CENTRO FEDERAL DE EDUCAÇÃO TECNOLÓGICA DE MINAS GERAIS

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA

COORDENAÇÃO DE ENSINO TÉCNICO

Laboratório de Orgânica III - Módulo III - T2 - Noturno

Professora: Adriana de Almeida Pinto Bracarense

Datas da prática: 12/02/2021

Cromatografia em coluna

Josianne Karla Silva

Nilo Beltoso da Silva Filho
Thalita Mirian da Silva Jorge

Belo Horizonte (MG)

2021
1. Introdução
Uma cromatográfica em coluna (CC) é constituída basicamente por uma fase
estacionária, empacotada em um tubo, e uma fase móvel ou eluente. A separação de uma
mistura em um sistema cromatográfico depende das interações que ocorrem entre os
componentes da mistura e as fases estacionária e móvel. Quando apresentam interações
diferentes, os constituintes de uma amostra podem ser separados, em princípio, por
cromatografia em coluna ou outro método cromatográfico[1].
Há uma grande variedade de fases estacionárias(FE) comerciais disponíveis no
mercado, como sílica, sílica flash, celulose, alumina, acetato de celulose, poliamida, RP-8,
entre outras. Quando comparadas às equivalentes de CCD, geralmente apresentam partículas
maiores, responsáveis por separações um pouco menos eficientes. Isso se deve a uma menor
capacidade de compactação das partículas dentro da coluna, tornando a FE menos
homogênea[2].

Sílica e alumina são os adsorventes mais utilizados. Ambos são polares, retendo mais
fortemente componentes mais polares. A sílica é recomendada na maioria dos casos. Este
adsorvente é levemente ácido, retendo com maior intensidade compostos básicos. A alumina
está disponível na forma básica, neutra ou ácida, sendo a forma básica mais comum. Esta irá
reter mais fortemente compostos ácidos. Este adsorvente é bom para componentes que são
fracamente ou moderadamente polares e para purificação de aminas[3].

2. Objetivo

Compreender a técnica da cromatografia em camada delgada (CCC), preparo da

coluna e identificar as substâncias presentes no espinafre.

3. Metodologia
3.1 Materiais

3.1.1 Algodão;

3.1.2 Areia;

3.1.3 Bastão vidro;

3.1.4 Béquer;

3.1.5 Bureta;
3.1.6 Capilar;

3.1.7 Cuba;

3.1.8 Erlenmeyer;

3.1.9 Espátula;

3.1.10 Funil;

3.1.11 Garras;

3.1.12 Gral e pistilo;

3.1.13 Papel alumínio

3.1.14 Pipetas de Pasteur;

3.1.15 Proveta;

3.1.16 Suporte para tubos de ensaio;

3.1.17 Suporte universal;

3.1.18 Tubos de ensaio;

3.1.19 Vidro de relógio;

3.2 Reagentes

3.2.1 Acetato de etila;

3.2.2 Acetona;

3.2.3 Folhas de Espinafre;

3.2.4 Hexano;

3.2.5 Sal sulfato de sódio;

3.2.6 Sílica em cromatoplaca de alumínio;

3.2.7 Sílica em gel;

3.3 Equipamentos

3.3.1. Balança analítica;

3.3.2 Câmara de UV;

3.4 EPI’s e EPC’s

3.4.1 Luvas;
3.4.2 Jaleco.

3.5 Procedimento
3.5.1 Cromatografia em coluna da amostra de espinafre

3.5.1.1 Mediu-se 15 g de folhas de espinafre, 5g de areia e 2 g do sal sulfato de sódio, usando

balança semi analítica.
3.5.1.2 Utilizando o gral e o pistilo, cortou-se manualmente (picou) as folhas de espinafre,
colocando-as no gral, adicionou-se 5 g de areia e 2 g do sulfato de sódio.
3.5.1.3 Fez-se o preparo da mistura dos solventes sendo 8 para 2 de acetona e hexano
utilizando o béquer e o bastão de vidro.
3.5.1.4 Adicionou-se a mistura de solventes as folhas no gral, realizou a maceração, de modo
a extrair um suco de espinafre.
3.5.1.5 Realizou-se a montagem do sistema de cromatografia em coluna, utilizando o béquer,
a bureta, a garra e o suporte universal.
3.5.1.6 Colocou-se algodão no interior da bureta para evitar que a fase estacionária escoasse.
3.5.1.7 Usando um funil colocou-se a sílica (saca) na bureta para verificar a altura na bureta,
logo, retirou-se da bureta a sílica, em seguida utilizando um béquer fez-se a mistura da sílica
com o 10 mL de hexano e verteu-se novamente na bureta. Escore-se o hexano.
3.5.1.8 Adicionou-se 10 mL do eluente hexano/acetona 8:2 à bureta com auxílio do funil.
3.5.1.9 Verificou-se a sílica estava muito bem empacotada e a altura da fase móvel, mantendo
acima da fase estacionária.
3.5.1.10 Acionou-se o suco de espinafre sob a fase móvel, utilizando a pipeta de Pasteur.
3.5.1.11Também reforço a presença da amostra adicionando mais amostra com a pipeta de
Pasteur. Após o procedimento observou-se o resultado.

3.5.2.1 Separação dos isômeros o-nitrofenol e p-nitrofenol através da cromatografia em

coluna (CC) - Parte I
3.5.2.1.1 Realizou-se a montagem do sistema de cromatografia em coluna, utilizando o
béquer, a bureta, a garra e o suporte universal.
3.5.2.1.2 Colocou-se algodão no interior da bureta para evitar que a fase estacionária
escoasse.
3.5.2.1.3 Usando um funil colocou-se a sílica (saca) na bureta para verificar a altura na
bureta, logo, retirou-se da bureta a sílica, em seguida utilizando um erlenmeyer fez-se a
mistura da sílica como 6 mL de hexano/acetato de etila 5:1, tomando a devida precaução de
homogeneizar bastante para retirar o ar, e verteu-se novamente na bureta.
3.5.2.1.4 Adicionou-se 10 mL do eluente hexano/acetona 5:1 à bureta com auxílio do funil.
3.5.2.1.5 Verificou-se a sílica estava muito bem empacotada e a altura da fase móvel,
mantendo rente a fase estacionária.
3.5.2.1.6 Acionou-se a amostra dos isômeros o-nitrofenol e p-nitrofenol, utilizando a pipeta
de Pasteur.
3.5.2.1.7 Realizou-se o abastecimento da coluna até que ocorresse a separação das
substâncias. As substâncias separadas foram coletadas nos tubos de ensaios. Tomasse o
devido cuidado de limpa-se com algodão no exterior da coluna após recolher a primeira
substância garantindo que não haja contaminação da segunda. Após o procedimento
recolheu-se as substâncias separadamente e observou-se o resultado.

3.5.2.2 Cromatografia em camada delgada (CCD) dos isômeros o-nitrofenol e p-

nitrofenol - Parte II
3.5.2.2.1 Primeiramente, recortou-se com auxílio de uma tesoura a cromatoplaca de camada
delgada que geralmente vem no tamanho de 20x20 cm. A tesoura foi aplicada com certos
cuidados, de tal forma que a lateral da sílica obteve um corte limpo, evitando a soltura da
camada branca do suporte de alumínio.
3.5.2.2.2 Com o auxílio de um lápis, realizou-se as marcações da base, assim como quatro
marcações em cada cromatoplaca para guiar a aplicação das amostras.
3.5.2.2.3 Com auxílio de tubos capilares, aplicou-se as substâncias separadas no processo
anterior, retirando-se os excessos aderidos aos tubos capilares.
3.5.2.2.4 Transferiu-se uma quantidade da mistura de hexano/acetato de etila 5:1 (fase móvel)
para a cuba.
3.5.2.2.5 Inseriu a cromatoplaca na cuba, utilizou uma placa de vidro para tampar a mesma. E
aguardou a eluição da fase móvel.
3.5.2.2.6 Retirou-se a cromatoplaca da cuba, com auxílio de uma pinça metálica, e
imediatamente realizou a marcação da linha de término da eluição da fase móvel.
3.5.2.2.7 Com auxílio de uma pinça metálica, introduziu a cromatoplaca dentro de uma
lanterna de emissão de radiação ultravioleta (Câmara de UV). Com auxílio de um lápis,
realizou-se as marcações das manchas. E observou-se os resultados.

4. Resultados e Discussão
4.1 Cromatografia em coluna da amostra de espinafre

O extrato de folhas de espinafre (amostra) foi obtido por maceração com sulfato de
sódio para desidratar as folhas, areia para facilitar a maceração e com o solvente
hexano/acetona na proporção 8:2.
Durante a preparação da fase estacionária, realiza-se a homogeneização adequada da
sílica com o solvente hexano (fase móvel), evitando a presença de gases na bureta (coluna).
Insere-se a fase estacionária na bureta, com o devido cuidado para evitar formação de bolhas
de ar e rachaduras, as quais prejudicariam o resultado da cromatografia.
Após a aplicação da amostra na coluna, adições sucessivas de porções do solvente
permitiram a eluição dos pigmentos amarelos, constituídos por β-caroteno (Figura 1), e dos
pigmentos verdes, constituídos por clorofila [clorofila a, C55H72MgN4O5 (Figura 2 -a);
clorofila b, C55H70MgN4O6 (Figura 2-b)]. As estruturas desses componentes podem ser
verificadas abaixo:

Figura 1 - Estrutura química do betacaroteno

Figura 2 - Estrutura química clorofila

 O β-caroteno (Figura 1), um hidrocarboneto insaturado, de coloração amarela e baixa
polaridade, mostrou interações mais efetivas com o solvente apolar (eluente, fase móvel) do
que com a sílica (fase estacionária), sendo coletado primeiro, uma vez que na coluna
cromatográfica o sentido da eluição é descendente. Por outro lado, as estruturas das clorofilas
a e b (Figura 2) de coloração verde, apresentam um metal (magnésio) no centro de uma
porfirina e favorecem interações mais fortes com a fase estacionária (sílica), sendo, portanto,
mais polares que o β-caroteno. Desta maneira, a separação dos pigmentos foi eficiente, com
um intervalo nítido entre as duas faixas coloridas, devido às diferenças das afinidades e das
interações dos constituintes do extrato com as fases estacionária e móvel do sistema
cromatográfico, conforme verificado na figura abaixo:

Figura 3 - Separação das substâncias na coluna cromatográfica

 Contempla-se na Figura 2 que há duas estruturas químicas distintas para a clorofila,
uma com o radical metil (clorofila a) e outra com o grupo aldeído (clorofila b). Comparando
as polaridades das mesmas, verifica-se que a clorofila (a) tem comportamento menos polar
frente a clorofila (b), uma vez que a extremidade contendo o grupo metil aumenta a
característica apolar, enquanto o grupo aldeído aumenta a característica polar. Dessa forma,
caso continuasse a extração da clorofila, a clorofila (a) seria coletada primeiro, pois ela
interage melhor com a fase móvel do que clorofila (b) que interage melhor com a fase
estacionária.
Não foi necessário o uso de uma bomba de vácuo para pressurizar a fase estacionária
(sílica), porém o seu uso aceleraria o processo de separação das substâncias, uma vez que a
pressão exercida empurraria a fase móvel, otimizando o tempo de análise e tornando o fluxo
mais rápido.

4.2.1 Separação dos isômeros o-nitrofenol e p-nitrofenol através da cromatografia em

coluna (CC) - Parte I
 A nitração do fenol envolve a formação de dois isômeros constitucionais do tipo
posicional, o-nitrofenol e p-nitrofenol, conforme pode ser verificado na Figura 4, os quais
foram separados utilizando a cromatografia em coluna.

Figura 4 – Reação química da nitração do fenol

Durante a preparação da fase estacionária, realiza-se a homogeneização adequada da

sílica utilizando o solvente hexano/acetato de etila (fase móvel) na proporção 5:1, evitando a
presença de gases na coluna cromatográfica. Insere-se a fase estacionária na coluna, com o
devido cuidado para evitar formação de bolhas de ar e rachaduras, as quais prejudicariam o
resultado da cromatografia.

Após a aplicação da amostra na coluna, adições sucessivas de porções do solvente

permitiram a eluição do pigmento amarelo mais forte, constituído por o-nitrofenol e do
pigmento amarelo claro, constituído por p-nitrofenol. As estruturas desses componentes
podem ser verificadas na figura abaixo:

Figura 5 – Estruturas químicas dos isômeros constitucionais.

O o-nitrofenol, mostrou interações mais efetivas com o solvente de baixa polaridade

(eluente, fase móvel) do que com a sílica (fase estacionária) de maior polaridade, devido ao
efeito das interações intramoleculares sobre as propriedades físicas dos compostos. No
isômero orto-nitrofenol, os grupos OH e NO2 podem associar-se internamente por meio de
ligações de hidrogênio, transformando-se no componente menos polar, sendo, portanto,
coletado primeiro. Por outro lado, o isômero p-nitrofenol, de coloração amarela clara,
apresentam interações mais fortes com a fase estacionária (sílica), sendo, portanto, mais polar
que o-nitrofenol, sendo coletado posteriormente. Desta maneira, a separação dos pigmentos
foi eficiente, com um intervalo nítido entre as duas faixas de coloração amarela, devido às
diferenças das afinidades e das interações dos constituintes do extrato com as fases
estacionária e móvel do sistema cromatográfico, conforme verificado na figura abaixo:

Figura 6 – Separação dos isômeros na coluna cromatográfica.

Durante o processo de coleta da fase móvel e de cada substância separada é preciso

agilidade para trocar os tubos de ensaio não permitido que as amostras se misturem
novamente na hora da coleta. Para garantir que não haja contaminação na hora da coleta da
segunda substância, limpa-se o bico da coluna no lado exterior.

4.2.2 Separação dos isômeros o-nitrofenol e p-nitrofenol através da cromatografia em

camada delgada (CCD) - Parte II

Após a separação e coleta dos isômeros o-nitrofenol e p-nitrofenol, preparou-se as

cromatoplacas de camada delgada utilizando suporte de alumínio e como fase estacionária a
sílica.
 Com o auxílio de tubos capilares foram realizadas aplicações da amostra de orto-
nitrofenol nas marcações 3,4 e 5 e da amostra p-nitrofenol na marcação de número 8,
retirando-se os excessos aderidos aos tubos capilares. Após a eluição utilizando como fase
móvel o solvente hexano/acetato de etila na proporção 5:1 na cuba de vidro, retirou-se a
cromatoplaca e realizou a marcação da linha de chegada da fase móvel. A cromatoplaca foi
revelada em uma câmara de UV, conforme a figura abaixo:

Figura 7 – Revelação das cromatoplacas na câmara de UV.

A partir da Figura 7, nota-se a importância em se utilizar a cromatografia de camada

delgada para acompanhar a cromatografia em coluna, uma vez que verifica-se que a
separação e coleta dos isômeros constitucionais o-nitrofenol e p-nitrofenol realizada na
coluna cromatográfica foi eficiente, uma vez que em cada aplicação apenas uma mancha é
visualizada, o que corresponde há apenas um componente em cada aplicação.
Ainda analisando a Figura 7, nota-se que o isômero o-nitrofenol apresenta maior
interação com a fase móvel (apolar), devido a interação intramolecular entre os grupos OH e
NO2 que podem associar-se internamente por meio de ligações de hidrogênio, transformando-
se no componente menos polar, percorrendo, portanto, uma maior distância na cromatoplaca,
uma vez que na cromatografia de camada delgada o fluxo é ascendente. Por outro lado, o
isômero p-nitrofenol apresenta uma maior interação com a fase estacionária (polar), ficando
mais retida na mesma. Os isômeros o-nitrofenol e p-nitrofenol diferem em outras
propriedades físicas devido a interação intramolecular que ocorre no o-nitrofenol, como por
exemplo, a solubilidade em água do para-nitrofenol é maior que a do orto-nitrofenol e o
ponto de fusão do para-nitrofenol é maior que a do orto-nitrofenol.
 Caso a cromatografia em camada delgada não fosse eficiente, e o eluente escolhido
não fosse capaz de arrastar os isômeros pela fase estacionária, poderia alterar a fase móvel
para um solvente com maior polaridade, uma vez que o fato do eluente não conseguir arrastar
os isômeros pela cromatoplaca se daria pela maior interação dos isômeros com a fase
estacionária (polar).

5. Conclusão

Concluiu-se que para uma boa execução do método da cromatografia em coluna é

necessário ter atenção e esmero durante a realização dos procedimentos. Os principais fatores
que estão ligados a análise cromatográfica em coluna são as interações das amostras com as
fases móveis e estacionárias, influenciadas diretamente pelas polaridades dos constituintes; o
cuidado requerido no empacotamento da fase estacionária a fim de não promover bolhas e
rachaduras; a necessidade de aplicações seguidas do solvente na coluna cromatográfica a fim
não promover o seu ressecamento e a importância de vedar a coluna com o algodão, para
evitar perda da fase estacionária (sílica). O extrato de folhas de espinafre apresenta em sua
composição pigmentos amarelos, constituídos por β-caroteno e pigmentos verdes,
constituídos por clorofila (a) e (b). O β-caroteno por se tratar de um hidrocarboneto
insaturado, apresenta baixa polaridade, e, portanto, mostrou interações mais efetivas com o
solvente apolar (eluente, fase móvel), sendo coletado primeiro. Por outro lado, as estruturas
das clorofilas (a) e (b) apresentam uma maior polaridade quando comparadas ao β-caroteno.
Sendo a clorofila (b) mais polar que a clorofila (a) por apresentar um grupo aldeído em sua
estrutura. Já na separação dos produtos obtidos na nitração do fenol, o-nitrofenol e o p-
nitrofenol é possível verificar que o isômero o-nitrofenol apresenta menor polaridade, devido
as interações intramoleculares entre os grupos OH e NO2 da sua molécula, formando ligações
de hidrogênio que diminuem sua polaridade, sendo separado e coletado primeiramente. A
cromatografia em camada delgada acompanhada da cromatografia em coluna permitiu
confirmar que a separação dos isômeros o-nitrofenol e p-nitrofenol foram eficientes, uma vez
que ao eluirem apresentaram apenas uma mancha em cada aplicação, após a revelação na
câmara de UV. Desta maneira é possível afirmar que este experimento teve seu objetivo
alcançado, uma vez que a separação do extrato de espinafre ocorreu de modo satisfatório,
separando o β-caroteno das clorofilas na coluna cromatográfica e a separação dos isômeros o-
nitrofenol e p-nitrofenol ocorreu de modo satisfatório, sendo confirmada pela cromatografia
em camada delgada.
6. Geração de Resíduos

Todos os resíduos líquidos gerados, foram armazenados de modo adequado em

frascos identificados, para posterior tratamento e descarte correto. Os resíduos sólidos não
apresentam periculosidade ao meio ambiente, logo, foram descartados no lixo, de forma
consciente.

Referências

[1] FONSECA, S. F.; GONÇALVES, C. C. S. Extração de pigmentos do espinafre e

separação em coluna de açúcar comercial. Química Nova na Escola, Rio de
Janeiro, n. 20, p. 1, nov. 2004.

[2] BINATTI, I. GARCIA, C. F. Laboratório de Química Orgânica III. Belo Horizonte

(MG), 2019.

[3] BRONDANI, B. P. Cromatografia em Coluna: Dicas. Revista e-curriculum,

Santa Catarina, v. 7, n. 2, p.1, ago. 2011. Disponível em: <
http://nuquiocat.quimica.blumenau.ufsc.br/files/2016/07/Cromatografia-em-
Coluna.pdf>. Acesso em: 20 fev. 2021.