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UNIVERSIDADE FEDERAL DOS VALES DO JETIQUINHONHA E MUCURI - UFVJM

INSTITUTO DE CIÊNCIA E TECNOLOGIA - ICT


APOSTILA DE ENGENHARIA BIOQUÍMICA - CTD 335
Sumário

1 Introdução ................................................................................................................................ 5

1.1 Definição de engenharia bioquímica ................................................................................. 5

1.2 Histórico e evolução.......................................................................................................... 5

2 Agitação e aeração .................................................................................................................. 8

2.1 Transporte molecular de oxigênio ..................................................................................... 8

2.1.1 A dissolução de o2 (teoria dos dois filmes) ................................................................. 8

2.1.2 Transferência de o2 e respiração ............................................................................. 10

2.1.3 Métodos de medição de kLa .................................................................................... 11

2.1.4 Respiração microbiana ............................................................................................ 15

2.2 Agitação mecânica ......................................................................................................... 17

2.2.1 Agitação sem aeração ............................................................................................. 17

2.2.2 Agitação com aeração ............................................................................................. 22

2.2.3 Transferência de massa em sistemas agitados e aerados ....................................... 24

3 Ampliação de escala .............................................................................................................. 29

3.1 Critérios para ampliação de escala ................................................................................. 29

3.1.1 Medida de kLa como critério de ampliação .............................................................. 30

3.1.2 Método de pg/v constante ........................................................................................ 31

3.1.3 Método baseado na velocidade terminal constante ................................................. 36

3.1.4 Método baseado no tempo de mistura ..................................................................... 37

3.1.5 Método baseado no kLa constante .......................................................................... 38

3.1.6 Método baseado na transferência de momento ....................................................... 41

3.1.7 Método baseado em relações geometricamente não similares ................................ 41

3.1.8 Outras considerações .............................................................................................. 42

3.1.9 Escolha do procedimento de scale-up ..................................................................... 42

4 Estequiometria da reação de crescimento microbiano ........................................................... 43

4.1 Equação estequiométrica geral....................................................................................... 43

2
4.1.1 Demanda de o2 e nitrogênio .................................................................................... 44

4.1.2 Caracterização do substrato .................................................................................... 45

5 Cinética de crescimento de culturas microbianas .................................................................. 46

5.1 Definição dos parâmetros cinéticos ................................................................................ 48

5.1.1 Velocidades instantâneas de crescimento ou transformação ................................... 48

5.2 Velocidades específicas de crescimento ou transformação ............................................ 49

5.3 Fatores de conversão ..................................................................................................... 50

5.4 Fases do ciclo de crescimento de uma cultura................................................................ 52

5.4.1 Fase lag ................................................................................................................... 52

5.4.2 Fase exponencial ..................................................................................................... 53

5.5 Cinética de crescimento de monod ................................................................................. 55

5.6 Metabolismo endógeno................................................................................................... 57

5.7 Modelos de crescimento ................................................................................................. 57

5.7.1 Não estruturados ..................................................................................................... 57

5.8 Modelos de formação de produtos .................................................................................. 65

5.8.1 Não estruturados ..................................................................................................... 65

5.9 Influências do ambiente no crescimento ......................................................................... 68

5.9.1 Ph ............................................................................................................................ 68

5.9.2 Temperatura ............................................................................................................ 68

6 Cinética de reações catalisadas por enzimas ........................................................................ 70

6.1 Introdução....................................................................................................................... 70

Atividade enzimática .............................................................................................................. 72

6.2 Equação de michaelis-menten ........................................................................................ 72

6.2.1 Determinação dos parâmetros cinéticos vmax e km.................................................... 76

6.3 Reações reversíveis e com múltiplos substratos............................................................. 78

6.3.1 Reações reversíveis ................................................................................................ 78

6.3.2 Reações com múltiplos substratos........................................................................... 79

6.4 Reações com inibição ..................................................................................................... 80

6.4.1 Inibição irreversível .................................................................................................. 81

6.4.2 Inibição reversível .................................................................................................... 81

3
6.5 Outras influências na atividade enzimática ..................................................................... 89

6.5.1 Efeito da temperatura .............................................................................................. 89

6.5.2 Efeito do binômio tempo x temperatura ................................................................... 95

6.5.3 Efeito do ph ............................................................................................................. 96

6.5.4 Outros fatores que podem influenciar a atividade enzimática .................................. 97

7 Reatores bioquímicos ............................................................................................................ 97

7.1 Reatores biológicos ideais .............................................................................................. 97

7.1.1 Reatores de misturas ............................................................................................... 97

7.1.2 Reatores tubulares ................................................................................................ 117

7.1.3 Reatores enzimáticos ............................................................................................ 121

8 Esterilização ........................................................................................................................ 126

8.1 Esterilização pelo calor ................................................................................................. 126

8.1.1 Esterilização pelo calor seco.................................................................................. 126

8.1.2 Esterilização pelo calor úmido ............................................................................... 126

8.1.3 Teoria da esterilização pelo calor ........................................................................... 127

8.2 Esterilização de equipamento e mosto ......................................................................... 131

8.2.1 Esterilização conjunta de equipamento e mosto .................................................... 132

8.2.2 Esterilização de equipamento e mosto separadamente.......................................... 132

8.2.3 Cálculos na esterilização do mosto ........................................................................ 134

8.2.4 Cálculos na esterilização contínua ......................................................................... 137

8.3 Esterilização por filtração .............................................................................................. 138

8.3.1 Esterilização do ar ................................................................................................. 138

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1 INTRODUÇÃO

1.1 DEFINIÇÃO DE ENGENHARIA BIOQUÍMICA

Durante muitos anos várias definições de Engenharia Bioquímica apareceram na literatura.


Praticamente todas elas definem a Engenharia Bioquímica como uma ciência que nasceu pela
combinação de 3 áreas do conhecimento científico: Microbiologia, Bioquímica e Engenharia
Química. Seu papel, na realidade, é de transformar conhecimentos obtidos por microbiologistas e
bioquímicos em processos industriais, com vistas a aperfeiçoá-los, assim com aumentar
produtividade e rendimento. Para isto, um engenheiro bioquímico deve não só ter sua formação
em princípios básicos de engenharia, como também em ciências biológicas.

1.2 HISTÓRICO E EVOLUÇÃO

Milênios antes de saber da existência de seres microscópicos, o homem já se utilizava


deles. É assim que o homem das cavernas já sabia que a carne maturada tinha melhor sabor,
produzia bebida alcoólica, assim como fabricava queijos e produzia coalhada e vinagre desde
tempos remotos. O pão fermentado por leveduras foi encontrado em pirâmides egípcias
construídas há milênios. Muitos produtos obtidos pela ação de microrganismos podem ser
incluídos nesta lista histórica: vinho (conhecido pelos antigos gregos), cerveja (2000 anos A.C.),
soja fermentada, etc.
Até meados do século XIX o homem permaneceu na ignorância total sobre as causas da
fermentação. Em 1857, Pasteur demonstrou que a fermentação alcoólica era produzida por
leveduras e que estas eram células vivas. Demonstrou também que várias doenças eram
causadas por microrganismos. Em 1901, Rudolf Emmerich e Oscar Loco, da Universidade de
Munique, isolaram a piocianase de Pseudomonas aeruginosa. Centenas de pacientes foram
tratados com sucesso pela piocianase, o primeiro antibiótico conhecido. Porém, a piocianase
estava muito a frente de seu tempo e pela inexistência de técnicas seguras e apropriadas de
produção e controle de qualidade, foi abandonada prematuramente pelos riscos apresentados.
No ínicio do século XX já se produzia levedura de panificação em tanques abertos e
aerados. Durante a I Guerra Mundial, Chain Weismann conseguiu produzir acetona a partir de
amido usando uma bactéria, Clostridium acetobutilicum, livrando a Inglaterra de uma séria falta de
munição, pois acetona é usada na fabricação de cordite. Em 1923, Pfizer inaugurou a primeira
fábrica para obtenção de ácido cítrico por fermentação, utilizando Aspergillus niger na conversão
do açúcar em ácido, barateando o produto. Alexander Fleming, em 1928 manipulando
Staphylococcus aureus, notou que numa das placas de cultura deste microrganismo havia
contaminação por bolor da família Penicillium, e que ao redor deste não houve crescimento da

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bactéria. Extraiu do bolor uma substância, a qual denominou de penicilina, ativa contra bactérias.
Mas foi somente durante a II Guerra que a penicilina foi industrializada devido a grande
necessidade de agentes bactericidas mais eficientes que a sulfa, até então utilizada. Seguiu-se
após, o aparecimento de outros antibióticos. Selman Waskman isolou um actinomicete,
Streptomyces grisens, da garganta de uma galinha, produtor de estreptomicina. Este antibiótico
mostrou-se altamente eficaz contra bactérias causadoras da tuberculose. A lista dos antibióticos
hoje é longa, além das penicilinas e estroptomicinas. A pesquisa é intensa e cada ano novos
produtos, novas técnicas e novos processos vêm se juntar aos já existentes. Muitas vitaminas são
produzidas por fermentações, com, por exemplo, vitamina B2 (riboflavina), vitamina B12
(Cianocobalamina) e vitamina C (ácido ascórbico). Processos fermentativos também são usados
na produção de cortisona e seus derivados, assim como na síntese de aminoácidos (L-lisina e
ácido glutâmico). A gibelerelina, hormônio regulador do crescimento das plantas, é um novo
produto de fermentação usado principalmente no Oriente. Inseticidas bacterianos (B.
thuringiensis) encontram grande aplicação na agricultura.
Antes da produção de penicilina em escala industrial ter começado, já se produziam
industrialmente certos produtos como leveduras de panificação, ácido cítrico e ácido glicônico
onde as condições de acidez do meio de cultura eram adversas a microrganismos contaminantes.
Da mesma forma, na obtenção de produtos como sorbose, acetona, butanol e etanol, as
concentrações de substrato ou produto eram demasiadamente elevadas de forma que
microrganismos contaminantes eram quase que inexistentes. Assim sendo, os requerimentos para
uma cultura pura nos processos de obtenção dos produtos acima descritos, eram praticamente
nulos. Porém, no caso da penicilina, as condições de operação tinham que ser estritamente
assépticas. Assim, os engenheiros bioquímicos se encontraram em face de um grande problema.
Esse desafio fez com que surgisse uma nova filosofia de “design” de fermentadores, de técnicas
de operação e de equipamentos em geral, de forma que uma perfeita esterilidade fosse obtida.
Além disso, para a extração de alguns produtos como a penicilina, que era encontrada no meio de
cultura em pequenas concentrações e relativamente instável, exigiu o desenvolvimento de novas
técnicas de filtração, extração, adsorção e concentração, dando origem a técnicas modernas de
extração e purificação de produtos de origem biológica.
As técnicas desenvolvidas para a produção de penicilina, como a fermentação submersa,
foram posteriormente aplicadas em outros antibióticos e também a diferentes produtos, de forma
que os equipamentos sofreram uma espécie de padronização, com algumas adaptações
dependendo das características de certos processos. Além disso, os equipamentos e operações
empregados em diferentes processos fermentativos são similares aos de processos químicos. Por
isso a Engenharia Bioquímica é baseada nos conceitos de operações unitárias e processos
unitários da Engenharia Química, assim como em seus princípios estequiométricos, cinéticos e
termodinâmicos. No entanto, é evidente que, apesar de características comuns entre as duas
disciplinas, existem peculiaridades diferentes entre elas, de forma que a engenharia bioquímica é

6
encarada como um ramo especializado da engenharia química. Como exemplo de operações
unitárias comuns entre elas podemos citar: mistura de três fases heterogêneas (microrganismos,
meio e ar), transporte de massa (oxigênio do ar para o microrganismo), transporte de calor (do
meio de cultura para o ambiente).
Transformações de matéria-prima em produtos por ação microbiológica possuem aspectos
comuns sob o ponto de vista químico ou físico, fornecendo-nos a possibilidade de classificar os
diferentes mecanismos de reação em processos unitários, como por exemplo, reduções,
oxidações, conversões de substrato, transformações, hidrólises, polimerização, biossínteses
complexas e formação de células.

7
2 AGITAÇÃO E AERAÇÃO

2.1 TRANSPORTE MOLECULAR DE OXIGÊNIO

2.1.1 A DISSOLUÇÃO DE O2 (TEORIA DOS DOIS FILMES)


Considerando a interface gás-líquido de um sistema aerado, tem-se:

GÁS
Pg , C*
Filme gasoso
Pi , Ci
Filme líquido
pL , CL
LÍQUIDO

Figura 2.1. Representação esquemática da Teoria dos dois filmes

Admitindo o estado estacionário, o fluxo de O2 ( O 2 ) é dado por:

 
ηO2  k g Hp g  p i   k g Hp i  p L   k L C*  Ci  k Ci  C L  (2.1)

em que:
O 2 : fluxo de O2 (massa O2/m2h)

kg : coeficiente de transferência da película gasosa (m/h)


kL : coeficiente de transferência de película líquida
H : constante de Henry (g O2/m3atm)
p : pressão parcial O2 (atm)

8
Medições experimentais de concentrações são fáceis de serem feitas na massa de fluidos,
mas virtualmente impossível nas interfaces. Desta forma, somente um efeito global pode ser
determinado. Considerando a figura abaixo a medida de pL é tão boa quanto a medida de CL, e o
mesmo pode-se dizer da medida de C* em relação à medida de pg. A transferência de massa
global entre as duas fases pode ser escrita em termos de coeficientes globais de transferência de
massa, Kg ou KL. e a equação torna-se:

  
O 2  K g H p g  p L  K L C*  C L  (2.2)

onde Kg e KL são coeficientes globais de transferência de massa na fase gasosa e na fase líquida
respectivamente.

pg P
Curva de equilíbrio
m" do Oxigênio
pi

-KL/Kg
m'
pL

CL Ci C*

Figura 2.2. Curva de equilíbrio ilustrativa de Oxigênio

Da figura obtém-se:

   
p g  p L  p g  p i  p i  p L   p g  p i  m' C i  C L 
   (2.3)
O 2 O 2 m' O 2
 
Kg kg kL

ou seja

1 1 m'
  (2.4)
Kg kg kL

1 1 1
ou similarmente   (2.5)
K L k L m" k g

onde m" é também conhecido como a constante de Henry (H). Desta forma tem-se:

9
1 1 1
  (2.6)
KL kL kgH

Como no caso do oxigênio a solubilidade é baixa, ou seja, m" ou H são grandes e têm-se:
1 1
  KL  kL (2.7)
KL kL

ou seja


O 2  K L C*  C  (2.8)

ou multiplicando-se pela área interfacial (a):


O 2 a  K La C*  C  (2.9)

onde KLa: coeficiente volumétrico de transferência de O2 (h-1).

No estado transiente: O2 a 


dC
dt

 K L a C*  C  (2.10)

dC
onde representa a variação da concentração de oxigênio no meio
dt

2.1.2 TRANSFERÊNCIA DE O2 E RESPIRAÇÃO

O balanço de O2 de uma fermentação fornece:


dC
dt
 
K L a C*  C   Q O2 X (2.11)

Variação da suprimento demanda


conc. O2

Onde QO2 é o quociente respiratório.


dC
Se C = constante,  0 e portanto,
dt
 
K L a C*  C  Q O 2 X (2.12)

10
X, [O2], [O2] [X]

tempo

Figura 2.3. Variação da concentração de oxigênio em função do crescimento celular

2.1.3 MÉTODOS DE MEDIÇÃO DE KLA

2.1.3.1 Método do sulfito


Neste método a determinação do KLa é feita sem a presença de microrganismos, pois o
sulfito é um composto tóxico e não permitiria o desenvolvimento das células. O método se baseia
na reação abaixo, onde o oxigênio é consumido pelo sulfito, em presença de um catalisador, no
caso o cobre. Portanto é um método puramente químico.
1 
Na 2SO 3  O 2 
Cu
Na 2SO 4
2

Para a determinação do oxigênio dissolvido, amostras são retiradas em espaços regulares


de tempo, e reagidas com iodo segundo a equação abaixo, na técnica analítica conhecida como
iodometria.

SO 3-2  (n)I2  H 2 O  4  2H  2I  (n  1)I 2
SO -2 -

Assim, o fluxo de oxigênio será dado por:

N.V1
Nv  [mol/min] (2.13)
4.t.V2

onde N: normalidade da solução


V1: volume gasto de tiossulfato
V2: volume da amostra em litros
t: intervalo de tempo entre uma amostra e outra
Nv: fluxo de oxigênio (moles por tempo)

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Desde que o consumo do oxigênio dissolvido é instantâneo, a concentração de oxigênio no
meio é praticamente zero. Desta forma a equação 2.10 se torna:
dO 2 N v
  K L a . C* (2.14)
dt V2
onde C* é a solubilidade do oxigênio nas condições do experimento e encontrado em tabelas.
Assim:
Nv
K La  (2.15)
V2 .C*

Tabela 2.1. Solubilidade do oxigênio em diferentes condições de meio


o
Temperatura Solubilidade Solubilidade em soluções (mM) – 25 C
0
( C) em água (mM) Concentração HCl 1/2 H2SO4 NaCl
0 2,18 - - - -
10 1,70 0 1,26 1,26 1,26
15 1,54 0,5 1,21 1,21 1,07
20 1,38 1,0 1,16 1,12 0,89
25 1,26 2,0 1,12 1,02 0,71
30 1,16 - - - -
35 1,09 - - - -
40 1,03 - - - -

2.1.3.2 Método do borbulhamento


Neste método, igualmente realizado sem a presença de microrganismos, a variação de
oxigênio no meio é medida por um eletrodo de oxigênio, colocado no interior do fermentador. O
oxigênio inicialmente presente no meio é retirado pelo borbulhamento de nitrogênio e em seguida
borbulha-se ar, como ilustrado na figura abaixo (Fig. 2.4), de forma a aumentar a concentração de
oxigênio.
Como não há presença de microrganismos, não há consumo de oxigênio e, portanto temos
a equação básica de transporte de oxigênio.

dC
dt

 K L a C*  C  (2.16)

Esta equação pode ser integrada para se obter:


 C*  C 
 *
dC
C C
 K L a  dt  C
  ln C*  C 0  K L a.t   ln 
C *

 K L a.t (2.17)

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O valor de KLa pode ser então obtido graficamente como ilustrado pela Figura 2.4.

Borbulhamento
[O2] com N2

dO2
dt

tempo
Restabelecimento da
aeração

Figura 2.4. Representação esquemática da medição de KLa pelo método do borbulhamento

 ln CC* C 
*

KLa

0
0
tempo

Figura 2.5. Representação gráfica da equação 2.17 para cálculo de KLa

2.1.3.3 Método dinâmico


Este método é feito em presença de microrganismos, ao contrário dos métodos
precedentes. Baseia-se na variação da concentração de oxigênio num curto intervalo de tempo,
devido à respiração do microrganismo, e este intervalo é suficientemente pequeno de forma a
manter a concentração de células praticamente constante. É feito inicialmente um corte no
suprimento de O2 durante alguns minutos, e então se restabelece o suprimento, como ilustrado na
figura abaixo. Nestas condições, ou seja, sem suprimento, tem-se apenas consumo (demanda) do
oxigênio, implicando numa queda de concentração, e desta forma a equação 2.18 torna-se:

dC
 Q O 2  X (2.18)
dt

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É possível, assim, calcular QO2, a velocidade específica de respiração, pela tangente da
primeira parte da curva. Na segunda parte da curva, após a aeração ser restabelecida, tem-se
simultaneamente respiração (demanda) e o suprimento de oxigênio, ou seja, toda a equação 2.19.
Pode-se rearranjar esta equação para se obter o seguinte:

dC  * QO2 X 
  C   C   K L a (2.19)
dt  KLa 

QO2 X
Para cada condição de trabalho pode-se considerar C* e constantes. Fazendo-se:
K La

C*  (QO 2 X / K La )  A' (2.20)

temos
dC
 ( A '  C)  K L a (2.21)
dt

logo
dC
 A' C  K a  dtL (2.22)

Integrando a equação acima entre C e C0, correspondendo aos tempos t e t0 = 0, tem-se:

A' C 0
ln  K La  t (2.23)
A'  C

No regime estacionário, ou seja, quando a concentração de oxigênio é constante, a


equação 2.23 pode ser escrita da seguinte forma:

 
K L a C*  C  QO 2 X

onde C tem uma concentração particular Ci. Rearranjando a equação acima e substituindo C por
Ci temos:

 
C*  QO 2 X / K La  Ci  A' (2.24)

C  C0
ou seja, ln i  K La  t (2.25)
Ci  C

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Na figura abaixo (Figura 2.6) está representado o esquema para a determinação dos
parâmetros da equação.

Corte de aeração

Ci

-Qo2X Ci-C

C Ci-C0

C0

t=0 t tempo

Figura 2.6. Representação esquemática do método dinâmico para cálculo de KLa

http://www.rpi.edu/dept/chem-eng/Biotech-Environ/AERATION/high.htm

2.1.4 RESPIRAÇÃO MICROBIANA


Quando O2 é o substrato limitante, ou seja, com concentração abaixo da concentração
crítica (ilustrado pela figura abaixo) pode-se representar a cinética de crescimento pela equação
de Monod:

   max
O 2 
(2.26)
K  O 2 

ou ainda

Q O2  Q O2 max
O 2 
(2.27)
K  O 2 

Sabendo-se que a taxa de dissolução de O2 é dada por:


dO 2
dt

 K La C*  C  (2.28)

dX dO 2
e que  YX / O (2.29)
dt dt

obtém-se
dX
dt

 YX / O k La C*  C  (2.30)

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QO2
QO2max

Ccritico [O2]
Figura 2.7. Variação de QO2 em função da conc. de oxigênio segundo a cinética de Monod, onde
Ccrítico é a concentração abaixo da qual ocorre limitação de oxigênio

Lembrete: Definições e nomenclatura


X: concentração celular (g/l)
S: concentração do substrato limitante
P: concentração de produto
C*: concentração de O2 no meio na saturação
C: concentração de O2

 ou  X : velocidade específica de crescimento

1 dX
 (2.31)
X dt

qs: velocidade específica de consumo de substrato


1 dS
qS   (2.32)
X dt

q P : velocidade específica de produção

1 dP
qP  (2.33)
X dt

YX/S: fator de conversão substrato/células


ΔX μ dX dt
YX/S    (2.34)
 ΔS q S  dS dt

YP/S: fator de conversão substrato/produto


ΔP q P dP dt
YP/S    (2.35)
 ΔS q S  dS dt

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QO2: velocidade específica de respiração
1 dO 2
QO 2  (2.36)
X dt

dO 2
em que : velocidade de consumo de O2 (g O2/L.h)
dt

YX/O: fator de conversão O2/células


X  dX dt
YX / O    (2.37)
O2 QO 2 dO 2 dt

2.2 AGITAÇÃO MECÂNICA

2.2.1 AGITAÇÃO SEM AERAÇÃO


Rushton demonstrou por análise dimensional que (Figura 2.8):

P0  NDi 2 ρ N 2 D i H L D t Wi Wb 
 f  , , , , , 
 (2.38)
3 5
N Di ρ  μ g D i D i D i D i 

N° de N° de N° de adimensionais
Potência Reynolds Froude relativos à
(Np) (NRe) (NFr) geometria

P 1
3
forças externas ND i D P
NP    3 5 (2.39)
forças inerciais N D i
2
N Di 

forças inerciais N 2 D i ND i 
2
N Re    (2.40)
forças vis cos as N 
Di
Para sistemas geometricamente semelhantes:

NP=K(NRe)m(NFr)n (2.41)

NFr: importante se existe formação de vórtex, do contrário, NFrn=1 ou n=o (que é o caso normal em
reatores). Portanto:

NP=K(NRe)m (2.42)
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Passo ou distância entre as linhas de percurso:
Dimensões padrão:
“pitch” = 1 a 2 D São geralmente empregadas no gráfico Npo
Rushton correlacionou dados de NP versus NRe, versus Re:
Figura 2.8, de onde se distingue 3 regiões: - Número de defletores = 4

Dt HL HL
-  3,  1, 3
- região laminar: NRe<100 Di Dt Di

HL Wb 1
N P  KN Re m com m= -1 (2.43)  1, 
Dt Di 10

P  Kμ N 2 D i
3
(2.44)
W L
-  0,2 e  0,25 para turbinas
Di Di
- região turbulenta: NRe>104 W L
-  0,25 para pás
Di Pá W
N P  K1 (2.45) -
W
 0,2 - 0,25 para hélices
Di
P
 K1 (2.46)
N Di 
3 5

Onde:
W= altura das pás do impulsor
P  K1 N D i 
3 5
(2.47) Hl= altura do líquido
Dt= diâmetro do tanque
Di= diâmetro do agitador
- região intermediária: 100 < NRe < 104
L= largura das pás do agitador
W b= largura dos defletores
N P  K 2 N Re  m
-1< m < 0

18
Figura 2.8: Evolução do número de Re e de potência com o tipo de impulsor

O trabalho de Rushton foi feito para fluidos Newtonianos e para sistemas com uma pá de
agitação. No entanto, em fermentações muito freqüentemente ocorre
do fluido não ser Newtoniano e o sistema conter mais do que um
propulsor. De uma forma prática, recomenda-se que: Di < Hi < 2*Di..
A Figura 2.9 mostra um sistema com várias pás.
No caso de mais de um propulsor procede-se
da seguinte forma de acordo com a figura abaixo:

 calcula-se Np para um agitador


 multiplica-se pelo número de agitadores

Figura 2.9: Sistema com várias pás

19
Figura 2.10. Relação entre o número de impelidores e o número de potência experimental

No caso de fluidos não-Newtonianos (em fermentação freqüentemente encontra-se fluidos


pseudoplásticos), calcula-se o NRe equivalente, ou modificado.

dv
Newtoniano:   
dx
dv
Binghaniano:   0    : coeficiente de rigidez
dx
n
 dv  dv
Pseudoplástico:   K  ou   A
 dx  dx

K: índice de consistência
n: índice de fluxo
 A : viscosidade aparente
n 1
 dv 
 A  K 
 dx 

Segundo Metzner & Otto, para fluido pseudoplástico:

D i N 2n ρ  n 
2 n

N Re '    (2.48)
0,1K  6n  2 

A Figura 2.11 correlaciona o Número de Potência com o Reynold modificado.

20
Figura 2.11: Correlação entre o Número de Potência e o Reynold modificado

No entanto, para fermentações, as características do fluido variam durante um processo


fermentativo, variando, portanto os índices com K e n (Figura 2.12).

Figura 2.12. Comportamento reológico típico de uma fermentação com caldo não-Newtoniano

21
2.2.2 AGITAÇÃO COM AERAÇÃO

Ao se aerar um líquido agitado mecanicamente ocorre


diminuição do diâmetro das bolhas e observa-se uma redução
da potência dissipada devido à redução da densidade aparente
da mistura líquido/bolhas nas vizinhanças da turbina.
Ao estudar este assunto Oyama definiu o número de
aeração (Na):

2
velocidade superficial ar Q Di Q
Na    (2.49)
velocidade terminal turbina N D i ND3 i

Q: vazão volumétrica de ar

E construíram a curva Pg /P0 versus f(Na) (Figura 2.13).

22
P0: potência sem aeração
Pg: potência com aeração

Figura 2.13. Curva Pg /P0 versus f(Na)

Michel e Miller examinaram outros meios de relacionar potência em líquidos aerados,


inclusive para grandes volumes, desenvolvendo a seguinte equação:

0, 45
 2 ND i 3 
Pg  K P0  K: constante que depende da geometria (2.50)
 Q 0,56 

Esta correlação se ajusta ao gráfico de Oyama e mostra-se válida para tanques desde 15
até 42000 l. Embora desenvolvida para fluidos newtonianos, mostra-se válida para fluidos não-
newtonianos em regime turbulento, mesmo para sistemas geometricamente não semelhantes. As
duas figuras abaixo mostram os estudos de Michael e Miller para a Potencia dissipada com
aeração para fluidos newtonianos e não-newtonianos.

Figura 2.14. Correlação de Michel e Miller para estimar a potência dissipada com aeração em
fermentadores

23
Figura 2.15. Correlação de Michel e Miller para estimar a potência dissipada com aeração para
fluidos não-Newtonianos em diferentes tamanhos de fermentadores

2.2.3 TRANSFERÊNCIA DE MASSA EM SISTEMAS AGITADOS E AERADOS


O trabalho clássico de estudo de transferência de O2 em sistemas aerados-agitados foi
feito por Cooper, baseado em dados obtidos a partir do método do sulfito:

K L a  k1 Pg V VS (2.51)

KLa: coeficiente de transferência (mM O2/L.h.atm) engloba H e P


Pg/V: potência dissipada por unidade de volume (HP/1000L)
VS: velocidade superficial (cm/min)
k1: constante de proporcionalidade

Q
Onde, VS 
A Transversal

A partir dos dados da figura abaixo foi proposta a seguinte equação para KLa:

K L a  k1 Pg V0,95 VS 0,67 (2.52)

24
Figura 2.16. Coeficiente de transferência de massa versus potência dissipada por unidade de
volume em diferentes velocidades superficiais dos gases (método do sulfito)

Alternativamente, Richards desenvolveu a seguinte equação a partir de análise


dimensional, cujos dados estão correlacionados na figura abaixo:

K L a  kPg V0,4 VS 0,5 N 0,5


(2.53)

Figura 2.17. Correlação de Richard’s (1961) para o coeficiente de transferência de massa

Ambos trabalhos foram em tanques pequenos, de até 60 litros, usando o método do sulfito.
Posteriormente, Fukuda trabalhando em tanques maiores verificou a necessidade de introduzir na
equação um termo relativo ao número de turbinas.
Assim, chegou a seguinte equação para tanques de 100 a 42.000 litros, e a Fig. 2.18.

25
K L a  α δNi  Pg /V 0,77VS
0,67
(2.54)

Figura 2.18. Correlação de tranferência de massa (método do sulfito) para diferentes tamanhos de
fermentadores

Em trabalhos com S. cerevisae em fermentador Waldohof de 20.000L, Hospodka


determinou a seguinte relação:

K L a  kPg V0,72 VS 0,11 (2.55)

Figura 2.20. Correlação da tranferência de massa a partir


Figura 2.19. Diagrama esquemático
de fermentações com leveduras no fermentador de
do fermentador de Waldhof
Waldhof
(dimensões em cm)

26
Enquanto Fukuda trabalhando com fermentação de Endomyces (pseudoplástico) verificou
que a expressão para KLa pode ser

K L a  kPg V0,33 VS 0,56 (2.56)

Figura 2.21. Correlação da transferência de massa de um caldo de fermentação não-Newtoniano


em diferentes tamanhos de fermentadores

27
Anexos

28
3 AMPLIAÇÃO DE ESCALA

Desenvolvimento de processos microbiológicos

Escala de Bancada Escala Piloto Escala Industrial


(screening, meio de (condições otimizadas de (maximização de
cultivo,etc.) fermentação) produtividade)

Nos processos de adaptação de fermentações pilotos de pequenas escalas para grandes


escalas, as condições ótimas ambientais devem ser mantidas o máximo possível. No caso de
fatores químicos (meio de cultura) isto é relativamente factível, porém para os fatores físicos
(transferência de massa, agitação, tensões de cisalhamento, potência dissipada) torna-se mais
difícil devido à dependência destes da geometria do sistema.
O critério de seleção de diferentes linhagens para translado em larga escala é também
importante.

3.1 CRITÉRIOS PARA AMPLIAÇÃO DE ESCALA

 taxa volumétrica de transferência de O2 constante (KLa);


 velocidade terminal do propulsor constante ( ND i );

 potência por volume constante (Pg/V);


 tempo de mistura iguais;
 número de Reynolds ou momento similar;
 controle do tipo feedback para assegurar que fatores ambientais chaves sejam mantidos
constantes.

Em processos onde o oxigênio é um fator de controle importante, KLa é um bom critério de


ampliação. No entanto, nem sempre é necessário ou desejável satisfazer inteiramente a demanda
de oxigênio para o microrganismo, por várias razões:
 a produção pode atingir a taxa máxima mesmo quando a demanda de oxigênio não é
satisfeita.
 Pode ser necessário restringir a oferta de oxigênio para a taxa máxima ser obtida.
 A potência extra adicionada pode não justificar economicamente os ganhos em
produtividade.

Os procedimentos de scale-up baseados em agitação-aeração, envolvem técnicas de


previsão da velocidade de agitação requerida para se obter a mesma eficiência de aeração da
pequena escala. Isto é devido a quatro pontos básicos:
 aumento da área interfacial das bolhas;
29
 aumenta o tempo de retenção das bolhas;
 evita coalescência;
 diminui espessura do filme líquido.

3.1.1 MEDIDA DE KLa COMO CRITÉRIO DE AMPLIAÇÃO

Neste método tem-se como regra medir o KLa na pequena escala e na grande escala. Por
coerência, deve-se usar o mesmo método de determinação de KLa em ambas escalas. Desta
forma determina-se as condições na grande escala para que ocorra a mesma eficiência em
aeração. Para cada método existente de determinação de KLa existem vantagens e desvantagens
que devem ser levados em conta no momento da escolha:

3.1.1.1 Método do sulfito


 simples e não requer equipamentos caros;
 é uma medida que corresponde a uma média no fermentador;
 demorado;
 necessita limpeza escrupulosa, podendo ser problema em plantas industriais;
 custo do sulfito é alto podendo ser proibitivo em grande escala.

3.1.1.2 Método do borbulhamento


 Uso de eletrodos;
 simples e relativamente barato;
 rápido (3 a 15 minutos);
 uso de nitrogênio pode ter custo proibitivo em larga escala;
 é uma medida pontual, não representando uma média, o que vem a ser dramático quando
a mistura não é boa como nos fermentadores industriais;
 requer-se eletrodos de resposta rápida (polarográfico).

3.1.1.3 Método dinâmico


 método necessita somente eletrodos de membrana, de resposta lenta (necessário fator de
correção);
 medida feita em condições reais de fermentadores;
 mede KLa e taxa de demanda de oxigênio ao mesmo tempo;
 não pode ser empregado em fermentadores com oxigênio limitado;
 medida pontual;
 mistura deficiente promove erros grandes;
 demorado.

30
3.1.1.4 Balanço Gasoso
 simples (mais que os anteriores) e rápido;
 medida feita em condições normais de temperatura;
 mede KLa e Qo2;
 eletrodo de alta sensibilidade e caro (paramagnético).

Além dessas considerações, algumas outras devem ser feitas como:

 nem sempre mesmo KLa significa mesma produtividade, principalmente se os


fermentadores são de relações geométricas diferentes.
 Combinações de métodos podem ser empregadas (método sulfito para condições
preliminares e depois dinâmico ou balanço)
 Para casos em que KLa muda durante a fermentação, principalmente com organismos
filamentosos, a medida deve ser feita no mesmo instante da fermentação
 Este método de scale-up não faz previsão dos resultados
 Outros métodos dados a seguir, são normalmente usados para prever valores de KLa. São
usados a priori e os valores checados com medidas de KLa por um dos métodos descritos.

3.1.2 MÉTODO DE Pg/V CONSTANTE

Considerando as equações de Cooper em regime turbulento:


 
K L a  k' Pg V 0,95 VS0,67 (3.1)

E Rushton
m
 ND 2 
N P  KN Re 
P0
m
ou  K  (3.2)
N 3 D5   
 
Que nos dá
P  Kρ N 3 D 5 em regime turbulento (m = 0)

P  Kμ N 2 D 3 em regime laminar (m = -1)

Pode-se prever os efeitos das variáveis de operação na potência consumida e em scale-


up. Em sistemas aerados tem-se a relação de Michel e Miller para regimes turbulentos:

0, 45
 P 2 ND 3 
Pg  K o 0,56  (3.3)
 Q 
 

No entanto, é bem aceito o uso da equação de Rushton para sistemas não-aerados, pois
as correções que são feitas para sistemas aerados são tão pequenas que poderiam ser

31
ignoradas. Ao mesmo tempo, as técnicas de scale-up são bem claras para fermentadores de
geometria similares, embora aproximações aceitáveis podem ser feitas para sistemas não
similares.
No método de scale-up com Pg/V constante, considera-se que os rendimentos de obtenção
de produtos serão proporcionais a Pg/V e eficiência de aeração (KLa).

3.1.2.1 Regime turbulento

P  Kρ N 3 D 5 , em que K = constante que depende da geometria

3 5
P1 V1 Kρ N1 D1
  (3.4)
P2 V2 Kρ N 2 3 D 2 5

Com fermentadores similares


1
V1 N 3D 5 D1  V1 3
 1 1 sendo   , temos (3.5)
V2 N 2 3 D 2 5 D 2  V2 

2
V 9
N 2  N 1  1  (3.6)
 V2 

3.1.2.2 Regime transiente

Neste caso é necessário construir toda a curva NPo  f NRe  .


Se existe similaridade geométrica a curva será a mesma para diferentes escalas. Assim
sendo os passos a serem dados serão:
 Calcular NRe1
 Achar NP1 pela curva

 Calcular P1  N p1N13 D15

 Calcular P2*  P1 * V2 V1

 Calcular diferentes números de Reynolds para diferentes N2


 Achar os respectivos NP2 pela curva
 Calcular P2 para cada N2 pela equação P2  N p2N 2 3 D 2 5

 Traçar log P2 versus log N2


 Achar N2 correspondente a P2* pelo gráfico acima

32
3.1.2.3 Regime Laminar
Nesta região, para Pg/V constante, chega-se, pela manipulação da equação P  KN 2 D3 ,
que N2=N1. Para manter Pg/V constante é necessário alterar a vazão de ar e assim manter a
velocidade superficial (VS) constante. O cálculo de Q2 pode ser feito da seguinte forma:

VS1 = VS2 (3.7)

2
4Q1 4Q 2 D 
  Q 2  Q1  2  (3.8)
D12 D 2 2  D1 

em sistemas geometricamente similares

1 2
D 2  V2  3 V 3
   Q 2  Q1  2  (3.9)
D1  V1   V1 

Apesar de ser amplamente utilizado, este método tem algumas desvantagens teóricas e
práticas:
 método baseia-se na proporcionalidade entre Pg/V e eficiência de aeração, o que nem
sempre é verdade, mesmo em regimes turbulentos. Além disso, embora seja desejável
trabalhar em regime turbulento (relação de Cooper é estabelecida nestas condições), isto
nem sempre é possível, principalmente nos casos de fluidos viscosos, que geralmente
recaem no regime transitório. Portanto nestes casos o uso de Pg/V constante pode ser de
validade duvidosa.

 a equação de Rushton baseia-se em sistemas não aerados, embora possa ser utilizada
com boa aproximação em sistemas aerados, para critérios de scale-up.

 método aplica-se bem para sistemas geometricamente similares, embora sistemas


geometricamente não similares produzam curvas Np versus NRe diferentes, o fator mais
importante afetando a potência consumida, é a geometria do agitador, como mostra a
figura de Rushton (devido a maior potência ser dissipada nas vizinhanças do agitador).
Neste sentido as equações de Richard para 3 tipos de agitadores são muito valiosas:

Agitador de pás retas:

P0  0,035N 3 Di 3.7 WB0,8 R 0,4 J 0,3 (3.10)

33
Agitador de pás curvas

P0  0,0085N 3 Di 3.7 WB0,8 R 0,4 J 0,3 (3.11)

Agitador de turbina

P0  0,25N 3 Di 2,2 WL1,5 B0,8 R 0,4 J 0,3 (3.12)

Em que J: largura das chicanas


B: número de pás
R: número de chicanas

Li

Di

Figura 3.1. Dimensões do impulsor (rotor)

No caso de fluidos não Newtonianos pode-se usar a metodologia de Metzner e Otto ou


Calderbank e Moo-Young, ou seja, emprega-se o NRe modificado:

Di 2 N 2  n
n
ND i 2  n 
N Re  ou N Re    (3.13)
 0,1K  6n  2 

Devido ao fato de que as características reológicas destes fluidos variam durante a


fermentação, é importante que os dados para a ampliação sejam tomados em instantes bem
determinados na fermentação. Além disso, a tensão de cisalhamento aplicada a um fluido no
fermentador varia radialmente, sendo maior nas vizinhanças das pás do agitador. Isto significa no
caso dos fluidos pseudoplásticos, cujo comportamento reológico varia com a tensão de
cisalhamento, que se torna difícil avaliar a viscosidade. Assim sendo, Metzner e Otto propuseram
o conceito da taxa de deformação média no fermentador, que é proporcional a rotação:

  kN (3.14)

34
onde  : taxa de deformação média
k: constante de proporcionalidade (10<k<13)

Se as propriedades do fluido são conhecidas, pode-se determinar a viscosidade aparente


média:

 (3.15)

Para pseudoplásticos   K n (3.16)

então  a  KkN n 1 (3.17)

 a : viscosidade aparente média

A equação anterior pode ser usada para propósito de scale-up.

3.1.2.4 Discussão sobre o método de Pg/V constante

Por análise dimensional Rushton (1951) obteve a seguinte expressão para o coeficiente de
transferência de massa KL:

 
K L D  ND 2    
N Sh  N Re  N Sc  ou     (3.18)
DL     D L 
 

DL: difusividade do oxigênio em fase líquida


,  : constantes experimentais

Assumindo tanques geometricamente similares, propriedades constantes do fluido, e KL


constante, a equação acima torna-se em scale-up:

21
N 2  D1  
  (3.19)
N 1  D 2 

Para Pg/V constante na região turbulenta, temos a partir da equação de Rushton:

3 5
P2  N 2   D2 
    (3.20)
P1  N1   D1 

Combinando as equações tem-se:

35
2  1 2  1
5 3 23
P2  D 2   P2 V 2  D 2  
     (3.21)
P1  D1  P1 V1  D1 

Figura 3.2. P/V vesus  no aumento de escala; os parâmetros são a relação do aumento de
escala Dt2/Dt1.

Para   0,75 , P2 V2  P1 V1 , portanto, para qualquer valores de D2/D1 o valor de P/V será
igual. Segundo Aiba, pode-se considerar em   0,75 para critérios de scale-up, embora
Bartholomew em 1960 tenha verificado que em fermentadores bem projetados o valor de  é um
pouco maior que 0,75. Isto implica que P/V decresceria com a ampliação de escala para manter
um mesmo KL.

3.1.3 MÉTODO BASEADO NA VELOCIDADE TERMINAL CONSTANTE

Vi1 = Vi2 (3.22)

Em que Vi = πND (velocidade terminal)

D1
N1D1  N 2 D 2  N 2  N1 (3.23)
D2

Ou para fermentadores geometricamente semelhantes:

1
V 3
N 2  N 1  1  (3.24)
 V2 

36
O máximo cisalhamento ocorre na extremidade do agitador. Se compararmos a equação
acima com a equação para P/V constante, o cisalhamento aumentaria no caso do critério P/V
constante e no caso do critério Vi constante a relação P/V diminuiria.
A aplicação deste método está restrita a microorganismos sensíveis ao cisalhamento,
como protozoários e microorganismos filamentosos.
Steel e Maxon (1959) mostraram que este método pode ser aplicado efetivamente em
fluidos com microorganismos filamentosos. Foi verificado que a taxa de transferência de oxigênio
obedece a seguinte equação:

TTO k' Vi1,6 (3.25)

A explicação dada é que em sistemas viscosos o problema de coalescência das bolhas de


ar não é tão dramático, sendo apenas necessária uma zona de alto cisalhamento para promover a
formação de pequenas bolhas. Assim sendo, nestas circunstâncias a eficiência de aeração
correlaciona-se com a velocidade terminal do agitador. Para fluidos newtonianos o inverso é
observado, ou seja, a eficiência de aeração dependerá de potência dissipada e não da velocidade
terminal.

3.1.4 MÉTODO BASEADO NO TEMPO DE MISTURA

O tempo de mistura é definido como o tempo requerido para uma gota de líquido ser
completamente e uniformemente diluída no seio de um fluido num tanque agitado, considerado
que os fluidos possuem as mesmas propriedades físicas, o que significa que a mistura ocorre a
nível molecular. Nowood e Metzner (1960) correlacionaram um tempo de mistura adimensional
com o número de Reynolds para um agitador de pás planas.

 g
2 1 1
2 3 6 2
tm ND t D
 1 3
(3.26)
2 2
H D
em que  : tempo de mistura adimensional

Dt: diâmetro interno do tanque


g: constante gravitacional
H: altura do líquido
D: diâmetro do agitador
A figura  versus número de Reynolds é muito similar à NP versus NRe de Rushton e,
particularmente para o agitador usado,   N Po  6 e para NRe > 104.
Os mesmos autores verificaram que para critérios de scale-up, para tanques
geometricamente similares e em regime turbulento

37
tm1 N12 3 D11 6  tm2 N 2 2 3 D 2 1 6 (3.27)

Desde que tm1 = tm2, então

14
D 
N 2  N1  2  (3.28)
 D1 

Segundo Rushton tem-se:

P2 V2 P2 V1 P2 D13 N 2 3 D 2 2
   (3.29)
P1 V1 P1V2 P1D 2 3 N13 D12

Combinando as equações

11 4 11 12
P2 V2  D 2  V 
    2  (3.30)
P1 V1  D1   V1 

Pode-se concluir, no uso deste método, que a potência por volume unitário aumentará
quase que proporcionalmente com o volume. A experiência mostra que este enorme aumento é
desnecessário. Este método não é, portanto, recomendado no contexto de requisitos em aeração-
agitação. Poderia ser útil, no entanto, para sistema não-aerados e viscosos.

3.1.5 MÉTODO BASEADO NO KLa CONSTANTE

Aiba (1965) desenvolveu um método baseado na manutenção do KLa constante,


envolvendo o cálculo da vazão de ar requerida a partir das relações de aeração por
borbulhamento (sem agitação mecânica) e a estimativa da velocidade de agitação a partir das
relações de Cooper.
As equações de aeração por borbulhamento desenvolvidas por Eckenfalder (1956, 1959)
são:

 B 1
KL  (3.31)
13
H N Sc 1 2

QH 1
a  ' (3.32)
10d B  B V H'

em que dB: diâmetro das bolhas


 B : velocidade terminal do ar

,' : constantes

1
Combinando as 2 equações e desprezando o termo ' , normalmente pequeno, tem-se:
H'

 H 2 3Q
K La  (3.33)
10Vd B N Sc 1 2

38
Se as propriedades físicas do líquido são constantes:

Q 23 1
K La  H (3.34)
V dB

K L a 1 Q1 V1  H1 
23
d B2
Para scale-up:    (3.35)
K L a 2 Q 2 V2  H 2  d B1

Para mesmo KLa e dB1=dB2

23
Q 2 Q1  H 1 
   (3.36)
V2 V1  H 2 

Esta relação fornece a vazão de ar, Q2, na escala maior. Para se determinar a velocidade
de agitação, é necessário os seguintes passos:

Tomar as relações de Cooper, relacionando KLa e Pg/V. Exemplo para “vaned disc”;

0,95
 Pg 
K L a  0,0635 
 VS 0,67 (3.37)
V 

em que KLa: kgmol/h.m3.atm

Pg/V: HP/m3
VS: m/h

Conhecido KLa na pequena escala, e sendo V e VS conhecidas, Pg na escala maior é:

1 0,95
 K La 
Pg 2  V2   (3.38)
 0,0635V 0,67 
 S2 

A agitação é determinada por um método interativo como segue:

Determina-se P0 pelo gráfico de Oyamah e Endoh que relaciona Pg/P0 versus Na


(Na=Q/ND3) estimando um valor de N.
Com o mesmo valor de N calcula-se P0 a partir da equação de Rushton P0  CN 3 D5

(região turbulenta)
Comparar os 2 valores de P0.

39
Este método tem alguns inconvenientes como o cálculo da vazão de ar baseado em
relações de aeração por borbulhamento sem agitação, enquanto o sistema de fermentação
normalmente possui agitação mecânica; devido ao uso das equações de Cooper, este método só
é válido se for usado o método do sulfito na determinação de KLa. As relações de Oyamah e
Endoh são aplicáveis para tanques com um único agitador.

Observações: No caso de fluidos não Newtonianos, deve-se usar a relação de Calderbank


e Moo-Young, onde o NRe é adaptado para fluidos viscosos.

D 2 N 2  n
N Re  (3.39)
n
k  6n  2 
 
10  n 

Para o cálculo de P0 ao invés da equação de Rushton.


Para o cálculo de Pg pode ser usada a equação de Michel e Miller ao invés da de Cooper.

 
0, 45
 P ND 3 0, 44   P 2 ND 3 
0, 45

K 0 i   Pg  k '  0 0,56 i  (3.40)


 Na 0,56   Q 
   

em que Pg: HP
N: min-1
Di: cm
Q: L/min
k’: depende da geometria e dimensões

Segundo Nishikawa, k’ depende das características do fluido.

Tabela 3.1: Valores de n, K e K’


Fluido n k k’

Newtoniano 1 1 0,087

Não newtoniano 0,91 0,4 0,087

Não newtoniano 0,73 3,4 0,087

Altamente não newtoniano 0,65 25 0,05-0,065

Ao invés da relação de Cooper pode-se usar outras relações para KLa, como a correlação
de Richards:

40
0,4
 Pg 
K L a  k'  
 N 0,5 VS 0,5 (3.41)
V 
a
 Pg 
K L a  1  2,8N i   VS b apc
 (3.42)
V 

A escolha do valor de KLa que será usado no scale-up, deve ser feita em relação ao
rendimento do processo, permitindo a máxima produtividade, evitando excessos e desperdício de
energia.

3.1.6 MÉTODO BASEADO NA TRANSFERÊNCIA DE MOMENTO

Blakebrough e Sambamurthy (1966) sugeriram um método baseado na transferência de


momento, considerando que o agitador funciona como uma bomba. O fator momento por eles
definido é o seguinte:

M f  WLND i  NDi  W (3.43)

em que L: comprimento das pás do agitador


W: largura das pás do agitador

E o KLa pela equação:

  Pg 
1,79 
K L a  k  tm0,203  
 M f 1,08 N 0,0437  (3.44)
 V  
 

3.1.7 MÉTODO BASEADO EM RELAÇÕES GEOMETRICAMENTE NÃO SIMILARES

Oldshwe (1966) sugeriu que a geometria similar não é tão importante para scale-up quanto
manter constantes KLa e o cisalhamento. Sugeriu que a relação Di/DT pode variar dentro de certos
limites. A prática corrente é manter constantes KLa e a velocidade terminal e ajustar Di/DT dentro
dos limites sugeridos pela figura abaixo. Típico Di/DT é de 0,25-0,4. Típica velocidade terminal é
de 500 cm/s.

41
faixa de operação
p/ ferm.
6

5
(Di/Dt)ot p/Kla
HP
4 aumentando

2 Área de boa
dispersão de
gás
1

0
10 100 1000
Potencial (H.P.) = P0 / Q
Taxa aeração

Figura 3.3. Faixas de opções de D/T para um aumento de escala não-geométrico.

3.1.8 OUTRAS CONSIDERAÇÕES

Para ampliações para grandes escalas, 500-1000 m3, fatores adicionais dificultam o scale-
up. Por exemplo, se o fermentador vai ser adquirido os problemas de transporte limitam o
diâmetro do tanque (3,6 - 4,3 m), o que afeta conseqüentemente a geometria. Também os
problemas de controle de temperatura. O fermentador deve ser capaz de remover de 10.000 a
15.000 cal/Lh. Às vezes são necessários trocadores externos, ou então soluções como
serpentinas (inconvenientes) ou então chicanas e tubo de aspiração serpentinados.

3.1.9 ESCOLHA DO PROCEDIMENTO DE SCALE-UP

Não existe um método que pode ser aplicado em todo tipo de fermentador, com alta
probabilidade de sucesso. Ao contrário, existem poucos casos onde um método pode ser aplicado
com total convicção. A escolha de um método depende, de um lado, de preferência pessoal, e de
outro, das características do processo, do fluido e condições de operação:
 método baseado no tempo de mistura não tem praticamente aplicabilidade;
 método da velocidade terminal constante pode ser aplicado se o microorganismo é
sensível ao cisalhamento;
 método baseado nas medidas de KLa são demorados e não permitem prever resultados;
 podem, no entanto, ser usado em conjunção com outros métodos, como do KLa constante;

42
 método de P/V constante, apesar de suas limitações, é provavelmente o melhor
procedimento.

4 ESTEQUIOMETRIA DA REAÇÃO DE CRESCIMENTO MICROBIANO

4.1 EQUAÇÃO ESTEQUIOMÉTRICA GERAL

Pode-se escrever a equação estequiométrica geral de seguinte forma:

aCu Hv Ow Nt  bO2  cNH4  C x H y Oz NE  dC HO N   eCO2  fH 2O (4.1)


         
1 2 3

(1) Fórmula bruta do substrato: peso molecular M s

(2) Fórmula bruta da biomassa: peso molecular equivalente M x

(3) Fórmula bruta do produto: peso molecular M p

A composição elementar média de um microrganismo pode ser determinada empiricamente, ou a


partir de dados da literatura. A composição média de bactérias e leveduras é dada na tabela
abaixo:

Tabela 4.1 Composição média de bactérias e leveduras.


Elemento Bactéria Leveduras
(%) (%)
C 53 47
O 20 30
N 12 7,5
H 7 6,5
P 3 1,5
S 1 1
Mg 0,5 0,5
Cinzas
7 8
(P,Mg,Cu,Ca,Co,Fe,Mn,Mo)

Assim sendo, os coeficientes u, v, w, t, x, y, z, E, , , , e  podem ser determinados


experimentalmente.

Chamando o rendimento de produção de biomassa em relação ao substrato carbonado de YX S

temos:
Mx
YX S  (4.2)
a*M s

43
Chamando o rendimento de produção de produto em relação ao substrato carbonado de YP S

temos:
d*M P
YP S  (4.3)
a*M s

Na equação 4.1, observamos as seguintes incógnitas: a, b, c, d, e, e f

Temos que:

C: a * u  x  d *  e (4.4)
H: a*v  4*c  y  d *   2*f (4.5)

O: a * w  2 *b  z  d *  2 * e  f (4.6)

N: a * t  c  E  d * (4.7)

Então:

1 Mx
a * (4.8)
YX S M s

 Mx    Y *Mx  
b  *  u  v  t  w    P S  *          E  x  y  z (4.9)
 YX * M s   4 2   YX S * M P   2 4 4 2
 S 
 YP S *  t 
c  E   *M x (4.10)
 YX * M P YX * M s 
 S S 
YP S Mx
d * (4.11)
YX S MP

 Mx   Y *Mx 
e  * u   PS  *  x (4.12)
 YX * M s   YX * M P 
 S   S 
 Mx  v  Y *Mx  
f   *   2 * t    P S  *  2 *      2 * E  y (4.13)
 YX * M s  2   YX S * M P   2 2
 S 

4.1.1 DEMANDA DE O2 E NITROGÊNIO

Numa reação de crescimento microbiano é importante determinar as quantidades dos reagentes


necessários para a total degradação do substrato carbonado.

44
4.1.1.1 Demanda de O2

Considerando bg o número de moles de O2 à introduzir no meio de cultura para a produção de 1g


de biomassa e a equação 4.9, temos: Mx=1
    YP S  
b
1  *  u  v  t  w     *          E  x  y  z (4.14)
 YX * M s   4 2   YX S * M P  2 4 4 2
 S  

Se bg for expresso em gramas de biomassa em relação ao oxigênio consumido:

1  gbiomassa 
YO2    (4.15)
X
bg  gO2 
Da mesma forma chega-se ao valor b` expressando a quantidade de O2 necessária para elaborar
uma molécula grama de metabólito: Mp=1
 Mx   Y *Mx  
b `   *  u  v  t  w    P S  *          E  x  y  z (4.16)
 YX * M s   4 2   YX S  2 4 4 2
 S  

4.1.1.1 4.1.1.2 Demanda de Nitrogênio

O número de moles necessários para a produção de 1g de células será, segundo a equação 4.10,
dado pela seguinte relação: Rx = Yx/s
YP S *  t
cE  (4.17)
Rx * M P Rx * M s
E para a produção de uma molécula grama de metabólito:

 YP *  t 
c ` E   S  *M x
 (4.18)
 Rx Rx * M s 

4.1.2 CARACTERIZAÇÃO DO SUBSTRATO


A construção celular necessita uma grande variedade de elementos em quantidade variável
(conferir tabela no item 4.1). A composição do substrato carbonado definirá a quantidade dos
outros elementos a introduzir no meio de cultura.
O rendimento Yx/s é sensivelmente equivalente para um mesmo tipo de substrato, entretanto, 2
compostos tendo os mesmos elementos numa mesma proporção não produzem forçosamente o
mesmo rendimento:

Glicose: (CH2O)6  YX/S  0,51

Ac. Acético: (CH2O)2  YX/S = 0,36

45
O quadro abaixo reúne alguns dados de YX/S para alguns microrganismos crescendo em
diferentes substratos carbonados:

Tabela 4.2. Dados de YX/S para alguns microrganismos crescendo


em diferentes substratos carbonados
Substrato Fórmula Microrganismo Yx/s
Maltose C12H22O11 Aerobacter aerogenes 0,43
Sacarose C12H22O11 Aerobacter aerogenes 0,50
Glicose C6H12O6 Aerobacter aerogenes 0,40
Glicose C6H12O6 Pseudomonas aeroginosa 0,43
Acetato C2H4O2 Pseudomonas aeroginosa 0,28
Glicose C6H12O6 Candida utiles 0,51
Acetato C2H4O2 Candida utiles 0,36
Etanol C2H6O Candida utiles 0,68
N-hexano C14H30 Candida lipolítica 0,78
N-octadecano C28H58 Candida lipolítica 0,88

Utilizando-se destes valores de YX/S, previamente conhecidos, e as equações estequiométricas


deduzidas acima, é possível calcular as quantidades necessárias e suficientes dos principais
componentes do meio de cultura (fontes de carbono, nitrogênio, fosfato, oxigênio...) para que os
rendimentos e produtividades desejados sejam obtidos, dentro de um parâmetro econômico
racional.

5 CINÉTICA DE CRESCIMENTO DE CULTURAS MICROBIANAS

Quando uma pequena quantidade de células vivas é colocada numa solução contendo
nutrientes essenciais em condições favoráveis de pH e temperatura, as células se reproduzirão.
No caso de microorganismos unicelulares que se dividem quando crescem, o aumento da
biomassa (massa de material vivo) é acompanhado pelo aumento do número de células, ou seja,
aumento de população. Quando se trata de bolores ou fungos filamentosos a situação é
completamente diferente. Aqui crescimento é associado ao comprimento e número de micélios,
aumentando em dimensão e densidade a biomassa, mas não em número.
Associados ao crescimento existem dois processos: consumo de material do meio e
liberação de metabólitos.

46
A medida do processo de crescimento é feita em geral por métodos gravimétricos (peso
seco) e turbidimétricos (densidade ótica). A densidade ótica da suspensão celular é função linear
da biomassa somente para baixos valores de densidade, como ilustra a figura abaixo.

0,9

0,8

0,7

0,6
D.O.

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

0
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7
Massa celular bacteriana, g de peso seco/L

Figura 5.1. Ilustração da densidade ótica da suspensão celular como função


linear da biomassa somente para baixos valores de densidade

A despeito disso, a densidade ótica tem grande aplicação devido a sua praticidade e
rapidez, com as quais dados são obtidos quase que instantaneamente.
Os modelos que representam o crescimento celular podem variar de simples aos mais
complexos possíveis, dependendo de uso e aplicação e da complexidade da situação física.
A Tabela 5.1. traça um perfil de quão complexo é o processo de crescimento de um
microrganismo.

Tabela 5.1. Processo de crescimento de um microrganismo.


Meio População celular
Nutrientes
 Multicomponentes  Componentes múltiplos

 Reações em solução  Heterogeneidade entre indivíduos
Produtos
 Equilíbrio ácido-base  Reações múltiplas

 pH, T, . . . variáveis  Controles internos
Calor
 Prop. reológicas variáveis  Adaptabilidade

 Fases múltiplas (G-L, S-L, G-S..) Int.  Probabilidade
Mecânicas
 Heterogeneidade espacial  Degenerescência

47
Está claro que a representação matemática de todos os fenômenos envolvidos na figura
precedente não é prática. Por esse motivo, faz-se aproximações de forma a simplificar a
representação de modelos de crescimento. As simplificações mais correntes são:
 Um único substrato limitante e o resto em excesso, de forma que se considere a
concentração somente deste substrato;
 Ocasionalmente a presença de um inibidor;
 Freqüentemente controla-se ou mantêm-se outras variáveis no meio (pH,
temperatura, O2, etc) em valores que afetarão minimamente a cinética de
crescimento;
 Em alguns casos pode ser necessário incluir variáveis múltiplas no modelo de
crescimento.
Tipicamente o número de células vivas numa cultura varia com o tempo de acordo com a
figura do site abaixo:
http://www.rpi.edu/dept/chem-eng/Biotech-Environ/FUNDAMNT/micro.htm

5.1 DEFINIÇÃO DOS PARÂMETROS CINÉTICOS


5.1.1 VELOCIDADES INSTANTÂNEAS DE CRESCIMENTO OU TRANSFORMAÇÃO

Para definir as diferentes velocidades de reação que ocorrem em processos fermentativos


em geral, considere um cultivo em batelada, uma forma simples de cultivo amplamente utilizada
no laboratório e na indústria. Refere-se a um cultivo de células num tanque fechado com uma
carga inicial de meio de cultura que é inoculada com uma certa quantidade de microrganismos.
Num processo em batelada é possível, a partir de amostras retiradas ao longo do cultivo,
visualizar as cinéticas de crescimento celular, de consumo de substrato e de formação de produto
a partir de perfis de concentração de células (X), substrato (S) e de produto (P) tal como ilustra o
gráfico da Figura 5.2.

48
Figura 5.2 Cinética de crescimento(X), consumo (S) e produção (P) de uma fermentação padrão,
dS dP dX
onde: A   t t * , B t t * e C t t *
dt dt dt

Balanços de massa para as células (X), substrato (S) e produto (P) nesse cultivo definem
as velocidades instantâneas de crescimento celular (rx), de consumo de substrato (rs) e de
formação de produto (rp) como sendo:

dX
rx  (5.1)
dt
dS
rs   (5.2)
dt
dP
rP  (5.3)
dt

Ou seja, em cultivos em batelada é possível determinar tais velocidades instantâneas de


reação a partir das tangentes (inclinações) das curvas num dado tempo de cultivo. É possível
definir velocidades de reação (rx, rs e rp) em diferentes formas de cultivo (descontínuos, contínuos
e semicontínuos) a partir de balanços de massa específicos para cada um deles.

5.2 VELOCIDADES ESPECÍFICAS DE CRESCIMENTO OU TRANSFORMAÇÃO

Devido ao fato da concentração celular variar durante um processo descontínuo


(normalmente aumenta) e as células constituírem o “catalisador” das reações microbianas, logo o
aumento da concentração celular acarreta também no aumento da concentração do complexo
enzimático responsável pela transformação do substrato no produto sendo mais lógico analisar os
valores das velocidades instantâneas em relação à concentração celular (X). Logo, torna-se
necessário a definição das velocidades específicas de crescimento celular, consumo de substrato
e de formação de produto, nas formas que seguem:

1 dX
 (5.4)
X dt

1  dS 
qS    (Também conhecida como S) (5.5)
X  dt 

49
1 dP
qP  (Também conhecida como P) (5.6)
X dt

5.3 FATORES DE CONVERSÃO

Os coeficientes de rendimento são definidos com base no consumo de um material para a


formação de outro em um intervalo de tempo para processos descontínuos ou em relação ao
espaço (entrada e saída do reator) para processos contínuos, tratando-se de parâmetros
relacionados com a estequiometria. Como exemplos de coeficientes de rendimento temos:

5.3.1.1 Coeficiente de rendimento celular (rendimento de substrato a células)

X  XO
YX /S  (5.7)
SO  S

YX/S definido na equação acima é o coeficiente global de conversão de substrato em


células, também conhecido como coeficiente de rendimento aparente ou observado. O valor deste
parâmetro varia ao longo de um cultivo, alcançando o valor máximo durante a etapa de
crescimento exponencial em cultivos descontínuos (batelada).

5.3.1.2 Coeficiente de rendimento de produto (rendimento de substrato a produto)


P  PO
YP / S  (5.8)
SO  S

Assim como para YX/S, trata-se de um coeficiente global, variável durante o cultivo. Os
coeficientes globais levam em consideração o consumo total de um material para a formação de
um outro. Por exemplo, YX/S indica a razão entre a quantidade de células formada e a quantidade
total de substrato consumida num cultivo, podendo este substrato também ser utilizado para
outros fins, tais como para a formação de produto e energia de manutenção celular.

Para um determinado tempo t* o cálculo do coeficiente de rendimento celular e de produto


instantâneos é realizado de acordo com as seguintes relações:
dX
YX / S  (5.9)
 dS
dP
YP / S  (5.10)
 dS

50
Conforme as definições de velocidades (eqs. 5.1, 5.2 e 5.3) e velocidades específicas (eqs.
5.4, 5.5 e 5.6), resultam as seguintes relações:
rX 
YX /S   X (5.11)
rS S
rP 
YP / S   P (5.12)
rS S

5.3.1.3 Cálculo das velocidades

Pelas definições apresentadas nos subitens acima, conclui-se que os cálculos das
velocidades e velocidades específicas de transformação necessitam, em primeiro lugar, dos
traçados das curvas de X, S e P em função do tempo, a partir dos pontos experimentais (Figura
5.2). Para exemplificar o cálculo das velocidades (eqs. 5.1, 5.2 e 5.3) e velocidades específicas
(eqs. 5.4, 5.5 e 5.6), estão representados na Figura 5.2 os resultados experimentais obtidos em
uma fermentação alcoólica descontínua.

Para t=t*, por exemplo, as velocidades de crescimento celular, de consumo de substrato e


de formação de produto são calculadas pela inclinação da reta tangente às curvas X=X(t*),
S=S(t*) e P=P(t*), respectivamente:

dX
rx t t *  t t* (5.13)
dt

dS
rS t  t *   t t* (5.14)
dt

dP
rP t  t *  t t* (5.15)
dt

De maneira análoga, as velocidades específicas de crescimento celular, de consumo de


substrato e de formação de produto são calculadas através das relações a seguir:

1 dX
 x t t *   t t* (5.16)
X * dt

1 dS
qS   t t* (5.17)
t t * X * dt

51
1 dP
qP   t t* (5.18)
t t * X * dt

5.4 FASES DO CICLO DE CRESCIMENTO DE UMA CULTURA

Nº de células

F. Estacionária

F. Lag F. Exponencial F. Morte Tempo

Figura 5.3: Fases do ciclo de crescimento

 Fase lag: fase de adaptação onde nenhum crescimento ocorre


 Fase exponencial: também chamada de fase logarítmica onde ocorre um aumento
exponencial do número de células.
 Fase estacionária: a população atinge sua população máxima
 Fase de morte: eventualmente poderá ocorrer uma fase de declínio do número de células
característico da fase de morte.

Todas as fases são de primordial importância em processos microbiológicos. Por exemplo,


os objetivos gerais de um bom processo prevêem a minimização da fase lag, a maximização da
velocidade, extensão da fase exponencial e o retardamento da fase de transição do crescimento
estacionário. Atingir a máxima concentração celular no final do processo é geralmente muito
importante. Para atingir este objetivo é necessário entender como cada variável influencia o
crescimento microbiano. Cada fase será discutida na seqüência e na seção seguinte discutiremos
mais sobre os modelos cinéticos que cobrem toda a curva de crescimento.

5.4.1 FASE LAG


A extensão da fase lag, invariavelmente indesejável, depende da mudança (se houver) na
composição do meio em que é efetuado o inóculo, da idade e do volume deste. A forma de
eliminar ou minimizar esta fase é fazer inóculos sucessivos em volumes crescentes até que o
volume de trabalho seja atingido, utilizando meios de cultura idênticos. A mudança de meio
implica na adaptação do microrganismo aos novos nutrientes e concentrações, o que requer a
síntese de outros tipos de enzimas necessárias para as novas condições. Múltiplas lag-fases são

52
às vezes observadas, devido à existência de múltiplas fontes de carbono. Este fenômeno é
conhecido como diauxia e é causado pela mudança nas vias metabólicas para se adaptar ao novo
substrato, após o primeiro e preferencial ter sido consumido. Este fenômeno está ilustrado na
figura seguinte.

1.1.1 S 1.1.3 X
1.1.2 X

S1

S2

Te
1.1.4

Figura 5.4: Gráfico representativo do fenômeno damp


diauxia
o
http://www.rpi.edu/dept/chem-eng/Biotech-Environ/MICROBIOL/diauxie.html

Com base nisto, algumas recomendações podem ser dadas para minimizar a lag-fase:
 A cultura inóculo deve ser tão ativa quanto possível e ser feita quando ainda na fase
exponencial.
 O meio de cultura do inóculo deve ter a mesma composição ou quanto muito a mais próxima
possível da composição do meio usado na etapa final do processo.
 Usar uma quantidade de inóculo razoavelmente grande (5 a 10%) do volume de meio a ser
fermentado.

5.4.2 FASE EXPONENCIAL


Ao final da fase lag a população de microrganismos se encontra bem adaptada ao meio e
começam a se multiplicar rapidamente, dobrando seu número em espaços regulares de tempo. O
esquema abaixo ilustra esta forma de reprodução e o conseqüente modelo matemático:
Divisão celular N° de células N° de gerações Generalização

0
1 0 X0*2
1
  2 1 X0*2
2
    4 2 X0*2
       8 3 X0*2
3

X0=número inicial de células; N=número de gerações X0*2N


Então para N gerações temos:

53
X  X0 * 2 N (5.19)

Se chamarmos de g o tempo de geração ou o tempo de duplicação de uma população e t o tempo


de crescimento, teremos:

t
N (5.20)
g

então

t
X  X0 * 2 g
(5.21)

aplicando Ln tem-se:

 X   tg   X  t
Ln    Ln 2   Ln    0,69 * (5.22)
 X0     X0  g

Se 0,69/g for constante, teremos uma reação de primeira ordem. Definindo  como a velocidade
específica de crescimento, temos:

0,69  X 
  Ln   *t (5.23)
g  X0 

Esta relação pode ser demonstrada experimentalmente da seguinte maneira: a velocidade


aumento da população será diretamente proporcional a esta população, ou seja:

dX
 *X (5.24)
dt
Aumento da população Quantidade populacional

Então a constante de proporcionalidade  (velocidade específica de crescimento) será igual a:

 1  dX
  * (5.25)
 X  dt

54
Integrando, obtém-se:

 X 
Ln   *t (5.26)
 X0 

Onde  é a velocidade específica de crescimento, corresponde ao aumento da população por


unidade de tempo e por unidade de população. A máxima inclinação, obtida na parte linear da
curva, como ilustrado na Figura 5.4, é max, ou seja, a velocidade específica de crescimento
máxima.

ln X

max

Tempo

Figura 5.5. Gráfico para obtenção de max

5.5 CINÉTICA DE CRESCIMENTO DE MONOD


Se somente um substrato é limitante os outros em excesso, de forma que somente a
mudança da concentração do substrato limitante é relevante, a cinética de crescimento varia
tipicamente numa forma hiperbólica, como mostrado na figura abaixo, onde S é o substrato
limitante (normalmente fonte de carbono) e  a velocidade específica de crescimento.


max

max/2

ks S
Figura 5.6. Cinética de crescimento de Monod

55
Monod expressou este tipo de curva numa forma idêntica à de Michaelis-Menten para
enzimas, ou seja:
S 1 dX
   max onde  (5.27)
ks  S X dt

As mesmas considerações feitas para a equação de Michaelis-Menten são válidas aqui:


S  kS    max (S > 10 ks) (5.28)

S  kS    k * S (S < 0,10 ks) (5.29)


  máx  kS  S (5.30)
2

Onde kS pode ser tomado como o valor da concentração de substrato abaixo da qual  é
linearmente dependente de S e acima da qual  torna-se independente de S.
A determinação de kS e max é melhor feita pela linearização da equação de Monod. A
equação de Lineweaver-Burk é um exemplo (consultar o capítulo 6 para outros tipos de
linearizações), como segue:
1 1 Ks 1
   (5.31)
  max  max S

Assim, da figura abaixo pode-se determinar as constantes ks e max pelos coeficientes da


reta.

1

K S  max
1
 max

1/S

Figura 5.7.: Linearização da equação de Monod

http://www.rpi.edu/dept/chem-eng/Biotech-Environ/GrowPresent/monodj.htm

56
5.6 METABOLISMO ENDÓGENO
Em alguns casos, notadamente quando a taxa de diluição em fermentador contínuo é
muito baixa, verifica-se um desvio da equação de Monod, que se transforma no seguinte:
S
   max - ke (5.32)
ks  S
onde ke é chamada de taxa de metabolismo endógeno, que significa que ocorrem reações nas
células de material intracelular. Por outro lado, ke pode ser também encarado como taxa de morte,
de forma que tenhamos:
obs   - kd (5.33)

Onde:
obs: velocidade específica de crescimento observada;
: velocidade específica de crescimento segundo Monod;
kd: coeficiente específico de morte.

Assim:

S
 obs   max - kd (5.34)
ks  S

Ou ainda:

dX SX
  max - kd  X (5.35)
dt ks  S

http://www.cape.canterbury.ac.nz/Archive/GrowPresent/deathter.htm

5.7 MODELOS DE CRESCIMENTO

5.7.1 NÃO ESTRUTURADOS

Modelos não estruturados são aqueles que tratam a biofase como formada apenas por um
elemento (normalmente massa celular), que se multiplica em crescimento balanceado.
Como exemplo deste tipo de modelo temos:

5.7.1.1 Monod
S
   max (5.36)
ks  S

57
5.7.1.2 Monod com metabolismo endógeno
S
   max - ke (5.37)
ks  S

5.7.1.3 Tessier

  max  1  e-S/Ks  (5.38)

5.7.1.4 Moser

  max 1  k SS-  1 (5.39)

5.7.1.5 Contois

S
   max (5.40)
X  S

5.7.1.6 Inibição pelo substrato (Andrews)


S
   max (5.41)
S2
ks  S 
ki
http://www.rpi.edu/dept/chem-eng/Biotech-Environ/GrowPresent/inhib.htm

5.7.1.7 Inibição pelo produto

S kP
   max (5.42)
ks  S kP  P

ou
n
S  P 
   max 1    (Levenspiel) (5.43)
k s  S  Pmaz 

5.7.1.8 Dois ou mais substratos limitantes

58
S1 S2
   max  (5.44)
k1  S1 k 2  S2

http://www.rpi.edu/dept/chem-eng/Biotech-Environ/GrowPresent/double.htm

http://www.rpi.edu/dept/chem-eng/Biotech-Environ/GrowPresent/either.htm

http://www.rpi.edu/dept/chem-eng/Biotech-Environ/GrowPresent/weight.htm

Tabela 5.2. Modelos cinéticos sem inibição e com um substrato limitante


Referência Modelo Cinético
s
Monod   max
KS  s
Teissier 
  max 1  e s / Ks 
n
s
Moser    max
KS  s n
Contois s
  max
Fugimoto KS  x  s
s
   max
Powell
K S  K D   s
 1 s
  para s  2K
 max 2 K
Blackman

e 1 para s  2K
 max
  KS
Dabes et al. s  K 
max  
Kono
rx      X
Kono e Asai

59
Representação gráfica da equação de Simulação computacional de um processo
modelo cinético encontrado em análise de em batelada utilizando a cinética de
processos cinéticos:  ou qp vs. S no caso de Monod para diferentes valores de max:
cinética de saturação simples (1), inibição dependência do tempo para a biomassa
pelo substrato (2), inibição pelo produto (3), (x) e concentração de substrato (s) para o
metabolismo endógeno (4) bissorção de um caso de s0= 1g/L, x0=0,05 g/L, YX/S=0,5,
caso de cinética com múltiplos substratos (5) KS=0,01 g/L
e fenômeno transiente com fase lag ou
repressão catabólica (6).

Simulação computacional para um processo Simulação computacional para um


em batelada utilizando cinética de Monod e processo em batelada utilizando cinética
variando os valores de kS (conforme figura de Monod e variando os valores do
14.9). coeficiente de rendimento YX/S (conforme
figura 14.9).

Um grande número de modelos pode ser encontrado na literatura. Modelos de crescimento


podem ser muito restritos, representando um dado processo, com um dado microrganismo, ou
mesmo uma determinada fase de um processo fermentativo. As tabelas abaixo trazem um resumo
de alguns modelos de crescimento de microrganismos.

60
Tabela 5.3. Modelos cinéticos com inibição pelo substrato
Referência Modelo Cinético

Andrews 1 s 1
  max  max 
Noack 1  KS / s  s / K1S KS  s 1  s / K1S

Webb   max

s 1    s / KS' 
s  KS  s 2
/ KS'
1
  max
Yano et al 1  KS / s   s / K1S  j
j
s
Aiba et al   max  e s / K1S
KS  s

Teissier-Type   max exp s / K1S   exp s / KS 

s
  max  e1,17  com   força iônica
s  KS 1   K1S 
Webb

 K1S s  sC 
Tseng e Waymann s
  max
Waymann e Tseng KS  s

Siimer r 

kcat  e0 1   S 1   1   S  / KS'   S / KP 2 
a  b S  c S2

61
Simulação de cinética em processo Cinética de inibição pelo substrato e
em batelada com inibição pelo substrato método de estimação de parâmetros de
para vários valores de constante de inibição acordo com HUMPHREY.
pelo substrato-K1,S; Biomassa (x) e
concentração de substrato (s) dependente
do tempo utilizando os seguintes valores:
YX/S= 0,5, max=0,35, KS=0,1 g/L, so= 10 g/L,
xo= 0,5 g/L.

Cinética de inibição pelo substrato


e método gráfico de estimação de parâmetros.

62
Tabela 5.4. Modelos cinéticos para cinética com inibição pelo produto
Referência Modelo Cinético

 s, p   max 1  k  p 
s
Dagley e Hinshelwood
KS  s

Holzberg et al.   max  k1 p  k2 

 p 
Ghose e Tyagi   max 1  
 pmax 

 s, p   max
s
Aiba e Shoda  e kp
KS  s

 s, p   max
s K1P
Jerusalimsky e Neronova 
KS  s K1P  p
 max  0  k1  pk 2  p 

 1 2
Bazua e Wilke
 max  0 1  p pmax
s
rx  kobs  x
Levenspiel KS  s
com kobs  k 1  p pcrit n
s K1P
  max 
K S  s K1P  YP / S s0  s 
Hoppe e Hansford

Gráfico da ação de concentração de Variação da constante da equação de


diferentes tipos de produto (p) sobre a Monod, kobs em função do decréscimo de n e
velocidade específica de crescimento () o aumento de p (Eq. de Levenspiel).
de acordo com HINSHEL-WOOD: Linear
(1), decréscimo exponencial (1a, 2a) ou
função degrau (2,3).

63
5.7.1.9 Crescimento em estado transiente

Durante certos intervalos em processos em batelada ou durante perturbações em


processos contínuos, a população cresce em regime transiente, no qual comportamentos cinéticos
mais complicados são observados. Geralmente existem modelos diferentes para diferentes tipos
de comportamento transiente. Aqui examinaremos alguns tipos de crescimento transiente.

5.7.1.10 Representação gráfica de crescimento de microrganismos

Crescimento exponecial Crescimento linear

a b c
X d e f g

a, d  lag fase
b, e  fase exponencial
c, g  fases de retardamento e estacionária
f  fase linear

64
5.8 MODELOS DE FORMAÇÃO DE PRODUTOS

A produção de um dado metabólito está intimamente associada ao crescimento celular, de


forma que só haverá formação de produto quando ocorrer crescimento. As associações entre
velocidades de produção e crescimento podem ocorrer em diferentes formas; e modelos de
crescimento como os vistos anteriormente podem ser usados (estruturados ou não estruturados).

5.8.1 NÃO ESTRUTURADOS


A cinética de formação de produtos pode ser descrita de forma simples, segundo a
descrição de Gaden e Luedecking-Piret. Gaden classificou a inter-relação entre produção e
crescimento da seguinte forma:

X X X
P P P

t t t

Tipo I Tipo II Tipo III


Produção associada Produção parcialmente Produção dissociada
ao Crescimento Associada ao crescimento do crescimento

Figura 5.8. Cinética de formação de produtos

Luedecking-Piret propuseram o seguinte modelo para a formação de produto:

dP dX
    .X (5.45)
dt dt

Produção associada ao Produção associada à


crescimento massa

Que pode ainda ser escrito na forma:

qP     (5.46)

Na classificação de Gaden esta equação seria:

65
Tipo I : q P    YP / X 
Tipo II : q P    
Tipo III : q P  

Além do modelo de Luedecking-Piret que associa produção de metabólito ao crescimento,


têm-se vários outros como ilustrado nas tabelas abaixo.

Tabela 5.5. Equações de modelos para velocidades de formação de produto.


Referência Modelo Cinético
YP / S
rP  YP / X  r x ou qP  YP / X   com YP/X 
YX / S
Gaden s
rP  YP / S  rS rP  qP max x
KS  s
rP  k P  x
Giona et al qP  k1  L  k2
Gaden qP  YP / X    k p
Rowley e Pirt q P  q pmax  YP / X  
exp k1 t  tmax  
Terui qP  qP max  exp k 2 t  tmax   K1  
 exp k 2 t  tmax 
Constantinides et r  Y
p P / X    x  k P  x  k p,d  P
al
rP   k1i  e k2i 
i
Shu t 
 k2 ,i  
P   x(  )   k1,i  e  d  d 
0 0 i
ti
x0   0   x  d

Aiba e Hara
t i  
t0
rP  qP   x
x t i 
Brown e Vass rP t  YP / X  r X t  t
M
Pt  YP / X  xt  tM
   rel
q p  qP max
1    1 rel
Ryu e Humphrey

s
q p  q p max
 
K P  s1  s
 K repr 
Bajpai e Reuss

q p  qP max
1   rel  rel 
K P / K s  x 1   rel 2  1   rel  rel    rel 2 / K repr / KS  x 
modelo com r   1

YS / X 
r x  mS x
manutenção P  aP  Y X / S aP  aP
 

66
Kono rP  k P1    x  k P 2 1  x
Kono e Asai 
Asai e Kono com k p1 e k P2  0 e 0   1

Representação esquemática da forma Método gráfico de tentativa e erro para


cinética entre a taxa específica de formação estimativa de parâmetros (YP/X, tM) para o
(qP) e taxa específica de crescimento (): caso de conceito de cinética de tempo de
crescimento associado (I), sem crescimento maturação.
associado (II), mistura de crescimento
associado com formação de produto (III), e
um caso de correlação negativa (IV).

Representação gráfica da equação de Representação gráfica da equação Bajpai e


Ryu e Humphrey, mostrando uma cinética Reuss como modelo cinético generalizado de
geral aproximada para formação de formação de produto num gráfico das taxas
produto devido à variação dos valores de adimensionais qP vs . A figura A apresenta
. padrões prévios sugeridos da taxa de
produção de penicilina da literatura.
KP/KS.x=0,00133(I); 0,0133(II); 0,0133(III);
0,00133(IV)
Krepr/KS.x=0,6667(I); 0,6667(II); 6,667(III);
6,667(IV)

67
5.9 INFLUÊNCIAS DO AMBIENTE NO CRESCIMENTO

5.9.1 pH
O pH, ou concentração de H+, ou ainda, a atividade de hidrogênio, ah, podem afetar
grandemente a atividade biológica. De forma geral, sempre existe um pH ótimo para uma dada
propriedade específica do microrganismo, como crescimento e formação de produto, embora
estes pH’s ótimos muitas vezes não serem coincidentes de espécie para espécie, linhagem para
linhagem e mesmo para o mesmo microrganismo (pH ótimo de produção pode ser diferente do pH
ótimo de crescimento). Num desenvolvimento de processo, estas características têm de ser
levadas em conta no momento da otimização.


1
maz qp/qpmáx

pHótimo pH

Figura 5.9. Curva de pH ótimo

As curvas de velocidade de crescimento pelo pH podem ser modeladas quando necessário


podendo ser as equações do tipo utilizadas em cinéticas, por exemplo:

m
 m pH   (5.47)
1  K1 H    K 2 H  
   

5.9.2 TEMPERATURA

As reações que ocorrem dentro das células são influenciadas pela temperatura, sendo que
as velocidades de reação são dadas pela equação de Arrhenius:
E 
K  A exp  (5.48)
 RT 

O que se observa normalmente é uma curva do tipo da Figura 5.10.

68

Que colocada na forma de Arrhenius nos dá:

ln   Ea
R

15 < Ea < 20 Kcal/mol

1/T

Figura 5.10. Influência da temperatura na velocidade específica


de crescimento e cálculo da energia de ativação Ea

A classificação de microrganismos em termos da dependência da velocidade de reação em


função da temperatura é representada na Tabela 5.6:

Tabela 5.6. Classificação dos microrganismos segundo a temperatura de crescimento


T (oC)
Mínimo Ótimo Máximo
Termófilos 40 - 45 55 - 75 60 – 80
Mesófilos 10 - 15 30 - 45 35 – 47
Psicrófilos Obrigatórios -5 a 5 15 a 18 19 a 22
Facultativos -5 a 5 25 a 30 30 a 35

Em um modelo não estruturado, se ocorre mudança de temperatura durante o processo,


este deve ser incorporado no modelo. De forma geral, as constantes cinéticas são dependentes
da temperatura segundo as equações:

E  E 
 m T    m exp  a   K d exp  d  (5.49)
 RT   RT 

e o modelo com inibição seria:

69
 m T 
 (5.50)
S2
KS  S 
K i T 

6 CINÉTICA DE REAÇÕES CATALISADAS POR ENZIMAS

O estudo da cinética de reação enzimática é fundamental à construção da cinética de


fermentação (crescimento de microrganismos), visto que o metabolismo microbiano consiste em
uma série de reações enzimáticas acopladas, que ocorrem de forma cadenciada. As células de
microrganismos são sensíveis a modificações de temperatura, pH, etc, devido, especialmente, as
propriedades das enzimas, que são dependentes destes parâmetros. Assim, o conhecimento da
cinética enzimática auxilia no entendimento de muitos fenômenos biológicos, uma vez que permite
compreender o modo como as enzimas funcionam nas células.

6.1 INTRODUÇÃO

As enzimas são proteínas sintetizadas pelas células com propriedades catalíticas devido
ao seu alto poder específico de atuação. Atuam de forma a diminuir a energia de ativação dos
reagentes, acelerando a chegada ao ponto de equilíbrio, sem afetar a constante de equilíbrio e
sem serem consumidas. São especializadas em catalisar reações biológicas, para as quais o seu
modo de atuação é muito importante, pois o equilíbrio deve ser atingido rapidamente e em
temperaturas relativamente baixas.
As enzimas podem ser obtidas a partir de células animais, vegetais e de microrganismos.
A atividade catalítica de uma enzima secretada por determinadas células ou isolada das mesmas
pode ser mantida sob condições adequadas, o que permite sua utilização como biocatalisador,
fora das células. Em processos biotecnológicos as enzimas são utilizadas para catalisar a
produção de compostos de interesse, sendo que ao final do processo podem ser recuperadas.
A alta especificidade das enzimas pelos seus substratos é conseqüência da presença dos
“sítios ativos”, constituídos por resíduos de aminoácidos, que são os locais onde ocorre a ligação
da enzima com o substrato para a formação do complexo Enzima-Substrato (ES), instável. Podem
existir mais de um centro ativo na mesma molécula de enzima e a formação de ES ocorre através
de múltiplas interações como pontes de hidrogênio, forças de Wan-der-waals e interações
hidrofóbicas.
As enzimas freqüentemente necessitam de cofatores, compostos não protéicos que
combinam com a enzima em estado inativo (apoenzimas) para formar um complexo
cataliticamente ativo (haloenzima). Como exemplo para este fenômeno podemos citar a
necessidade Zn2+ para a ativação da enzima álcool desidrogenase e Fe2+ para a catalase, quando

70
se trata de íons metálicos, e da necessidade de moléculas orgânicas complexas denominadas
coenzimas (NAD, FAD, coenzima A, etc.).

Figura 6.1: Necessidade de cofatores para as reações enzimáticas

As reações enzimáticas diferem das reações químicas (catalisadas por um catalisador


inorgânico) em vários aspectos:
 As velocidades de reação são mais elevadas: uma reação catalisada por uma enzima pode
ser 106 a 1012 vezes mais rápida que uma reação não catalisada, e várias ordens de grandeza
mais rápida que uma reação catalisada por um catalisador inorgânico.
 Condições de reação mais suaves: as reações catalisadas por enzimas ocorrem em
condições relativamente suaves - temperaturas abaixo dos 100oC, pressão atmosférica, e pH
próximos da neutralidade. Pelo contrário, a catálise química freqüentemente requer temperaturas
e pressões elevadas, bem como valores de pH extremos.
 Elevada especificidade: as enzimas têm uma especificidade de reação muito maior quanto
aos substratos (reagentes) e produtos que os catalisadores químicos. Ou seja, as reações
enzimáticas raramente apresentam produtos secundários.
 Enzimas são biodegradáveis e atóxicas.
 Capacidade de regulação: As atividades catalíticas de muitas enzimas variam em resposta
às concentrações de substâncias diferentes dos seus substratos. Os mecanismos destes
processos de regulação incluem o controle alostérico, a modificação covalente das enzimas e a
variação nas quantidades de enzima sintetizada.

71
Atividade enzimática
A quantidade de enzima presente ou usada em um processo é difícil de ser determinada
em termos absolutos (por ex. em gramas), pois a pureza é freqüentemente baixa e pode existir
uma certa proporção da enzima em estado inativo. Além disso, a atividade da enzima é o
parâmetro mais relevante.
Esta atividade é usualmente medida em termos de unidades de atividade (U ou UI) que é
definida como a quantidade que catalisa a transformação de 1 micromol de substrato por minuto
mol
em condições padrões 1 UI  1
min
A atividade de uma enzima é claramente de grande interesse quando a enzima é utilizada
em um processo. Por esta razão, as enzimas são comercializadas em termos da atividade ao
invés do peso. A atividade específica (p. e. U/Kg) é também de grande interesse.

6.2 EQUAÇÃO DE MICHAELIS-MENTEN

Em 1913, Leonor Michaelis e Maud Menten, baseados no conceito da formação do


complexo ES (enzima-substrato) como intermediário do processo de catálise enzimática,
introduzido em 1882, propuseram uma equação para a velocidade, explicando o comportamento
cinético das enzimas. Para chegarem a esta equação estes pesquisadores observaram que:

 A velocidade de uma reação enzimática depende da concentração desta enzima, conforme


mostram as figuras abaixo.

P v
4 [ E]
3 [ E]
2 [ E] Prováveis problemas com
métodos de det. de ativ.
1 [ E] Enzimática.
1o ordem

t
v  k[ E ] [ E]

Figura 6.2: Relação entre concentração enzimática e velocidade de reação

 A concentração de substrato é um dos fatores mais importantes que determina a


velocidade das reações enzimáticas, de modo que, fixando-se a concentração de enzima e
variando a concentração de substrato, observa-se o seguinte comportamento:

72
v max
v

Fase III: cinética de


ordem zero
v max
2

a
Fase I: cinética de 1 ordem

km
S
Figura 6.3: Relação entre concentração de Substrato e velocidade de reação

A primeira parte da curva representa uma condição em que o aumento na concentração de


substrato implica em um aumento da velocidade da reação, sempre que ocorram no meio as
condições padrão de trabalho para a enzima. O platô, que ocorre na segunda parte da curva,
significa que a concentração de substrato não é mais o fator limitante, já que seu aumento não
acarreta aumento na velocidade de reação. Inicialmente têm-se uma reação de primeira ordem e
depois, uma reação de ordem zero, independente da concentração de substrato. Este
comportamento pode ser explicado em termos da formação do complexo ES.

Quando a concentração de substrato é baixa, nem todas as moléculas de enzima estão


combinadas com o substrato, portanto, um máximo de velocidade pode ser encontrado para cada
quantidade de enzima. Se a concentração de substrato é alta, todas as moléculas de enzima
estarão complexadas com o substrato, ou seja, os sítios ativos da enzima começam a ficar
saturados e, para cada molécula de produto formado, só uma molécula de substrato é ligada à
enzima, isto quer dizer que a velocidade da reação é constante.
Este comportamento cinético foi proposto em 1913 por Michaelis-Menten, que postularam
que a enzima se complexa reversivelmente com o substrato para formar ES. De acordo com estes
pesquisadores, o modelo cinético que se ajusta à Fig. 6.3, para uma reação enzimática simples
está demonstrado abaixo:

73
k1 k3
ES ES EP
k2 k4
Onde: E: enzima; S: substrato; ES: complexo enzima-substrato; P: produto; K: constantes de
reação.
Segundo Michaelis-Menten, quando se mistura enzima mais substrato, a formação do
complexo ES é imediata, e este imediatamente se rompe, havendo a formação do produto e a
liberação da enzima livre. Para chegar ao modelo matemático, Michaelis-Menten assumiram o
seguinte:

A) Como o estudo se baseava em velocidades iniciais, a concentração de produto neste caso


pode ser considerada desprezível, de forma que a reação inversa praticamente não ocorreria,
ou seja:
k1 k3
ES ES EP
k2

B) Após a mistura da enzima com o substrato ocorre a formação do complexo ES, que permanece
numa concentração constante, ou seja:

d[ES]
0
dt
Assim tem-se:
d[ES]
 [E].[S].K1  [ES].K2  [ES].K3  0 (6.1)
dt
K 2  K 3 [E].[S]
  Km e,
K1 [ES]

ES  [E].[S] (6.2)


Km

Notas:
- A constante Km, dita constante de Michaelis-Menten, é um valor característico para cada
reação enzimática, e quanto menores seus valores, maior é a afinidade da enzima pelo
substrato (Km corresponde à concentração de substrato onde v=vmáx/2).
- Km pode ser aproximadamente igual à constante de dissociação do complexo [ES], visto a
constante K3 ser geralmente muito menor que K1 e K2, assim:

K2
Km 
K1

C) Conceito de velocidade relativa (v/vmáx):

74
O total de enzima participando da reação [Eo] é igual à soma da enzima livre [E] com a
enzima em forma de complexo [ES], ou seja:

E0   E  ES  (6.3)

Visto K3 ser bem menor que K1 e K2, a transformação de ES em E + P será a etapa


limitante do processo, ou seja:

v  K 3 ES (6.4)

Da mesma forma, se toda a enzima estiver participando da reação, então a velocidade de


reação estará no seu máximo, ou seja:

v max  K 3 E0  (6.5)

Então, tem-se que a velocidade relativa v/vmáx (utilizando as Eq. 6.3, 6.4 e 6.5):

v

[ES]

ES (6.6)
v max [Eo] E  ES
Na equação acima tem-se a velocidade em função do complexo ES, não mensurável na
prática. Deseja-se relacionar a velocidade com a concentração de substrato (mensurável), e para
tal, utiliza-se a Eq. 6.2, obtida a partir da consideração B. Substituindo a expressão para ES na
equação 6.6:

[E][S]
v Km [S]
 
v max [E][S] Km [S]
[E] 
Km

Logo:
[S]
v  v max  Equação de Michaelis-Menten
Km  [S]
Nesta equação observa-se:

Se [S] >> Km  v = v max (reação de ordem zero)


v max
Se [S] << Km  v  [S] (reação de 1a ordem)
Km
v max
Se v   Km = [S]
2

75
Convém chamar a atenção para o fato de que a teoria de Michaelis-Menten, embora seja
válida para a maioria das enzimas, é uma simplificação. A formação do complexo ES engloba um
conjunto de intermediários, desde que o substrato se liga a enzima, incluindo as várias
transformações que sofre, até a liberação da enzima e do produto formado.

+ +

E S P
ES ES’ EP’ EP
E

ES da teoria de M-M
Fig. 6.4: Intermediários incluídos no complexo ES

6.2.1 DETERMINAÇÃO DOS PARÂMETROS CINÉTICOS VMAX e KM

A determinação das constantes Km e vmax a partir da Equação de Michaelis-Menten é difícil


de ser obtida no gráfico v= f(S), pois para concentrações de substrato elevadas, a velocidade da
reação aproxima-se assintoticamente de vmax. Na prática, é muito difícil estimar vmax com precisão
a partir de um gráfico como o da Fig. 6.3. Isto implicará em erros, também na determinação de
Km, que depende da determinação de Vmax.
Existem maneiras mais práticas de se obter estas constantes, seguindo a técnica de
linearização da equação. Existem 3 tipos correntes de linearização para a equação de Michaelis-
Menten, conforme descrito a seguir.

6.2.1.1 Equação de Lineweaver-Burk


A transformação da equação de Michaelis-Menten em uma equação linear foi proposta por
Hans Lineweaver e Dean Burk, através da inversão e posterior rearranjo dos termos da equação,
obtendo-se:
1 Km 1 1
 .  (6.7)
v vmax [ S ] vmax

A equação é do tipo y=a.x+b, podendo ser representada da seguinte forma:

Km 1
y .x  (6.8)
Vmax Vmax
1 1
Quando y=0  x  , e quando x=0  y 
Km v max

76
A representação gráfica da obtenção dos parâmetros cinéticos Km e vmáx pode ser
visualizada na Figura 6.5.

6.2.1.2 Equação de Eadie-Hanes


A multiplicação da Eq. 6.7 por S (concentração de substrato) gera a Eq. de Eadie-Hanes,
cuja representação gráfica consta na Figura 6.5.

S 1 Km
 S (6.9)
v vmax vmax

6.2.1.3 Equação de Hofstee


Multiplicando a equação 6.7 (Lineweaver-Burk) por

v 
v max 
 KM 
e reordenando, obtém-se outra forma linearizada da equação de Michaelis-Menten. A
representação gráfica de obtenção dos parâmetros cinéticos através desta forma de linearização
também está colocada na Fig. 6.5.

v
v   Km  vmax (6.10)
S
Lineweaner- Burk Eadie-Hanes Hofstee

vmax
1 S v
v v

km 1
vmax vmax k m

1 km
v`max v`max
vmax
Figura 6.5: Representações gráficas da formas de linearização km

1 1  km S v

km S S
O gráfico de Lineweaver-Burk dá ênfase especial a valores de velocidade baixos, obtidos
em baixas concentrações de substrato, onde os valores de v são relativamente imprecisos.
Portanto, a tangente é pouco precisa (Km/vmax).
O gráfico de Eadie-Hanes tende a espalhar os valores mais altos e mais precisos de v, de
forma que a inclinação 1/vmax é de boa precisão. A intersecção é, no entanto, muito próxima de
zero, o que inclui um grande erro na medida de Km.

77
O gráfico de Hofstee coloca igual ênfase em todos os pontos, dando um bom Km,
necessitando, porém, altas concentrações de S para fornecer um bom vmax. No entanto, apresenta
a variável v nas ordenadas e abscissas o que pode provocar grandes erros.
Em vista disso, a estratégia mais correta aconselhável para a avaliação de Km e vmax é a
seguinte: determinar vmax pela 1a ou 2a equação e posteriormente, voltar ao gráfico v x S e
encontrar S correspondente a v = vmax/2, que corresponde ao valor de Km.

6.3 REAÇÕES REVERSÍVEIS E COM MÚLTIPLOS SUBSTRATOS

6.3.1 REAÇÕES REVERSÍVEIS

Reações reversíveis são muito freqüentes em processos enzimáticos, particularmente


quando a concentração de produto atinge concentrações consideráveis. Isto é muito freqüente em
reações de isomerização, como a transformação de glucose em frutose pela enzima glicose-
isomerase. O modelo para este tipo de reação é do tipo:

k1 k3
ES ES EP
k2 k4

Neste caso:
d ES 
 0  E 
. S 
. K1   ES .K 2  ES .K 3  E 
. PK 4 (6.11)
dt

ES   E . S   E . P (6.12)


KM KP
Onde:
K1 1

K2  K3 K M
K4 1

K2  K3 K P

Substituindo [ES] na equação de v/vmax reescrita abaixo:

v K 3 .ES  ES 
 
vmax K 3 .EO  E   ES 

Obtém-se:
v

S  
P
v max
KM  S  
P.K M K P  P  
S .K P (6.13)

KP KM
78
6.3.2 REAÇÕES COM MÚLTIPLOS SUBSTRATOS

Grande parte das reações enzimáticas ocorrem com 2 ou mais substratos. Em boa parte
delas o segundo substrato é a água (hidrólises), cuja concentração é mais de 1000 vezes superior
ao outro substrato, podendo ser considerada constante, de forma que se cai num tratamento
semelhante ao de Michaelis-Menten. No caso de existir efetivamente 2 substratos, um possível
tratamento matemático é o seguinte:

E  S1 ES 1
k1
E  S2 ES 2
k2

ES 1  S 2 ES 1 S 2
k12

ES 2  S1 ES1 S 2
k 21

ES 1 S 2 PE
k

v = K [ES1S2]

Chamando:
[E] = e [ES1] = es1 [ES1S2] = es1s2
[S1] = s1 [ES2] = es2 [Eo] = eo
[S2] = s2

Temos:
eo = e + es1 + es2 + es1s2

Então se deve achar o valor de (es1s2) para se obter a equação de v.

K1. es1 = (eo - es1 - es2 - es1s2 ) s1


K2. es2 = (eo - es1 - es2 - es1s2 ) s2
K12. es1s2 = es1. s2  es1 = K12 . es1s2 / s2
K21. es1s2 = es2. s1  es2 = K21 . es1s2 / s1

K 12 es1 s 2
K1  (eo  es1  es 2  es1 s 2 ) s1
s2
K1K12  K 2 K 21

79
K 2 1 es1 s 2
K2  (eo  es1  es 2  es1 s 2 ) s 2
s1
K 12 es1 s 2 K es s K es s
K1  (eo  12 1 2  2 1 1 2  es1 s 2 ) s1
s2 s2 s1
eos1 eo
es1 s 2  
K 1 K 12 K s K 1 K 12 K K
 K 21  12 1  s1  21  12  1
s2 s2 s1 s 2 s1 s2

Portanto:
K [ Eo ]
v (*) (6.14)
K 1 K 12 K K
 21  12  1
s1 s 2 s1 s2
S1
ou v  vmax
*
,
K  S1
*
M

KEoS 2 K12 K1  K 21S 2


onde: *
v max  K M* 
S 2  K12 S 2  K12

A determinação das constantes desta equação é um processo bastante trabalhoso,


descrito com detalhes em Dixon e Webb, baseando-se na manutenção de um substrato constante
e variando o outro, e vice-versa.
Por outro lado, se os sítios ativos da enzima são diferentes para cada substrato, não
ocorrerá interferência nas respectivas afinidades, ou seja, K1 = K21 e K2 = K21, de forma que a
equação se reduzirá a:
S1S2
K [Eo ]
K1K 2
v (6.15)
S S
(1  1 )(1  2 )
K1 K2

6.4 REAÇÕES COM INIBIÇÃO

Nem todas as reações enzimáticas seguem a teoria clássica descrita por Michaelis-
Menten. Via de regra, encontram-se problemas de inibições, seja por compostos que podem estar
presentes na solução, seja pelo produto formado ou pelo substrato a partir de uma determinada
concentração. Os inibidores afetam a atividade das moléculas enzimáticas combinando-se com
elas, influenciando negativamente a ligação do substrato ou a velocidade de reação, e são
classificadas conforme o seu modo de ação. Os processos de inibição podem ser reversíveis ou
irreversíveis, conforme descrito a seguir.

80
6.4.1 INIBIÇÃO IRREVERSÍVEL

Neste tipo de inibição o inibidor liga-se à enzima diretamente no seu centro ativo,
formando um complexo EI inativo, irreversível com a enzima, impedindo que a mesma se ligue ao
substrato. Como exemplos de inibidores irreversíveis podem-se citar os cianetos, gases tóxicos e
metais pesados. O mecanismo da reação é:

.
K1 K3
ES ES EP
 K2
I
K4
EI

Neste caso o somatório de todas as formas presentes de enzima é:


E0   E   ES   EI 

A velocidade relativa será:

v K 3 .ES  ES 
  (6.16)
vmax K 3 .EO  E   ES   EI 

Torna-se necessário encontrar uma relação para [ES] e para [EI] em função da
concentração de substrato (mensurável). Para [ES], tem-se que:
d ES 
 0  E . S . K1   ES .K 2  ES .K 3 (6.17)
dt
Mas, para [EI]:
d EI 
0 (6.18)
dt
Logo, não há modelo cinético para este tipo de inibição, pois com o decorrer do tempo, [EI]
estará sendo acumulado e a enzima sendo consumida.

6.4.2 INIBIÇÃO REVERSÍVEL

Na classe de inibidores reversíveis encontra-se uma grande diversidade de tipos. Os mais


comuns são: competitivos, não-competitivos e incompetitivos.

81
6.4.2.1 Inibição Reversível Competitiva
Um inibidor competitivo é uma molécula que compete diretamente com o substrato pelo sítio
ativo da enzima. Um inibidor deste tipo em geral tem suficientes semelhanças estruturais com o
substrato para se ligar ao centro ativo, mas é suficientemente diferente para não reagir (Fig. 6.6).

O grau de inibição depende da relação Inibidor/Substrato,


de modo que, aumentando-se a concentração de substrato, o
efeito pode ser revertido. Isto ocorre em função de que com
uma maior concentração de substrato, este competirá com
maior vantagem pela enzima em relação ao inibidor.
Na prática identifica-se este tipo de inibição pela redução
da porcentagem de inibição através do aumento da
concentração de substrato. Através da análise cinética, que se
faz através do uso de diversas concentrações de substrato em
concentração fixa do inibidor (gráfico da Fig. 6.7), verifica-se
Fig. 6.6: Inibição competitiva que o valor de Km é alterado, porém, vmax permanece
constante.
A representação gráfica desse tipo de inibição pode ser
i
visualizada na figura abaixo:
1 km
v
vmax  vmax
i
v
Graficamente observa-se v km
o comportamento
max
:
vmax

1 1
 i
v`max v
`max

km kmi S 
1 1 1

km k mi
S

Fig. 6.7: Representação gráfica de Inibição Competitiva

Para a obtenção dos mecanismos de reação e modelos cinéticos da inibição reversível


competitiva, considera-se a inibição totalmente competitiva.

K1 K3
ES ES EP
 K2
I
K4 K5
EI
inativo

82
O modelo matemático para esta reação pode ser determinado da seguinte forma:
Tal como visto anteriormente,

[Eo] = [E] + [ES] + [EI]


d ES 
 0  E . S . K1   ES .K 2  ES .K 3 ES   [E].[S]
dt Km
d EI 
 0  E . I . K 4   EI .K 5 EI   [E].[I] , onde 1/Ki=K4/K5
dt Ki
v = K [ES]
vmax = K [Eo]

E S  S
v

ES   Km  Km 
S
v max E   ES   EI 
E   E S   E I  1  S  I Km  S  Km I
Km Ki Km Ki Ki
S
v  v max (6.19)
S  K m  1  I 
 Ki 

ou, em outra forma de expressar:

S  I 
v  v max onde K im  K m 1  (6.20)
S  K im  Ki 

Sendo Ki a constante de inibição e K im a constante de Michaellis-Menten aparente (afetada


pelo inibidor).

6.4.2.2 Inibição Reversível Não-Competitiva


O inibidor com essa característica liga-se a enzima em um ponto diferente do centro ativo,
combinando-se reversivelmente com a enzima ou com o complexo enzima-substrato, interferindo
na ação de ambos (Fig. 6.8). Ocorre que a enzima perde a capacidade de formar ES na
velocidade normal e, quando se forma ES, ele não pode ser desfeito. Esta inibição não pode ser
revertida pelo aumento da concentração de substrato, pois a reação com o inibidor produz formas
inativas de EI e EIS. É um tipo comum de inibição, pois reagentes podem combinar-se com
grupos funcionais da enzima, fora do sítio ativo, mas que podem ser essenciais para a
manutenção da atividade catalítica ou da conformação da enzima.

83
Fig. 6.8: Inibição não competitiva

Esse tipo de inibição é reconhecido na prática em gráficos de 1/v x 1/[S], porque na


presença do inibidor, o gráfico apresenta diferente inclinação e a intersecção 1/vmáx é maior para a
enzima inibida do que para a enzima não inibida (Fig. 6.9). Portanto a velocidade máxima é
diminuída pelo inibidor e não pode ser restabelecida. No entanto, Km permanece inalterado.

v 1
v max v km
i
vmax

i
Vmáx/2 vmax
km
1 vmax
i
v`max
1
v`max
k m  k mi 1 1
S   i 1
km km
S
Fig. 6.9: Representação gráfica da Inibição não Competitiva

Da mesma maneira que para a inibição competitiva, para a obtenção dos mecanismos de
reação e modelos cinéticos da inibição reversível não competitiva, considera-se a inibição
totalmente não-competitiva.

ES ES EP
 km  k
I I
ki ki

EI  S EIS 84
km
A equação de velocidade de reação é dada pela equação:
S
v  v imax
Km  S

Sendo:
v max
v imax  (6.21)
1 I
Ki

6.4.2.3 Inibição Reversível Incompetitiva


O inibidor incompetitivo não se combina com a enzima livre, nem afeta sua reação normal
com o substrato, mas combina-se com o complexo ES formando ESI inativo, incapaz de sofrer a
transformação em produto. O grau de inibição aumenta com o aumento da concentração de
substrato. O esquema deste tipo de inibição está demonstrado abaixo, bem como a representação
gráfica. As constantes Km e vmáx sofrem uma diminuição.

-I +I

Fig. 6.10: Inibição Incompetitiva

v 1
vmax
v

i
vmax
1
i
v `max

1
v`max
i
km km 
1

1 '' 1
S k mi km
' S

85
Fig. 6.11: Representação gráfica da Inibição Incompetitiva

O mecanismo reacional é:

ES ES EP
km 
I
ki

ESI
Neste caso, o modelo cinético será obtido a partir das equações abaixo:

[Eo] = [E] + [ES] + [ESI]


d ES 
 0  E 
. S 
. K1   ES .K 2  ES .K 3  ES 
. I .K 4  ESI .K 5 (6.24)
dt

d ESI 
 0  ES 
. I 
. K 4   ESI .K 5 ESI   [ES].[I].K 4 (6.25)
dt K5
Substituindo a Eq. 6.24 na Eq. 6.25:

ES   [E].[S] (6.26)


Km

Com a substituição das Eq. 6.25 (onde K4/K5 = 1/Ki) e 6.26 na equação abaixo, obtém-se o
modelo cinético para este tipo de inibição, representado pela Eq. 6.28.

v

ES (6.27)
v max E  ES  ESI 

Modelo:

86
v

S
SI
(6.28)
v max Km  S 
Ki

Intersecções nos gráficos de Lineweaver-Burk para casos de Inibição

A Tabela 6.1 representa os valores das intersecções nos gráficos de Lineweaver-Burk para
os casos de cinética com inibição. A intersecção no eixo das abscissas representa o termo -1/Kmi,
de modo que, a partir da determinação da constante de M-M na presença do inibidor (Kmi) pode-se
determinar a constante Ki.

Tabela 6.1: Intersecções nas figuras de Lineweaver-Burk


Intersecção nos eixos das Intersecção nos eixos das
Tipo
ordenadas abscissas
1
1
Competitivo  I 
v max Km 1  
 Ki 
I
1 1
Não-competitivo Ki
v max Km

 I 
1
I
1  
Incompetitiva Ki  Ki 
v max Km

As constantes são determinadas fazendo-se medidas sem inibidores para se determinar


Km e vmax e em seguida com inibidor para se determinar Kim e vimax. No caso das inibições mistas,
medidas adcionais devem que ser efetuadas a fim de se obter K’m e v’max. v’max é obtido com
excesso de inibidor e de substrato e K’m com excesso de inibidor.

6.4.2.4 Inibição pelo substrato

Mecanismo:
ES ES EP
km 
S
ki

ESS

Quando há inibição pelo substrato, o gráfico da velocidade de reação em função da concentração


de substrato (S) toma a forma abaixo:

87
v max
Michaellis-Menten

Com inibição
pelo substrato

S* S

Figura 6.12: Velocidade em função da concentração de substrato para inibição pelo substrato

Onde:
S*= concentração de substrato onde começa a haver inibição.

A obtenção do modelo cinético é semelhante ao demonstrado para a Inibição


incompetitiva, porém, para o caso da inibição pelo substrato, I=S. Assim, o modelo cinético pode
ser representado pela Eq. 6.29:
v max S (6.29)
v
S2
Km  S 
Ki
Ki
Quando S>>Km, então: v  v max ,
S  Ki
1 1 S
que na forma recíproca torna-se:  
v v max Ki v max

S
Quando S << Ki então: v  v max
Km  S
1 1 Km 1
que é a equação de Michaelis-Menten, ou seja, na forma recíproca:  
v v max v max S

1/v
× ×
× ×
× × × Km/Vmáx
×
1/Vmáx

-1/Km 1/S

Figura 6.13.: Determinação das constantes cinéticas

88
Para o cálculo de Ki toma-se a derivada da equação de v em função de S e iguala-se a
zero, obtendo-se a tangente no ponto de máxima velocidade, onde a concentração de substrato
atinge o valor onde inicia-se o processo de inibição:

dv
 0  S*  K m .K i (6.30)
dS

6.5 OUTRAS INFLUÊNCIAS NA ATIVIDADE ENZIMÁTICA

6.5.1 EFEITO DA TEMPERATURA

A enzima, sendo uma proteína, esta sujeita à desnaturação, o que implica na perda da
atividade. Geralmente esta desnaturação é irreversível, significando perda definitiva do poder
catalisador. Esta desnaturação pode ser mais ou menos rápida dependendo das condições do
meio. Em relação a temperatura, os seus efeitos sobre as enzimas são complexos, podendo
afetar o estado de dissociação dos grupos funcionais envolvidos na reação enzimática, a afinidade
da enzima por ativadores ou inibidores, a solubilidade do oxigênio (pode ser um dos substratos da
reação), etc.
As reações enzimáticas, como na maioria das reações químicas, têm sua velocidade
aumentada pelo aumento da temperatura, dentro da faixa de temperatura em que a enzima é
estável e mantém sua atividade integral. A maior parte das enzimas apresentam temperatura
ótima em torno de 30-40ºC. Na faixa entre 45 e 50ºC, as enzimas começam a ser inativadas por
desnaturação térmica, que acima de 50ºC é muito rápida. Sob temperaturas de congelamento as
enzimas operam lentamente. Para a conservação de determinada enzima ocorre que a
estabilidade é maior quanto mais baixa for a temperatura, de modo que esta condição deve ser
utilizada para se estocar enzimas.
A inativação de uma enzima consiste na perda de atividade, diferente da inativação de
uma proteína, que é caracterizada por uma modificação na estrutura secundária ou terciária.
Como conseqüência das observações acima pode-se dizer que quando há um aumento da
temperatura de reação, dois fenômenos ocorrem simultaneamente:
 a velocidade da reação enzimática aumenta, como conseqüência do aumento da energia
cinética;
 ocorre o aumento na taxa de desnaturação da enzima, acima da temperatura crítica, que é
aquela em que a enzima estará ainda com sua capacidade catalítica inalterada.
O resultado final é uma curva como a da Figura 6.14, cujo formato depende do tempo de
reação:

89
zona de ativação zona de desnaturação
v térmica

Tótima T
Figura 6.14.: Efeito da temperatura na velocidade de reação enzimática

6.5.1.1 Zona de ativação térmica

Sabe-se que: v = K [E] (6.31)

A velocidade v pode ser relacionada com a temperatura, na zona de ativação térmica,


segundo a formalização de Arrhenius:
Ea

v  vo e RT

Ou seja,

E
ln v  ln vo  a (6.32)
RT

O termo Ea/R é a tangente da reta de lnv x 1/T, de modo que é possível conhecer a
energia de ativação da reação àquela temperatura. Este conhecimento facilita o cálculo em termos
de quantidade de energia para que ocorra uma transformação enzimática que resulte no
rendimento desejado de um produto, ou para diminuir ou inibir uma transformação indesejável.

Se em baixas temperaturas, a desnaturação for desprezível, [E] é constante, então:


E
 a
*
K Ko e RT (6.33)
Onde:
K: constante cinética
K*o: constante cinética hipotética para uma T infinitamente alta
Ea: energia de ativação
R: constante universal dos gases
T: temperatura absoluta

90
A partir da equação 6.33 podemos chegar em:

Ea
ln K  ln K o  (6.34)
RT

ln K

Ea

R

1/T

Figura 6.15.: Influência da temperatura na constante cinética e cálculo da energia de ativação Ea

Por outro lado, a desativação a temperaturas mais altas pode não ser desprezível de forma
que neste caso deve ser considerada de cinética de desnaturação. É comum descrever a cinética
de desnaturação, como sendo de 1a ordem, muito embora casos mais complexos sejam
freqüentes.

6.5.1.2 Zona de desnaturação - cinética de desnaturação de primeira ordem


Devido ao fato que a quantidade de enzima ativa pode diminuir consideravelmente durante uma determinada reação, como
conseqüência da temperatura, pH, força iônica, força mecânica e presença de substâncias estranhas como detergentes e metais
pesados, em muitas aplicações a cinética de desativação da enzima é tão importante quanto a cinética da própria reação.

Na cinética de primeira ordem a enzima perde a atividade segundo a equação abaixo:


dE
  Kd .E (6.35)
dt
Onde:
E: concentração da enzima ativa
Kd: constante cinética de desnaturação numa dada temperatura

A integração da equação acima resulta em uma expressão para a concentração de enzima


ativa em função do tempo:

E  E0  e  K d t (6.36)
Onde:
Eo: concentração de enzima ativa no tempo 0
t: tempo de reação

91
De acordo com a Eq. 6.36, a concentração de enzima ativa diminui exponencialmente com
o tempo, de modo que a maior velocidade de desativação da enzima ocorre quando E
(concentração de enzima ativa) é alta.

E
dE
dt

T1
T2
T3 T1<T2<T3<T4<T5
T4
T5

Figura 6.16.: Concentração de enzima ativa em função do tempo para diferentes condições de
temperaturas

T5
dE
T4
dt
T3

T2
T1<T2<T3<T4<T5
KdT2
T1
KdT1

Figura 6.17.: Determinação da constante cinética de desnaturação em diferentes condições de


temperatura

A estabilidade das enzimas é expressa em função de sua meia vida (t1/2) numa dada
temperatura, a qual pode ser obtido a partir da equação 6.36. Sabe-se que (t1/2) corresponde ao
E
tempo decorrido no qual a enzima perdeu 50% da atividade inicial, ou seja,  0.5
Eo

t1/2

T 92
Figura 6.18.: Tempo de meia vida de uma enzima em função da temperatura

Desta forma tem-se, a partir da Eq. 6.36:


E
 0.5  e  Kd t1/ 2
Eo
Ou
ln 0.5
t1 / 2   (6.37)
Kd
Deve-se considerar que a constante Kd é dependente da temperatura, assim como o é K,
dentro da formalização de Arrhenius. Então pode-se escrever para Kd:
Ed

Kd  K . e *
d
RT
(6.38)

Onde:
Kd*: constante de desnaturação hipotética a T infinita
Ed: energia de ativação de desnaturação da enzima

Assim sendo, a equação global da dependência da velocidade em relação à temperatura


seria:
v = K [E]
Ea

K K e * RT

E = Eo e-Kd.t
Ed

Kd  K *d e RT

Então
  Ea  Ed  
v  k * Eo exp    t . Kd * exp     (6.39)
  RT  RT  
Ou seja,

  Ea t 
v  k * Eo exp    0.69  (6.40)
  RT t1 / 2 

6.5.1.3 Cinética de desnaturação não linear

Além do mecanismo de desnaturação linear, existem outros tipos de desnaturação que


podem ser explicados por um mecanismo de desnaturação denominado “modelo em série”, onde

93
existe um estado intermediário da enzima, no qual ela não estando completamente desnaturada,
pode ter uma atividade diferente da inicial, podendo até ser maior.

k1 k2
E E1 E2

Matematicamente seria:

dE
  K1 E (6.41)
dt
Integrando-se:

E = Eo.exp (-K1.t)

Partindo do mecanismo de desnaturação em série ilustrado acima pode-se chegar:

dE1
  k 2 E1  K 1 E
dt

 K 2 E1  K 1 Eo exp  K 1. t 
dE1

dt

Integrando-se esta equação para t = 0 e E1 = 0 tem-se:

E1 
K 1. Eo
K 2  K1
exp  K . t  exp  K . t 
1 2 (6.42)

Sendo: E2 = Eo – E – E1

tem-se que a quantidade de enzima inativa:


 K1 K1 
E 2  Eo . 1  exp  K 1 . t   exp  K 1 t   exp  K 2 t  (6.43)
 K 2  K1 K 2  K1 

A atividade total da enzima num determinado tempo t é resultante das três formas da
enzima, combinando suas respectivas atividades. Chamando de:

E, E1, E2 = concentrações enzimáticas


v, v1, v2 = velocidade ou atividade
1 e 2 = razão da atividade nos estados intermediários pela velocidade inicial
v1 v2
1  e 2 
v v

Então a velocidade ou atividade global pode ser descrita pela equação:

94
 E   1 E1   2 E 2
vK (6.44)
Eo

De forma que a equação final será:

  1 K1  K   K  K  
v  K  2  1   2 2  . exp  K 1 .t    1 1  2 1  . exp  K 2 . t  (6.45)
  K 2  K1 K 2  K1   K 2  K1 K 2  K1  

Desta forma, dependendo do valor de 2 num dado tempo, a atividade pode ser menor ou
mesmo maior (2 > 1) que a inicial. Se 1 e 2 forem nulos, recai-se numa cinética de 1a ordem.
Assim este modelo pode englobar as várias formas de desnaturação enzimática encontradas na
literatura.

6.5.2 EFEITO DO BINÔMIO TEMPO x TEMPERATURA

Sendo a enzima uma proteína, ela tende a perder atividade no tempo. Esta perda será
mais rápida quanto maior for a temperatura, como ilustra a figura abaixo.

Figura 6.19: Perda de atividade de uma enzima com o decorrer do tempo, para diferentes
temperaturas (50, 55, 60, 65 e 70°C)

Além da temperatura, outros fatores também influem na estabilidade da enzima, tais como
pH, concentração de sais, etc. O ideal é se conhecer estas condições de ótima estabilidade não
só para o armazenamento do produto, como também para minimizar a perda durante determinado
processo. Normalmente é aconselhável a realização de um estudo da produtividade e custos em
função destes fatores, para minimizar perdas. O gráfico abaixo ilustra bem este argumento,
verificando-se que nem sempre a temperatura ótima da enzima é a temperatura ideal de
operação. Na figura, T1 seria a temperatura de operação com menor perda de enzimas e T 2, a
temperatura de máxima produtividade, porém com perda consideravelmente maior da enzima.

95
rs t1/2

t1/2**

t1/2
*

Tótima T

Figura 6.20.: Representação gráfica do binômio tempo x temperatura

6.5.3 EFEITO DO pH

O pH influencia a atividade enzimática interferindo com a estabilidade e com a atividade


propriamente dita, pois, devido ao fato da enzima possuir vários grupos ionizáveis, mudanças no
pH afetarão o sítio catalítico e a conformação da enzima. O pH adequado propicia que os
grupamentos do centro ativo fiquem na forma química adequada para interagirem com o
substrato. Os efeitos ambientais e do meio interagem sobre a atividade enzimática, mas o
conhecimento do pH ótimo de atividade de uma enzima é um bom indicador para caracterizá-la
frente a um substrato. Principalmente se ela pode atuar sobre mais de um substrato, cada um
será melhor transformado em diferentes pHs.
Em geral, enzimas são ativas numa faixa limitada de pH e em muitos casos existe um
ótimo. A faixa ótima de atividade, para a maioria das enzimas, está entre pHs variando de 4,5-8,0.
Há exceções como a pepsina (pH ótimo 1,8) e arginase (pH ótimo 10), que por serem enzimas
que atuam em situações específicas dos tecidos vivos, apresentam diferenças mais
características em termos de pH.
Outros exemplos são mostrados na figura abaixo.

1 2 3 4
% atividade
máxima

2 6 10 pH

Fig. 6.21.: Representação gráfica do efeito do pH em diversas enzimas:1–Invertase de leveduras;


2--amilase de Bacillus sp; 3–Aminoacilase (A. oryzae); 4-Protease alcalina (Bacillus sp)

96
6.5.4 OUTROS FATORES QUE PODEM INFLUENCIAR A ATIVIDADE ENZIMÁTICA

Muitos outros fatores podem afetar a atividade enzimática. Podemos citar como exemplos
a força iônica do meio, a pressão (principalmente se um dos reagentes for gasoso), o tampão
empregado e a pureza dos reagentes e da enzima.
Todos estes fatores devem ser experimentalmente determinados ou no mínimo, escolhidos
arbitrariamente e mantidos constantes durante os estudos.

7 REATORES BIOQUÍMICOS

Os biorreatores ou reatores bioquímicos são o coração dos processos bioquímicos. São


reatores onde uma dada reação bioquímica ocorre. Esta reação pode ser o resultado de
crescimento de microrganismos ou uma reação catalisada por enzimas. No primeiro caso dizemos
que o biorreator é um fermentador. O conceito de biorreatores pode ser também estendido para
outros tipos de processos que envolvem microrganismos ou produtos de origem biológica como
tanques para tratamento biológico de águas residuárias ou ainda colunas de purificação de
bioprodutos (enzimas, vitaminas, aminoácidos, etc.). Os biorreatores podem ser divididos também
nas formas clássicas dos reatores de mistura e tubulares. O estudo do comportamento, projeto e
dimensionamento de cada biorreator é possível de ser efetuado pela combinação de
conhecimentos de cinética das reações biológicas com balanços de energia e massa.
Neste capítulo consideraremos inicialmente a forma simplificada dos reatores ideais, para
melhor entendimento das características essenciais dos biorreatores, para, em seguida,
estudarmos os desvios da idealidade nos reatores reais, como conseqüência dos desvios da
hidrodinâmica dos sistemas.

7.1 REATORES BIOLÓGICOS IDEAIS


Dentro dos biorreatores reais estudaremos inicialmente os fermentadores do tipo reatores
de mistura perfeita, nas suas diferentes formas de operação, tais como, reatores em batelada,
batelada alimentada e contínuos. Em seguida, veremos os reatores tubulares e os enzimáticos.

7.1.1 REATORES DE MISTURA

7.1.1.1 Reatores em Batelada


Este processo constituiu-se basicamente de duas etapas: preparação do inóculo e a
fermentação propriamente dita.

97
a. Preparo do inóculo
Inóculo (pé-de-cuba ou pé-de-fermentação) é o volume de uma suspensão de
microrganismos capazes de garantir a fermentação de um dado mosto. O volume de inóculo pode
variar segundo as condições de 0,5 a 50% da capacidade do tanque. A técnica de seu preparo
compreende uma fase de laboratório e outra industrial, segundo o esquema abaixo, obedecendo a
regra do volume crescente.

incubação incubação
fase
laboratório

cultura pura V1 V2 >V1 V3 > V2

Incubação
fase
planta ind.

Vn
V4

Figura 7.1. Técnica de preparo do inóculo

Existem, basicamente, três modos de operação de um sistema batelada:


 processos em que a dorna recebe um inóculo;
 processos com recirculação do microrganismo;
 processo por meio de cortes.
No primeiro caso, o sistema oferece as melhores condições para uma boa fermentação,
pois recebe o inóculo de células ativas e praticamente isenta de contaminantes. No segundo caso,
algumas dornas são incubadas no início do processo. O meio, uma vez fermentado, é
centrifugado obtendo-se assim uma suspensão de microrganismos de elevada concentração. A
suspensão é tratada (ou não) com o objetivo de eliminar as células inativas e os microrganismos
contaminantes. Esta suspensão é re-utilizada então como inóculo de outro fermentador. No
terceiro caso, inocula-se uma dorna no início do processo e quando a fermentação atinge um
estágio apropriado, passa-se parte do conteúdo para uma outra dorna e completa-se ambas as
dornas com o meio fresco, a fermentar. A sucessão de cortes pode ocasionar perda de
98
rendimento principalmente se o meio não é esterilizado. Este processo pode ser utilizado também
na preparação do inóculo o que evita que o processo seja reiniciado repetidas vezes. Existem
também processos mistos que associam dois dos processos citados.
Um reator batelada, ilustrado na figura abaixo, ideal é espacialmente homogêneo de forma
que as propriedades físicas e químicas do meio são iguais em todo o reator.

b. Equações do reator em batelada


A forma matemática geral de balanço para reatores em batelada pode ser escrita da
seguinte forma:

V
S
X

entrada - saída – consumo (ou crescimento) = acúmulo

ou seja,
dC i V 
0 - 0 -r(Ci.Cj)V =
dt
dCi V 
 V r Ci , C j  (7.1)
dt
Onde V é o volume do reator, Ci é a concentração do componente i e Cj representa a
concentração de outras substâncias que podem influir na cinética de formação ou consumo do
componente i. O termo r(Ci,Cj) é a taxa volumétrica de formação ou consumo do componente i.
Pode-se escrever o balanço de massa global do sistema como sendo:
d V 
0 (7.2)
dt
Isto implica que a massa total do sistema permanece constante, em outras palavras, tanto
V como a densidade do meio permanecem constantes. Desta forma pode-se simplificar a equação
7.1 para obter-se:
dC i
dt

 r Ci , C j  (7.3)

Considerando o modelo de Monod para crescimento de microrganismos, a equação acima


pode ser reescrita da seguinte forma para expressar a velocidade de crescimento celular e de
consumo do substrato, após o balanço de células e balanço de substrato:

Balanço de células

99
dX μ SX
 μX  max (7.4)
dt Ks  S
Balanço de substrato

dS 1 μ max SX
 (7.5)
dt Yx s K s  S
Estas equações podem ser somadas, após a multiplicação da equação de S por Yx/s, e
obteríamos a equação abaixo:

d X  Yx sS
0

(7.6)
dt
Ou seja, para X(0)=X0 e S(0)=S0:

X  Yx sS  X 0  Yx sS0  X  X 0  Yx s S0  S

Substituindo-se X na equação de S, tem-se:

dS μ
  max

X 0  Yx s S0  S S  (7.7)
dt Yx s K s  S

Cuja integração analítica fornece

 X 0  Yx s S0  S 
X 0 
 Yx s S0  K s  ln    K s Yx s ln
S
 μ max X 0  Yx s S0  t (7.8)
 X 0  S 0

Esta equação é implícita em S e a melhor forma de se calcular o consumo do substrato em


função do tempo é obtendo-se t para valores especificados de S.
Se existe formação de produto e este é parcialmente associado ao crescimento pode-se
escrever:
dP  SX
  max  X (7.9)
dt Ks  S

De uma forma geral, as equações cinéticas de um processo fermentativo em batelada, que


segue a lei de Monod, seriam:

dX
 μX (7.10a)
dt

dS 1
 μX (7.10b)
dt YX
S

100
dP dX
α  βX (7.10c)
dt dt

c. Cálculo do número e volume dos reatores


Em todo processo em batelada, o número total de reatores que são colocados em
operação deve ser tal que a operação pós-fermentação (downstream) mantenha-se, de
preferência, em fluxo contínuo. Isto é particularmente importante em processos onde é necessário
destilação, como na industria de etanol, pois as colunas de destilação trabalham em fluxo
contínuo. Este cálculo depende de alguns fatores como explanado a seguir.
Consideremos:
F: vazão média do meio fermentado enviado ao setor de tratamentos finais
tf: tempo de fermentação
V: volume do fermentador
n: número de fermentadores
td; tempo de descarga de um fermentador
tc: tempo de limpeza e carregamento
M: massa do produto que se deseja obter num tempo t.
r: rendimento do tratamento final
C: concentração do produto no meio fermentado
M
F (7.11)
C. t .r
V
td  (7.12)
F
Para facilitar os cálculos, toma-se tc = td.
Existirá um tempo td de intervalo entre o começo de funcionamento de duas dornas
consecutivas. Tomando-se como tempo zero o início de funcionamento da primeira dorna, a dorna
n deverá iniciar o funcionamento no instante (n-1).td. Por outro lado, a dorna n deverá iniciar seu
funcionamento no instante tf + td, como indica a figura abaixo:

101
tf td
d

fermentador 1 fermentador 2 fermentador 3 fermentador n fermentador 1


b

a
td tempo
Figura 7.2.: a: início do preparo do fermentador, b: fim da carga e início da fermentação, c: final da
fermentação e início da descarga, d: final da descarga e início de outro ciclo de operação

Podemos então escrever:

n  1.t d  t d  t f  n  2  t f (7.13)
td
F.t f
n  2 (7.14)
V
F e tf são conhecidos e V deve ser determinado em função de custos mínimos. Assim sendo,
teremos o número econômico de dornas (ne). Sendo p, o custo de um fermentador de volume útil
V, é válida a equação empírica, onde K e a são parâmetros que dependem das condições
econômicas:

p  K.V a 0<a<1 (7.15)

Indicando P o custo de n fermentadores, temos combinando as equações (7.13) e (7.14):

n
P  n.p  K( F.t f ) a .
( n  2) a
(7.16)
Esta equação permite o cálculo de ne que conduz ao valor mínimo de P:

2
ne  (7.17)
1 a

Aplicando-se a equação acima na equação (7.13) teremos a capacidade útil econômica


(Ve) de cada um dos n fermentadores.
1 a
Ve  .F.t f (7.18)
2a

102
Se houver a disponibilidade de uma lista de preços de dornas de diversas capacidades
pode-se achar o valor de a da seguinte forma:

p  K.V a (7.19)

logp  logK  a . logV (7.20)

d. Morte celular em culturas em batelada


De forma geral, culturas em batelada se processam em tempos relativamente curtos e
neste estado a morte celular é praticamente irrelevante. Contudo em algumas culturas, com tempo
relativamente longo e com células submetidas a stress físico ou químico, pode ocorrer morte
celular em taxas importantes de modo que a viabilidade em tais culturas passa a ser
significativamente menor que 100%. Em tais casos é importante poder avaliar a cinética de morte.
Se considerarmos que somente células viáveis (Xv) geram células não viáveis (Xd), numa cinética
de primeira ordem, cuja constante é k, pode-se escrever para batelada
dX v
 X v  kX v (7.21)
dt
dX d
  kX v (7.22)
dt

O crescimento total da população é dado por:


dX t dX v  X d 
  X v (7.23)
dt dt

7.1.1.2 Reatores em batelada alimentada


A batelada alimentada é um tipo especial de processos em batelada onde o substrato é
alimentado constantemente, durante o processo fermentativo, de forma a manter esta
concentração constante, ou aproximadamente constante, resultando num sistema com volume
variável. A batelada alimentada é um processo de muito sucesso, pois elimina a inibição pelo
substrato, resultando em altas produtividades, geralmente muito maiores que as obtidas na
batelada simples. Os balanços são muito similares à batelada simples, exceto pelo fato de que
existe uma alimentação e, portanto o volume do reator é variável. Fazendo-se os balanços a partir
da figura abaixo tem-se:

Sa

V0
S0
X0

103
Figura 7.3. Reator em regime de batelada alimentada

dρV 
 ρ A F : balanço global de massa no reator
dt
Considerando ρ constante e igual a ρA,então:
dV
F (7.24)
dt
dSV 
 FSa  rs V : balanço do substrato
dt
dXV
 rx V : balanço de células
dt
dPV
 rp V : balanço de produto
dt
Onde V é o volume do reator num tempo t e F é a vazão de alimentação, rs e rx são as
velocidades de consumo do substrato e de crescimento, respectivamente.
Sabendo-se que:
rx  μX (7.25)
temos
dXV dXV
dt
 μXV   XV
 μ*t (7.26)

Como S é mantido constante pelo efeito da adição de substrato (na concentração S*),
toma-se  constante e igual a *. Assim, integrando-se a equação acima de (XV)0 a um (XV)
genérico tem-se:

XV  XV0 e μ t
*
(7.27)

Do balanço do substrato, considerando S constante e igual a S*, tira-se:


dV 1 *
S*  S* F  FSa  μ XV (7.28)
dt Yx s


F Sa  S*   1 *
Yx s
*
μ X 0 V0 e μ t (7.29)

De onde tira-se a equação para F, que é a vazão de alimentação necessária para manter S
constante.
*
μ * X 0 V0 e μ t
F (7.30)

Yx s S a  S* 
A estimativa da variação do volume pode ser tirada da seguinte equação, obtida da
integração da equação acima ao se substituir F por dV/dt:

104
 
 X0 
V  V0 1  eμ t  1 
*
(7.31)

 Yx s Sa  S
*

e a concentração da biomassa
*
X 0 eμ t
X (7.32)

1 
X0

 
eμ t  1 
*



 Yx s S a  S
*


Fim da alimentação Fim da fermentação

V X S
V
Vf
X

S*

Vo Xo
S

t
Batelada alimentada Batelada simples

Figura 7.4. Volume, biomassa e substrato em função do tempo para um reator de batelada
alimentada

7.1.1.3 Reatores de mistura contínuos

a. O Quimiostato: o reator de mistura ideal


O uso de reatores contínuos começou na década de 50 com os trabalhos de Monod. A
descoberta de que as culturas de microrganismos podiam ser mantidas em estado estacionário
por longos períodos, em qualquer taxa de crescimento até max, foi um passo importante no
entendimento da fisiologia e metabolismo dos microrganismos.
A configuração típica de um reator de mistura contínuo é ilustrada na figura abaixo:

105
Fe
X0 Saída de gases
S0 (O2, CO2)

Controle de pH

Reservatório de
Fs
meio
X
S
V
X
S
Reservatório de
ácido ou base

Reservatório de meio
Entrada de ar fermentado
estéril

Figura 7.5. Configuração típica de um reator de mistura contínuo.

Meio novo, normalmente estéril, é introduzido no reator e o volume é mantido constante


para que a retirada de meio fermentado seja em igual taxa na qual é introduzido o meio novo. O
nome “quimiostato” deriva das propriedades químicas do ambiente que são constantes quando o
sistema funciona em regime permanente.
Um outro sistema, conhecido como turbidiostato, é um quimiostato provido de uma célula
fotoelétrica para regular a turbidez da cultura, ou seja, para aumentar a vazão de entrada do meio
(F), quando a concentração celular ultrapassa o nível desejado.
O volume de líquido é mantido constante através de um controlador de nível. A diferença
básica existente entre o turbidiostato e o quimiostato, é que no primeiro a densidade da biomassa
é fixada e a taxa de diluição ajusta-se ao regime estacionário e no segundo a taxa de diluição é
fixada e a concentração de biomassa ajusta-se ao regime estacionário.
As equações de balanço podem ser escritas para as principais variáveis do processo:

a.1. Balanço de células

Células entrando – Células saindo + Células crescendo = Acúmulo de células

d  XV 
 FO X O  FX  rxV (7.33)
dt
Sabemos que rx  X , Fo=F, e que V é constante, portanto:

106
d X  F F
 .X 0  .X  .X (7.34)
dt V V
Usualmente X0 = 0, o que nos dá:
F dX 1 dX F
 .X  .X   .  (7.35)
V dt X dt V

dX
Em regime permanente:  0 , logo:
dt
F
 (7.36)
V
F
Chamando de taxa de diluição D, que é o inverso do tempo de residência (), temos:
V
1
D (7.37)

Portanto, em regime estacionário, a taxa específica de crescimento será igual à taxa de
diluição D.

a.2. Balanço do substrato

Substrato entrando – Substrato saindo – Substrato consumido = Acúmulo de substrato

F F 1 dS
.S0  .S  ..X  (7.38)
V V Yx s dt

dS
Em regime estacionário: 0
dt
F F 1
.S0  .S  . .X  0 (7.39)
V V YX
S

 .X
D(S0  S)  (7.40)
YX
S

Como =D
X  Yx s (S0  S) (7.41)

Considerações feitas para obtenção desta equação:


 Yx s independe de  e D (o que nem sempre é verdadeiro);

 X independe de todos os nutrientes, exceto o limitante;


 Yx s é afetado somente pelo tipo de substrato.

107
As duas últimas são relativamente corretas em certas condições (Temperatura, pH, O2,
constantes e excesso de todos os outros nutrientes).

Temos deduzidas as equações:


=D
X  Yx s (S0  S) (7.42)

Já conhecemos a equação de Monod:


S
   máx (7.43)
KS  S
Então podemos escrever para um quimiostato em regime permanente:
S
D  Dc (7.44)
KS  S
Onde DC é a taxa de diluição crítica que representa a máxima diluição em que um
quimiostato pode operar. Com algumas exceções, DC é geralmente igual a máx. A equação acima
fica:
D.K S
S (7.45)
μ max  D
Substituindo as equações temos:
D.K S
X  Yx s (S0  ) (7.46)
μ max  D
Usando as equações acima, o comportamento teórico de um quimiostato pode ser
representado na figura abaixo, onde nas ordenadas tem-se os valores das variáveis X, S e Pr em
regime permanente e nas abscissas os valores da taxa de diluição D:

X S
S
Pr X

Pr
washout

DM Dc D

Figura 7.6. Variações da taxa de diluição em função de X, S e P

108
X
S S0
X

S
F3 D3
F2 D2
F1 D1
X=0
tempo

Figura 7.7.: Efeito da vazão nas concentrações de biomassa e substrato

O washout é o ponto onde a concentração de células atingirá zero, em regime permanente,


devido à taxa de alimentação ser superior a taxa de reprodução do microrganismo. Essa taxa de
diluição é normalmente conhecida como diluição crítica (Dc). Pode ser determinada
aproximadamente pela relação:
 S
D c  max 0 (7.47)
K s  S0

a.3. Produtividade
Um processo de fermentação é sempre avaliado pelo fator de conversão ou rendimento e
pela produtividade média. A produtividade Pr é definida como:
Pr  D.X (7.48)

M 
  3   produtividade volumétrica
V
onde pr
 L .t 
A produtividade volumétrica faz referência à eficiência do processo ou equipamento

M 
pr     produtividade mássica
m

 t 
A produtividade mássica está relacionada à capacidade de produção da indústria.
  D 
Pr  D.Yx s S 0  K S   (7.49)
   máx  D 
A variação de Pr em função de D está representada na figura anterior. A taxa de diluição
necessária para obtenção da produtividade máxima será a derivada primeira da equação acima
igualada a zero. Derivando obtém-se DM
 1 
  KS  2 

D M   máx 1    (7.50)
 K  S 0  
  S 

109
Então a produtividade máxima PrM será:
 1 
  KS  2 
PrM  D M .X M   máx 1    .X (7.51)
  K S  S0   M
 
É interessante notar que a produtividade máxima não ocorre necessariamente em uma
taxa de diluição que corresponde à conversão máxima do substrato. Portanto neste processo, a
otimização deve ser feita levando-se em conta a produtividade, o rendimento e o substrato
residual no efluente.

Auto regulação de um quimiostato


Considerando as equações:
1 dX
. D (7.52)
X dt
S
   máx (7.53)
KS  S

 D.S0  S 
dS 1
..X (7.54)
dt Yx s

Analisemos os 4 casos abaixo:

Perturbação Resposta
dS dX
X↓  0, S , μ ,  0, X 
dt dt
X↑
dS dX
 0, S , μ ,  0, X 
dt dt
F↓ dS
D ,  0, S , μ , μ  D
dt
F↑ dS
D ,  0, S , μ , μ  D
dt

Neste ultimo caso, se D > max, ocorrerá uma lavagem no reator, ou washout, com a
eliminação total dos microrganismos.

110
b. Sistemas múltiplos-estágios

F, X0, S0, P0

F, X1, S1, P1

F, X2, S2, P2 F, Xn-1, Sn-1, Pn-1

F, Xn, Sn, Pn

Figura 7.8. Esquema de fermentação com múltiplos estágios.

O balanço de massa no primeiro reator será exatamente o de um quimiostato, se a


alimentação for estéril, ou seja, X0 = 0. Se todos os volumes forem iguais então D1=D2=…=Dn=D

Desta forma tem-se para o primeiro reator:

1  D (7.55)

DK s
S1  (7.56)
 max  D

X1  Yx s S0  S1  (7.57)

7.1.1.3.1.1.1

7.1.1.3.1.1.2 b.1. Balanço de massa celular no segundo reator

7.1.1.3.1.1.2.1 Células entrando – Células saindo + Células crescendo = Acúmulo de


células

F F dX
.X1  .X 2   2 .X 2  (7.58)
V V dt
dX
D.X1  D.X 2   2 .X 2  (7.59)
dt

111
dX
No estado estacionário: 0 (7.60)
dt
D.X1  D.X2   2 .X 2  0 (7.61)
X 2  X1
2  D (7.62)
X2

b.2. Balanço do substrato no segundo reator

Do balanço de massa do substrato, de forma análoga ao quimiostato, tira-se:

Substrato entrando – Substrato saindo – Substrato consumido = Acúmulo de substrato

F F 1 dS
.S1  .S2   2 .X 2 
V V Yx s dt

F F 1
.S1  S 2  2X2  0 (7.63)
V V Yx s

DS1  S 2  
1
2X2 (7.64)
Yx s

Substituindo-se a equação de 2 obtida acima na equação anterior tem-se:


X 2  Yx s S1  S2   X1 (7.65)

E tomando-se a equação de X1 e substituindo na equação anterior tira-se:


X 2  Yx s S0  S2  (7.66)

Tendo-se ainda a equação de Monod, recai-se num sistema de 3 equações e 3 incógnitas


(X2, S2 e 2) que devem ser resolvidas para se obter S2 e X2.
Caso o sistema contenha mais de 2 reatores, procede-se de forma idêntica até o último
reator. Generalizando as equações podemos escrever:

Para a concentração celular:


X n  X n 1
n  D (7.67)
Xn

ou ainda
D.X n  2
X n 1  (7.68)
D   n 1

Ou seja:

D 2 X n  2 
Xn  (7.69)
D   n D   n 1 

112
Genericamente:

D n 1 .X 1
Xn  (7.70)
n
 D   i 
i2

Para a concentração do substrato:

DS n 1  S n  
1
nXn (7.71)
Yx s

1 1
S n  S n 1  nXn (7.72)
D Yx s

A outra equação necessária é sempre a equação da cinética de crescimento.


Considerando a equação de Monod, teremos para o enésimo reator:
Sn
 n   max (7.73)
Sn  Ks

Caso haja formação de produto teremos:


Pn  Yp x X n  X n 1   Pn 1 (7.74)

ou ainda
Pn  Yp s S n 1  S n   Pn 1 (7.75)

c. Sistema com reciclo de células

F, X0, S0, P0 F',X'0,S'0,P'0


B
F',X1,S1,P1

F, Xs, Ss, Ps

Fr, Xr, Sr, Pr

Figura 7.9. Sistema com reciclo de células

Sistemas com reciclo de células são muito comuns na indústria de fermentação. A principal
função do reciclo de células é aumentar a concentração celular no interior do fermentador, tendo
como conseqüência o aumento da velocidade de conversão do substrato. Industrialmente, este
reciclo é feito com centrífugas, normalmente quando o microrganismo é uma levedura, ou por
microfiltração, quando o microrganismo é uma bactéria. Neste último caso, o reciclo de células é

113
total, ou seja, a concentração de células no efluente (Xs) é zero, e no caso das centrífugas, deve-
se ter em conta a eficiência do aparelho. Em ambos os casos, ocorre a concentração da massa
celular (Xr > X1) e não há concentração de compostos solúveis (S, P).
O tratamento matemático leva em consideração, inicialmente um balanço de massa na
junção B, para se obter os valores de fluxo e concentrações na entrada do reator. Deve-se ter em
conta também a eficiência da centrífuga e o valor da taxa de reciclo.

c.1. Balanço no ponto B:

Balanço Global:

F a  Fr  r  F' 
Para simplificar, consideremos as densidades dos diferentes fluxos iguais, de forma que
teremos:
F  Fr  F'

Levando em consideração ainda a taxa de reciclo   Fr F tem-se:


F'  F1  

Balanço de Células:

Fr X r  FX0  F' X' 0

Se a alimentação é estéril então:


α
X 0  Xr (7.76)
1 α

Se por outro lado, a eficiência da centrífuga for definida como , tem-se:


Fr X r

F ' X1
α
X r  φ X1
1 α
ou seja,
1 α
Xr   X1 (7.77)
α
assim, tem-se para X'0:
X' 0  X1 (7.78)

Balanço do Substrato

114
Fr S r  FS0  F' S' 0

FSr  FS0
S' 0  (7.79)
F1   

S r  S 0
S' 0 
1 

Como a concentração de reciclo Sr é praticamente igual à que sai do fermentador S1, tem-
se:
S1  S 0
S' 0  (7.80)
1 

Se a conversão do substrato é total temos S10, então:


S0
S' 0  (7.81)
1 

Balanço do Produto

Fr Pr  FP0  F' P' 0 (7.82)

Se P0=0 e PrP1 tem-se:



P' 0  P1 (7.83)
1 

c.2. Balanço no reator:


O balanço no reator segue os mesmos critérios do reator com inoculação constante (por
exemplo, o segundo reator de um sistema múltiplo estágios), de forma que teremos para as
diferentes variáveis:
X  X' 0
D 1 (7.84)
X1

onde D=F'/V=F(1+)/V
X1  Yx s S' 0 S1   X' 0 (7.85)

E se a cinética pode ser a de Monod teremos:


S1
   max (7.86)
K s  S1

Desta forma, como nos casos anteriores, teremos 3 equações e 3 incógnitas que possuem
solução real, se os valores de , , F e V forem conhecidos, assim como as constantes cinéticas
max e Ks.

115
d. Sistema múltiplos-estágios com alimentação múltipla
Estes sistemas encontram aplicação quando existe algum ganho de produtividade,
normalmente quando o substrato e o produto são inibidores, ou quando há necessidade de
alimentar um segundo substrato ou um ativador para um determinado produto (enzima, antibiótico,
etc.). A Figura 7.9 ilustra o processo.
A análise matemática do sistema é muito similar ao visto anteriormente. O primeiro reator
funciona como um quimiostato, se a alimentação for estéril, ou como um reator de reciclo caso
haja reciclo de células (linhas pontilhadas). No segundo reator deve-se fazer o balanço na junção
B, como visto anteriormente. É importante notar que a vazão de alimentação no segundo reator
neste caso será F+F', ou seja, a taxa de diluição será diferente no segundo reator, caso os
volumes sejam iguais.

F’, S’

F, Xo, So, Po
F, X1, S1, P1 F'', X'1, S'1, P'1

B
F', X2, S2, P2

Figura 7.10. Sistema estágios com alimentação múltiplos

e. Comparação entre quimiostato e sistema de múltiplos estágios


Muitas vezes é difícil manter uma cultura no estado fisiológico trabalhando-se num reator
homogêneo simples estágio tipo quimiostato. É o que acontece quando uma cultura tem atividade
máxima na fase exponencial de crescimento. Neste caso deveríamos manter D=máx o que não é
aconselhável, pois qualquer aumento acidental da vazão do meio padrão poderá provocar uma
lavagem no fermentador. Então aqui se deve empregar um turbidiostato ou um sistema duplo
estágio. No caso do turbidiostato a taxa de diluição se ajustará a concentração de células fixada à
priori (no caso seria uma concentração celular que fornecesse D=máx). Para o sistema duplo
estágio, ou eventualmente, múltiplos estágios existe maior possibilidade de representar em maior
escala as fases de uma curva de crescimento e, portanto a reprodução do estado fisiológico onde
a atividade é máxima. Esta característica pode ser esquematizada segundo a figura abaixo:

116
P

1 estágio

2 estágios

D
Figura 7.11. Variação do produto com D

O mesmo raciocínio pode ser aplicado no caso em que a atividade máxima encontra-se na
fase estacionária. É praticamente impossível manter uma cultura na fase estacionária num
simples estágio. Haveria necessidade de um volume adicional relativamente muito grande o que
acarretaria em encarecimento dos custos de implantação. É mais sensato, portanto adicionar um
segundo estágio onde a fase estacionária será mais facilmente atingida e com menores custos.
Outros tipos de fermentação exigem altas concentrações do substrato para que se chegue
a resultados expressivos. O resultado disto é que a constante de saturação torna-se muito alta
dificultando a utilização do substrato. Deve-se então usar um fermentador multi-estágios ou
eventualmente uma combinação de um quimiostato com um fermentador tubular. Este sistema
misto pode também ser utilizado na produção de toxinas onde um reator simples ou duplo estágio
não permite a suficiente concentração do produto.

7.1.2 REATORES TUBULARES

A aplicação de reatores tubulares em processos biológicos é muito rara senão inexistente.


A razão é muito simples: primeiro que devido às próprias características do processo, onde via de
regra é necessário aerar, agitar, corrigir o pH, alimentar com substrato, etc., torna-se quase
impossível manter-se um fluxo pistonado. Além disso, a existência de material particulado, como o
microrganismo, tende a formação de um sistema bifásico, com decantação da biomassa,
crescimento na parede do reator, etc. As dificuldades, portanto, são inúmeras. Por outro lado,
conhecendo-se a teoria dos reatores tubulares, pode-se obter sistemas que se aproximam deste
tipo de reator, como veremos agora.

117
F, S0, X0 F, S, X

S, X S

L
Figura 7.12. Comportamento do substrato e biomassa em reatores tubulares

Como característica principal de um tubular as concentrações variam no interior do tubo


como ilustra a figura acima. Observa-se também, que o formato das curvas assemelha-se muito
aos processos descontínuos em reatores de mistura. De fato, a análise matemática dos reatores
tubulares ideais, mostra que a cinética deste tipo de reator é igual a, o reator tubular, ao contrário
do reator de mistura, necessita uma inoculação constante para que o processo fermentativo
ocorra. Esta inoculação constante pode ser conseguida com reciclo de células.
Embora as concentrações mudem no interior do tubo, quando o regime permanente está
estabelecido, as concentrações não mudam num mesmo ponto durante o tempo de fermentação.
Isto significa que o reator tubular é um sistema variável no espaço, mas constante no tempo.
A análise matemática pode ser feita a partir do esquema abaixo:

v (m/s) vS|z vS|z+Z v (m/s)

S0 A S

Z Z+Z Z=L
v = vazão linear (m/s);
A: área da seção transversal;
S: concentração do substrato;
Z: distancia percorrida pelo fluido dentro do reator.

O balanço no volume infinitesimal é:

taxa de entrada – taxa de saída – taxa de transformação = acúmulo

118
dS
vAS z  vAS z Δz  A  zrs z  AΔ z
dt Acumulo

Em regime permanente o acúmulo é zero e, portanto, dS/dT = 0. Assim, obtém-se após


rearranjo da equação acima:
vS z  vS z Δz dvS dS
rs     v , pois v é constante, dada ser a área também constante.
Δz dz dz
Assim
dz dS
v  rs   (7.87)
dt dt
Este resultado é o mesmo obtido para um reator de mistura em batelada. No caso do
reator tubular o tempo de reação será igual ao tempo de retenção  do fluido dentro do reator.
Neste caso temos:
V
 (7.88)
F

V = volume do reator (L)


F = razão do fluido (L/s)

Por ser impossível se obter um verdadeiro tubular em fermentações, consegue-se


aproximadamente o mesmo efeito, dividindo-se o tubo em diferentes seções, ou seja, colocando-
se vários reatores de mistura em série, como ilustra a figura abaixo.
Neste sistema a variação das concentrações será em degrau e quanto maior o número de
reatores de mistura mais próximo se estará do tubular verdadeiro. Na prática, limita-se o número
de reatores por motivos econômicos, pois a partir de uma certa quantidade (4 ou 5) os ganhos em
produtividade são desprezíveis.

F, S0, X0 F, S, X

S, X S

X
L
119
Figura 7.13. Analogia entre reatores tubulares e sistemas de múltiplos estágios

É importante frisar, que este sistema é aplicável para alguns tipos de processos
fermentativos, principalmente aqueles em que o produto é inibidor e a concentração do substrato
é geralmente alta na entrada do primeiro reator. Este sistema exige um tempo de residência longo
para que todo o substrato seja convertido, e isto só é conseguido com altos rendimentos e altas
produtividades em reatores múltiplos estágios deste tipo. Um exemplo típico desta aplicação é a
produção de álcool combustível, que utiliza 4 a 5 fermentadores e reciclo de células. No entanto,
para outros sistemas este tipo de fermentador pode não ser o mais indicado.
Portanto, a análise matemática deste tipo de reator é idêntica à análise feita anteriormente
nos sistemas múltiplos estágios, e não necessita ser repetida.
Partindo dos resultados obtidos numa fermentação descontínua e da equação de
1 dX
crescimento do microrganismo, μ  , pode-se determinar as condições necessárias para se
X dt
obter uma determinada quantidade de células.
A reta partindo da origem, linha de operação, fornece o valor de D, como mostra a figura.
Este método pode ser utilizado para predizer a concentração celular em regime estacionário num
exato D ou, vice versa, empregado para determinar o D necessário para uma desejada população.
A linha de operação deverá passar pela origem se X0=0. A intersecção da linha de
operação com a curva fornece a concentração celular no reator. A primeira intersecção M deve
ser ignorada porque representa um estado instável e porque ocorre na fase lag.
Quando o método gráfico é usado em sistemas multiestágio, as condições no primeiro
estágio são determinadas como se fosse um único estágio, ou seja, a reta partida da origem (se
X0=0), a tangente fornecerá D e a intersecção com a curva fornecerá a concentração celular X 1
em regime permanente. No segundo, a alimentação é fornecida pelo primeio reator cuja
concentração celular é X1 como mostra a figura abaixo.
Para os demais estágios procede-se de maneira idêntica. Quando o volume dos reatores é
igual, todas as linhas de operação serão paralelas e conseqüentemente D1=D2=D3=....Dn.
Quando X0 for diferente de 0 (reciclagem de células) a base da primeira linha operatória
deve ser deslocada da origem ao valor de X0 na abscissa.

120
μmáx
X rX Linha de operação

=rX/X=μ
dX/dt

tempo X
Batelada simples Sistema Contínuo

Figura 7.14.: Análise gráfica de sistemas contínuos

rX

Reator 2

D
Reator 3

Reator 1

Xo X1 X2 X3 X
Sistema Contínuo
Figura 7.15.: Projeto de sistemas contínuos

7.1.3 REATORES ENZIMÁTICOS

As conversões bioquímicas podem ser feitas em reatores usando microrganismos, ou


enzimas isoladas como catalisadores. As enzimas produzidas extracelularmente pelos
microorganismos são disponíveis em larga escala e são usadas em vários processos industriais:
panificação, cervejaria, alimentos, couro, têxtil, etc. No entanto, somente algumas enzimas
produzidas intracelularmente por microorganismos são disponíveis comercialmente.
As enzimas podem ser utilizadas na forma solúvel ou insolúvel (imobilizada) e a escolha
entre um processo ou outro depende do tipo de reação na qual está envolvida e/ou do custo do
processo. O mesmo pode se dizer entre a escolha do emprego de enzimas, microorganismos ou
agentes químicos num dado processo industrial.

7.1.3.1 Tipos de Reatores Enzimáticos

121
a. Introdução:
Muitos reatores são usados com enzimas, seja ela na sua forma solúvel ou imobilizada. O
sistema mais comum é o de batelada em tanques agitados. Alguns exemplos são mostrados nas
figuras abaixo:

Figura 7.16. Exemplos de


reatores de fluxo contínuo

Quando a estabilidade da enzima é boa deve-se considerar sua reutilização. Desta forma,
os reatores podem ser classificados como abertos, quando a enzima se perde no efluente do
reator, ou fechado quando ela é retida dentro do sistema. Portanto, quando a enzima deve ser
reutilizada o sistema a ser utilizado deve ser fechado.

b. Cinética de reatores enzimáticos:

b.1. Equação integrada de Michaelis-Menten – Reatores batelada

Consideremos a equação de Michaelis-Menten da seguinte forma:


KE S dS
rS   (7.89)
V K M  S dt

rS = velocidade da reação (mol.seg-1.L-1);


KE = atividade máxima da enzima (mol.seg-1);
V = volume em litros.

Para reações em batelada a equação acima pode ser integrada dando:

S 0  S f   K m ln
Sf

KE
t (7.90)
S0 V
S 0 Sf 
Chamando x a conversão , temos:
S0

xS o  K m ln 1  x  
KE
t (7.91)
V

Rearranjando a Equação 7.91.


122
ln 1  x  
1 KE
xS o  t (7.92)
Km VK m

b.2. Reatores tubulares:

Para um reator tubular (RT) temos:

v (m/s) vS|z vS|z+Z v (m/s)

S0 A S
Z Z+Z Z=L

v = vazão linear (m/s);


A: área da seção transversal;
S: concentração do substrato;
Z: distribuição percorrida pelo fluido dentro do reator.

O balanço na camada infinitesimal é:


taxa de entrada – taxa de saída – taxa de transformação = 0

vAS z  vAS z  z  Azrs z 0 v: m/s


A: m2
vS z  vS z  z dvs dS
rs    v S: g/m3
z dz dz
dz dS rS: g/(m3.s)
v  rs  
dt dt

Este resultado é o mesmo obtido para um reator em batelada. No caso do reator tubular o
tempo de reação será igual ao tempo de retenção  do fluido dentro do reator.
Neste caso temos:
V V = volume do reator (L)

Q Q = vazão do fluido (L/s)

Portanto, a equação integrada de Michaelis-Menten para um reator tubular se torna:

xS o  K m ln 1  x  
KE KE
  (7.93)
Q V
ou,

123
1 KE 1 KE
ln(1  x)  xS o   xS 0   (7.94)
Km QK m K m VK m

b.3. Reatores de Mistura Contínuos


Num reator de mistura contínuo temos:

FR/S F

So S

Tanque agitado

taxa de entrada – taxa de saída – taxa de transformação = 0

QS0  QS  rsV  0

Q S S
Q( S 0  S )  rsV  rs  (S 0  S )  0
V 
KE 1
rs  (7.95)
V Km
1
S
S 0  S KE 1 x KE KE
  xS 0  K m  
 V K 1 x V Q
1 m
S
ou,

1 KE S0
  (7.96)
1 x   1  S 0 (1  K m )  K m
V 1  K m 1  
  S 0 

c. Cinética de Reatores Enzimáticos com Inibição


No parágrafo precedente assumiu-se que a enzima não sofria inibição nem do substrato
nem dos produtos da reação. Muitas enzimas sofrem, no entanto, alguma espécie de inibição, o
que tem um efeito considerável na cinética de um reator.

c.1. Inibição pelo substrato


Neste caso, a velocidade de reação é dada por:

124
KE V S
rs  (7.97)
S2
S  Km 
Ks
As equações para os três tipos de reatores são:

batelada e tubular (RT):


2
S KE KE
xS 0  K m ln ( 1  x)  0 ( 2 x  x 2 )  t ou τ (7.98)
2K s V V

reator de mistura contínuo:


2
x S KE
xS 0  K m  0 (x  x 2 )  (7.99)
1 x Ks Q

c.2. Inibição competitiva pelo produto

rs 
KE/V   S (7.100)
 I 
S  K m 1  
 Ki 

batelada e tubular (RT):

 Km   S  KE KE
1   xS 0  1  0  K m ln ( 1  x)  t ou τ (7.101)
 Ki   Ki  V V

reator de mistura contínuo:


x K x 2 S 0 KE
xS 0  K m  m  (7.102)
1  x Ki 1  x Q

c.3. Inibição não competitiva pelo produto


KE V S
rs  (7.103)
 I  S  Km
1  
 K i 

batelada e tubular (RT):

 S K  2 2  x   S  KE KE
xS 0 1  0  m   S 0   x  1  0  K m ln(1  x)  t ou  (7.104)
 Ki Ki   2K i   K i  V V

reator de mistura contínuo:

125
x x 2 S0
2
 K m  KE
xS 0  K m  1    (7.105)
1 x Ki  S 0 1  x   Q

8 ESTERILIZAÇÃO

A esterilização de um meio de cultura ou ambiente é a operação pela qual todas as formas


de vida (sejam vegetativas ou esporuladas) são eliminadas (destruídas ou removidas) deste meio
ou ambiente.
O conceito de esterilização difere do conceito de desinfecção pelo fato de que neste último
processo ocorre o emprego de uma substância que destrói ou inibe o crescimento de certos
microrganismos em determinados meios.
Os agentes de esterilização e desinfecção podem ser físicos ou químicos:
 Agentes físicos: calor (seco ou úmido); filtração (obtenção de meio ou ar estéril); radiação
(ultra-sons, ultravioleta, raios catódicos).
 Agentes químicos: ácidos, bases, sais, halogênios, álcoois, aldeídos, éteres, fenóis.
A tendência atual é considerar os agentes químicos como ligados aos processos de
desinfecção e os físicos aos de esterilização.
Os processos de maior interesse industrial são os efetuados por agentes físicos e
consubstanciam os processos de esterilização.
A pasteurização (80oC, 15’’) é um processo mais brando que a esterilização (121oC, 15’).
Na pasteurização a intenção é a de eliminação de células vegetativas, sobretudo as células de
microrganismos patogênicos que são mais sensíveis ao calor.

8.1 ESTERILIZAÇÃO PELO CALOR

8.1.1 ESTERILIZAÇÃO PELO CALOR SECO


A esterilização pelo calor seco é feita a temperatura de 160-170oC por duas horas. Não é
aplicada a meios de cultura ou líquidos. Aplicável à vidraria e material de laboratório, e no caso da
esterilização do recheio fibroso dos filtros de ar.

8.1.2 ESTERILIZAÇÃO PELO CALOR ÚMIDO


É feita num ambiente de vapor saturado a 1atm de pressão (T=121oC) durante 15-20min.
Estas condições são suficientes para a eliminação das formas esporuladas (vida latente) de
bactérias, muito mais resistentes que as formas vegetativas. Esta esterilização pode ser feita por
dois métodos:
a) Com vapor latente (100oC): é utilizado vapor à pressão atmosférica. Este método é
preferido sempre que haja no meio de cultura compostos que se decomporiam ou reagiriam com

126
outros à temperaturas mais elevadas, ou quando as condições de cultura inibem o crescimento de
contaminantes (pH baixo, por exemplo). Existem basicamente 2 processos:
a1) esterilização simples por vapor fluente: 20 a 30 minutos.
a2) tindalização: é o aquecimento em ambiente úmido com vapor fluente feito à
100oC/30min e repetido mais 2 vezes com intervalos de 24horas. Os esporos
sobreviventes ao primeiro aquecimento desenvolver-se-ão nas 24 horas seguintes e as
formas vegetativas daí resultantes seriam eliminadas no segundo aquecimento. Por
garantia faz-se um terceiro aquecimento após 24horas.
b) com vapor saturado sob pressão: é feita em autoclaves à 1atm (121oC) por 15 a 20
minutos.

8.1.3 TEORIA DA ESTERILIZAÇÃO PELO CALOR

8.1.3.1 Morte logarítmica

Embora a morte térmica de microrganismos possa ser classificada em várias categorias,


as formas mais comuns de classificação são taxas de morte logarítmica e não logarítmica. A taxa
de morte logarítmica pode ser expressa matematicamente pela seguinte equação:
dN
  K .N (8.1)
dt
Onde N é o número de microrganismos viáveis por mL, K é a constante específica de
morte (min-1) e t é o tempo em minutos.
Integrando a equação acima temos:
N
ln   K .t ou N  N 0 . exp(  K .t ) (8.2)
N0

A última equação é ilustrada na figura abaixo para células vegetativas. A inclinação das
retas é numericamente igual a constante específica de morte K (min-1). O valor absoluto da taxa
específica é a medida da resistência térmica do microrganismo. Quanto menor este calor, maior a
resistência térmica.
1

54ºC
10-1

10-2
No
N

56ºC
10-3

10-4 58ºC
60ºC

10-5
0 2 4 6 8 10 127
Tempo (min)
Figura 8.1. Dados típicos da velocidade de morte para E.coli em tampão, onde N= número de
células viáveis a qualquer tempo e No= número original de células viáveis

8.1.3.2 Morte não logarítmica

Este tipo de morte térmica é freqüentemente encontrado em esporo bacteriano. A cinética


não-logarítmica de morte térmica é ilustrada na figura abaixo.

105ºC
10-1
No
N

10-2
108ºC

10-3 110ºC
116ºC
121ºC
10-4
0 5 10 15 20 25

Tempo (min)

Figura 8.2. Dados típicos de velocidade de morte para esporos de Bacillus stearothermophilus Fs
7954, em água destilada

Onde: N=número de esporos viáveis a qualquer tempo;


No=número original de esporos viáveis.

O modo de inativação dos esporos ocorre da seguinte forma, proposta por Humphrey
(1970):

N R 
KR
 NS 
KS
ND
Os esporos resistentes NR são levados ao estado de inativação ND, passando por um
estado intermediário sensível NS. As equações diferenciais representando estes modelos são:
dN R
  K R .N R
dt
dN S
 KR NR  KS NS
dt

NR, NS, ND: número de esporos resistentes, sensíveis e desativados respectivamente por mL.
KR: taxa específica de desativação das formas resistentes.

128
KS: taxa específica de desativação das formas sensíveis.
t: tempo em minutos.
A solução destas equações diferenciais simultâneas é:

KR  K 
 exp .K S .t   S exp  K R .t 
N
 (8.3)
N0 K R  KS  KR 

N = NR+NS
N0 = número inicial de células viáveis

Um meio de cultura a esterilizar terá inúmeros microrganismos, cujas resistências térmicas


podem ser muito diferentes, como mostra a tabela abaixo:

Tabela 8.1. Resistência térmica de microrganismos.


Tipo de microrganismo Resistência relativa
Células vegetativas de bactérias e leveduras 1
Esporos bacterianos 3x106
Esporos de fungos 2-10
Vírus e bacteriófogos 1-5

Como pode se verificar na tabela, os esporos bacterianos são de longe os mais resistentes
ao calor. Portanto toda a esterilização é baseada na destruição dos esporos bacterianos, o que
nos garantirá que os outros tipos de contaminantes serão destruídos simultaneamente.

8.1.3.3 Efeito da temperatura na cinética de morte

A constante K da velocidade específica de morte, no que diz respeito às suas relações


com a temperatura, comporta-se como as constantes de velocidade das reações químicas,
podendo ser expressa, portanto pela reação empírica de Arhenius:
E

K  A.e R .T
(8.4)
Onde:
A: constante
R: constante dos gases perfeitos
T: temperatura absoluta
E: energia aparente de ativação da destruição de microrganismo
Aplicando logaritmo normal (neperiano):
E1
ln K  ln A 
RT

129
Graficando ln K vs 1/T, a inclinação da reta resultante é numericamente igual à E/R.

ln K

-E/R

1/T

Figura 8.3. Gráfico ln K vs 1/T

A energia de ativação E é a medida da suscetibilidade do microrganismo ao calor. Para a


maioria dos microrganismos a energia de ativação de destruição térmica encontra-se entre 65 e
85 kcal. A alta temperatura destrói os microrganismos e certos compostos presentes no meio de
cultura e que são sensíveis ao calor, como por exemplo, as vitaminas do complexo B. A tabela
abaixo ilustra este fenômeno.

Tabela 8.2. Energias de ativação para destruição de esporos bacterianos e de vitaminas.


Energia de ativação (cal/mol)
Ácido fólico 16800
Álcool d-pantofenil 21000
Cianocobalamina 23100
Tiamina 22000
B. stearotermophilus 67700
B. subtilis 76000
C. botulinum 82000
Vit. C 23100
Vit. A 14600

A esterilização a alta temperatura em curto intervalo de tempo destrói parcialmente menos


nutrientes que a esterilização em temperaturas baixas com grandes intervalos de tempo. Esta
afirmação é a base dos modernos processos de esterilização HTST (high temperature and short
time). O princípio no qual é baseada a esterilização HTST pode ser demonstrado, teoricamente da
seguinte forma:
Consideramos dois substratos S1 e S2 com energias aparentes de destruição E1 e E2 onde
E1 > E2. Construindo o gráfico ln K versus 1/T, temos:

130
ln K
lnK22 A

lnK21 B
lnK12 S1
C
lnK11
D S2

1/T2 1/T1 1/T


Figura 8.4. Gráfico ln K versus 1/T

Notamos na figura acima que quando aumentamos uma temperatura de T1 a T2 a


constante K de velocidade específica de destruição aumenta mais para S1 do que para S2. Isto
quer dizer que, quanto maior a energia de ativação de uma substância ou microrganismo, mais
rapidamente o mesmo será destruído com a elevação da temperatura. Desta forma, podemos
destruir completamente os microrganismos do meio de cultura. A tabela abaixo ilustra bem este
fato:

Tabela 8.3. Efeito da temperatura na destruição de tiamina num nível constante de esterilidade
(esporos de B. stearothermophilus)
Temperatura de Tempo (min) requerido para manter o Perda de
o -16
Esterilização ( C) nível de esterilidade (N/Nb = 10 ) tiamina (%)
100 843 99,99
110 75 89
120 76 27
130 0,851 10
140 0,107 3
150 0,015 1

8.2 ESTERILIZAÇÃO DE EQUIPAMENTO E MOSTO

O fermentador e o mosto podem ser esterilizados em conjunto ou separadamente.

131
8.2.1 ESTERILIZAÇÃO CONJUNTA DE EQUIPAMENTO E MOSTO

8.2.1.1 Aquecimento

É feito por vapor indireto (serpentina ou camisa) ou direto neste caso, pelo fundo da dorna.
No caso de vapor direto, ocorrerá diluição e isto deve ser levado em conta quando da diluição da
matéria-prima. Mantém-se uma pressão de 1 atm por 20 minutos.

8.2.1.2 Resfriamento

É feito por circulação de água através das mesmas serpentinas ou camisas de


aquecimento.

8.2.1.3 Vácuo

Na parte superior da dorna deve haver um orifício para expulsão do ar que fica acima do
mosto, expulsão esta que se verificará durante o aquecimento e reciprocamente suprimento de ar
estéril para evitar a formação de vácuo no espaço livre após resfriamento. Vácuo no sistema
estéril propicia condições favoráveis a contaminações pelas juntas do agitador, gachetas e
registros.

8.2.1.4 Equipamentos acessórios


Deve-se considerar a necessidade de esterilização das conexões existentes no
fermentador (inoculação, amostragem, retirada do mosto fermentado, agitadores registros para
aeração, saída de gases, antiespumante). Em geral, usa-se uma linha de vapor independente
para cada conexão, isto permitirá a esterilização do equipamento acessório independentemente
da dorna.

8.2.2 ESTERILIZAÇÃO DE EQUIPAMENTO E MOSTO SEPARADAMENTE


O processo é o mesmo acima descrito, feito em separado para mosto e para dorna. A
esterilização do mosto pode ser feita através de dois processos distintos, descritos abaixo.

8.2.2.1 esterilização de mosto por processo descontínuo

O recipiente em que se processa a esterilização do mosto é interligado à dorna por uma


tubulação que também é esterilizada antes da transferência. Este processo é muito empregado na
esterilização de mostos amiláceos, sendo aproveitado para cozimento e gelatinização ou
solubilização do amido. Normalmente o tempo gasto neste processo de esterilização é muito
grande (em horas), pois deve ser considerado também o tempo necessário para aquecer e resfriar
o mosto.

132
8.2.2.2 Esterilização do mosto por processo contínuo

Neste processo o mosto é circulado através de uma tubulação como mostra a figura
abaixo.

Figura 8.5 (a). Esterilizador contínuo

D C

B
C

Figura 8.5 (b). Tubo de Figura


espera8.5 (b). Tubo de esfera

Uma das seções desta tubulação (tubo de espera) é isolada termicamente e o tempo que o
mosto leva para percorrer esta seção em temperatura praticamente constante é o tempo de
esterilização propriamente dito. Esta seção, que corresponde no diagrama a ABCD, é dita o tubo
de espera do esterilizador contínuo. Este processo apresenta inúmeras vantagens, a saber:
 flexibilidade tempo x temperatura: com pH baixo podemos usar tempo menor ou temperatura
menor;
 é mais rápido: o mosto permanece pouco tempo com a temperatura elevada;
 há menor destruição de nutrientes que no processo descontínuo, onde a temperatura é menor
e o tempo é maior;
 há menos consumo de vapor;
 ausência de incrustação;
 permite alimentar continuamente um reator operando continuamente;
 controle automático.

133
8.2.3 CÁLCULOS NA ESTERILIZAÇÃO DO MOSTO

8.2.3.1 Esterilização descontínua


Sendo relativamente grandes os tempos que o mosto leva para se aquecer e resfriar, é
necessário leva-los em conta nos cálculos da esterilização descontínua, mesmo porque os
microrganismos começam a ser destruídos em uma temperatura inferior ao da esterilização
propriamente dita, que é denominada temperatura mínima letal. Devemos construir então as
curvas de aquecimento e resfriamento, que têm o seguinte aspecto:

Temperatura Temperatura

tempo tempo
Aquecimento Resfriamento

Figuras 8.6. Curvas de aquecimento e resfriamento.

Como visto anteriormente, o tempo de esterilização é dado por:


 1 N 1 N0
t ln  ln (8.5)
k N0 k N
A eficiência da esterilidade é dada por:
N0  N
n (8.6)
N0
No caso de eficiência 100%, N = 0 e a equação acima perde o seu significado físico. Entra
aqui a noção de grau de incerteza que nada mais é do que outra forma de expressão da
esterilidade. Como nem sempre podemos ter a certeza de que todos os microrganismos foram
destruídos, os cálculos são feitos de maneira a admitir uma probabilidade de destruição
incompleta, suficientemente pequena para satisfazer as necessidades práticas. O grau de
incerteza é, assim, a medida da probabilidade de não haver destruição completa de
microrganismos. Esta probabilidade é numericamente igual a N quando N0 = 1. Assim, por
exemplo, N = 0,001 significa que a probabilidade de destruição não ser completa é de 1/1000.
Quanto maior N, menor o grau de confiança.
Para determinação do tempo t de esterilização de um mosto é necessário: conhecer a
concentração C de um microrganismo no mosto; curvas de morte do microrganismo pelo calor

134
lnN N0 x t  para a confecção da curva (lnk x 1 t ) ; curvas de aquecimento e resfriamento da

dorna (T vs t); temperatura mínima letal para o microrganismo (T m) e temperatura de esterilização


propriamente dita (Te); eficiência desejada ou grau de incerteza.
A aplicação da equação acima durante a fase de esterilização a temperatura constante T e
não apresenta problemas, pois k é constante.
Isto, entretanto, não ocorre durante o aquecimento e resfriamento em que se variando a
temperatura varia-se também o k. É preciso, portanto, elaborar curvas da variação de k com o
tempo. Para que se possa aplicar a equação acima nestes períodos, devemos calcular os valores
médios de k, nos intervalos de tempo correspondentes a estes períodos, entre as temperaturas
letal (Tm) e de esterilização propriamente dita (Te). Utilizamos as curvas T x t de aquecimento e
resfriamento.

Temperatura Temperatura

Te
Tm Te
Tm
T0
Tf

t0 t t1
Figuras 8.7. Curvas T versus t2 tempo t3 t4 t5 tempo

Aquecimento Resfriamento
Como k varia com a temperatura e a temperatura varia com o tempo. Os valores de k são
calculados graficamente, fazendo k x t. Os diferentes valores de k nas diferentes temperaturas são
tirados das curvas ln k x 1/T. Assim sendo, tem-se os dados que permitem construir as figuras
abaixo.

k k

t1 t2 tempo t3 t4 tempo
Aquecimento Resfriamento

Figuras 8.8. Curvas k versus t

135
O valor médio de k nos intervalos de aquecimento (km) e de resfriamento (k’m) é dado pela
fórmula de valor médio de uma função.
t2

 kdt t2

km   k m t 2  t1    kdt  A
t1
(8.7)
t 2  t1 t1

t4

 kdt
 
t4

k m'   k m' t 4  t 3   kdt  B


t3
(8.8)
t 4  t3 t3

As constantes A e B são calculadas graficamente a partir das figuras k x t podemos


construir a gráfico da variação da temperatura durante a esterilização descontínua.

Figura 8.9. Representação esquemática da variação da temperatura de um meio durante sua


esterilização por processo descontínuo

t3 – t2 = te (tempo de esterilização);
N0 = número inicial de microrganismos viáveis;
N2 = número de microrganismos viáveis no início da esterilização propriamente dita;
N3 = número de microrganismos viáveis no fim da esterilização propriamente dita;
N4 = número de microrganismos viáveis no fim do processo.

Apliquemos a equação ln N0/N = kt nas três fases do processo.

136
1 – Aquecimento: trecho N1N2

 K m t 2  t 1   A
N1
ln (8.9)
N2

2 – Na esterilização propriamente dita: trecho N2 N3


N2
ln  kt e (8.10)
N3

3 – No resfriamento: trecho N3 N4
N3
ln  k 'm ( t 4  t 3 )  B (8.11)
N4
Somando-se (1), (2) e (3), e considerando N1 = N0 e N4 = N, temos
2 t 4t
N0
ln  kt e  A B  kt E   kdt   kdt (8.12)
N t1 t3

Esta equação nos permite calcular o tempo de esterilização te, sabendo-se N, dado pelo
grau de incerteza ou eficiência e N0.

8.2.4 CÁLCULOS NA ESTERILIZAÇÃO CONTÍNUA

Como a temperatura é praticamente constante, k pode ser considerado constante. Desta forma podemos nos deparar com dois
problemas genéricos:

a) Conhecidos N0, N, Te e as curvas de destruição, determinar t, tempo de permanência do mosto


no tubo de espera. Calculado o valor do tempo de permanência no tubo de espera, ajusta-se a
vazão ao comprimento do tubo de espera, já que:
1 N0
t ln (8.13)
k N
V A L
t  (8.14)
F F

b) Determinar a temperatura de esterilização Te. Este caso se dá quando a fermentação é


contínua, pois o mosto deve alimentar a dorna numa vazão determinada pelo processo
(fermentação), o que fixa t. Conhecidos N0, N e as curvas de destruição, calcula-se k, e utilizando
o gráfico ln k x 1/T, tira-se a temperatura de esterilização.

1 N
k  ln 0 (8.15)
t N

137
8.3 ESTERILIZAÇÃO POR FILTRAÇÃO

8.3.1 ESTERILIZAÇÃO DO AR

A maior aplicação da esterilização por filtração na indústria de fermentação é na


esterilização do ar. Além desse modo de esterilização do ar, existem alguns outros, mas com
sérios inconvenientes, como é o caso do aquecimento, que exige uma instalação de grande porte.
A filtração através de substâncias químicas, além de exigir equipamentos de grandes dimensões
apresenta o inconveniente de possível arraste de substâncias químicas para o interior do
fermentador.
Verificou-se que tanto a lã de vidro quanto a lã de ROCHA apresentam bons resultados na
filtração, com eficiência que varia de 99,7% a 100%.
Temos abaixo um diagrama típico de filtro de ar. Estes tipos de filtros são esterilizados
após cada fermentação, com ar seco a 170 oC por duas horas.

Sistema de esterilização por resistências elétricas Filtro tradicional para esterilização de ar

Figura 8.10. Filtro para esterilização de ar

8.3.1.1 Teoria da esterilização do ar por filtração


A filtração de células bacterianas ou seus esporos através de uma camada fibrosa é
logarítmica, à semelhança da destruição dos microrganismos pelo calor. A figura abaixo ilustra
esse fato:

N C
ou 2 1
N0 C1
-1 Var= 15,1 pés/s
10
6 3
Densidade de esporos = 8.10 /pés
-2
10
-3
10
-4
10 138
0,1 0,2 0,3 0,4 espessura (pol)
Figura 8.11. Fração de esporos retidos versus espessura da camada fibrosa

Generalizando, consideremos C a concentração de microrganismos que sai do filtro de


espessura x, temos o gráfico abaixo. Considerando K, constante de retenção que depende, para
dado material filtrante, das propriedades físicas do ar, do microrganismo visado e da velocidade
do ar. Esta velocidade é a velocidade linear e é calculada através da seção reta do filtro, suposto
sem material filtrante.

log C

Var = constante

Figura 8.12. Concentração de microrganismos que saem do filtro (C) versus espessura do filtro (X)

Podemos escrever:
dC
  KC (8.16)
dx
Seja C1 a concentração de microrganismos no ar na entrada do filtro, C2 após atravessar o
filtro e x a espessura da camada filtrante.
2 C x
dC dC
  Kdx    k  dx (8.17)
C C1
C 0

C  N 
Kx  ln  1  ou ln  1   Kx (8.18)
 C2   N2 

Onde N1 e N2 representam o número de microrganismos na entrada e na saída do filtro,


respectivamente. Para determinado tipo de ar e para um dado microrganismo, K depende da

139
velocidade do ar (vs). As curvas de K x vs são elaboradas experimentalmente e são da seguinte
forma:

ln k

ln vS
Figura 8.13. Curva de k versus vS elaborada experimentalmente

8.3.1.1.1 Eficiência dos processos de esterilização de ar por filtração

A eficiência é a relação percentual entre o número de microrganismos retido pelo filtro e o número inicial de microrganismos.

N1  N 2
n (8.19)
N1

8.3.1.1.2 Dimensionamento de filtros de ar

Contaminação de ar
Os tipos e concentração de microrganismos no ar dependem de muitos fatores: local,
época, condições meteorológicas (vento, umidade, etc). Por exemplo, após a chuva a
concentração de contaminantes é menor. Nas cidades, via de regra, as concentrações variam, de
3 a 9 células por litro de ar. Os contaminantes mais comuns são esporos de Bacillus subtilis e B.
cereus.
Cálculos
Deve-se construir, com o auxílio de dados obtidos em laboratório, curvas que
correlacionam a espessura da camada filtrante necessária para reter certa porcentagem de
microrganismos. Para simplificar os cálculos considera-se a espessura necessária para reter 90%
dos microrganismos no filtro, deixando passar 10% e esta espessura denomina-se 90. O gráfico
da espessura desse suposto filtro sem camada filtrante em relação à velocidade linear, vs de ar é
o seguinte:

140
ln 90

ln vS

Figura 8.14. Gráfico da espessura do suposto filtro sem camada filtrante em relação à velocidade
linear de ar, vs

Para a retenção de 90%, temos:


N 1 100
  10
N 2 10

N1
log 1
N2
Sabemos que
N1 N Kχ 90
ln  Kx  log 1  (8.20)
N2 N2 2,3
Então:
K 1
Kx 90  2,3   (8.21)
2,3 χ 90

Quer-se dimensionar um filtro que permite esterilizar o ar necessário a determinado


processo fermentativo. Consideramos um suprimento de ar a uma vazão Q, durante um tempo t.
Sabendo-se que a concentração de microrganismo no ar é dada por C, tempos para N1 (Caso não
se conheça C, deve-se tomar uma concentração que varia de 103 a 104 partículas/m3):

N1 = Q . t . C

N2 deve ser conhecido, seja através dos dados de eficiência mínima ou probabilidade de passar
um microrganismo pelo filtro.
N1 Kχ 90 1
log   x (8.22)
N2 2,3 χ 90
ou

141
N1
x  χ 90log (8.23)
N2

Conhecido vs, fixa-se 90 a partir do gráfico vs x 90 e com o auxílio da equação acima
calcula-se x, a espessura da camada filtrante. Como garantia, costuma-se tomar o maior 90
representado na curva de forma que qualquer outra vazão de ar, maior ou menor, daria maior
eficiência ao filtro.
Conhecido Q e vs, calcula-se a superfície do filtro, S = Q/vs.
A Tabela 8.4 expressa as resultados teóricos da dimensão do filtro, para reduzir a
concentração de microrganismo de entrada de um fator de 1015 passando 1200 ft3/min de ar.

Tabela 8.4. Resultados teóricos da dimensão do filtro para reduzir a concentração de


microrganismo de entrada.
vs (ft/s) 90 (in) x (ft) Queda pressão/ Perda Filtro necessário
de carga (psi) Área (ft2) Volume (ft3)
0,1 1,6 2,0 0,06 200 400
0,5 3,6 4,5 0,8 40 150
1,0 4,6 5,8 2,6 20 15
3,0 2,3 1,9 3,2 7 13
5,0 0,6 0,75 2,4 4 3
10 0,15 0,19 1,5 2 0,4

Isto mostra a economia que pode ser feita aumentando-se a velocidade do ar, mas não
tanto que produza deslocamento das fibras, dando lugar à formação de canais ou forçando a
passagem pelas bordas.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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1971.

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Inc., 1972.

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