AVANCE DE TESIS

“HIDRODINÁMICA, TRANSFERENCIA
DE MASA Y ESTUDIO REOLÓGICO EN
LA PRODUCCIÓN DE L-LISINA EN UN
BIOREACTOR AIRLFT”

Asesor: Dr. Eleazar M. Escamilla Silva

Co-asesor: Dr. Luis Medina Torres

Presenta: Adán Castorena Quintanar

Sinodales:
Dr. Alejandro Estrada Baltasar
Dr. José Enrique Botello Álvarez

30/11/2009
 AVANCE DE TESIS ITC

HIDRODINÁMICA, TRANSFERENCIA DE M ASA Y

ESTUDIO REOLÓGICO EN LA PRODUCCIÓN DE L -
LISINA EN UN BIOREACTOR AIRLFT

RESUMEN

El análisis y la descripción del comportamiento de los biorreactores involucra usualmente

el uso de parámetros como la retención de gas o gas holdup, la velocidad del líquido y el
mezclado así como el coeficiente de transferencia de masa ( ) y calor. Existe un marcado
grado de interacción entre los antes mencionados, por lo que la descripción de su
comportamiento se vuelve una tarea compleja.

La productividad de muchas fermentaciones aerobias entre ellas la producción de L-lisina,

está limitada por la disponibilidad de oxígeno debido a su baja solubilidad en el medio de
cultivo. Propiedades reológicas del medio de cultivo influyen notablemente en el
desempeño del biorreactor y por lo tanto es importante considerar este aspecto en la
evaluación de un proceso microbiano. La morfología particular puede causar la formación
de una suspensión que puede ser muy viscosa lo que conlleva a dificultades en él, que se
traduce en problemas de transferencia de oxígeno y por consiguiente la disminución en la
productividad de la fermentación.

En el presente proyecto se determinarán los comportamientos hidrodinámicos, reológicos y

de transferencia de masa así como sus interrelaciones y dependencias con las fases
fermentativas, utilizando la cepa mutante sobreproductora ATCC 21253 de
Corynebacterium glutamicum, con el objetivo de sentar las bases para el escalamiento
adecuado del proceso de producción de L-lisina.

Adán Castorena Quintanar

1
 AVANCE DE TESIS ITC

INTRODUCCIÓN

L-Lisina

La Lisina (Lys, K) es un aminoácido esencial, no puede ser sintetizado por el organismo, es

de gran importancia en la alimentación humana y animal por lo que debe ser aportado en
cantidades suficientes por la dieta diaria. Numerosas evidencias sugieren que suplementar
este aminoácido a la alimentación puede aumentar el apetito y contribuye a prevenir
algunas infecciones, facilita el metabolismo de los carbohidratos, incrementa la tasa de
fosforilación oxidativa y promueve la excreción de ácidos grasos (Reyes, 2006).

Los requerimientos nutricionales de lisina en humanos son de 1,5 g al día. La tabla 1

muestra el contenido de lisina en algunos cereales y legumbres(Wikipedia, 2009).

Tabla 1. Algunos cereales y legumbres que contienen gran concentración de lisina.

Fuente ppm Fuente ppm Fuente ppm

Berros 1340-26,800 Espárrago 21,360-23,304 Espinaca 1,740-20,664
Frijol 2,390- 25,700 Lenteja 7,120-23,735 Soya 24,290-26,560

Producción de Lisina

La lisina puede producirse por síntesis química o por procedimientos enzimáticos o

microbiológicos. La obtención de lisina por síntesis química es un proceso caro y poco
eficiente además de que por este método se obtienen mezclas racémicas de las formas D y
L que luego deben ser procesadas para obtener la forma L que es la biológicamente activa.

Los procesos de fermentación microbiológicos son métodos más eficientes y directos.

Tradicionalmente el proceso de producción de lisina por fermentación
microbiológica, es realizado en tanques agitados (Reyes, 2006).

Adán Castorena Quintanar

2
 AVANCE DE TESIS ITC

Corynebacterium glutamicum

Los principales microorganismos productores de aminoácidos a escala industrial son cepas

sobreproductoras, la mayoría mutantes no reguladas o auxótrofas inducidas de cepas
silvestres, el grupo de las corynebacterias es uno de los más importantes. De este grupo, la
especie más utilizada es la Corynebaterium glutamicum (figura 1) aunque también se
emplean Arthrobacter, Brevibacterium, Microbacterium y Micrococuus (Reyes, 2006).

Figura 1. Corynebacterium glutamicum. (Liebl, 2009)

Bioreactores airlift

Usualmente para mantener una velocidad de transferencia de oxígeno adecuada en tanques

agitados es necesario usar altas velocidades de agitación (400 – 750 rpm), lo cual genera
altos esfuerzos de corte, que dañan a las células y la potencia requerida para lograr una
adecuada trasferencia de oxígeno y un mezclado homogéneo, en ocasiones, resulta
económicamente inconveniente.

Una mejor alternativa a esta configuración son los reactores airlift (figura 2), cuyas ventajas
principales son: bajos esfuerzos de corte, altas velocidades de transferencia de oxígeno y
buen mezclado, lo que implica una mejor transferencia de masa eliminando gradientes de
concentración de cualquiera de los componentes del medio, evitando la sedimentación de
las células, creando por lo tanto, un ambiente más favorable para su desarrollo y
mantenimiento (Chisti, 1989); aumentando los rendimientos y la producción en este caso de
lisina.

Adán Castorena Quintanar

3
 AVANCE DE TESIS ITC

Biocontrolador

Reactor

Bioconsola

Figura 2. Reactor airlift, bioconsola y biocontrolar (Applikon ®), cortesía Dr. Escamilla.

Por lo general los reactores airlift son aireados por el fondo utilizando por lo general una
rejilla o tamiz con el objeto de dividir en burbujas el flujo de aire. Cuentan con dos
secciones marcadas, el riser y el downcomer, que son las secciones por las cuales la
dispersión gas-líquido asciende hasta el nivel que es llenado el reactor y en la cual el
líquido desciende al fondo del reactor por medio de una diferencia de densidades.

Fases fermentativas y Modelos Cinéticos

Es importante entender la cinética de crecimiento microbiano para el diseño y operación de

sistemas de fermentación. Los modelos matemáticos facilitan el análisis de datos y pueden
proporcionar una estrategia para resolver problemas encontrados en procesos de
fermentación industrial.

El proceso fermentativo (figura 3) puede dividirse una fase inicial de latencia o

acoplamiento (1), fase de crecimiento (que a su vez se puede considerar como una fase de
aceleración (2) y una fase exponencial (3)), fase estacionaria (fase de ralentización (4) y
fase estacionaria (5)) y una fase de muerte o declive (lisis o metabolismo endógeno (6))
(Dunn et al. ,2000; Chávez, 2005).

Adán Castorena Quintanar

4
 AVANCE DE TESIS ITC

1 2 3 4 5 6
100

Biomasa, Sustrato,
80
60
Producto Sustrato
40
20
Biomasa
0 Producto I
0 20 40 60 80 100 120 140

Tiempo, t

Figura 3. Fases del proceso fermentativo; Fase de crecimiento en ladrillos, fase estacionaria en
burbujas.

La función de los modelos biológicos es describir las velocidades de reacción metabólicas y

su estequiometria con base a las condiciones del fermentador (Chávez, 2005).

Crecimiento Celular (Ecuación logística de Verhulst-Pearl)

El modelo asume que la velocidad de crecimiento celular (1) decrece linealmente con el
aumento en la población de células, en donde la constante indica una velocidad de
crecimiento específico "en condiciones normales" y el factor , con , indicará el
retardo en la velocidad de crecimiento cuando la población sea muy grande, por lo tanto
es valor máximo que la población puede alcanzar (Reyes, 2006).

Adán Castorena Quintanar

5
 AVANCE DE TESIS ITC

Generación de producto (Modelo de Luedeking-Piret)

El modelo de Luedeking-Piret combina las contribuciones asociadas al crecimiento (α

constante estequiométrica) y no asociadas al crecimiento (β constante de proporcionalidad,
similar a la actividad enzimática). Esta expresión cinética de dos parámetros ha probado ser
útil y versátil en el ajuste de datos de formación de productos de diferentes tipos de
fermentaciones (Dunn et al., 2000; Reyes, 2006).

Consumo de sustrato
Por definición la velocidad de consumo específico se expresa por:

en donde es la velocidad específica del metabolismo o cociente metabólico (

).
Escrito de otra forma:

La ecuación (8) establece que el consumo de sustrato sólo es posible cuando hay
crecimiento. Sin embargo, cuando el sustrato considerado es la fuente de carbono y energía,
puede darse el caso en el que el crecimiento sea nulo ( ) y el consumo de
sustrato no. A este consumo de sustrato que no redunda en aumento de biomasa se lo asocia
con el mantenimiento de funciones vitales. Pirt ha propuesto la siguiente ecuación para la
velocidad de consumo de la fuente de carbono y energía (Reyes, 2006):

en donde es el coeficiente de mantenimiento y es el rendimiento que se obtendría

si el mantenimiento fuese nulo.

Adán Castorena Quintanar

6
 AVANCE DE TESIS ITC

Hidrodinámica, Reología y Transferencia de masa en Airlifts

Existe un marcado grado de interacción entre parámetros como la retención de gas o gas
holdup, la velocidad del líquido, el mezclado así como el coeficiente de transferencia de
masa ( ), por lo que la descripción del comportamiento de los bioreactores se vuelve una
tarea compleja (Chávez, 2005).
La retención de gas ( ) o es la fracción de gas que esta contenida en la
dispersión gas-líquido, este parámetro determina el tiempo de residencia del gas en el
líquido y en combinación con el tamaño de burbuja influye en el área interfacial gas-líquido
disponible para la transferencia de masa (Chávez, 2005).
Las velocidades ascendente de la dispersión ( ) y descendente del líquido ( ) junto con
el tiempo de residencia, afectan la turbulencia, los coeficientes de transferencia masa ( )
y calor ( ) y la fuerza de cizalla ( ) a las que está expuesta el microorganismo.
En los últimos años, la caracterización hidrodinámica de los biorreactores se ha mejorado,
debido a los avances en la tecnología del mezclado, buscando una mayor homogeneidad.
Las características de mezclado pueden expresarse como tiempo de mezclado, definido
como el tiempo requerido para lograr un grado de suficiente de homogeneidad. Muchas
veces determinado como el tiempo necesario para que al ser aplicado un pulso de trazador
la variación del pH sea menor al 5 % de su valor final.
La morfología particular puede causar la formación de una suspensión que puede ser muy
viscosa, del orden de varios Pa*s. Una elevada viscosidad conlleva a dificultades en el
mezclado, lo que se traduce en problemas de transferencia de oxígeno y la consiguiente
disminución en la productividad de la fermentación. Actualmente, existe poco
conocimiento sobre el comportamiento reológico en cultivos microbianos, esto debido, a lo
complejo del sistema por la acumulación de biomasa, y por su sensibilidad al esfuerzo de
cizalla, de aquí, la propuesta de realizar un estudio hidrodinámico a la par con el
comportamiento reológico en cultivos microbianos. El comportamiento reológico es
usualmente no-Newtoniano, para la mayoría de los fluidos biológicos la ley de la potencia o
el modelo de Bingham son satisfactorios. (Chávez 2005).
Por lo general se han utilizado correlaciones del tipo mostrado en la ecuación (9) para
relacionar diferentes parámetros:

Adán Castorena Quintanar

7
 AVANCE DE TESIS ITC

Donde puede ser:

 Retención de gas ( ).
 Velocidad de líquido en el riser ( ).
 Velocidad de líquido en el downcomer ( ).
 Coeficiente de transferencia de masa ( ).
Se he reportado que los parámetros y son dependientes del régimen de flujo así como
del índice de comportamiento de flujo del fluido (n), y más aún es dependiente del índice
de consistencia del fluido (k), de las densidades del fluido y del campo gravitacional
(Chávez et al., 2006).

ANTECEDENTES

En 1957, se reportó una bacteria que fue identificada como Micrococcus glutamicus
(reidentificada después como Corynebacterium glutamicum), la cual producía L-ácido
glutámico en apreciables cantidades en medios de cultivo (Kinoshita et al., 1957).
Después de la introducción exitosa de esta tecnología, se investigaron y desarrollaron
varios métodos para la producción de otros aminoácidos.

Las cepas de C. glutamicum auxótrofas a treonina y leucina producen grandes cantidades de

lisina, pero su rendimiento es inferior a los mutantes que requieren homoserina (Reyes,
2006).

La cepa ATCC 21253 de Corynebacterium glutamicum es auxótrofa a la homoserina (L-

treonina más L-metionina) y L-leucina. Fue obtenida por Nakayama, et al. (1973).

En el 2005 se realizó un estudio para obtener Optimizar del medio de cultivo para la
producción de L-lisina en matraz agitado con la cepa ATCC 21253 de Corynebacterium
glutamicum, encontrándose que la producción de L-lisina máxima fue 595.52 mg/l en 48 h,
sin embargo se tuvieron deficiencias en cuanto a las condiciones de fermentación, ya que ni
el pH (reportado como un adecuado de entre 6-9) ni la cantidad de oxígeno disuelto fue
monitoreada, de igual manera, el mezclado fue eficiente (Alcantar, 2005).Algunas de las
concentraciones de nutrientes que fueron más prometedoras encontradas en ese estudio son
presentadas en la tabla 2.

Adán Castorena Quintanar

8
 AVANCE DE TESIS ITC

Tabla 2. Concentraciones de para máxima producción de L-lisina encontradas por Alcantar.

Nutriente Concentración
Glucosa 100 g/l
Fosfato dibásico 0.5 g/l
Hierro 0.01 g/l
Sulfato de amonio 20 g/l
Biotina 50 μg/l
Cloruro de sodio 0.2 g/l

En el 2006 se realizó un estudio más afondo del crecimiento de la cepa ATCC 21253 y la
biosíntesis de L-lisina, ahora en un biorreactor airlift. En este s fue controlado el pH,
considerando que el crecimiento de Corynebacterium glutamicum ocurre en el rango
de pH de 6 a 9 y a una temperatura de 25 – 37° C (Alcantar, 2005; Reyes, 2006).

Por medio de experimentación se encontró un rendimiento de lisina de 0.247

, con una concentración inicial de glucosa de 140 . Se observó que la L-
treonina es un factor limitante en el crecimiento de la bacteria, sin embargo se obtuvo una
fase de mantenimiento mayor con una concentración de 1.5 de la misma (Reyes,
2006).

Este mismo trabajo arrojó que el coeficiente de transferencia de masa se encuentra en

aproximadamente , y por medio de simulaciones se pudo observar que la
concentración crítica de inhibición de crecimiento es de 263 de glucosa (Reyes, 2006).

Se recomendó hacer uso de antiespumante, así como también se sugirió investigar la

cinética de cambio de la L-treonina a lo largo de la fermentación, con el objeto de poder
entender mejor la axotrofía del microorganismo a este componente.

Las características de la suspensión a analizar no permiten que la medición de la viscosidad

sea una tarea sencilla, al ser estimada por ejemplo con el uso de reómetros convencionales,
por tal motivo es necesario utilizar una estrategia más adecuada. La estimación de la
viscosidad debe ser llevada a cabo en un reómetro especial, en este caso con la ayuda de
alternativas reométricas no convencionales, con el objetivo de evitar que los

Adán Castorena Quintanar

9
 AVANCE DE TESIS ITC

microorganismos sean destruidos y las características de la suspensión se vean afectadas

(Chávez 2005).

OBJETIVO GENERAL

Determinar los parámetros hidrodinámicos, reológicos y de transferencia de masa del

proceso de producción de L-lisina en un bioreactor airlift utilizando la cepa ATCC 21253
de Corynebacterium glutamicum.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1. Determinar los parámetros hidrodinámicos:

a. Holdup (Retención de gas ).
b. Velocidades del líquido en el riser ( ) y en el downcomer ( ).
c. Tiempo de mezclado ( ).
2. Determinar el comportamiento reológico del caldo de cultivo durante la
fermentación (viscosidad aparente, ).
3. Determinar el coeficiente transferencia de masa ( ) durante el proceso
fermentativo y su relación con los parámetros hidrodinámicos y reológicos.

METODOLOGÍA.

Para cubrir lo antes expuesto, se pretenden realizar fermentaciones en un biorreactor airlift

a lo largo del proyecto y en la medida que sea posible, se partirá de lo reportado por
Alcantar (2005) y por Reyes (2006), utilizando la cepa sobreproductora de
Corynebacterium glutamicum ATCC 21253 en un biorreactor airlift.

A lo largo del proyecto se realizará una revisión bibliográfica con el objeto de comprender
las cinéticas celulares de producción, crecimiento y consumo en el medio fermentativo, así
como comprender los modelos que describen las etapas de la fermentación.

De igual manera se revisaran los avances obtenidos en el campo de la hidrodinámica y

reología en biorreactores o fermentadores con el objeto de analizar las interrelaciones entre
las fases cinéticas y el efecto de los parámetros hidrodinámicos y reológicos.

Adán Castorena Quintanar

10
 AVANCE DE TESIS ITC

En un principio se pretenden realizar fermentaciones experimentales con el objeto de

familiarizarse con el proceso, técnicas de caracterización y del reactor.

Posteriormente se continuará con las fermentaciones, y durante las mismas se monitoreara

la fracción de retención de gas usando el método propuesto por Chisti (1989) utilizando en
manómetro en “U” invertida.

La medición de las velocidades del líquido en el riser y el downcomer pretenden ser

realizadas en un principio con la ayuda de un pulso de trazador de acido sulfúrico con
fenolftaleína y determinado el tiempo que este requiere para trasladarse desde un punto en
el fondo del reactor hasta el nivel máximo de la dispersión y viceversa (Chávez, 2005), y
posteriormente con la ayuda de partículas pequeñas de densidad similar a la presentada en
el reactor (aún por determinar) con el objeto de comparar ambos métodos.

El tiempo de mezclado será determinado por la técnica de variación del 5% del pH

utilizando pulsos de trazador y siguiendo la cinética de variación de pH en el reactor
(Chávez, 2005) a fin de visualizar patrones de flujo al interior del mismo buscando la
homogeneidad del biorreactor.

a) b)

Figura. Campos de velocidad y líneas de corriente al interior de un bioreactor.

Adán Castorena Quintanar

11
 AVANCE DE TESIS ITC

El coeficiente de transferencia de masa será determinado por la técnica de eliminación de

gas descrita por Quintero (1981).

En cuanto a la caracterización reológica se llevará a cabo tomando muestras, a diferentes

tiempos, y estas muestras serán caracterizadas en la UNAM, con geometrías reométricas no
convencionales en un reómetro de esfuerzos controlados AR2000 a las diferentes
condiciones de mezclado.

En la parte final del proyecto se pretenden correlacionar los datos obtenidos con el fin de
observar las dependencias y relaciones entre los datos obtenidos.

La determinación de lisina y de biomasa serán realizadas por el método presentado por

Alcantar (2000). El cronograma tentativo de actividades es el presentado en la tabla 3.

Tabla 1. Cronograma de actividades.

Abril-10

Julio-10
Marzo-
Ago-09

Nov-09

Ene-10

Feb-10
Sep-09

Oct-09

Dic-09

Mayo-

Junio-
10

10

10
Revisión
Bibliográfica

Reproducción de
Experimentos

Experimentación

Análisis y
correlación

Validación

Escritura de Tesis

Adán Castorena Quintanar

12
 AVANCE DE TESIS ITC

REFERENCIAS

 Chávez-Parga, M. C.; González-Ortega, O.; Negrete-Rodríguez, M. L. X.;

Medina Torres, L.; Escamilla Silva, Eleazar M. (2006). Hydrodinamics,
mass trasnfer and rheological studies of gibberellic acid production in an
airlift bioreactor. World J Microbiol. Biotechnol.. 23:615-623.
 Ph. D. Wolfgang Liebl, Georg-August-Universität. Recuperado el 25 de
octubre de 2009 de:
http://wwwuser.gwdg.de/~appmibio/Abbildungen/Coryne_SEM.jpg.
 I. J. Dunn et. al.,“Biological Reaction Engineering, Dynamic Modelling
Fundamentals with Simulation Examples”, Wiley-VCH, 2000.
 José Antonio Alcantar Garduño, “Optimización del medio de cultivo para la
producción de Lisina en Matraz Agitado”, Tesis de Maestría, U.A. Querétaro,
2000.
 Kinoshita, S., Udaka, S., Shimono, M. (1957). Studies on the amino acid
fermentation. Prt I. Production of L-glutamic acid by various
microorganisms. J. Gen. Appl. Microbiol. 3:193 – 2005.
 Leopoldo Reyes Pantoja, “Biosíntesis de L-Lisina en un Bioreactor Airlift con
Corynebacterium glutamicum ATCC 21253”, Tesis de Maestría, I.T. Celaya,
2006.
 M. Y. Chisty, “Airlift Bioreactors”, Elsevier Applied Science London and New
York, 1989, pp. 14
 Ma. Del Carmen Chávez Parga, “Producción de Ácido Giberélico en un
Bioreactor Airlift”, Tesis de Doctorado, I.T. Celaya, 2005, pp. 68
 Nakayama, K., Araki, K. Process for producing L-lysine. 1973.
 Quintero, R. R. Ingeniería bioquímica. Teoría y aplicaciones. 1981. Editorial
Alambra mexicana. México.
 Wikipedia. Recuperado el 20 de octubre de 2009 de:
http://es.wikipedia.org/wiki/Lisina

Adán Castorena Quintanar

13