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UNIVERSIDADE FEDERAL DE JUIZ DE FORA

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA - ICE


METODOLOGIA ANALÍTICA

Determinação de ácido acetilsalicílico, paracetamol e cafeína em medicamentos


por HPLC

1. INSTRUMENTAÇÃO
Equipamento: HPLC Agilent 1100 serie com injetor manual com alça de amostragem de
20µL, sistema desgaseificador, bomba quaternária, detector UV-VIS de múltiplos
comprimentos de onda, software Agilent Chemistation LC Systems.
Coluna: C8 Zorbax eclipse XDB (150 mm x 4,6 mm de diâmetro interno, 5µm de diâmetro de
partícula)
pH metro
Balança analítica
Ultrassom

2. MATERIAIS E REAGENTES:

Metanol grau HPLC Amostras: comprimidos de Cibalena.


Ácido fosfórico grau HPLC Filtros para seringa membrana de PTFE 0,45
Ácido acetilsalicílico p.a., cafeína p.a e µm
paracetamol p.a. Seringas descartáveis
Vidraria

3. PROCEDIMENTO
3.1. Preparo da solução H3PO4 pH 2,5:
Coloque cerca de 800 mL de água deionizada em um béquer com capacidade de 1L e
introduza o eletrodo de vidro do pHmetro na água. Sobre agitação constante, adicione na
água pequenos incrementos de H3 PO4 concentrado (grau HPLC), até atingir o pH 2,5.

3.2. Solução para diluição dos padrões e amostras metanol /sol. H3PO4 pH 2,5 (40: 60 v/v):
Misture 60 mL da solução de H3 PO4 pH 2,5 com 40 mL de metanol. Utilize esta solução para
preparar as soluções padrões e amostras. Transfira uma alíquota desta solução para um
microtubo previamente rotulado com CAL 1.

3.3. Preparo das soluções padrões:

a) Solução padrão
Pese em béqueres distintos (10,0 mL) cerca de 50,0 mg de AAS, 50,0 mg de paracetamol e
25mg de cafeína. Adicione cerca de 5 mL da solução anteriormente preparada (item 3.2) e
leve as soluções ao ultra-som por 10 min. Transfira cada uma das soluções para um balão de
10,0 mL e complete o volume do balão com a solução 3.2.

b) Solução padrão individual


Transfira a 50 µL da solução pad rão 5 mg/mL para um microtubo e acrescente 1400 µL da
solução (item 3.2). Filtre cada uma das soluções preparadas em filtro de seringa com
membrana de 0,45 µm em PTFE.

c) Soluções padrão mistura estoque e curva analítica


Transfira as alíquotas (Figura 1) das soluções padrões 5,0 e 2,5 mg/mL para o mesmo balão
volumétrico (5,00 mL) e complete o volume do balão com a solução (item 3.2). Filtre a solução
em filtro de seringa com membrana de PTFE com 0,45 µm de porosidade e prepare a curva
analítica, conforme o esquema apresentado. Transfira alíquotas das soluções da curva
analítica para microtubos previamente rotulados. Injete as soluções da cu rva analítica no
HPLC.

Sol. padrão AAS Sol. padrão paracetamol Sol. padrão cafeína


5,04 mg/mL 5,00 mg/mL 2,54 mg/mL

Alíquota Alíquota Alíquota


500 µL 500 µL 100 µL

Balão 5,00 mL

Solução padrão mistura estoque


AAS ( mg/mL), paracetamol ( mg/mL) e cafeína ( mg/mL)

Filto de membrana
PTFE 0,45 µm

Líquido filtrado

Curva analítica

40 µL 80 µL 120 µL 160 µL

BV 2 mL BV 2 mL BV 2 mL BV 2 mL

CAL 1 CAL 2 CAL 3 CAL 4 CAL 5


(0 mg/L) ( mg/L) ( mg/L) ( mg/L) ( mg/L)

Figura 1: Esquema de preparo das soluções padrões.

3.4. Preparo da amostra:


Pese e triture um comprimido de Cibalena. Em béqueres (25 mL) distintos, pese 120,0
mg do comprimido triturado. Prepare cada amostra em triplicata (Figura 2). Adicione
cerca de 20 mL da mistura MeOH/solução H3 PO4 pH 2,5 (40:60) (item 3.2) em cada um
dos béqueres e leve a solução ao utrassom por 10 min. Após este tempo, transfira a
solução para um balão de 25 mL e complete o volume com a solução para diluição. Filtre
a solução em filtro de seringa com membrana de PTFE com 0,45 µm de porosidade e
transfira 130 µL do filtrado para um balão de 5 mL. Complete o volume do balão com a
solução para diluição (item 3.2) e transfira alíquotas das amostras para microtubos
previamente rotulados. Injete as amostras no HPLC.
Massa da amostra
MeOH/água pH 2,5 H3PO4 (40:60)

Ultrassom -10 min


MeOH/água pH 2,5 H3PO4 (40:60)

Balão volumétrico (25 mL)

Filtro de membrana
PTFE 0,45 µm

resíduo filtrado Alíquota 130 µL

Balão volumétrico (5 mL)

HPLC
Figura 2: Esquema de preparo das amostras.

3.5. Parâmetros do HPLC


• Transfira a solução H3 PO4 pH 2,5 para frasco âmbar no canal A e acetonitrila para o
frasco no canal B, metanol no fraco do canal C e água deionizada no frasco do canal D.
• Purgue os canais A e C.
• Condicionamento da coluna: composição inicial da FM - MeOH/Sol. H3 PO4 pH 2,5
(40:60)
• Crie um método para análise com os seguintes parâmetros:
Gradiente: tempo % H3PO4 pH 2,5 % MeOH Fluxo P max

Tempo de
análise:

Tempo de
espera:

Detector: A (_____) B (_____) C (_____) D (_____) E (_____)


• Injete as soluções padrões da curva analítica (Cal 1, 2, 3, 4 e 5) e as soluções padrões
individuais para identificação dos picos no cromatograma. Injete as amostras.
Obs: Todas as soluções injetadas no HPLC devem ser p reviamente filtradas em
membrana de 0,45 µm.
• Purgue o canal D com água e limpe o sistema passando água por 15 min com fluxo de 1
mL/min pela coluna. Condicione a coluna com ACN ou metanol por 5 min com fluxo
de 1 mL/min.
• Limpe a válvula de injeção, na posição “inject”, com água e metanol.
• Construa a curva analítica no software do HPLC e imprima os relatórios da curva
analítica e das análises das amostras.
• Construa as curvas analíticas para cada analito utilizando o Origin ou Excel.
• Determine as concentrações dos analitos nas amostras de medicamento ( % m/m) e
compare o resultado obtido com valor do fabricante.

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