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Tecnologia microarray (biochips de DNA)

Publicado em 22 de abril de 2009 por Laurí Mayer

O acúmulo de conhecimento que está sendo gerado pela ciência nas últimas
décadas é algo sem precedentes na história da humanidade. Este processo
continua em aceleração e, a cada ano que passa o volume de descobertas
científicas bem como de artigos publicados aumenta consideravelmente. Na área
da biologia celular e molecular, por exemplo, têm se conseguido progressos
fantásticos e inimagináveis quando a estrutura da dupla hélice do DNA foi
desvendada a pouco mais de meio século. Os avanços nas técnicas de biologia
molecular, aliada ao considerável desenvolvimento da bioinformática em anos
recentes têm possibilitado gerar uma enorme quantidade de dados, bem como
fazer descobertas fantásticas com aplicações igualmente maravilhosas. Como
exemplo, podemos citar as pesquisas com células tronco, vacinas recombinantes,
seqüenciamento de vários genomas (desde bactérias até o homem), etc.
Os microarrays, também popularmente conhecidos como biochips de DNA, são
micro arranjos de DNA dispostos em um suporte sólido, geralmente um vidro
especial, com tamanho semelhante com uma lâmina de microscópio óptico. Esta
recente tecnologia, que ainda não é muito difundida no Brasil, permite analisar um
grande volume de dados simultaneamente, sendo uma técnica poderosa na
análise prévia da composição genômica de determinado organismo ou traçar um
perfil da expressão gênica deste genoma em determinado momento.
Basicamente, eles são constituídos de uma lâmina de vidro (geralmente) onde
estão aderidos oligonucleotídeos de DNA fita simples de aproximadamente 50 a 70
pb. Cada oligonucleotídeo possui uma seqüência representativa de um
determinado gene. Ainda, cada oligonucleotídeo está aderido em um ponto
específico do slide (microarray), conhecido como spot. Uma único slide pode
conter dezenas ou até centenas de milhares de spots, cobrindo assim um
determinado genoma inteiro. Para a sua construção, o genoma de interesse é
primeiramente seqüenciado e então um oligonucleotídeo de DNA fita simples de
cada gene é representado no microarray. O processo de construção do biochip é
todo robotizado e requer uma estrutura complexa para a sua execução. Os
oligonucleotídeos podem ser impressos (aderidos) no biochip ou sintetizados
diretamente sobre ele. O laboratório que deseja trabalhar com esta técnica não
necessita possuir toda a estrutura para a construção do biochip, pois há empresas
especializadas que fornecem o microarray.
Objetivos da técnica
A principal aplicação desta tecnologia está no estudo de perfis de expressão
gênica de todos os genes de determinado genoma. Outra aplicação é no
mapeamento genômico de genomas relacionados com o genoma de referência
(representado no biochip). No primeiro caso utiliza-se o mRNA e no último caso o
DNA genômico. Em estudos de expressão gênica, a maior vantagem, é que é
possível em um único experimento, mensurar a expressão de milhares de genes
simultaneamente. Quando se deseja analisar a expressão de apenas alguns
genes, a técnica de real-time PCR é geralmente empregada, que consegue
analisar a expressão de até 4 genes simultaneamente. Quando se deseja analisar
o perfil da expressão gênica no nível de genoma, esta técnica é tecnicamente
inviável, já que, por exemplo, para um genoma bacteriano de 4 mil genes, seriam
necessários 1000 análises. Esta tecnologia usa o princípio da complementaridade
de bases dos ácidos nucléicos. Essencialmente, microarray é uma técnica de
hibridização de ácidos nucléicos em grande escala.
Executando a técnica
Para explicar o funcionamento da técnica, será abordado seu uso em
experimentos de expressão gênica. O protocolo geral não difere muito nas duas
aplicações.
Primeiramente, é feita a extração do mRNA nas condições do estudo. Em qualquer
experimento, sempre será utilizado material genético de duas situações distintas,
onde uma será a amostra controle e a outra a amostra experimento. No momento
de coletar a amostra de células para a extração do mRNA, as mesmas devem ser
imediatamente colocadas em temperaturas de congelamento, para evitar que
enzimas RNAses degradem parcialmente o RNA, comprometendo seriamente a
confiabilidade dos resultados. Após a extração do mRNA conforme protocolo
específico para cada caso, é realizada uma RT-PCR, obtendo como produto final
de interesse o cDNA. As amostras de cDNA são coradas com compostos
fluorescentes, geralmente as cianinas Cy3 e Cy5, sendo que uma amostra é
corada com Cy3 e a outra com Cy5. Este cDNA corado é então desnaturado por
aquecimento e hibridizado com o biochip (Fig. 1).

Fig. 1. Esquema mostrando as principais etapas da técnica de microarray.


(Céditos da foto: http://www.scq.ubc.ca).
Quando a solução contendo o cDNA corado for colocado sobre a lâmina de
microarray, ocorrerá a hibridização entre este cDNA e o DNA do biochip, pelo
princípio da complementaridade das bases de DNA. Após a hibridização o biochip
é colocado em um scanner especial, que irá fazer a leitura da intensidade da
fluorescência nos comprimentos de onda referente aos 2 compostos fluorescentes
utilizados. Cy3 emite a cor verde, e Cy5 a cor vermelha. É fácil deduzir que quando
um determinado gene é expresso em ambas as amostras, o spot correspondente
no microarray irá hibridizar com ambos os mRNAs. Como conseqüência, este spot
emitirá tanto a cor verde como a cor vermelha, resultando na cor amarela. Durante
a leitura o scanner digitaliza a imagem em alta resolução, para análise posterior.
As imagens digitalizadas são então analisadas por um software específico que irá
converter a cor e a intensidade da fluorescência em um conjunto de valores
numéricos. Os arquivos resultantes (valores numéricos) são analisados
posteriormente em outros softwares onde os dados são filtrados e tratados
estatisticamente.
Esta tecnologia está auxiliando pesquisas nas mais diversas áreas. Um exemplo
importante é na pesquisa do câncer, onde normalmente se compara a expressão
gênica de células saudáveis e de células do tumor, para analisar as diferenças na
sua expressão gênica e assim identificar genes que possuem uma função chave
no desenvolvimento do câncer.

Leia mais em: http://www.webartigos.com/artigos/tecnologia-microarray-biochips-de-


dna/17028/#ixzz4RGJ9BVyZ

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