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PROCEDIMENTOS BASICOS EM MICROBIOLOGIA CLINICA Carmen Paz Oplustil Cassia Maria Zoccoli Nina Reiko Tobouti Sumike Ikura Sinto Projeto Grafico CLR Balieiro Editores Leda, Fotolitos/Impressao/Acabamento Grifica Ave Maria Direitos Reservados Nenhuma parte pode ser duplicada ou reproduzida sem expressa autorizagao do Editor fel ava Sardar Eade ros Mio Lids. Ce ott2aa0. ale SST Erma nee Gustcamte Dados Internacionais de Catalogacao na Publicacio (CIP) (Camara Brasileira do Livro, SP, Brasil) Procedimentos basicos em microbiologia clinica / Carmen Paz Oplustil .. [et al.]. ~ 2. ed, rev. ¢ ampl. -- Sio Paulo : SARVIER, 2004. Outros autores: Cassia Maria Zoccoli, Nina Reiko Tobouti, Sumiko Ikura Sinto Bibliografia. ISBN 85-7378-143-2 1. Microbiologia 1. Oplustil, Carmen Paz. IL Zoccoli, Cassia Maria. III, Tobouti, Nina Reiko, IV. Sinto, Sumiko Tkura. 04-2816 CDD-579 Indices para catalogo sistematico: 1. Microbiologia $79 50 = FROCEDIMENTOS BASICOS EM MICROBIOLOGIA CLINICA Tabela $.1 - Caracterfsticas fenotipicas de cocos gram-positivos catalase negativos aos pares e em cadeias; ou agrupados ¢ irregulares; com ou sem hemélise alfa, Microrganismos PYR LAP NaCla6,5% BE MOT 45°C 10°C SAT ARG VAN Enterococcus ++ + eV eee SF Vagococeus | + | 4 | Vv +] + - | + i]-i)np/ 5s Lactococcus i+ Vv af - - yoSUND OS Facklamia™* + | + + - - +). NDS Abiotrophia + [+ = ND - - = +) = 5S Granulicatella, ++ ND ND. ND ND ND + VS Gemella + ov - en Globicatella +[- + -() - - - - ND 5 Dolosicocens + = - ND ND ND ND - ND. 5S Leuconostoc -|- Vv ND - V « - - R Pediococcus” - + Vv ND = + = = + R Aerococeus* vov Vv vio-.- -/|- > wl s Stomatococcus V+ -_-(e) = ND ND. - NDS PYR = pirrolidonil arilamidase; LAP = leucina aminopeptidase; NaCI = cloreto de sédio; BE = bile eseulinas MOT = motilidades 45°C ¢ 10°C = crescimento a 45°C ¢ 10°C; SAT = satelitismo; VAN = vancomicina; ND = resultado no disponivel; + = maioria positiva; - = maioria negativa; V = varidvel; R = resistente; *hidrélise do hipurato positivo; *cocos agrupados e irregulares; ARG = arginina (Moeller); (e+) = esculina positiva. *Cepas resistentes tém sido relatadas. 2. Identificacao de bacilos gram-negativos Bacilos gram-negativos Fermentador da glicose Nao-fermentador Ves Se Seat Vo ed Oxidase (-) Oxidase (+) Oxidase (- [Oxidase (+) Enterobactérias | { Aeromonas Exemplos: Exemplos: | Plesiomonas Acinetobacter spp. Pseudomonas spp. Vibrio Burkolderia cepacia Burkolderia spp. Campylobacter | | Stenotrophomonas maltophilia || Alcaligenes spp. Figura 5.4 — Esquema para a identificagZo inicial de bacilos gram-negativos, + Enterobactérias Provas bioquimicas individuais - a utilizacao de séries bioquimicas pode identifi- car a grande maioria das enterobactérias. A tabela 5.2 mostra algumas provas utilizadas no laborat6rio para identificar enterobactérias e a porcentagem de posi- tividade para cada prova. NTO = 51 2p vz s9de epenionge sor aghast sesnp epore 8 0 0 0 0 i s 010 0 0 “dds myjatiqg seAN 8 0 0 1 1 0 36 z q 0 sanuos vypotuys 5 @NV LIN ‘Teo 19 € 86 ss 66 £6 66 0 66 0 oO 86 1 ‘Sua2SAD4PUL DITDALIS. 3 0 7 96 1 S66 06 86 S686 OT ds ryjouotapes sen Q 0 o 0 6 £ 86 0 0 uw 0 0 yey, pyouoray a dV ‘LIN ‘109 0 oo os ss 0 0 0 of 56 0 6 86 sums ve ay SLL ‘LIN “1d ‘189 or st +6 0 0 86 86 0 6 66 LL ‘UV ‘LIN “8 0s S8 $6 0 0 0) 6 66 $6 S186 ja suaong SLIN ‘8D z os 96S s6 66 0 86 % 6 SY syqoune soto LIN “19 ‘UNV \ 1 $6 56 1 86 $6 <0 mario neues any £6 6 66 0 0% 8 0 0% 0 uotanoud oyorsqary ay 86 0 6 (OO 0 66 | 4 0 $6 66 mopcxo nyeIsqayy lo 0 os | 86 so 406 Ta 1 1 86 yo? vigstuoqrse, AWV‘OID "HD Se Lo % % 6 0 9 0 0 oor 0 29200} 4o120 aWY “HO 59 0 0z so) ss 0 0 0 o SOT gg SUOEMUOITRD soprqoLoHEy INV “Od 86 0 | OL 6 0 86 7 0 s6 sauoosoy sop0qon is) 0 86 0 oor 0 ool 1 66 part mporspanonpy 1 aWY, I 0 68 68 68 | 0 oO 0 0 BL RL | ee upunay] soveqour ay 06 0 86 oF % | 6 OB se 0 66 | 66 af) SMstoayp sopeqoury Dest 2809118 ARDUDISISAY —_ OMBUOLE LUMO vu CUS] eDay eUIUEpEpUD sioadsq ol] Fuad Ts * PE, 52 = PROCEDIMENTOS BASICOS EM ¥ Rugai modificado (IAL) - esse meio de cultura consiste de um tubo contendo substratos para visualizagao de nove provas bioquimicas, conforme ilustracao da figura 5.5 EPM/MILi - é um sistema composto de dois tubos, um contendo os substratos para verificar a produgio de gas de glicose, H,S, uréia, L-triptofano desaminase, e © outro tubo para detectar motilidade, indol ¢ a produgao de lisina descarboxilase. + Inoculacao, incubagao e interpretagao — Repicar uma coldnia com um fio bacteriolégico estéril ¢ introduzir até quase final do(s) tubo(s). Na volta da semeadura, estriar a superficie do 4gar quando ele apresentar uma superficie inclinada. - Incubar a 35 * 1°C por 18 a 24 horas. — A figura 5.6 mostra as possiveis bactérias de acordo com as diversas reagdes no meio de Rugai modificado (IAL). = A tabela 5.2 serve como guia para identificar as bactérias quando o meio EPM/MILi ou as provas individuais forem utilizados. + Bacilos gram-negativos nao-fermentadores da glicose Utilizando uma série bioquimica apropriada podemos agrupar e identificar a maio- ria das espécies dos bacilos gram-negativos nao-fermentadores da glicose. Em ge- ral, quando procedemos a identificagao de nao-fermentadores, devemos usar um indculo mais denso em cada prova, ¢ as provas ndo devem ser interpretadas antes de 48 horas de incubagao. Para obter os melhores resultados, a incubagao deve ser feita & temperatura ambiente (20 a 25°C), com leitura final em sete dias. A identificagdo sugerida a seguir foi descrita pelo Dr. Paul Schreckenberger (Dire- tor da Divisao de Patologia Clinica da Universidade de Illinois, Chicago) no ma- nual “Pratical approach to the identification of glucose nonfermenting gram-ne- gative bacilli*, 2000. A. Algodio 3 Nat Indol Sacarose | Fenilalanina (LTD) Fermentagio da glicose HS Gis de glicose Vascar ——> | (cera de carnadiba «| Lisina | + vaselina} Motilidade Figura 5.5 — Esquema do meio de Rugai modificado (IAL). 12 13 14 A Figura 5.6 — Possiveis reacées do Rugai mo- dificado (IAL) para as diferentes enterobac- térias: 1. Escherichia coli; 2. Escherichia coli invasiva; 3. Shigella sonnei; 4, Shigella flex- neris 5. Enterobacter aerogenes; 6. Klebsiella pneumoniae; 7. Enterobacter cloacae; 8. Pro- videncia spp. uréia positiva ou Morganella morganiis 9. Providencia spp. uréia negativas 10. Providencia spp. uréia positiva ou Morga- nella morganiis 11. Proteus mirabilis, 12. Proteus vulgaris; 13. Salmonella spp.s 14. Ci- trobacter freundiiy 15. Serratia marcescens; 16. Pseudomonas aeruginosa; inoculado. Foto: SDC FMUSP - Carlos Eduardo Lemos 272 « * Soro estéril de cavalo. * Solucdo de cefalexina = cefalexina: 0,04g; — gua destilada: 10m. Esterilizar por filtracao. Procedimento + Pesar e hidratar 0 meio conforme as instrugGes do fabricante. * Distribuir 25ml do meio em tubos de vidro com tampa de rosca. + Autoclavar a 121°C por 15 minutos. + Retirar da autoclave e resfriar até 50°C. + Conservar 0 meio em geladeira até o uso. + No momento do uso fundir o meio e deixar esfriar. « Adicionar 1,5ml de soro estéril de cavalo e 0,25ml da solugao de cefalexina assepticamente. « Homogeneizar evitando a formagdo de espuma. * Distribuir 25ml em placa de Petri estéril (90mm) homogeneizando constante- mente para nao depositar o carvao. Validade - um més, se conservado embalado de 2 a 8°C. Controle de qualidade Esterilidade - retirar uma amostragem do lote preparado e colocar em estufa a 35 + 1°C por 24 horas. Se no houver crescimento, liberar o meio para uso. Crescimento — preparar uma suspensio de Bordetella pertussis ATCC 12742 na escala 0,5 de McFarland e diluir 1:100 (0,1ml em 9,9ml de solugio fisioldgica). Semear 0,01ml da suspensao na placa. Preparar uma suspensao de Staphylococ- cus aureus ATCC 25923 na escala 0,5 de McFarland, diluir 1:10 (0,1ml em 0,9ml) e semear 10 em uma placa. Incubar as placas a 35 + 1°C por até sete dias. Se a Bordetella pertussis crescer na placa e o Staphylococcus aureus for inibido, liberar o lote para uso. RUGAI MODIFICADO (Meio IAL) Finalidade — utilizado para identificar as principais espécies de enterobactérias. Materiais + Erlenmeyer. « Tubos de 12 x 120mm. + Algodio hidréfilo. Procedimento - 0 meio de Rugai ¢ composto de quatro fases: a interface, a fase inferior, a fase superior ¢ 0 indol. CORANTES E TESTES BOQUIMICOS * 273 * Interface (Vascar) Vaselina liquida - 90ml. Cera de carnatiba - 10g. ~ Colocar os dois componentes em um Becker e aquecer em fogo brando até com- pleta dissolugao da cera e aparecimento de uma mistura liquida homogénea. = Colocar com uma pipeta 8 gotas de vascar dissolvida, em cada tubo (12 x 120mm). + Fase inferior (Lisina) - pH = 6,4 Para o preparo da fase inferior pode ser utilizado o meio de lisina formulada ou semiformulada disponivel comercialmente. a) Lisina formulada Extrato de levedura - 3g. Nitrato de potdssio - 0,5g. Lilisina - 5g. Dextrose - 0,5g. Agua destilada — 1.000ml. Agar (Difco ou Oxoid) - 4g (Merck = 3,59). Purpura de bromocresol — 0,02g. — Pesar 0 extrato de levedura, nitrato de potassio, L-lisina e dextrose ¢ dissol- ver em dgua. = Homogeneizar até completa dissolugio e acertar o pH. — Acrescentar Agar e ptirpura de bromocresol. = Levar ao fogo sob constante agitagio até completa dissolugao do agar. — Distribuir 2ml em cada tubo ja contendo vascar. = Tampar com algodao e esterilizar a 121°C por 10 minutos. —Retirar da autoclave e deixar resfriar na posigao vertical até o vascar endurecer (formagao de um anel branco). Estocar os tubos embalados em sacos plasticos na geladeira até ser colocada a fase superior. b) Lisina semiformulada - pH = 6,4 Meio de descarboxilase disponivel comercialmente. Agar (Difco ou Oxoid) ~ 4g (Merck = 3,5g). Lilisina - 10g. Agua destilada — 1.000ml. — Pesar ¢ hidratar 0 meio de descarboxilase conforme as instrugées do fabricante. - Acertar o pH. - Acrescentar 0 agar ¢ aquecer sob constante agitaco, até completa dissolugio. - Distribuir 2ml em cada tubo, j4 contendo o vascar. — Tampar com algodao hidréfilo. ~ Esterilizar a 121°C por 15 minutos. —Retirar da autoclave e deixar resfriar na posigao vertical até o vascar endurecer (formagdo de um anel branco). Estocar os tubos embalados em sacos plisticos na geladeira até ser colocada a fase superior. Nota: a quantidade do agar que ser colocada vai depender da marca utiliza- da. Fazer um teste variando a quantidade do agar colocada no meio até obter uma concentragio ideal para verificar a motilidade. Fase superior (base + 4pice) Solugao de substratos e indicadores (preparar 15 dias antes do uso). ~ Esterilizar por autoclavagao 8Sml de agua destilada, em um Erlenmeyer de 500ml ou em um frasco com tampa de rosca. ~ Esterilizar um bastao de vidro enrolado em papel-aluminio. = Pesar os componentes abaixo em papel-aluminioz citrato de ferro amoniacal - 2g; tiossulfato de sédio (Na,S,0,.5H,O) - 2g; sacarose ~ 80g; glicose ou dextrose — 10; uréia p.a. — 40g. Nota: a fase superior pode ser preparada sem sacarose e o meio pode entio ser utilizado para identificago de Yersinia. — Colocé-los individualmente no Erlenmeyer com Agua destilada estéril e homo- geneizar bem com o bastdo de vidro apés cada adigao. = Cobrir 0 frasco ou Erlenmeyer totalmente com papel-aluminio e levar ao ba- nho-maria previamente aquecido a 65°C para dissolugao, durante 1 hora. — Homogeneizar a soluc&o periodicamente. A agua do banho-maria deve estar no nivel do volume substrato. ~ Apés dissolugao total, deixar resfriar ¢ estocar em geladeira. Nota: nao utilizar o substrato recém-preparado, pois as reagdes no Rugai podem no ocorrer na forma esperada, principalmente a produgao de H,S. Meio base: Triptona ou bacto-triptona ~ 10g. Extrato de carne - 2g. Cloreto de sédio ~ Sg. Fosfato diss6dico (Na,HPO,.12H,O - 3,125g. ou Na,HPO,.5H,O ~ 2g. ou Na,HPO,.7H,0 - 2,34g. L-triptofano — Lg. Agua destilada — 1.000ml. Solugao alcoélica de azul de bromotimol (1,5%) - 2ml. Agar — 11g (Oxoid = 9,5g). pH = 7,4-7,6 ENTES, SOLUCK TESTES BOQUMMICOS = 275 — Pesar todos os componentes, exceto o agar, e colocar em um Erlenmeyer ou balao de fundo chato. — Colocar agua destilada e homogeneizar até completa dissolucio. — Acertar o pH. ~ Adicionar o agar ¢ a solucio de bromotimol, aquecer sob constante agitagao até completa dissolugao. — Esterilizar a 121°C por 15 minutos. — Retirar da autoclave, resfriar 0 meio até 50°C. — Adicionar assepticamente 20ml da solucg&o de substrato por litro de base. — Homogeneizar bem e distribuir 3 a 4ml nos tubos jé contendo a lisina e 0 vascar. — No momento da distribuigao, molhar o tampao com o reativo de indol. — Colocar 0s tubos inclinados em angulo de 45° & temperatura ambiente, até solidificagao. Nota: para acertar 0 pH, utilizar NaOH 1N ou HC1 IN. * Reativo de indol P-dimetilaminobenzaldeido ~ 1g. Acido ortofosférico (d = 1,70) - 20g ow na forma liquida (xaroposo) - 14ml. Alcool etilico absoluto — SOml. Agua destilada q.s.p. - 100ml. = Dissolver o p-dimetilaminobenzaldeido em dlcool etilico. - Adicionar lentamente 0 Acido ortofosférico e a Agua destilada. = Estocar 4 temperatura ambiente em frasco com tampa esmerilhada. Molhar 0 tampao nesta solucio ao mesmo tempo em que est sendo distribuido © meio base. Nota: para facilitar a impregnacio do tampao de algodao com o reativo de indol, utilizar placa de Petri com gaze embebida no reativo. Carimbar 0 tam- pao nessa gaze, tomando cuidado para nao embeber excessivamente 0 tampao. Inoculagao — inocular com fio bacteriolégico uma colénia, introduzindo-o até a fase da lisina, e ao voltar semear na superficie do meio. Incubar a 35 = 1°C por 24 horas. Validade — um més, se conservado de 2 a 8°C. Interpretacao — proceder a interpretagdo de acordo com a tabela 5.2 ¢ figura 5.6. Controle de qualidade Esterilidade - retirar uma amostragem do lote preparado e colocar em estufa a 35 + 1°C por 24 horas. Se nao houver crescimento, liberar o meio para uso. 276 » PROCEDIMENTOS BASK Reagao bioquimica ICOS EM MICROBIOLOGIA CLINICA Reagio bioquimica Resultado Cepa Resultado Lisina (fase inferior) Positive Salmonella spp. Roxo Negative Citrobacter freundii Amarelo H,S (base} Positive Salmonella spp. Preto Negativo Escherichia coli Nao desenvolve a cor preta LTD (pice) Positive Proteus spp. Verde-garrafa Negativo Escherichia coli Inalterado Uréia (base) Positive Proteus spp. Azul Negativo Escherichia coli Inalterado Motilidade Positive Salmonella spp. Meio de lisina turvo (fase inferior) Negativo Klebsiella pneumoniae Meio de lisina com crescimento apenas na picada Gis de glicose (base) Positive Klebsiella pneumoniae Amarelo com bolhas Negative Shigella spp. Amarelo sem bolhas Indol (tampa) Positivo Escherichia coli ‘Tampao com base rosa Negative Klebsiella pneumoniae Sem alteragao Glicose (base) Positive Klebsiellla pneumoniae Amarelo Negative Pseudomonas aeruginosa Inalterado Sacarose (pice) Positive Enterobacter cloacae Amarelo Negative Shigella spp. Azul