Ley de Rapidez y Energía de Activación para la Reacción

de Oxidación de Catecol Catalizada por Catecol Oxidasa

Objetivos:

• Determinar la ley de rapidez para la reacción de oxidación de catecol

• Estudiar el efecto de la concentración de los reactivos, la catálisis
enzimática y la temperatura en la rapidez de la reacción
• Utilizar análisis de gráficas y datos experimentales para:
 Determinar el orden de cada reactivo en la reacción
 Determinar la energía de activación de la reacción

Información de Trasfondo:

La rapidez de una reacción química es afectada por varios factores como la

concentración de los reactivos, la temperatura, el área superficial de los
reactivos y la presencia de un catalítico. La rapidez de una reacción se
puede expresar de diferentes formas, dependiendo de la naturaleza de los
reactivos y de los productos. Experimentalmente la rapidez se puede
determinar monitoreando diferentes paramentaros como por ejemplo: la
concentración molar de uno de los reactivos o productos por unidad de
tiempo, el cambio en absorbencia por unidad de tiempo, o el cambio en
presión entre otros.

La ley de rapidez de una reacción permite establecer de manera cuantitativa

la relación entre las concentraciones de los reactivos y la rapidez de la
reacción. Consideremos la siguiente ecuación general:
aA + bB → Producto(s) (1)

La rapidez de esta reacción está relacionada, por una potencia exponencial,

a la concentración inicial de cada reactivo. Esta relación se puede establecer
usando la ley de rapidez, que para esta reacción seria:
r = k [A]m[B]n (2)

Donde: k, es la constante de rapidez de la reacción a una temperatura dada

y los exponentes m y n designan el orden de la reacción respecto a cada
reactivo. La constante de rapidez de la reacción, cambia con la temperatura
pero es independiente de la concentración de los reactivos. El orden de la
reacción respecto a cada reactivo siempre se determina experimentalmente.
Excepto por las reacciones elementales, los exponentes m y n no están
relacionados los coeficientes de la ecuación química balanceada. La suma de
los exponentes nos proporciona el orden total de la reacción.
En este experimento se determinará la seudo ley de rapidez para la reacción
de oxidación de catecol catalizada por la enzima catecol oxidasa:

Como la concentración molar de O2 se mantendrá constante en la mezcla de

reacción la ley de rapidez que determinaremos será:

r = k’ [catecol] m [Catecol Oxidasa]n, donde k’= k[O2] (3)

Catecol es un fenol que se encuentra en muchas plantas y frutas. Cuando el

tejido de una planta es dañado se libera catecol y este es oxidado por
catecol oxidasa a orto-benzoquinona. La benzoquinona es tóxica para las
bacterias por lo que ayuda a proteger a las plantas y frutas. La ortho-
benzoquinona una vez se produce es convertida a melanina un producto de
color marrón. Por esta razón cuando se cortan las frutas o papas estas se
tornan de color marrón. En este ejercicio de laboratorio determinaremos la
rapidez de la reacción de oxidación de catecol midiendo la rapidez con la que
aparece el producto coloreado. Con este propósito mediremos el cambio en
absorbencia como función del tiempo usando un colorímetro a 470 nm (luz
azul) .

En las primeras partes del experimento determinarás el orden de la reacción

respecto a catecol y a catecol oxidasa, la ley y la constante de rapidez de la
reacción. Para determinar el orden de la reacción respecto a cada reactivo se
realizara una serie de experimentos en donde se mantendrán constantes
todos los parámetros, excepto la concentración del reactivo para el que se
quiere determinar el orden de reacción. Por ejemplo para determinar el
orden de la reacción respecto a catecol, la concentración de enzima se
mantendrá constante y se cambiará la concentración de catecol. Por tanto
para el conjunto de experimentos en donde lo que se cambia es solo la
concentración de catecol la ley de rapidez se puede expresar como:

r = k’ [catecol]m c , donde c = [Catecol Oxidasa]n (3)

La forma logarítmica de esta ecuación nos permite tener la expresión de una

línea recta:
 log r = m log [catecol] + C (4)

donde C = log k’ + log [Catecol Oxidasa]n

Por tanto una gráfica de log (rapidez inicial) vs log [catecol] produce una
línea recta con una pendiente igual a m, donde m es el orden de la reacción
respecto a la concentración molar de catecol. Para esto necesitamos
primero determinar la rapidez inicial de la reacción para las diferentes
concentraciones y con este propósito se graficará el cambio en absorbencia
como función del tiempo para las diferentes concentraciones de catecol a un
intervalo de tres minutos. La pendiente de esta gráfica nos permite conocer
la rapidez inicial de la reacción a un conjunto de concentraciones dadas. Para
determinar el orden de la reacción respecto a catecol oxidasa se realizará el
mismo análisis pero manteniendo la concentración de catecol constante y
variando la concentración de catecol oxidasa.

En la última parte del experimento usted diseñará un protocolo para

estudiar el efecto de la temperatura en la rapidez de reacción y tendrá que
utilizar los resultados para determinar la energía de activación de la misma.
La rapidez de una reacción depende de la temperatura. A temperaturas
altas la energía cinética de las moléculas aumenta, por tanto cuando las
moléculas de reactivos colisionan lo hacen con mayor fuerza aumentando la
probabilidad de que reaccionen. La energía que se requiere para que una
reacción ocurra se conoce como la energía de activación Ea. La relación
entre la constante de rapidez de una reacción, k, a una temperatura dada T
(K), esta expresada en la ecuación de Arhenius:

k = Ae-Ea/RT (5)

donde A es el parámetro de colisión para la reacción y R es la constante de

los gases (=8.314J/molK). La forma logarítmica de esta ecuación es:

ln k = ln A – (Ea/RT) (6)

Esta forma logarítmica nos da una ecuación de una línea recta para una
grafica de ln(k) vs 1/T, donde la pendiente es igual a - Ea/RT y el intercepto en
y es ln A. Si experimentalmente se determina la constante de rapidez de la
reacción a diferentes temperaturas y se construye una gráfica de ln k como función
de 1/T se puede determinar la energía de activación de la reacción.

Precauciones de Seguridad:

Utilice batas, gafas y guantes todo el tiempo. El catecol es una sustancia

nociva, tenga precaución con el manejo de todas las soluciones.
Use los materiales con las precauciones debidas de seguridad. Los reactivos
no deben ser inhalados y no deben tener contacto con la piel, ojos, o ropa.
Lávese bien luego de acabar.

Materiales:

Soluciones de Catecol y de Catecol oxidasa

Matraces volumétricos
Pipetas
Colorímetro
Celdas para colorímetro
Plancha de calentamiento
Baño con hielo
Sonda de Temperatura

Procedimiento Experimental:

Parte I – Efecto de la catálisis enzimática en la rapidez de la

reacción:

En este ejercicio te familiarizaras con el procedimiento experimental y

determinaras el efecto de la catálisis enzimática en la reacción de oxidación
de catecol. También se determinara la concentración de enzima que se
usara para la tercera parte del experimento. Cada grupo utilizara una
concentración diferente de la enzima catecol oxidasa.

Prepare el Colorímetro para realizar las medidas. Refiérase al apéndice I para

las instrucciones.
¡Añada enzima a la celda del colorímetro solo cuando ya esté listo
para tomar las medidas de absorbencia!

1. Anote la concentración de catecol oxidasa que le asigne su instructor.

2. Use 5 mL del buffer de fosfato como blanco de referencia para el
colorímetro.
3. Prepare tres celdas de colorímetro como sigue: coloque 4 mL de la
solución de catecol 0.0125 M en la celda 1 y 2, en la celda # 3 coloque
4 mL de agua destilada.
4. La celda 1 se utilizara para estudiar la oxidación de catecol en
ausencia de la enzima. Añada 1 mL del buffer de fosfato, mezcle y
mida la absorbencia de la solución. Coloque la solución en un tubo de
ensayo rotúlelo y colóquelo en la mesa del instructor hasta el final del
experimento. Al final del experimento vuelva a medir la absorbencia de
la solución y observe la solución.
5. Mida la absorbencia de la solución en la celda 2, Luego cuando esté
listo para proceder añada 1 mL de la solución de catecol oxidasa
asignada a la celda 2. Mezcle e inmediatamente coloque la celda en el
 colorímetro. Tome las medidas de absorbencia vs tiempo hasta llegar
a un valor constante de absorbencia (al menos 3 minutos). Repita el
mismo procedimiento con la celda # 3.
6. Construya una gráfica de absorbencia vs tiempo. Coloque los datos
absorbencia obtenidos para la celda 2 y 3 en una misma gráfica.
7. Calcule la rapidez inicial de la reacción para la celda 2 y 3 usando la
pendiente de la gráfica de absorbencia vs tiempo en el intervalo de los
primeros 3 minutos de la reacción. Refiérase al apéndice I.
8. Reporte sus resultados a su instructor.
9. Utilizando la data de todos los grupos determine cuál es la
concentración de enzima que se debe usar para poder obtener buenos
resultados.

• ¿Cuánto tiempo debe tardar la reacción en ocurrir de modo que

se obtengan suficientes dados para construir las gráfica s
pertinentes?

10. Recuerde luego de terminar el experimento medir la absorbencia de la

solución que contiene solo catecol y la de celda a la que se le añadió
la enzima. ¿Qué se efecto tiene la enzima en la reacción de oxidación
de catecol?

Parte II – Determinación del orden de la reacción respecto a la

concentración molar de la enzima.

En esta parte del experimento estudiara el efecto de la concentración de la

enzima en la rapidez de la reacción. La concentración del sustrato (catecol)
permanecerá constante y la concentración de la enzima se variara. Su
instructor le proveerá una solución patrón de la enzima de una
concentración de 70 unidades/ mL.

1. Prepare 25 mL de tres soluciones de la enzima que tengan una

concentración entre 70 y 15 unidades/ mL.

¿Qué instrumentos volumétricos debes usar para preparar las

soluciones?

Con cadacon
2. Trabaje unauna
de las soluciones
sola de la enzima
concentración realizara
a la vez lo siguiente:
¡Añada enzima
a la celda del colorímetro solo cuando ya esté listo para
tomar las medidas de absorbencia!
a. Coloque en una celda 4 mL de la solución de catecol 0.0125 M que
se preparo usando la solución amortiguadora de fosfato a pH 6.5
¿Por qué es importante que el pH de la solución sea 6.5?
b. Anada 1 mL de la solución de la enzima a la celda con el catecol,
mezcle y coloque la celda en el colorímetro. Tome medidas de
 absorbencia como función del tiempo hasta llegar a un valor
constante de absorbencia.
c. Repita este procedimiento con cada una de las concentraciones de
la enzima.

Concentración Concentración Concentración

Enzima #1 Enzima #2 Enzima #3
______ Unidades/mL ______ ______ Unidades/mL
Unidades/mL
Tiempo Absorben Tiempo Absorben Tiempo Absorben
(s) cia (s) cia (s) cia
0

180

3. Para cada concentración de la enzima construya una gráfica de

absorbencia vs tiempo (utilice solo los datos de los primeros tres
minutos). Obtenga la ecuación de la línea recta que mejor describa la
tendencia de estos datos. La pendiente de esta línea es igual a la
rapidez inicial de la reacción (r).
4. Con los valores obtenidos con cada concentración de enzima complete
la siguiente tabla:
Concentración
Rapidez Inicial
de Catecol
(M/s)
Oxidasa (M)

5. Construya una gráfica de la rapidez inicial como función de la

concentración de catecol oxidasa. Obtenga la ecuación de la línea
recta que mejor describa la tendencia de estos datos. La pendiente de
esta línea es igual al orden de la reacción respecto a la concentración
de catecol oxidasa.

Parte III – Determinación del orden de la reacción respecto a la

concentración molar del sustrato (catecol).

En esta parte del experimento estudiara el efecto de la concentración del

catecol en la rapidez de la reacción. La concentración de la enzima
permanecerá constante y la concentración de catecol se variara. Su
instructor le proveerá una solución patrón 0. 025 M de catecol. La
cocentracion de la enzima que se utikizara será la determinada en la parte I
del experiemento.

6. Prepare 25 mL de tres soluciones de la catecol que tengan una

concentración entre 0.003 y 0.025 M. Utiliza como disolvente una
solución amortiguadora de fosfato con pH 6.5

¿Qué instrumentos volumétricos debes usar para preparar las

soluciones?

Trabaje
7. Con cada con
una una sola
de las concentración
soluciones a la
de catecol vez ¡Añada
realizara enzima
lo siguiente:
a la celda del colorímetro solo cuando ya esté listo para
tomar las medidas de absorbencia!

¿Con que concentración de catecol se debe comenzar a trabajar? ¿Por

qué?

a. Coloque en una celda 4 mL de la primera concentración de catecol

b. Añada 1 mL de la solución de la enzima a la celda con el catecol,
mezcle y coloque la celda en el colorímetro. Tome medidas de
absorbencia como función del tiempo hasta llegar a un valor
constante de absorbencia.
c. Repita este procedimiento con cada una de las concentraciones de
catecol. Complete la tabla que se presenta a continuación.

Concentración Concentración Concentración

Catecol #1 Catecol #2 Catecol # 3
______ M ______M ______M
Tiempo Absorben Tiempo Absorben Tiempo Absorben
(s) cia (s) cia (s) cia
0

180
 8. Para cada concentración de catecol construya una gráfica de
absorbencia vs tiempo (utilice solo los datos de los primeros tres
minutos). Obtenga la ecuación de la línea recta que mejor describa la
tendencia de estos datos. La pendiente de esta línea es igual a la
rapidez inicial de la reacción (r).
9. Con los valores obtenidos con cada concentración de Catecol complete
la siguiente tabla:
Concentración Rapidez Inicial
Catecol (M) (M/s)

10. Construya una gráfica de la rapidez inicial como función de la

concentración de catecol. Obtenga la ecuación de la línea recta que
mejor describa la tendencia de estos datos. La pendiente de esta línea
es igual al orden de la reacción respecto a la concentración de catecol.

Parte III– Determinación de la ley de rapidez y constante de rapidez

de la reacción:

1. Ley de rapidez: use los datos de orden de reacción de cada uno de

los reactivos (Parte II y III del experimento) y exprese la ley de rapidez
de la reacción.

2. Constante de rapidez: utilizando la ley de rapidez de la reacción

calcule el valor de k’ para cada una de las concentraciones usadas en
las parte II y III . Recuerde calcular la concentración que se tenía en la
mezcla de reacción para cada una de las especies.

Experimen [Catecol] [Catecol Rapidez Constante

to Oxidase] Inicial de de Rapidez
la de la
Reaccion reacción
(M/s) (k’)
1
2
3
4
5
6
 3. Calcule el valor promedio y la desviación estándar de la constante de
rapidez. Determine las unidades de k’. Reporte su resultado como k’
promedio ± desviación estándar.
4. Compare sus resultados con los de los demás grupos.

Parte III– Efecto de la Temperatura en la Cinética de la reacción y

Determinación de la Energía de Activación:

Usted y los miembros de su grupo deben diseñar un protocolo para

examinar el efecto de la temperatura en la rapidez de la reacción y
determinar la energía de activación de la misma. Las temperaturas a usarse
deben fluctuar en un rango de 10 a 35 oC. Para controlar la temperatura
puede usar baños de agua o agua con hielo la temperatura deseada.
Recuerde que una vez el catecol y la enzima están en contacto comienza la
reacción por tanto debe controlar la temperatura de estos reactivos por
separado. ¡Mezcle la enzima y el catecol en la celda del colorímetro
solo cuando ya esté listo para tomar las medidas de absorbencia!
Asegúrese siempre de limpiar las paredes de la celda antes de colocarla en
el colorímetro.

A continuación se presentan algunas preguntas guías que lo pueden ayudar

en su diseño:

1. ¿Qué parámetros deben permanecer constantes, cual debo cambiar?

2. ¿Cómo puedo determinar la rapidez inicial de la reacción a las
diferentes temperaturas?
3. ¿Qué datos necesito para calcular la energía de activación?
4. ¿Qué parámetros debo graficar para obtener la energía de activación
de la reacción usando la pendiente de la gráfica?