José Antonio VISINTIN1, Marco Roberto Bourg MELLO, Marcella Pecora
MILAZZOTTO, Mayra Elena Ortiz D’Ávila ASSUMPÇÃO
O desenvolvimento, aprimoramento e uso de biotécnicas aplicadas à
reprodução animal são, atualmente, indispensáveis para o aumento da eficiência reprodutiva dos rebanhos. Enquanto algumas já apresentam grande apelo comercial e importância econômica como a inseminação artificial, a transferência e criopreservação de embriões e a produção de embriões por fecundação in vitro, outras ainda iniciam sua inserção no mercado como a clonagem ou permanecem mais restritas a centros de pesquisa, como a transgenia. A clonagem, originalmente, desenvolveu-se como método para estudar os mecanismos envolvidos na diferenciação celular (ROBL et al, 1987). Hans Spemann, um dos grandes biólogos experimentais do século XX, foi o pioneiro nos estudos sobre totipotência de células embrionárias. Em experimentos realizados em 1902, Spemann separou os blastômeros de embriões de 2 células de salamandra, dando origem a indivíduos adultos, evidenciando sua totipotência. No entanto, apenas em 1951 foi realizado com sucesso o primeiro experimento com transferência nuclear (TN) (BRIGGS e KING, 1952). Pesquisadores da Filadélfia enuclearam oócitos de rã e os fundiram com células de embrião no estádio de blástula, que se desenvolveram até o estádio de girino (WILMUT; CAMPBELL; TUDGE, 2000). Desde o clássico trabalho de Briggs e King em anfíbios, o método da transferência nuclear tem sido empregado na produção de indivíduos geneticamente idênticos (FULKA et al., 1998). Em mamíferos, o primeiro sucesso foi obtido em camundongos por Illmensee e Hoppe (1981), utilizando células de embriões como núcleos doadores. A clonagem empregando células diferenciadas adultas foi realizada com sucesso, pela primeira vez, em ovinos (WILMUT et al., 1997). Neste experimento, após a reconstrução de 277 embriões com células da glândula mamária, obteve-se o nascimento da ovelha Dolly. A grande repercussão gerada por este acontecimento foi decorrente da demonstração, pela primeira vez, de que era possível clonar um mamífero a partir de uma célula somática diferenciada. Após publicação de Wilmut et al. (1997), o sucesso da clonagem com células diferenciadas foi também alcançado em bovinos, murinos, caprinos, suínos, felinos e equídeos (BAGUISI et. al., 1999; KATO et al., 1998; ONISHI et al., 2000; SHIN et al., 2002; WAKAYAMA et al., 1998; WOODS et al., 2003).
1 Médico veterinário, Professor Titular, Departamento de Reprodução Animal, FMVZ, USP, São Paulo, SP.
No Brasil, foram conseguidos podendo um gene de interesse ser
clones bovinos a partir de células inserido nestas células juntamente embrionárias, fetais e adultas. No com um gene de seleção dia 17 de março de 2001, em (resistência a antibióticos). As Brasília, DF nasceu o primeiro clone células que expressam a construção a partir de célula embrionária, a gênica são selecionadas, cultivadas Vitória. No dia 27 de abril de 2002, in vitro e utilizadas como fonte em Monte-Mor – SP, nasceu o doadora de núcleos. As células primeiro clone a partir de célula transgênicas em cultivo podem diferenciada jovem, o Marcolino da ainda ser facilmente criopre- USP (MELLO et al., 2003), o qual servadas, assegurando a conser- apresentou desenvolvimento vação de material genético para corporal, comportamental e sexual reconstrução de embriões. A maior normais. Em julho de 2002, em vantagem da técnica de Jaboticabal-SP, nasceu o primeiro Transferência Nuclear para produ- clone a partir de célula diferenciada ção de animais transgênicos, adulta, a Penta. Em 15 de quando comparada à microinjeção Dezembro de 2003 nasceu a Bela de DNA em pró-núcleos de zigotos da USP, uma bezerra Nelore é a economia de tempo e custos. A oriunda de célula diferenciada produção de animais transgênicos adulta, apresentando desenvol- por transferência nuclear de células vimento corporal, comportamental e somáticas modificadas in vitro já foi sexual normais. relatada em diversas espécies Ao contrário do que muitos (SCHNIEKE et al., 1997, PARK et imaginam, a idéia inicial da al., 2001, BROPHY et al., 2003). O clonagem não foi a produção de maior pré requisito para o sucesso animais geneticamente idênticos da técnica, no entanto é a com apelo comercial. O nascimento disponibilidade de células primárias da ovelha Dolly foi, na verdade, o ou linhagens celulares compatíveis desenvolvimento da metodologia com as modificações genéticas necessária para a criação de necessárias para o ganho ou perda animais como a ovelha Polly. A de função. Diversos casos já foram ovelha Polly foi produzida seguindo descritos visando ganho de função o processo que gerou a Dolly, com como ovinos produzindo o fator IX a diferença de que foi introduzido na de coagulação no leite, caprinos célula doadora de núcleo um gene produzindo antitrombina III e suínos humano. Assim, a ovelha resultante expressando GFP (SCHINIEKE et foi capaz de produzir leite com al., 1997; BAGUISI at al., 1999; proteína humana, de valor PARK et al., 2001). terapêutico. Apesar dos primeiros experi- A possibilidade de introdução mentos para a obtenção de animais de genes exógenos no genoma de transgênicos terem sido conduzidos células estabelecidas in vitro e a em ratos, durante os últimos 15 utilização destas como núcleos anos estudos têm sido voltados doadores na reconstrução embri- para animais de interesse zootéc- onária pela Transferência Nuclear nico, com o intuito de aumentar a abrem nova perspectiva para produção animal (PINKERT e produção de animais transgênicos. MURRAY, 1999). Devido à indis- Diferentes linhagens de células ponibilidade de linhagens estabe- bovinas são isoladas e cultivadas, lecidas de células tronco embrio-
nárias para a produção de quimeras células espermáticas têm a
e à dificuldade na injeção de DNA capacidade de se ligar a proteínas e exógeno em pronúcleos de zigotos DNA em quase todas as espécies devido a coloração escura do (LAVITRANO, et al., 1989). Desta citoplasma, até pouco tempo a forma, elas podem ser usadas como técnica de TN era a opção mais vetores naturais para introduzir promissora na geração de animais moléculas de DNA exógeno no de produção transgênicos. No oócito durante o processo de entanto, a eficiência na geração de fecundação. Simões et al (2007) ao progênie transgênica ainda perma- submeterem células espermáticas necia baixa e inconstante. Assim, bovinas a diversos tratamentos para metodologias alternativas foram inserção do DNA exógeno obti- sendo desenvolvidas. veram embriões positivos para a Recentemente, a combinação presença do transgene em todos os de vetores virais para a introdução grupos estudados. do transgene tem tornado o CONSIDERAÇÕES FINAIS processo mais eficiente (GOJO et A produção de bovinos a partir al., 2002). A possibilidade de sua da técnica de Transferência Nuclear utilização diretamente em células utilizando células somáticas diferen- germinativas e/ou embrionárias com ciadas possibilita a obtenção de excelentes resultados fazem dos indivíduos geneticamente idênticos vetores virais alvos de diversos em larga escala e também bovinos estudos (JAENISCH, 1976; transgênicos (geneticamente modifi- TISCORNIA et al, 2003; HOFMANN cados). No entanto, as taxas de et al, 2004). Hofmann et al. (2004) desenvolvimento in vitro e in vivo de relataram a transdução efetiva de embriões clonados a partir de vetores lentivirais para expressão células diferenciadas permanecem estável da GFP em oócitos bovinos baixas (BORDIGNON, 2003). Este que foram posteriormente utilizados insucesso deve-se, principalmente, para fecundação in vitro (FIV), a baixa taxa de implantação, pelos gerando 83% de embriões freqüentes problemas placentários e fluorescentes. Outra vantagem é a pela alta mortalidade embrionária, possibilidade de se transduzir com fetal e perinatal. Esses problemas, eficiência vetores para modulação segundo Bordignon (2003), ocorrem gênica, promovido pelos RNAs de porque núcleos de células dife- interferência (TISCORNIA et al, renciadas não são corretamente 2003). Assim, fenótipos desejáveis, reconduzidos ao estádio embrio- como no caso do bloqueio total da nário nos embriões clonados miostatina resultando no fenótipo de (reprogramação nuclear), o que musculatura dupla em bovinos provocaria a expressão errônea de (MCPHERRON et al., 1997), que genes que são necessários para pudessem vir acompanhados de sustentar o desenvolvimento nor- características não desejáveis mal. O melhor entendimento dos (POTTS et al, 2003), poderiam ser mecanismos envolvidos na repro- atenuados pelo bloqueio apenas gramação nuclear representa um parcial da miostatina (MILAZZOTTO dos principais desafios para et al, 2007). aumentar a eficiência da clonagem, Outra abordagem é o uso de visto que hoje a técnica vem sendo espermatozóides como vetores de aplicada inclusive comercialmente. DNA exógeno. Sabe-se que as
A melhora na eficiência da BROPHY, B., SMOLENSKI, G.,
técnica de TN também será refletida WHEELER, T. et al. Cloned no campo da transgenia animal. transgenic cattle produce milk with Atualmente, com a identificação higher levels of beta-casein and cada vez maior de genes de kappa-casein. Nature Biotech- interesse zootécnico e terapêutico, nology. v. 21, p. 157-162, 2003 tem havido um maior interesse na FULKA, J.; FIRST, N. L.; LOI, P.; geração de animais de produção MOOR, R. M. Cloning by somatic transgênicos. Assim, a otimização cell nuclear transfer. BioEssays, v. das tecnologias de produção desses 20, n. 10, p. 847-851, 1998. animais e inserção do transgene na linhagem germinativa tornam-se GOJO, S.; YAMAMOTO, S.; cada vez mais essenciais para o PATIENCE, C.; et al. Gene therapy crescimento econômico. – its potential in surgery. Annals of Embora haja grande interesse the Royal College of Surgeons na utilização da Transferência England, v. 84, p. 297-301, 2002. Nuclear e da transgenia nas áreas HOFMANN, A.; da produção animal, biomedicina, ZAKHARTCHENKO, V.; WEPPERT, biotecnologia e na pesquisa básica, M.; et al. Generation of Transgenic a expansão e difusão desta Cattle by Lentiviral Gene Transfer tecnologia estão limitadas pela into Oocytes. Biology of baixa eficiência de todo o processo Reproduction, v. 71, p. 405-09, de clonagem. O melhor enten- 2004. dimento dos eventos envolvidos na reprogramação nuclear poderá ILLMENSEE, K.; HOPPE, P. C. trazer resultados mais previsíveis e Nuclear transplantation in mus com maior reprodutibilidade, tornan- musculus: developmental potential do a técnica mais segura, tanto para of nuclei from preimplantation pesquisa quanto para a produção embryos. Cell, v. 23, n. 1, p. 9-18, animal. 1981. JAENISCH, R. Germ line integration REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS and Mendelian Transmission of the BAGUISI, A.; BEHBOODI, E.; exogenous Moloney leukemia virus. MELICAN, D.T. et al. Production of Proceedings of National Academy goats by somatic cell nuclear of Science – USA, v. 73, p. 1296- transfer. Nature Biotechnology, v. 1264, 1976. 17, n. 5, p. 456-461, 1999. KATO, Y.; TANI, T.; SOTOMARU, BORDIGNON, V. Animal Cloning by Y.; et al. Eight calves cloned from Nuclear Transplantation: progress somatic cells of a single adult. and future challenges. Acta Science, v. 282, n. 5396, p. 2095- Scientiae Veterinariae, v. 31, p. 74- 2098, 1998. 89, 2003. Suplemento. LAVITRANO, M.; CAMAIONI, A.; BRIGGS, R.; KING, T. J. FAZIO, V. M. et al. Sperm cell as Transplantation of living nuclei from vectors for introducing foreign DNA blastula cells into enucleated frogs into eggs: Genetic transformation in eggs. Proceedings of the National mice. Cell, v. 57, n. 5, p. 717-723, Academic Society, v. 38, n. 4, p. 1989. 455-463, 1952. MCPHERRON, A. C.; LEE, S. J. Double muscling in cattle due to
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