BIOQUÍMICA CLÍNICA

5ª Aula Teórica
19-03-20

Enzimologia Clínica

ENZIMOLOGIA CLÍNICA

Princípios gerais e enzimas relevantes no

diagnóstico e na terapêutica da doença humana.

A Enzimología Clínica é a aplicação do conhecimento das

enzimas (proteínas especializadas na catálise de reacções
orgânicas) ao diagnóstico, tratamento e prognóstico da doença.

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 Enzimas:

• São proteínas com actividade catalítica, consideradas as unidades

funcionais e reguladoras do metabolismo celular.

• Podem ser classificadas segundo a IUB em 6 grandes classes, e

possuem um número de dígitos que as identifica quanto à sua
função e reacção catalisada, denominado E.C. (Enzyme
Commission ).
• Nome sistemático (natureza da reacção catalisada)
• Nome trivial (nome simplificado)
• Abreviaturas

Classificação das Enzimas:

Sufixo “_ase”
Ex: urease
glucose oxidase
glucose-6-fosfatase

Classificação Sistemática
E.C. + 4 algarismos:
classe principal (1 – 6)
subclasse Fosfotransf.
ATP + glucose " ADP + glucose 6-fosfato
sub-subclasse (OH)
Enzima: ATP-glucose fosfotransferase (hexocinase)
nº de série (gluc)
E.C. 2.7.1.1
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 Nomenclatura das Enzimas:

Nome sistemático Nome trivial Abreviaturas

ATP-creatina N-fosfotransferase Creatina Cinase CK
L-Aspartato:2-oxoglutarato aspartato AST
aminotransferase aminotransferase
(transaminase)
L-Alanina:2-oxoglutarato alanina aminotransferase ALT
aminotransferase (transaminase)
(5-glutamil)péptido:aminoácido 5- γ-glutamiltransferase GGT
glutamiltransferase

ortofosfórico monoéster fosfo- fosfatase alcalina ALP

hidrolase (alcalina)
ortofosfórico monoéster fosfo- fosfatase ácida ACP
hidrolase (ácida)

Distribuição das Enzimas:

• Intracelular: Alta concentração de enzimas, com alto grau de

compartimentalização. Por exemplo, enzimas da Cadeia Glicolítica no
citosol; enzimas do Ciclo de Krebs na matriz mitocondrial.

• Extracelular: Baixa concentração de enzimas são poucas as

enzimas com actividade plasmática, como por exemplo as da cascata
da coagulação, e a lipoproteína-lipase.

• Esta situação gera um alto GRADIENTE DE CONCENTRAÇÃO

entre os meios intra e extracelular, com tendência para as enzimas
saírem da célula; isto não acontece porque a membrana celular é
altamente selectiva, e praticamente impermeável às macromoléculas.

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 Enzimologia Clínica:

• Baseia-se num único e simples princípio:

Existe uma baixa atividade enzimática no soro.
Em situações patológicas em que ocorre lesão de tecido com aumento da
permeabilidade ou mesmo morte celular, há libertação do conteúdo celular
para a corrente sanguínea, dando
ALTERAÇÕES DE ACTIVIDADE ENZIMÁTICA no sangue
DIAGNÓSTICO!

• Após a libertação das enzimas para o sangue, ocorre uma queda gradual
de sua actividade, causada pela destruição da molécula proteica por
proteólise.

• Valores normais no soro, são resultantes da degradação das enzimas

intracelulares e sua remoção do plasma pelo rim.
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Factores que afectam os valores de enzimas

no plasma ou soro:
O valor das enzimas no soro resulta do balanço entre a velocidade da sua entrada em
circulação a partir das células originais e a velocidade da sua inativação ou remoção
(Turnover).

1 - Entrada das enzimas para o sangue

• Saída da célula
Integridade da membrana celular; morte celular; ataque por vírus ou químicos orgânicos (fígado);
redução da oxigenação celular (enfarte do miocárdio), infecções, inflamações, drogas, álcool (tecido
hepático e muscular)

• Produção celular alterada

Há valores normais no plasma, resultantes do turnover normal.
Decréscimo: Síntese diminuída deficiências genéticas ou alteração patológica.

Aumentos: podem significar doença ou podem ser causados por fisiologia normal
(ALP – osteoblastos –crescimento ou patologia óssea; - placenta – gravidez).
Indução enzimática (gamaGT por uso de barbitúricos ou álcool).
8
Factores que afectam os valores de enzimas
no plasma ou soro:

2 - Clearance das enzimas

Devido ao seu tamanho, a excreção urinária não é a principal via de

eliminação das enzimas da circulação

(exceção: amilase sérica aumentada - excreção aumentada (amilasúria)).

t1/2 no plasma varia, com valor médio de 6 a 48h.

Valor diagnóstico das enzimas no plasma:

• Apesar de serem raras as enzimas exclusivas de um tecido, a

alteração da concentração sérica de uma determinada
enzima orienta sobre os tecidos mais provavelmente afectados.

• Além disso, muitas enzimas têm diferentes formas moleculares

(isoenzimas) características de diferentes tecidos.

• A análise da isoenzima cuja concentração sérica se encontra

alterada dá frequentemente informação sobre as causas da
alteração.

10
 Distribuição de Enzimas Órgão-específica:
Há, para certas enzimas, diferenças
marcantes de actividade entre
diferentes tecidos e órgãos.
AST
Por exemplo:

• Alanina-transaminase (ALT):
Existe principalmente no Fígado

ALT
• Creatina-cinase (CK): Existe
principalmente no Músculo.

• Lactato-desidrogenase (LDH):
Tem ampla distribuição entre tecidos
- baixa especificidade.
CK
• Fosfatase Alcalina (ALP): Tem
ampla distribuição – fígado, osso,
intestino, placenta, rim

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Enzimas com valor diagnóstico:

• As enzimas intracelulares aparecem aumentadas no sangue quando há

lesão celular.

ALT Lesão hepatocelular

AST Lesão hepatocelular ou muscular (enfarte do miocárdio)
CK Lesão muscular e enfarte do miocárdio agudo
GGT Lesão hepatocelular (não específica)
Lipase Lesão pancreática (pancreatite aguda)
Amilase Lesão pancreática
ALP Lesão hepática colestática; lesão óssea

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 Enzimas com Valor Diagnóstico:
• Frequentemente a informação desejada obtém-se avaliando duas
ou mais enzimas séricas.
(ex. uma elevação da γGT indicará, com grande probabilidade, colestase,
se aparecer aumentada a ALP)

• O tipo de alteração observada também proporciona grande

informação:
– O mais frequente é encontrar elevações devidas a aumento da
permeabilidade celular e dano tecidular.

– É possível detectar diminuições devidas a doenças crónicas

que originam disfunção celular.

– O grau de alteração da função catalítica pode ser indicativo de

determinadas alterações
(ex: as transaminases séricas aparecem mais aumentadas em caso de
hepatites agudas do que em hepatites crónicas)
13

Enzimas com Valor Diagnóstico:

14
 Isoenzimas:
• São enzimas com funções idênticas mas que possuem pequenas
diferenças estruturais formas moleculares diferentes mas mesma
função catalítica.

• São reconhecidas imunologicamente e identificáveis através de sua

decomposição em sub-unidades.

• Diferentes isoenzimas podem ser provenientes de tecidos diferentes a

sua detecção específica pode indicar o tecido afectado.

• Por exemplo:
ALP: 5 isoenzimas: osso; fígado; placenta; intestino; rim.
LDH: 5 isoenzimas: LD1, LD2, LD3, LD4, LD5 (coração, rim, GV;
fígado, músculo esquelético).
CK: 3 isoenzimas: MM (CK3) específica para músculo esquelético;
MB (CK2) mais específica para coração; BB (CK1) específica para
tec. nervoso.

• As isoenzimas podem ser detectadas isoladamente em alguns casos, o que

aumenta muito a sua especificidade utilidade no diagnóstico de certas
doenças. 15

Análise de Isoenzimas:
Isoenzimas podem diferir

propriedades fisico-químicas
tamanho, carga,
termoestabilidade
Km e especificidade para o substrato
capacidade de ser reconhecidas por agentes específicos
imunoreactividade

• base dos ensaios que permitem diferenciar isoenzimas:

• Diferenças de carga electroforese ou cromatografia troca-iónica.

• Diferença de termoestabilidade inactivação selectiva.
• Diferente capacidade de cada isoenzima para fixar inibidores.
• Possuir um substrato específico.
• Diferenças imunológicas anticorpos.

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 Determinação da Actividade Enzimática:

• A concentração de enzimas no soro é muito baixa. Contudo, dada a

sua elevada capacidade catalítica, é possível determinar a sua
actividade e pressupor que esta é proporcional à sua concentração.

• O estudo das enzimas no laboratório baseia-se na demonstração “in

vitro” da actividade catalítica.

E + S → ES → E + P

• Pode-se determinar a actividade enzimática analisando:

– O aparecimento de algum produto
– O desaparecimento do substrato
– A variação de um cofactor ou de algum componente da reacção

• –Δ[S ] ou +Δ[P] por unidade de tempo, em condições exactamente definidas

(pH, temp.) e estritamente controladas.

17

Determinação da Actividade Enzimática:

- CINÉTICA ENZIMÁTICA:

• Importante na avaliação de métodos!

Factores que afectam a Vo:

Vo
1 – [E]
V = dP/dt 2 - [S]
3 – pH
4 – Temp.
5 – Activadores ou Inibidores

Tempo

18
 Determinação da Actividade Enzimática:
Determinação de vo = (d[P]/dt)0 Vo

Reacção atingiu o Equilíbrio

[P]

v4
v3
v2
v1

tempo

] Equação de Michaelis-Menten

[S]>>>> Km à V = k [E] Vmáx [S]

V=
• as reações enzimáticas estão standardizadas,
[S] + K M
sendo a conc de enzima o único factor que
influencia a vel da reação. 19

Determinação da Actividade Enzimática:

Determinação de vo = (d[P]/dt)0

Reacção atingiu o Equilíbrio

[P]
[E4]
v4 [E3]
v3
v2
[E2]
v1
[E1]

tempo

[S]>>>> Km V = k[E]
• pH e temp. óptimos
• - Inibidores e activadores -> Podem estar presentes na amostra
Sais, ADP, etc. (diluição do soro)
20
 Determinação da Actividade Enzimática:

Conclusão

• A fase linear da reacção corresponde à formação de produto a uma velocidade

constante, sendo a concentração de enzima da amostra o único factor limitante
– Vo ou velocidade inicial da reacção.

• À medida que a reacção vai decorrendo, chega um momento em que o substrato se

vai esgotando e a velocidade da reacção diminui até se anular.

• Para que uma determinação enzimática seja válida, é necessário realizá-la na fase
linear (Vo) onde o único factor limitante é a concentração da própria enzima e as
condições da reacção se mantêm óptimas (excesso de substrato e outros
reagentes). Para isso, deve-se trabalhar com uma concentração de substrato 10 xs
superior ao Km.

21

Métodos de Análise:

Métodos analíticos para determinar a actividade enzimática (ΔA/min):

1) Reacção a tempo fixo

2) Monitorização contínua

1) Reacção a tempo fixo:

Mede a actividade de uma enzima baseado apenas nos pontos inicial e
final da reacção. Não se considera o que acontece durante a reacção. É
menos preciso.
Ex.: Determinação da actividade da Amilase Sérica pelo método do Iodo.

2) Monitorização contínua:
Considera a reacção enzimática em vários pontos, sendo portanto muito
mais preciso e sensível.
Ex.: Todos os métodos em U.V. (340 nm).

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 Determinação da Actividade Enzimática:

Optimização (eliminação de lag phases e prolongamento da linearidade):

• Selecção cuidadosa das condições da reacção ([S], [cofactor])
• Métodos cinéticos mais vantajosos para identificar a linearidade 23

Determinação da Actividade Enzimática:

- UNIDADES:
• Unidade catalítica internacional (U ou U.I.): Corresponde à
quantidade de enzima que catalisa a conversão de 1 μmol de
substrato por minuto, em condições óptimas específicas para cada
enzima. Na prática, utilizamos a unidade U/L, ou mU/L.

• O Katal (Kat): Unidade expressa em mol/segundo, e corresponde à

actividade catalítica necessária para, em condições pré-definidas,
transformar 1 mol de substrato por segundo de reacção.

• Concentração de enzima : Kat/L

1 U = 10-6 mol/60 s = 16.7 x 10-9 mol/s
1 nKat/L = 0.06 U/L

24
 Como se obtém o valor de actividade
enzimática?
Ensaios espectrofotométricos,
– evolução de algum dos elementos que participam na reacção e que devem absorver luz
a um determinado λ.
• o aparecimento do produto medindo o aumento de absorvência a esse λ .
• o desaparecimento do substrato medindo a diminuição de absorvência a esse λ .
• variação de um cofactor ou de algum componente da reacção.

• ALP: p-nitrofenil fosfato → p-nitrofenol

Cor amarela; Absorvência a 410 nm.

• Aparecimento ou Desaparecimento de NADH ou de NADPH

as formas reduzidas absorvem a 340 nm enquanto que as formas oxidadas
absorvem noutro λ.
NAD+ → NADH
NADP+ → NADPH → → Aumenta a absorvência a 340nm
NADH → NAD+
NADPH → NADP+ → → Diminui a absorvência a 340nm
25

Determinação da Actividade Enzimática:

• LDH: Piruvato + NADH+H+ → Lactato + NAD+

Há uma DIMINUIÇÃO na Absorvência a 340 nm

Quando nenhum dos elementos que participam directamente na reacção absorve

luz, é necessário acoplar uma segunda reacção na qual algum dos produtos ou
substratos absorva luz. Analisando esta segunda reacção, poderemos avaliar a
actividade enzimática da primeira.

• AST: Asp. + α KG → Glutamato + Oxaloac.

Oxaloac. + NADH+H+ → Malato + NAD+
Há uma DIMINUIÇÃO na abs. a 340 nm

• CK: Creat.-P + ADP → Creat. + ATP

ATP + Glu → ADP + Glu-6-P
Glu-6-P + NADPH2 → Gluconato-6-P + NADP+
Há uma DIMINUIÇÃO na Abs. a 340 nm

Em qualquer destes sistemas, podemos:

• analisar como evolui a absorvência (a reacção) ao longo do tempo
• obter um valor de ΔA/min
26
 Cálculo dos Resultados:
- Na análise cinética:
VARIAÇÃO da absorvência do sistema de reacção em intervalos de
tempo pré-determinados ΔAbs, que é proporcional à velocidade da
reacção.
Para obter o valor definitivo da actividade enzimática (AE) em U/L aplicamos a
seguinte fórmula
DDO 1000 V f
AE (UI / L) = x x
min e .b Vi
Onde:
· ε a absortividade molar do composto cuja absorvência estamos a medir no
espectrofotómetro
· b é a espessura da cuvete (1 cm)
· VF é o volume total da reacção
· VI é o volume da amostra no ensaio
Para um determinado ensaio todos os parâmetros que aparecem a vermelho
são constantes, por isso a fórmula anterior fica:
UI/L=ΔA/min · constante
(factor cinético, fornecido com a bula dos kits comerciais) 27

Indicações práticas:
Colheita do Material :
• Principal: Evitar a destruição de elementos figurados do sangue, pois pode haver
libertação de certas enzimas que interfeririam no resultado. Ex: LDH, AST, ALT,
Fosf. Ácida são enzimas encontradas nos eritrócitos, leucócitos e plaquetas.
– Evitar amostras hemolisadas!
• Não utilizar amostras que tenham sido congeladas e descongeladas várias vezes.
• Separação imediata do soro após a colheita.
• Evitar a estase venosa prolongada durante a colheita.

Conservação da Amostra:
• De preferência à temp. ambiente ou refrigerada à 4ºC. Evita-se o congelamento.
- O ideal é o ensaio no dia da colheita!

Causas de Erro:
• - Principal: Consumo excessivo de substrato, no caso de actividades séricas muito
altas para certas enzimas.
- Outras: Erro no pH, contaminação microbiana dos reagentes, temperatura diferente
da ideal, etc.

28
 Enzimas como Reagentes

Também é frequente utilizar enzimas para a determinação de

substratos por métodos enzimáticos.

Vantagens:

• Especificidade para o Substrato a ser quantificado (ex: uricase,

urease, glucose oxidase)

• Reacções acopladas como sistema analítico (det. da glucose pelo

mét. da hexocinase)

• Métodos de equilíbrio e Métodos cinéticos.

29

Determinação enzimática de substratos:

Ex:
Método da GOD/POD ou método da hexocinase para determinar a
concentração de glucose de uma amostra

Mét. da Glucose Oxidase Mét. da Hexocinase

30
 Determinação enzimática de substratos:

Métodos “end point” ou métodos de equilíbrio

São os mais usados.
A reacção ocorre até ao esgotamento do substrato que é convertido no produto.
A reacção cessa quando o equilíbrio é atingido.

Vantagens:
Não são sensíveis a pequenas alterações nas condições da reacção (pequenas variações
de [E], pH e temp. não interferem).
Inconvenientes:
Necessitam de quantidades apreciáveis de enzima (evitar períodos de incubação muito
longos).
À medida que [S] diminui, a velocidade da reacção passa a depender também do Km. São
preferíveis enzimas com baixos Km para a afinidade ser maior.

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Determinação enzimática de substratos:

Métodos Cinéticos
Mede-se a variação de concentração produzida num curto intervalo de tempo,
reduzindo a quantidade de enzima-reagente necessária.
Numa reacção de 1ª ordem, V=K[S].
Podem ser usados dois tempos definidos aos quais se mede a concentração
formada Métodos Cinéticos de Dois Pontos.

Vantagens e Inconvenientes:
São os métodos mais precisos.
As condições da reacção (pH, temp. e [S]) devem ser mantidas rigorosamente constantes
no decurso da reacção. Analisadores automáticos
Solução referência do analito (substrato) – Calibrador

Deve-se manter a reacção de 1ª ordem ([S] baixa, < (0.2xKm)). São preferíveis E com
elevados Km para permitir valores maiores de [S].
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 Valor Semiológico da determinação de Enzimas

A determinação da actividade enzimática permite auxiliar o diagnóstico

clínico em doenças:

• Cardíacas: AST, LDH(LD1), CK(CK-MB)

• Hepáticas:
Lesão hepatocelular: ALT,AST LDH(LD5)
Colestase e lesão hepatobiliar: ALP, GGT
• Musculo-esqueléticas: CK (CK-MM), AST
• Ósseas: ALP
• Pancreáticas: Lipase, amilase, isoenzima pancreática
• Glândulas salivares: amilase, isoenzima salivar
• Tumorais: ACP – carcinoma próstata, ósseo (metástases)
ALP – carcinoma pâncreas, ducto biliar, fígado (metástases)
LDH – leucemia, linfoma, fígado (metástases)

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Valor Semiológico da determinação de Enzimas

Alanina aminotransferase (ALT)

Muito aumentada:
necrose celular hepática
trauma extenso do músculo esquelético
miosite
miocardite
Aumentada:
cirrose
icterícia obstrutiva
enfarte do miocárdio
distrofias
miopatias
alguns tumores hepáticos
doenças hemolíticas

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Valor Semiológico da determinação de Enzimas

Aspartato aminotransferase (AST)

Muito aumentada:
- hepatites (formas fulminantes, sobretudo virais)

Aumentada:
- necrose celular hepática
- icterícia obstrutiva e colestática
- hepatite crónica
- hepatite medicamentosa
- hepatite alcoólica
- necrose ou trauma cardíaco
- necrose ou trauma do músculo esquelético
- enfarte agudo do miocárdio
- cirrose

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Valor Semiológico da determinação de Enzimas

Desidrogenase láctica (LDH)

Muito aumentada:
- anemia megaloblástica
- carcinomatose Aumentada:
- hepatite viral - qualquer lesão celular com
- hipoxia Citólise
- hipertermia - enfarte miocárdio ou pulmonar
- leucemias
Moderadamente aumentada: - anemias hemolíticas
- cirrose - hepatites (não virais)
- icterícia obstrutiva - linfomas
- doença renal - drepanocitose
- síndromes musculo-esqueléticos
- tumores
- falha cardíaca congestiva
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Valor Semiológico da determinação de Enzimas
Creatina Cinase (CK)

Diminuida:
- massa muscular reduzida
- sedentarismo

Aumentada:
- trauma - síndrome de Reye
- cirurgia - intoxicação com coma
- enfarte do miocárdio - hiperexia maligna
- miopatias - hipotermia prolongada
- poliomiosite - hipotiroidismo
- dermatomiosite - doenças infecciosas (tifóide)
- miocardite - arritmias
- alcoolismo - falha cardíaca congestiva
- miopatia de Duchenne - taquicardia
- tétano - convulsões generalizadas
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Valor Semiológico da determinação de Enzimas

γ-glutamiltransferase (GGT)

Muito aumentada:
- colestase hepática

Aumentada:
- doença hepática com cirrose
- hepatite
- tumor (lesão hepática que ocupa espaço)
- mononucleose infecciosa

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 Valor Semiológico da determinação de Enzimas

Fosfatase Alcalina (ALP)

Aumentada:
- metabolismo ósseo acelerado - doença hepática
- fractura - Mononucleose inf.
- hiperparatiroidismo primário ou secundário - Obstrução biliar
- osteomalácea - icterícia hepatobiliar
- doença renal - abcessos hepáticos
- raquitismo associado a deficiência em vit. D - cirrose portal
- doença óssea - outras
- carcinoma com metástases ósseas - sepsis
- sarcoma osteogénico - colite ulcerativa
- mieloma - enterite regional
- doença de Hodgkin, Paget, Gaucher - tirotoxicose

Diminuida:
- hipotiroidismo - acondroplasia - cretinismo - diminuição do fósforo 39

Valor Semiológico da determinação de Enzimas

Lipase

Muito aumentada:
- pancreatite, de qualquer causa

Aumentada:
- cólica biliar
- cálculo
- enfarte ou estrangulação intestinal
- quistos pancreáticos
- peritonite

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Valor Semiológico da determinação de Enzimas

Amilase

Muito aumentada:
- pancreatite

Aumentada:
- parotite
- enfarte ou obstrução intestinal
- gravidez ectópica
- doenças do tracto biliar em geral
- cetoacidose diabética
- quistos pancreáticos
- peritonite
- alguns tumores do pulmão e ovário

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