase (PFK) e a piruvato quinase resultando em
inativação da ACC. O efeito líquido destas fosforilações seria a redução da conversão de
carbonos da glicose para malonil-CoA e desvio da glicose derivados da glicogenólise hepática
para o trabalho muscular. A diminuição da malonil-CoA, neste caso, seria causada por uma
fonte de substrato energético diminuído em vez de regulação alostérica ou covalente da ACC.
É provável que a presença elevada de palmitoil-CoA e a diminuição do fornecimento de
substrato desempenham um papel importante durante testes físicos leves de duração
prolongada. Seja qual for o mecanismo, o declínio no fígado de malonil-CoA teria o efeito de
permitir o aumento da atividade da CPT-1 e o aumento da taxa oxidação de ácidos graxos e
cetogênese (VAN SCHAFTINGEN, 1990).

O conteúdo hepático de frutose-2-6-bisfosfato diminui muito rapidamente


durante exercícios de alta intensidade. Isso parece ter efeito sobre a diminuição da glicólise e
aumento da gliconeogênese, diminuindo a disponibilidade de substratos para a síntese de
malonil-CoA. Estudos com ratos durante exercício demonstraram que o AMPc hepático
aumenta durante curtos surtos de alta intensidade com corrida em esteira, bem como durante
atividades prolongadas de intensidade moderada (WINDER, 1988).

A expressão protéica aumentada de ACCp em 326% no fígado (Figura 41) dos


animais exercitados corrobora com os poucos dados encontrados na literatura sobre o possível
aumento da ACCp em resposta a adaptação crônica ao treinamento durante o repouso. Os
valores observados na literatura são conflitantes, sendo a maior parte das análises realizadas
imediatamente após exercício intenso. Os dados colhidos na presente pesquisa corrobora, por
tanto com a otimização da utilização de energia regulada pelo metabolismo aeróbio ao
treinamento físico, quanto à elevação da atividade lipogênica, que sinaliza a um
aprimoramento da utilização dos ácidos graxos e melhor conteúdo e aproveitamento do
glicogênio (HARDIE e CARLING, 1997).
141

Tem sido proposto que a AMPK possui efeito protetor contra depleção de ATP
pela inibição da biossíntese das vias energéticas (HARDIE e CARLING, 1997). O efeito seria
o desvio de carbonos da glicose das vias biossintéticas para os músculos em contração e ainda
a disposição do lactato e do piruvato, derivados do trabalho muscular, para a gliconeogênese
no fígado fornecendo indícios de um efeito poupador de ácidos graxos.

Quantificação protéica de Citocromo C no Fígado.

Sabe-se que o exercício físico altera inúmeras funções orgânicas, dada a


capacidade de manter um exercício dinâmico prolongado como o ciclismo, a corrida, dentre
outros. O desempenho depende da taxa de utilização do ATP no interior do músculo ativo ser
coordenado pela taxa de suprimento de ATP, na qual se isso não ocorrer, surgirá à exaustão.
O número de mitocôndrias musculares e os níveis de alguns elementos envolvidos na
produção de energia devem ser reorganizados para atender a demanda imposta pelo exercício
(HOLLOSZY e COYLE, 1984). Laye e colaboradores (2009) demonstraram que o exercício
aumentou a atividade de enzimas mitocondriais em fígado de ratos. Quiles e demais
pesquisadores (2001) relataram aumento de 50% na concentração da citocromo-C oxidase em
fígado de ratos, não havendo dúvidas sobre o efeito do exercício no aumento da atividade de
fosforilação oxidativa no hepatócito, o que confirma os dados da presente investigação
analisados no fígado (Figura 42), quanto à elevação observada nos animais submetidos ao
treinamento de endurance.

O mecanismo molecular responsável pela reestruturação mitocondrial esta


relacionada ao aumento da demanda energética determinada pela intensidade e duração do
exercício, resultando em adaptação crônica ao estímulo (ROBINSON et al., 1994). Foi
verificada elevação de 25% no conteúdo protéico de citocromo C no fígado dos animais
exercitados, sugerindo aumento dos componentes mitocondriais, ocorrendo satisfatória
adaptação ao programa de exercício padronizado neste estudo.

O citocromo C exerce um papel de carregador de elétrons, imprescindível a cadeia


transportadora de elétrons na mitocôndria. O aumento estatisticamente significante da ACCp
encontrada no fígado dos animais submetidos ao protocolo de treinamento confirma o
aprimoramento mitocondrial da fosforilação oxidativa ao suprimento de ATP e a participação
142

do fígado como um importante órgão para a manutenção da demanda energética imposta pelo
exercício. No músculo esquelético (STALLKNECHT et al., 1991), relata que o aumento dos
elementos oxidativos após o exercício é assumido como sendo um efeito local diretamente
causado pela contração durante a atividade física.

O aumento dos elementos oxidativos no fígado verificado no presente


experimento foi notável, embora este orgão seja submetido a uma substancial diminuição da
oferta de oxigênio durante o exercício (ASTRAND e RODAHL, 1986). O aumento dos
elementos mitocondriais da cadeia transportadora de elétrons pode estar relacionado a uma
maior mobilização de nutrientes para o exercício que reflete em um aprimoramento do
desempenho ao esforço.

Concentração de Nitrito: Óxido Nítrico (NO)

Estudos têm relatado que a rigidez arterial é diminuída pelo treinamento de


endurance (MAEDA et al., 2004). No entanto, os mecanismos subjacentes as diversas
adaptações para este tipo de treinamento ainda não estão totalmente esclarecidas, apesar dos
inúmeros estudos envolvendo exercícios com variações de intensidade e duração. O presente
estudo foi caracterizado pela prescrição do treinamento aeróbio e avaliação funcional do
desempenho dos ratos em esteira adaptada.

As células endoteliais vasculares desempenham um papel importante na regulação


da atividade vascular através da produção de substâncias vasoativas, como a endotelina-1
(ET-1) e o óxido nítrico (NO) (MIYAUCHI et al., 1999). O NO produzido pelas células
endoteliais vasculares tem um potente efeito vasodilatador e exerce um papel importante na
regulação do fluxo de plaquetas na parede vascular. A atividade do NO plasmático, é
verificado através das concentrações (produtos finais) de nitrito e nitrato, onde se observa em
alguns estudos a diminuição das concentrações em indivíduos portadores de doenças
cardiovasculares, como por exemplo, na hipertensão (NODE et al., 1997); e no
envelhecimento, onde se verifica diminuição da biodisponibilidade de NO (TADDEI et al.,
1997).
143

Demonstrou-se neste estudo que a concentração de nitrito aumentou no músculo


cardíaco (Figura 43) e na porção vermelha do músculo gastrocnêmio (Figura 44) após 6
semamas de treinamento. Estes dados indicam a presença aumentada de NO, como o
observado em indivíduos jovens submetidos ao protocolo de endurance durante 8 semanas
(MAEDA et al., 2001; 2004). Foi observado relatos de que o treinamento de endurance esta
associado com melhor a biodisponibilidade de NO em sujeitos hipertensos (HIGASHI et al.,
1999). Na avaliação da concentração de nitrito na porção branca do músculo gastrocnêmio
(Figura 45), não se verificou diferença estatisticamente significante entre os grupos estudados.
Foi encontrado um aumento da concentarção de nitrito no coração e na porção vermelha do
músculo gastrocnêmio em gatos, equivalente a 61% e 39% nos animais exercitados,
confirmando que os valores encontrados estão de acordo com dados da literatura (SUGIURA
et al., 2002).

Lu e colaboradores (1999), demonstraram que o exercício realizado em esteira por


4 meses, em gatos, aumentou a produção de NO e a expressão do RNAm para a òxido nitrico
sintetase (iNOS) em animais adultos (60 dias) . Portanto, alterações nas concentrações
plasmáticas de NO podem ter significado clínico importante para os estados fisiológicos e
patológicos.
144

7 CONCLUSÃO

Diante dos resultados encontrados neste estudo, podemos concluir que o


percentual de intensidade a 60% obtido pelo teste exaustivo equivale ao limiar de lactato,
sendo, por tanto uma intensidade ideal para o treinamento de endurance.

O treinamento foi eficaz em causar melhoria na performance física dos animais,


sendo confirmado pelo marcadores metabólicos energéticos. A atividade da citrato sintase
aumentada dos tecidos avaliados caracteriza o treinamento aeróbio proposto. A ocorrência de
biogênese mitocondrial, do conteúdo de glicogênio muscular, da elevação do conteúdo de
fibras musculares oxidativas e a regulação e seleção do substrato energético por proteínas
moleculares em resposta crônica ao treinamento físico verificados neste estudo, justifica o
desempenho alcançado pelos animais nesse estudo.

Por fim, os testes funcionais padronizados foram eficientes em avaliar o


desempenho dos animais em resposta ao treinamento de endurance quando comparado a seus
congêneres sedentários. As dosagens de lactato foram importantes marcadores de capacidade
aeróbia, enquanto que as análises de glicemia refletiram as mudanças nas vias produtoras de
energia.
145

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