UNIVERSIDADE FEDERAL DE JUIZ DE FORA

Campus Avançado Governador Valadares

Departamento de Ciências Básicas da Vida
Disciplinas: Bioquímica (BQU513GV – Nutrição e Fisioterapia)
Bioquímica I (BQU501GV – Medicina)
Bioquímica (BQU507GV – Odontologia)

APOSTILA DE AULA PRÁTICA

CRONOGRAMA DE AULAS PRÁTICAS DE BIOQUÍMICA

PROFA DIRCE RIBEIRO DE OLIVEIRA I semestre/2020
Datas Conteúdo
Aula prática I: Introdução ao laboratório e Preparo
10/03/2020
de soluções
17/03/2020 Aula prática II: pH e solução tampão
24/03/2020 Aula prática III: Caracterização de carboidratos
31/03/2020 Aula prática IV: Saponificação de triacilgliceróis
Aula prática V: Pipetagem
07/04/2020
automática/Espectrofotometria

GOVERNADOR VALADARES
2020
1. INSTRUÇÕES GERAIS: ................................................................................................................ 3
A. Introdução ......................................................................................................................... 3
B. Princípios gerais de técnicas: ............................................................................................ 4
C. Vidrarias importantes........................................................................................................ 4
D. Equipamentos ................................................................................................................... 5
E. Técnicas de transferência de materiais:............................................................................ 6
2. MODELO DE RELATÓRIO: .......................................................................................................... 7
3. ROTEIROS DE AULAS PRÁTICAS: ................................................................................................ 8
A. AULA PRÁTICA 1: Preparo de soluções ............................................................................. 8
B. AULA PRÁTICA 2 (1ª parte): pH ....................................................................................... 11
C. AULA PRÁTICA 2 (2ª parte): Solução-tampão ................................................................. 13
D. AULA PRÁTICA 3: Identificação de carboidratos ............................................................. 16
E. AULA PRÁTICA 4: Propriedades de lipídeos e saponificação de triacilgliceróis .............. 18
F. AULA PRÁTICA 5: Pipetagem Automática/Espectrofotometria ...................................... 21

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1. INSTRUÇÕES GERAIS:

A. Introdução
❖ Lembre-se que o laboratório é um lugar para trabalhos sérios e não para
experimentos ao acaso.
❖ Não é permitido o ingresso do aluno no laboratório sem o avental/jaleco.
❖ É extremamente proibido fumar no laboratório, quer seja visitando ou
trabalhando.
❖ Não são permitidas brincadeiras nem conversas entre alunos, a não ser quando
tratar-se da aula em questão.
❖ Realize somente os experimentos indicados na aula. Não é permitido realizar
aqueles não autorizados.
❖ Leia as práticas com antecedência para obter melhor aproveitamento das aulas.
❖ Leia com o máximo de atenção os rótulos dos frascos, antes de utilizar as
sustâncias contidas neles.
❖ Não troque os reagentes de uma bancada para outra.
❖ Nunca prove uma solução a não ser com a permissão do professor, e quando for
cheirar qualquer substância, proceda com cuidado, mantendo o rosto afastado da
substância, com movimentos de mão dirigindo os vapores ao nariz.
❖ Quando qualquer substância cair no chão ou na mesa, lave o local imediatamente,
assim como se a substância cair em sua pele, lave também imediatamente com
muita água corrente e avise o professor.
❖ Quando aquecer a substância em um tubo de ensaio, não aponte a extremidade
aberta para outras pessoas ou em sua direção, e o faça sempre agitando o tubo ao
qual se aquece.
❖ Substâncias inflamáveis devem ser aquecidas em banho-maria, chapa elétrica ou
banho de areia. Nunca use a chama direta para aquecer substâncias inflamáveis.
❖ Quando trabalhar com utensílios de vidro proceda com cuidado para evitar cortes
e queda dos mesmos.
❖ Nunca use quantidades maiores de reagentes que o indicado no roteiro.
❖ Antes de efetuar qualquer alteração nos reagentes empregados na experiência (por
qualquer motivo), discuta as mudanças com o professor.

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❖ Quando for diluir ácidos com água, sempre junte o ácido à água, com cuidado.
NUNCA junte a água aos ácidos concentrados porque você pode causar uma
explosão.
❖ Tendo qualquer dúvida solicite ao professor os devidos esclarecimentos.
❖ No final da aula, limpe todo material: passe água de torneira nas vidrarias
utilizadas. As pipetas devem ser colocadas dentro das cubas.
❖ Qualquer material quebrado ou qualquer substância alterada ou contaminada pelo
aluno deverá ser comunicado imediatamente ao professor responsável. Lembre-
se que só quebra material ou só estraga os reativos os indivíduos que estão
trabalhando, já que os ociosos nunca causam estragos.
❖ Qualquer acidente deve ser comunicado imediatamente ao professor.

B. Princípios gerais de técnicas:

❖ Use sempre uma pipeta para cada reagente a fim de evitar contaminações.
❖ Evite a troca de rolhas/tampas dos reagentes.
❖ Para aquecer o tubo na chama direta (no bico de gás), observe se o tubo está
externamente seco; caso contrário, seque o mesmo antes de efetuar a operação.
Para que o tubo seja uniformemente aquecido, utilize pinças especiais e mantenha
o tubo em constante agitação.
❖ Nunca dirija a boca do tubo em direção a si mesmo ou ao colega, pois poderão
ocorrer esguichos e com isto atingi-lo.
❖ Não deixe peças de vidro quentes em qualquer lugar, espere sempre que o vidro
quente volte a esfriar antes de pegá-lo. Lembre-se que o vidro quente parece
sempre estar frio.
❖ Terminando o uso do bico de gás, verifique se a torneira do gás está bem fechada,
evitando assim explosões e intoxicações.

C. Vidrarias importantes

❖ Béquer: recipiente com ou sem graduação, utilizado para o preparo de soluções,

aquecimento de líquidos, cristalização, entre outros.
❖ Erlenmeyer: frasco utilizado para aquecer líquidos ou para efetuar titulações.

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❖ Proveta ou cilindro graduado: frasco com graduações, destinado a medidas
aproximadas de volume de líquidos.
❖ Pipeta: equipamento calibrado para medida precisa de volume de líquidos.
❖ Balão volumétrico: recipiente calibrado de precisão destinado a conter um
determinado volume de líquido a uma dada temperatura, utilizado no preparo de
soluções de concentrações finais.
❖ Funil: utilizado na transferência de um líquido de um frasco para outro ou para
efetuar filtrações simples.
❖ Funil de separação ou decantação: usado para separar líquidos imiscíveis.
❖ Dessecador: utilizado no armazenamento de substâncias que exigem baixo teor de
umidade na atmosfera.
❖ Bastão de vidro: usado na agitação e transferência de líquidos.
❖ Almofariz ou grau e pistilo: destinado a pulverização de sólidos, que podem ser
de porcelana, ágata ou metal.
❖ Cadinho: usado para calcinação de substâncias.

D. Equipamentos

❖ Estufa: as estufas de dessecação comuns são aparelhos com aquecimento elétrico

e termostaticamente controlados, construídas para produzir temperaturas desde
aproximadamente 40C até 200C. A temperatura é lida por um termômetro e
controlada por uma chave seletora. A circulação de ar através da estufa, durante
seu funcionamento, é assegurada por orifícios no alto da câmara trocando
continuamente os vapores desprendidos.
❖ Balança: no preparo de produtos farmacêuticos que envolvem relação de massas
a exatidão de suas medidas é um fator essencial. As balanças podem ser de vários
tipos desde as mais grosseiras até as de alta sensibilidade, mas independente do
tipo todas devem atender as especificações de: exatidão, estabilidade e
sensibilidade. E para que a balança mantenha sempre estes requisitos é importante
um cuidado dos que fazem uso do aparelho e manutenção. Algumas regras que
ajudam são: instalar a balança em local estável e longe de reagentes; deve ser
nivelada, deve ser limpa; pesar de acordo com a capacidade do aparelho, manter

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 os pratos da balança sempre limpos e após a pesagem deixar a balança sempre no
zero.
❖ Outros equipamentos importantes: Centrifuga, Banho-Maria, pHmetro,
Espectrofotometro.

E. Técnicas de transferência de materiais:

❖ Reagentes sólidos: Ao se retirar uma pequena quantidade de um sólido granulado

ou pulverizado de um frasco, deve-se ter o cuidado de fazê-lo usando uma espátula
limpa e seca, colocando a tampa sobre uma folha de papel limpo. Se a quantidade
a ser retirada é grande, deve-se inclinar o frasco que contém o sólido sobre um
frasco coletor girando-o lentamente. Pode-se improvisar um funil ou mesmo uma
pequena tira encurvada para facilitar a transferência.
❖ Reagentes líquidos: A transferência de líquidos pode ser feita com auxílio de uma
pipeta, com bastão de vidro ou a mão livre se o frasco coletor for de boca larga.
Caso o recipiente seja de boca estreita deve-se usar o funil.

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2. MODELO DE RELATÓRIO:

CAPA

NOME DO(S) AUTOR(ES) EM ORDEM ALFABÉTICA

(Centralizado)

TÍTULO
SUBTÍTULO, SE HOUVER
(Centralizado negritado)

Cidade

Ano

(Centralizado)

CONTEÚDO
1 Introdução
2 Materiais e equipamentos
3 Procedimento Experimental
4 Resultados e discussão
5 Conclusão
6 Questionário (se houver)
7 Referências

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3. ROTEIROS DE AULAS PRÁTICAS:

A. AULA PRÁTICA 1: Preparo de soluções

❖ Introdução:
O preparo das soluções e reagentes consiste de uma etapa importante para um
experimento bem sucedido. Para isso é necessário verificar as normas técnicas
relacionadas ao preparo de soluções, observar os rótulos dos produtos a serem
manipulados, averiguar possíveis incompatibilidades e condições físico-químicas para
manipulação e atentar para a concentração.
A validade dos produtos é variável dependendo do local de armazenamento
(temperatura, umidade, incidência de luz, entre outros). Entretanto qualquer modificação
no aspecto da solução se faz prudente descartá-la, atentando para as normas de segurança
quanto à eliminação de resíduos.

❖ Objetivos
➢ Conhecer as principais vidrarias utilizadas em um laboratório de Bioquímica;
➢ Entender os princípios do preparo de soluções.

❖ Materiais
➢ Béquer de 100 e 250 mL;
➢ Provetas;
➢ Vidro de relógio.

❖ Reagentes
➢ Cloreto de sódio.

❖ Procedimentos

1 – Preparo de 150 mL de uma solução de cloreto de sódio 0,9%

a) Calcule a massa necessária de NaCl a ser medida na balança analítica;

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 b) Utilize um vidro de relógio para medir a massa de NaCl na balança analítica;
c) Transfira a massa de NaCl para um béquer;
d) Use uma proveta para medir 150mL de água destilada;
e) Transfira a água destilada para o béquer;
f) Coloque uma barra magnética no béquer com água e NaCl e leve o conjunto para
um agitador magnético. Mantenha o sistema em agitação por 2min.

2 - Preparar 100mL de solução NaCl 0,3% por diluição da solução de NaCl 0,9%
preparada anteriormente.
a) Calcule a quantidade da solução de NaCl que deve ser transferida para um balão
volumétrico de 100mL. Utilize uma proveta para realizar a transferência;
b) Complete o volume do balão volumétrico para 100mL.

3 – Finalizando a aula
a) Após o término de todas as atividades, descartar as soluções de NaCl vertendo-as
na pia do laboratório, lavar a vidraria apenas com água da torneira (sem utilizar
detergentes), passar água destilada (ou deionizada) na vidraria e deixá-la sobre o
centro da bancada.

LEMBRETES:

%=M/V*100
Concentração (C) = m/V
Onde:
m = massa do soluto (g)
V = volume da solução (L)
Molaridade (M) = m /mol.v
Onde:
m = massa atômica (g)
Mol = massa molecular (g)
v = volume (L)
Concentração Percentual (sólido em líquido): % equivale a massa de 1 g do soluto em
100 mL de solução.

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Concentração Percentual (líquido em líquido): % equivale a 1 mL do líquido a ser
diluído em 100 mL de solução.
Formula para ajuste de concentração: C.V = C´. V´
Onde:
C = concentração inicial
V = volume inicial
C´ = concentração final
V´ = volume final

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B. AULA PRÁTICA 2 (1ª parte): pH

❖ Objetivos
➢ Definir pH e reconhecer sua importância no sistema biológico;
➢ Transformar concentração de H+ em pH e vice-versa;

❖ Materiais
➢ Tubos de ensaios e suporte;
➢ Pipetas graduadas de 1, 5, e 10 mL;
➢ Conta-gotas.

❖ Reagentes
➢ Ácido clorídrico 0,1M;
➢ Ácido acético 0,1M;
➢ Reativo de Topfer: solução alcoólica de p-dimetilaminoazobenzeno a 5%
(amarelo de metila, vermelho em pH 1,2 e amarelo em pH 4,0);
USAMOS FENOLFTALEÍNA – 5 GOTAS
1- Procedimento experimental
a) A partir de uma solução HCl 0,1M, preparar 10 mL das concentrações abaixo:
0,01 M; 0,001 M; 0,0001 M; 0,00001 M; 0,000001 M (fazer diluições 1 mL/10
mL)
b) No 1º tubo, colocar 10 mL de HCl 0,1 M. Transferir, com o auxílio de pipeta, 1
mL do 1º tubo para o 2º tubo e adicionar 9 mL de água destilada.
c) Realizar este procedimento para os tubos seguintes: retirando 1 mL do tubo
anterior e transferir para o tubo posterior, completando o volume com 9 mL de
água destilada. Desprezar 1 mL do 6º tubo para que todos fiquem com 9mL.
d) Adicionar, a cada tubo, 1 gota do reativo de Topfer e misturar sem inversão.
e) Observar a cor correspondente em cada tubo e conservá-lo para comparação.
f) Calcular o pH aproximado de cada solução.
g) Colocar 9 mL de ácido acético 0,1 M em um tubo de ensaio e adicionar 1 gota de
reativo de Topfer.
h) Determinar o pH comparando-o com o padrão de HCl. Anotar os resultados.

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2- Finalizando a aula
a) Após o término de todas as atividades, descartar as soluções de HCl e ácido
acético dos tubos de ensaio vertendo-as em um frasco determinado pelo professor.
Retornar os tubos de ensaio para a grade e deixá-los na pia do laboratório.
ATENÇÃO: não misture as soluções de HCl e de ácido acético, pois elas serão
neutralizadas separadamente pelo técnico do laboratório para o descarte
adequado.

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 C. AULA PRÁTICA 2 (2ª parte): Solução-tampão

❖ Objetivos
➢ Definir sistema tampão, explicar como funciona e observar seu efeito.

❖ Materiais
➢ Tubos de ensaios e suporte;
➢ Pipetas graduadas de 1, 5, e 10 mL;
➢ Conta-gotas.

❖ Reagentes
➢ Ácido clorídrico 0,1M;
➢ Hidróxido de sódio 0,1M;
➢ Soluções tamponantes de pH: 3, 4, 5, 6, 7, 8 e 9;
➢ Indicador universal.

Tabela I – Exemplos de alguns indicadores de pH

Indicador pKIn Cores e zonas de Ph
Timol azul (ácido) 1,7 vermelho 1,2 – 2,8 amarelo
Amarelo de metila 3,3 vermelho 1,2 – 4,0 amarelo
Laranja de metila 3,5 vermelho 3,1 – 4,4 amarelo
Bromofenol azul 4,0 amarelo 3,1 – 4,7 azul
Bromocresol verde 4,7 amarelo 3,8 – 5,4 azul
Vermelho de metila 5,0 vermelho 4,2 - 6,3 amarelo
Clorofenol 6,0 amarelo 5,1 – 6,7 vermelho
Bromocresol púrpura 6,2 amarelo 5,4 – 7,0 púrpura
Bromotimol azul 7,1 amarelo 6,1 – 7,7 azul
Fenol vermelho 7,8 amarelo 7,0 – 8,6 vermelho
Cresol 8,3 amarelo 7,4 – 9,0 vermelho
Timol azul (alcalino) 8,9 amarelo 8,0 – 9,6 azul
Fenolftaleína 9,7 incolor 8,3 – 10,0 vermelho

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 Se adicionarmos algumas gotas de solução de um dos indicadores mencionados na
tabela I à solução de pH desconhecido, um deles se encontrará em zona de transição
apresentando cor intermediária, tendo-se desta forma, medida aproximada do pH da
solução.

Indicador universal
Mistura de indicadores que apresenta transição em toda escala do pH. É usado para
determinação aproximada do pH.

Indicador universal
Laranja de metila 0,05 g
Vermelho de metila 0,15 g
Azul de bromotimol 0,30 g
Fenolftaleína 0,35 g
Álcool etílico 66% 1L

Tabela II – Coloração do indicador universal em vários valores de pH.

pH Cor pH Cor
3 ou menos Vermelho 8 verde – azulado
4 vermelho – laranja 9 Azul
5 Laranja 10 Violeta
6 Amarelo 11 ou mais Púrpura
7 verde amarelado

Procedimento experimental
a) Em 8 tubos de ensaios colocar 1 mL das seguintes soluções tamponantes: pH 3,
pH 4, pH 5, pH 6, pH 7, pH 8, pH 9 e pH 10. Adicionar, a cada tubo, 5 gotas de
indicador universal e misturar sem inversão. Observar as cores formadas e
comparar estas com as cores indicadas na tabela II. Conservar esta escala para
comparação.
b) Em outros 4 tubos de ensaio, numerá-los de 1 a 4, e colocar 5 gotas de indicador
universal em cada um deles.
c) Aos tubos 1 e 3 adicionar 10 mL de água destilada.

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d) Aos tubos 2 e 4 adicionar 1 mL de tampão pH 7 e 9 mL de água destilada.
e) Acrescentar aos tubos 1 e 2, 2 gotas de NaOH 0,1M e misturar sem inversão.
Observar se há mudança de pH.
f) Soprar o tubo 1 até que não se verifique mais mudança de cor da solução.
Determinar o pH, comparando com a escala e anotar.
g) Soprar o tubo 2 por um tempo mais prolongado. Anotar o que foi observado.
h) Tratar os tubos 3 e 4 com 2 gotas de HCl 0,1M.
i) Continuar a adição de HCl 0,1M ao tubo 4 gota a gota. AGITAR A CADA 5
GOTAS. Determinar quantas gotas de ácido foram acrescentadas até que se
obtenha a mesma cor do tubo 3.

Questões para estudo

1. No procedimento da letra (e), em qual tubo (tubo 1 ou tubo 2) houve maior

variação de pH? Por quê?

2. No procedimento (f), descreva, quimicamente, o que ocorre quando se sopra a

solução. Dê as reações.

3. Quantas gotas de HCl 0,1 M foram adicionadas ao tubo 4 para atingir o mesmo
pH do tubo 3 com 2 gotas de HCl 0,1M? Qual a explicação para essa diferença?

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 D. AULA PRÁTICA 3: Identificação de carboidratos

Objetivos
Executar testes qualitativos em tubos de ensaio para reconhecimento de carboidratos;
Testar os seguintes testes: Molish, Benedict, Seliwanoff e reação de iodo;
Aplicar os testes acima para identificação de carboidratos desconhecidos.

Materiais Reagentes
Tubos de ensaio; Reagente de Molish;
Suporte para tubo; Ácido sulfúrico concentrado;
Pinça de madeira; Reagente Benedict;
Banho-maria; Reagente Seliwanoff;
Pêra de borracha; Solução de iodo – lugol;
Pipeta de 1 mL; Solução desconhecida de carboidratos;
Pipeta de 2 mL; Soluções padrões (glicose, frutose, sacarose e amido).
Conta-gotas.

- Procedimentos
1) Teste de Molish: teste positivo para carboidratos com mais de 5 carbonos.
a) Marcar três tubos de ensaio: “padrão”, “desconhecido” e “água”;
b) Pipetar 1 mL de água no tubo “água”, 1mL de glicose no tubo “padrão” e 1mL
da amostra desconhecida no tubo “desconhecido”;
c) Adicionar 3 gotas do reativo de Molish e agitar;
d) Adicionar 1 mL de ácido sulfúrico concentrado, pelas paredes dos tubos, de modo
que os dois líquidos não se misturem.
e) Observar o aparecimento de um anel roxo no limite de separação dos dois líquidos
correspondente a formação de furfural ou hidroximetil furfural por carboidratos com
mais de 5 carbonos.

2) Teste de Benedict: teste positivo para açúcares redutores.

a) Marcar três tubos de ensaio: “padrão”, “desconhecido” e “água”;
b) Pipetar 1 mL de reativo de Benedict em cada tubo;
c) Adicionar 0,5 mL de água no tubo “água”, 0,5mL de glicose no tubo “padrão” e
0,5mL da amostra desconhecida no tubo “desconhecido”;
d) Ferver por aproximadamente 5min no banho-maria em 100oC;
e) Observar o resultado, notando a cor e o precipitado que se formam.

3) Teste de Seliwanoff: teste positivo para cetoses

a) Marcar três tubos de ensaio: “padrão”, “desconhecido” e “água”;
b) Adicionar 1, 0 mL de reativo de Seliwanoff em cada tubo;
c) Adicionar 0,5 mL de água no tubo “água”, 0,5mL de frutose no tubo “padrão” e
0,5mL da amostra desconhecida no tubo “desconhecido”;
d) Ferver por aproximadamente 5min no banho-maria em 100oC. Observar os tubos
assim que eles forem posicionados no banho-maria. O aparecimento imediato de
cor vermelha indica teste positivo para cetoses.

4) Teste de iodo: identificação do amido.

a) Marcar três tubos de ensaio: “padrão”, “desconhecido” e “água”;
b) Pipetar 2 mL de água no tubo “água”, 2mL da solução de amido no tubo “padrão” e
2 mL da amostra desconhecida no tubo “desconhecido”.

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 c) Adicionar 2 gotas de solução de iodo. Notar o aparecimento de cor azul no
“padrão”.

5) Finalizando a aula:
a) Após o término de todas as atividades, descartar as soluções presentes nos tubos de
ensaio vertendo-as em um frasco determinado pelo professor. Retornar os tubos de
ensaio para a grade e deixá-los na pia do laboratório.
b) ATENÇÃO: tenha muito cuidado da hora de realizar o descarte. Utilize luvas.
c) São quatro frascos para descarte: um para o teste de Molish, outro para o teste de
Seliwanoff, outro para o teste de Benedict e outro para o teste do iodo.

17
 E. AULA PRÁTICA 4: Propriedades de lipídeos e saponificação de
triacilgliceróis

❖ Introdução:
Os lipídeos possuem inúmeras funções, tais como: reservas de energia,
componente das membranas biológicas, isolamento e proteção de órgãos. São
moléculas insolúveis em água, que tendem a se agregar. Segue abaixo algumas
características dos lipídeos:
1) Gorduras naturais: 98 a 99% de TAGs (ácidos graxos e glicerol), restante MAg,
AGs
2) Propriedades físicas: proporção e estrutura química de seus ácidos graxos
3) Mistura de TAGs: formados por AGs insaturados (compõem os óleos líquidos em
TA)
4) Ácido graxo insaturado presente em óleos de soja (C18:2) – ácido linoléico (uma
dupla entre carbonos 9 e 10; uma dupla entre os carbonos 12 e 13) C18:2 (9,12).
Pertencente à família ômega 6;
5) Gorduras sólidas em TA são uma mistura de TAGs com ácidos graxos saturados

Reação de saponificação
TAG (apolares e insolúveis em H2O) hidrolisado na presença de uma base, ocorre
a formação de sais de ácidos graxos ou sabões.
NAOH (base forte - é base cuja constante de dissociação é elevada, aumentando
com maior intensidade a concentração de OH- quando adicionada a uma solução aquosa).

etanol

Figura 01: Esquema geral da reação de saponificação entre uma molécula de

triacilglicerol reagindo com 3 moléculas de NAOH, tendo como catalisador da reação
etanol e aquecimento, levando a produção de sabão de sódio e glicerol.

18
❖ Objetivos:
➢ Geral
Ao final da prática os estudantes deverão ser capazes de obter o sabão através da
reação de saponificação, entre um ácido graxo (glicerídeo) e uma base forte (NaOH).
➢ Específicos
a) Caracterizar os TAGs quanto a solubilidade;
b) Explicar a reação de saponificação a partir de TAGs;
c) Obter sabão a partir de AGs livres;
d) Observar como ocorre a reação do glicerídeo com hidróxido de sódio, e analisar
o que é necessário para que a reação ocorra, tanto em termos de materiais como
de ações. Analisar os produtos formados e a importância desta reação para a
indústria.

❖ Materiais:
➢ 2 Tubos de ensaio;
➢ Grade para tubos de ensaio
➢ Tela de amianto;
➢ Tripé de ferro;
➢ Pipetas de vidro de 5 mL, 10 mL;
➢ Pêra de borracha;
➢ Bastão de vidro;
➢ Béquer

❖ Reagentes:
➢ Óleo vegetal de soja:
➢ Hidróxido de sódio;
➢ Álcool etílico (age como solvente);

❖ Procedimentos:
1) Colocar em três tubos de ensaios limpos e secos:
o Tubo 1: 0,5mL de ácido acético
o Tubo 2: 0,5mL de ácido oléico
o Tubo 3: pequenos fragmentos de ácido esteárico (cerca de 0,05g)

19
 o Verificar o cheiro e o aspecto físico de cada um e anotar as observações.

2) Adicionar a cada tubo 2,0 mL de água destilada. Agitar os três e observar.

Anote as observações.

3) Aquecer separadamente os tubos do item (1). Observar o cheiro e colocar na

extremidade do tubo um pedaço de papel de azul de tornassol. Anotar as
observações.

4) Pipetar 2mL de solução de hidróxido de sódio 1M em etanol 95% nos três

tubos e deixar no aquecimento por cerca de 10min. Ao final, colocar os tubos
em banho de gelo. Observe o resultado e anote as observações.

5) Finalizando a aula:
a. Após o término de todas as atividades, descartar as soluções presentes
nos tubos de ensaio vertendo-as em um frasco determinado pelo
professor. Nos tubos contendo ácido graxo ou sabão solidificado,
utilizar uma escova de tubo para facilitar a remoção. Retornar os tubos
de ensaio para a grade e deixá-los na pia do laboratório.

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 F. AULA PRÁTICA 5: Pipetagem Automática

❖ Introdução
As pipetas automáticas foram inventadas na década de 1940 por George Riggs. O
invento pretendia ser uma alternativa às pipetas graduadas de vidro, utilizadas pelos
inspetores de leite para recolher amostras visando avaliar a presença de bactérias. A pipeta
automática facilitaria o trabalho e preveniria a contaminação dos inspetores, pois
dispensava a sucção do líquido com a boca (http://labiq.iq.usp.br).
Atualmente as pipetas automáticas são amplamente utilizadas, principalmente em
laboratórios de Biologia Molecular, Microbiologia e Bioquímica. Elas são capazes de
transferir pequenos volumes (entre 0,25 µL – 5000 µL) com alta reprodutibilidade e
exatidão. Cada pipeta apresenta uma faixa de volume ajustável, e é conhecida pelo
volume máximo que pode dispensar. Por exemplo, a P1000 é capaz de dispensar volumes
de 200 µL a 1000 µL (1 mL) (http://labiq.iq.usp.br).
A lista abaixo relaciona as pipetas e os volumes que são capazes de dispensar com
exatidão e precisão.
Modelo Volume recomendado (µL) Volume mínimo (µL)
P-2 0,1 a 2 0,002
P-10 0,5 a 10 0,02
P-20 2 a 20 0,02
P-100 10 a 100 0,2
P-200 50 a 200 0,2
P-1000 100 a 1000 2,0
P-5000 500 a 5000 2,0

Princípio da técnica

A pipeta automática é um aparato composto de uma parte fixa, contendo todos os

dispositivos para seu funcionamento, à qual se adapta uma ponteira removível (tip),
normalmente de plástico. A parte fixa apresenta um pistão de aço inoxidável capaz de
mover-se dentro de um cilindro. O movimento apropriado cria vácuo, fazendo com que o
líquido em contato com a ponteira seja aspirado para dentro do cilindro, ocupando o
volume antes ocupado pelo ar (http://labiq.iq.usp.br).

21
 A alta exatidão indica que as pipetas automáticas dispensam volumes bastante
aproximados do volume indicado no equipamento. A precisão está relacionada à
reprodutibilidade de mensurações individuais de um mesmo volume, e também pode ser
expressa como um desvio padrão (http://labiq.iq.usp.br).
A tabela abaixo mostra alguns exemplos de exatidão e precisão de pipetas.
Pipeta Volume (µL) Exatidão absoluta (µL) Precisão absoluta (µL)
2 0,1 0,04
P-20 10 0,1 0,05
20 0,2 0,06
50 0,5 0,2
P-200 100 0,8 0,25
200 1,6 0,3
100 3 0.6
P-1000 500 4 1
1000 8 1,3

Objetivos

➢ Treinar qualitativamente o manuseio de pipetas automáticas

Materiais

➢ Pipeta monocanal
➢ Frasco de descarte de ponteiras
➢ Béquer
➢ Relógio de vidro

Reagentes

➢ Água destilada
➢ Óleo vegetal

Procedimento

Para a obtenção de resultados corretos é necessário selecionar a pipeta certa. O

volume a ser transferido deve estar dentro da faixa de volume recomendada para a pipeta.

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Por exemplo, para transferir 2,48 µL, a pipeta mais adequada é a P-10, já que este volume
está dentro da faixa de precisão para esta pipeta. Uma P-2 não seria adequada, pois o
volume ultrapassa o máximo para a pipeta (2,00 µL). Uma P-20 (volumes entre 2 - 20
µL) também não seria adequada devido ao volume estar muito próximo do mínimo
permitido pela pipeta. O uso de pipetas automáticas fora de suas respectivas faixas de
precisão resulta em erros nos volumes medidos e na perda de regulagem da pipeta.
Selecionada a pipeta adequada, é necessário ajustar o volume de interesse. Para isso,
pegue a pipeta com uma das mãos e gire o botão de ajuste com a outra mão até chegar ao
volume desejado. Existe um anel no meio do botão que bloqueia o volume. Para o ajuste
fino do volume é necessário girar o botão 1/3 acima do volume desejado e voltar
lentamente para a configuração exata. Isso aumenta a precisão da medida.
O visor digital indicador de volume geralmente tem três dígitos e é lido na direção do
botão de pipetagem para a base (onde se encaixa a ponteira). Os três dígitos indicam o
volume em microlitros e podem ser coloridos em preto ou vermelho. Se houver esta
distinção de cores, os dígitos pretos indicam volumes inteiros e os vermelhos, indicam
frações. Os algarismos significativos variam de pipeta para pipeta e são, via de regra,
0,05% do volume máximo da pipeta. Por exemplo, a P-20 chega a 0,01µL e a P-200 a 0,1
µL.
Depois de ajustado o volume, coloque a ponteira na pipeta de forma que fique
bem presa. Aperte o botão de pipetagem até sentir o primeiro ponto de resistência. Leve
a pipeta com o botão apertado até o recipiente contendo o líquido a ser transferido. Com
a pipeta na posição vertical, faça a ponteira imergir de 1 a 6 mm abaixo da superfície do
líquido (1 mm para P-2; 4 mm para P-1000 e 6 mm para P-5000). Para fazer o líquido
subir na ponteira, volte lentamente o botão para a posição inicial. Espere alguns segundo
até que o líquido ocupe todo o volume. Retire a ponteira do líquido. Se ficarem algumas
gotas do lado de fora da ponteira, passe cuidadosamente um papel no entorno sem
encostar na abertura da ponteira.
Para dispensar o líquido, aperte novamente o botão até sentir a primeira
resistência. Espere alguns segundo e depois aperte até sentir a segunda resistência. Isso
permite dispensar o restante do líquido.
Para retirar a pipeta do recipiente, mantenha o botão apertado no segundo ajuste e
deslize cuidadosamente a ponta da ponteira pela parede do recipiente. Volte o botão para
a posição inicial lentamente. Para descartar a ponteira, aperte o botão ao lado do botão de
pipetagem.

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 A manipulação de líquidos viscosos utilizando pipetas automáticas pode ser
difícil, uma vez que a viscosidade limita a velocidade com que o liquido é aspirado. Para
estas aplicações, são recomendadas pipetas específicas para líquidos viscosos.

Calibração

Geralmente as pipetas são calibradas utilizando água. Para líquidos com

densidades muito diferentes da água, os volumes transferidos são incorretos. Para
contornar este problema é possível ajustar o volume para mais (densidades muito
maiores) ou para menos (densidades muito menores). No entanto, este ajuste deve ser
determinado empiricamente, utilizando-se valores de densidade e massa (lembre-se que
volume = massa/densidade).
Nunca coloque a pipeta na posição horizontal se a ponteira estiver cheia de
líquido. Isso pode causar a entrada de líquido no sistema de pistões, o que irá danificar a
pipeta.
Caso soluções corrosivas sejam transferidas é recomendado que, após o uso, a
pipeta seja desmontada para avaliação das peças e para limpeza, se necessário. O
desmonte e descontaminação também são recomendados após o uso com substâncias
tóxicas e/ou carcinogênicas.
Evite a formação de bolhas quando aspirar o líquido. Isso reduz a precisão das
medidas. Caso ocorra a formação de bolhas, dispense o líquido no frasco original, e faça
subir o líquido novamente de forma lenta. Caso volte a formar bolhas, dispense o líquido
no frasco original e troque a ponteira. O uso de ponteiras siliconizadas também pode
evitar a formação de bolhas em casos em que estas sejam recorrentes, como na pipetagem
de soluções de ácidos nucleicos.

Etapa 01: Realizar a pipetagem de água destilada dos seguintes volumes:

1000 uL; 800 uL; 550 uL; 237 uL; 133 uL; 66 uL e verificar em balança analítica a
calibração das pipetas.
Etapa 02: Aprender a pipetar substâncias oleosas.
Pipetagem de 500 uL óleo vegetal

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