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TOXICOLOGIA ANALÍTICA: DA TRIAGEM À CONFIRMAÇÃO

Chapter · January 2021

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Carvalho, V.M.; Rocha, E.D. Toxicologia analítica: da triagem à confirmação. In: Peixe,
T.S.; Ribeiro Neto, L.M.; Graff, S.; Santos, C.E.M. Toxicologia: tópicos aplicados.
Curitiba: Brazil Publishing, 2020, p.303-347.

TOXICOLOGIA ANALÍTICA: DA TRIAGEM À CONFIRMAÇÃO

Virgínia Martins Carvalho


Ernesto Díaz Rocha

1. Introdução

De acordo com os objetivos de (1) prevenir, (2) diagnosticar e (3) tratar as


intoxicações, a toxicologia se divide em três áreas: experimental, analítica e clínica.A
toxicologia analítica se insere no diagnóstico e no prognóstico da intoxicação e se
dedica ao estudo de métodos precisos e de exatidão adequada na pesquisa de
toxicantes ou de parâmetros bioquímicos relacionados à intoxicação ou às ocorrências
de interesse toxicológico.
O diagnóstico pode ter a finalidade de determinar o agente envolvido, para
nortear um tratamento (análise de urgência); de auxiliar em processos judiciários
(análise forense); de acompanhar farmacoterapias; de avaliar a exposição a drogas de
abuso no ambiente de trabalho ou no monitoramento da abstinência; de avaliar a
exposição às substâncias químicas em ambiente laboral (monitoramento ambiental e
biológico); de avaliar a contaminação ambiental (monitoramento ambiental voltada às
análises de poluentes); ou de avaliar a contaminação de alimentos. A finalidade do
diagnóstico indicará o analito a ser pesquisado – que pode ser o próprio toxicante, seu
metabólito ou um parâmetro bioquímico relacionado à toxicodinâmica do agente –,
assim como irá indicar a matriz de análise adequada, tais como: amostra biológica,
material de apreensão (drogas de abuso), alimentos, amostra de solo, água etc.
Somente após a definição dos parâmetros balizadores – (1) finalidade, (2)
toxicante e (3) matriz –, a metodologia ou o método será selecionado. A metodologia
se refere a um conjunto de métodos que, por sua vez, é composto por conjunto de
técnicas ou procedimentos.Enquanto algumas finalidades requerem a aplicação de um
método, outras requerem o emprego de metodologia; neste caso, a metodologia será
composta de, pelo menos, um método presuntivo ou de triagem e um método
confirmatório. Este é o caso, por exemplo, das análises toxicológicas forenses, que

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devem atender ao princípio fundamental da presunção da inocência ou in dubio pro
reo, o qual define que a dúvida deve recair como um benefício ao réu. Neste caso, é
adotada a marcha analítica que ofereça resultados irrefutáveis; caso contrário, fere-se
o ordenamento jurídico e o laudo gerado perde a validade probatória.
Nas situações em que não há elementos que indiquem o provável toxicante,
faz-se necessária a análise toxicológica sistemática (ATS), que é a busca químico-
analítica de substâncias desconhecidas em matrizes biológicas, envolvendo etapas de
preparação da amostra para extração de grupos de substâncias, segundo suas
propriedades físico-químicas predominantes, seguida de aplicação de técnicas
cromatográficas direcionadas a grupos de substâncias (LINDEN; MOREAU,
2016)(LINDEN; ANTUNES, 2018).
Neste capítulo, a ATS está inserida dentro dos tópicos preparação de
amostras, técnicas de triagem e confirmatórias. As técnicas cromatográficas
empregadas nas análises confirmatórias (cromatografia gasosa e líquida acopladas a
diferentes detectores) podem ser empregadas também na triagem de substâncias,
desde que planejadas as extrações e desde que sejam adotados métodos de
separação padronizados e bibliotecas de espectros de absorção e massas na
identificação dos analitos.
A classificação do agente tóxico pode ser adotada para nortear tal busca.
Assim, gases e vapores tóxicos, praguicidas, fármacos psicotrópicos (estimulantes,
depressores e alucinógenos), toxinas (substâncias tóxicas de origem natural,
geralmente proveniente de animais, fungos ou bactérias) e metais tóxicos podem ser
alocados em grupos que apresentam propriedades físico-químicas ou toxicológicas
similares.
A finalidade sempre definirá o(s) método(s). Testes rápidos, por exemplo, são
essenciais nas análises de urgência nas quais o resultado analítico irá complementar
dados clínicos observados, por exemplo, a identificação rápida de salicitatos por
colorimetria pode indicar a causa de uma acidose metabólica, quando se suspeita de
intoxicação por aspirina; por outro lado, o controle terapêutico de digoxina irá requerer
método de alta sensibilidade, devido à estreita janela terapêutica. Seja qual for a
finalidade, a toxicologia analítica se ocupa da identificação e/ou da quantificação de
substâncias e da interpretação dos resultados. Para tanto, etapas de preparação de
amostra, de métodos de triagem, de testes confirmatórios e de validação dos métodos
analíticos devem ser planejadas.

2. Preparação de amostras

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A preparação da amostra visa à retirada de interferentes e, em alguns casos,
busca concentrar os analitos em solvente apropriado ao método selecionado,
permitindo sua identificação e quantificação.
Drogas ilícitas, bebidas e demais alimentos, medicamentos, solo e matrizes
biológicas são frequentemente empregadas nas análises toxicológicas. A seleção
deve levar em consideração a distribuição dos toxicantes e as inferências almejadas
na interpretação do resultado. Por exemplo: no monitoramento terapêutico, plasma e
soro devem ser as matrizes de escolha, pela possibilidade de correlação entre a
concentração do fármaco na matriz e o efeito (concentração no sítio de ação). A
interpretação pode ficar comprometida, neste exemplo, se for selecionada a urina,
devido às variáveis patológicas ou de metabolismo(SANTOS; LANCHOTE; GIRAUD,
2014).
Em se tratando de matrizes biológicas, o sangue representa o primeiro
compartimento de distribuição para a maioria dos fármacos, tendo alto valor
interpretativo em indivíduos vivos. A urina representa a matriz de eliminação, sendo
esperadas maiores concentrações em relação ao sangue, especialmente dos
metabólitos; por outro lado, o valor interpretativo é limitado por variáveis associadas à
cinética de eliminação e aos fatores patológicos, como alterações na função renal e
hepática.
As matrizes biológicas adotadas em análises toxicológicas são fluidos, tais
como sangue, plasma, soro, urina e saliva. Cabelo, pelo e unhas são matrizes
alternativas, indicadas para avaliação do uso crônico de algumas substâncias. Em
casos postmortem,podem ainda ser coletados humor vítreo, bile, tecidos encefálico,
pulmonar, hepático e renal(CARVALHO et al., 2014).
Fatores relacionados à coleta e ao armazenamento da matriz, tais como local,
horário, recipiente de armazenamento, adição ou não de aditivos como inibidores
enzimáticos e quelantes devem ser planejados de acordo com toxicante a ser
pesquisado, de modo a garantir correta interpretação e confiabilidade do resultado.
A técnica de extração será selecionada em função das propriedades físico-
químicas dos analitos; por exemplo, a separação em compostos orgânicos
(hidrossolúveis, lipossolúveis, ácidos, alcalinos ou neutros), inorgânicos, voláteis e não
voláteis representa uma classificação útil. Material de apreensão, como drogas de
abuso (anfetaminas, opioides, cocaína etc.), e medicamentos podem requerer apenas
liberação do(s) analito(s) da matriz, por técnica de diluição em solvente,
homogeneização e centrifugação, enquanto matrizes complexas, como solo e
alimentos, e matrizes biológicas requerem, em geral, técnicas mais elaboradas de
extração. Em alguns casos, é necessário adotar, previamente à extração, a liberação

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do analito ou a retirada de interferentes, por exemplo, a análise de sangue total requer
a precipitação de proteínas com solventes (acetonitrila, metanol etc.) ou sais (sulfato
de zinco) seguida de centrifugação (CARVALHO et al., 2013). Analitos eliminados na
forma conjugada com ácido glicurônico ou sulfato requerem a hidrólise química ou
enzimática, a fim de deixá-los livres para serem extraídos. São eliminados na forma
conjugada em urina os fármacos altamente apolares que sofrem reações de fase II na
biotransformação, como o (se escreve junto: tetrahidrocanabinol) tetra-hidrocanabinol
– composto psicoativo da maconha(MOREAU, 2014)(QUEIROZ; BERGAMASCHI;
QUEIROZ, 2016).
Quando são esperadas baixas concentrações dos analitos, a técnica de
extração deve conter a etapa de concentração. As técnicas mais comumente utilizadas
na extração e/ou na pré-concentração dos compostos são extração líquido-líquido
(LLE), extração em fase sólida (SPE), microextração em fase sólida (SPME) e, no
caso de compostos voláteis, extração por headspace.
Analitos presentes em algumas amostras sólidas, tais como vegetal (maconha,
haxixe, folhas de coca), solo e óleos, podem ser extraídos diretamente com solventes,
desde que os compostos de interesse sejam miscíveis e ocorra separação de fases. O
rendimento da extração pode ser melhorado se forem utilizadas menores quantidades
de solvente extrator de forma seriada, ou seja, é mais eficiente extrair várias vezes
determinado volume de amostra, com menores quantidades de solvente orgânico, do
que uma única vez, com grande quantidade de solvente.

2.1 Extração líquido-líquido (ELL)

A ELL se fundamenta na afinidade dos analitos entre duas fases imiscíveis,


aquosa (polar) e orgânica (apolar) sendo esta a fase extratora. Os analitos presentes
na matriz aquosa irão migrar para a fase extratora, atingindo um equilíbrio de
distribuição entre as duas fases imiscíveis. O objetivo é forçar a migração dos analitos
para a fase extratora que, sendo apolar e volátil, poderá ser evaporada promovendo
sua concentração. Quanto mais apolar (lipossolúvel) for o analito, maior a afinidade
pela fase orgânica extratora. As variáveis para otimização na ELL são tipo de solvente
extrator, pH da fase aquosa, proporção das fases aquosa e orgânica, tempo de
agitação e repouso(QUEIROZ; BERGAMASCHI; QUEIROZ, 2016). Pode ser adotada
a relação inicial em volume entre a fase aquosa e a fase orgânica de 1:5 v/v; o
aumento dessa relação pode melhorar o rendimento de extração. A fase aquosa é
representada pela matriz (urina, sangue, humor vítreo e tecidos homogeneizados em
soluções aquosas), que pode ser diluída em solução tampão ou ter ajustado o pH e

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misturada com clorofórmio, acetato de etila, n-hexano, éter de petróleo, diclorometano
ou outros solventes apolares representando a fase orgânica.
Em grande parte das vezes, os analitos orgânicos são eletrólitos fracos e
classificados como ácidos ou bases fracas; assim, sua lipossolubilidade poderá ser
aumentada pela influência do pH da fase aquosa. Em comparação aos ácidos e às
bases fortes que estão totalmente dissociados em solução, os ácidos e as bases
fracas apresentam as formas ionizada e não ionizada, de acordo com o valor de sua
constante de dissociação (pKA) e com o valor de pH do meio. Por exemplo: um ácido
forte com valor de pKa=3,4 apresentará estado de equilíbrio com 50% na forma
ionizada e 50% não ionizada quando em solução de pH=3,4. Ácidos fracos em
soluções com valores de pH mais altos em relação ao seu pKa terão seu equilíbrio
deslocado para a forma ionizada (hidrossolúvel), enquanto valores de pH inferiores ao
seu pKa deslocam o equilíbrio para a forma molecular (lipossolúvel). A mesma lógica é
aplicada às bases fracas; assim, soluções com valores de pH inferiores ao seu
pKadeslocarão o equilíbrio para a forma ionizada (hidrossolúvel) e os valores de pH
superiores favorecerão a forma molecular (lipossolúvel).
Os termos não ionizado, não dissociado, molecular e apolar são equivalentes,
para se referir à forma lipossolúvel que tem maior afinidade pelo solvente orgânico
apolar. O contrário vale para os termos ionizado, dissociado e polar, que são
equivalentes, para se referir à forma hidrossolúvel que tem maior afinidade pela fase
aquosa.
Como explicado, o grau de ionização do eletrólito fraco depende de seu pKa e
do pH do meio. Conhecendo os valores das constantes de dissociação dos ácidos e
das bases fracas, é possível empregar a equação de Henderson-Hasselbach na
previsão do deslocamento do equilíbrio químico através da manipulação do pH do
meio (quadro 1).

Ácidos fracos Bases fracas

Dissociação RCOOH ⇌ H+ + RCOO- RNH2⇌ HNH3+

H-H pKa = pH +log(R-COOH)/(R- pKa = pH +log(HNH3+)/(RNH2)


COO-)
Simplificação 10 pKa-pH = (R-COOH)/(R-COO-) 10 pKa-pH = (HNH3+)/(RNH2)

Onde RCOOH=forma não ionizada do HNH3+=forma ionizada da base


ácido RNH2= forma não ionizada da
RCOO-= forma ionizada do
base
ácido

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Quadro 1 – Equações empregadas no planejamento do pH na ELL.
Nota: EH-H: Henderson-Hasselbalch.

Quando esta técnica é adota em ATS, a amostra é submetida à ELL em pH


ácido e alcalino, sendo que os fármacos neutros irão ser recuperados em ambas as
extrações. Os extratos ácidos e alcalinos poderão ser usados nos métodos de triagem.

O rendimento da ELL será melhorado pela adição de sais higroscópicos que


aumentem a força iônica e a polaridade da fase aquosa, tais como cloreto de sódio ou
sulfato de sódio anidro. A adição do sal higroscópico irá diminuir as camadas de
solvatação, ou seja, irá atrair as moléculas de água que circundam as moléculas de
analito, favorecendo sua migração para o solvente apolar – este efeito é chamado
salting out(QUEIROZ; BERGAMASCHI; QUEIROZ, 2016).

2.2 Extração por headspace


A técnica headspace, empregada na extração de compostos voláteis, está
baseada na separação pelo ponto de ebulição do analito – que deverá ser inferior ao
da água. A matriz é inserida em um recipiente de vidro, de modo que se tenha um
espaço vazio entre a amostra e a tampa do recipiente. Após lacrar o recipiente, a
amostra é aquecida pelo tempo necessário para que se alcance um equilíbrio
dinâmico entre as moléculas em estado de vapor e presentes na amostra. O vapor
contido no espaço “vazio” é coletado com o auxílio de uma seringa e injetado no
equipamento de cromatografia gasosa (GC) (QUEIROZ; COLLINS; JARDIM,
2001)(OLIVEIRA, 2016). Essa técnica é a mais empregada nos métodos de
quantificação de etanol em sangue (alcoolemia) (MIHRETU et al., 2020) com
finalidade forense e em análises de urgências toxicológicas(CORRÊA, 2016), mas
também pode ser empregada na identificação de tolueno, n-hexano, metanol e outros
compostos voláteis em matrizes não biológicas e biológicas.
O headspace também pode ser aplicado de forma combinada com a
microextração em fase sólida, na qual se insere uma fibra no espaço vazio, para que
os compostos voláteis adsorvam no material da fibra,o qual posteriormente será
exposto no injetor do GC (figura 1)(QUEIROZ; COLLINS; JARDIM, 2001).

2.3 Microextração em fase sólida

A microextração em fase sólida (do inglês SolidPhaseMicroextraction – SPME)


se fundamenta na migração dos analitos da amostra para uma fibra de aço ou sílica
fundida recoberta por um filme fino que atua como fase estacionária. Embora tenha

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maior aplicação na análise de compostos voláteis, por permitir a amostragem dos
compostos presentes em amostras líquidas e sólidas, através de introdução direta em
equipamento de cromatografia gasosa, é possível a análise de outros tipos de
compostos, através da exposição da fibra a matrizes aquosas, em condições
controladas, e da posterior eluição dos analitos para solventes que possam ser
evaporados para concentração dos analitos (QUEIROZ; COLLINS; JARDIM, 2001).
No mercado, há vários tipos de fibra, a ser selecionada de acordo com a
polaridade do(s) analito(s); a mais comumente empregada na análise de compostos
apolares é a fibra recoberta do polímero polidimetilsiloxano, do inglês
polydimethylsiloxane (PDMS), na espessura de 100µm. Porém, há fibras recobertas
com poliacrilato (compostos polares, principalmente fenóis),
divinilbenzenopolidimetilsiloxano (compostos polares, principalmente aminas),
polidimetilsiloxanocarboxen (analitos de baixo peso molecular), carbowax-
divinilbenzeno (analitos polares, principalmente álcoois) e divinilbenzeno-carboxen-
polidimetilsiloxano (analitos polares e apolares)(BORDIN et al., 2015).
A fibra de extração é inserida em um dispositivo,semelhante à lapiseira ou à
seringa,dotado de um microtubo de aço e controlado por um dispositivo que expõe ou
retrai a fibra. Após introdução da agulha no tubo, fechado através da tampa, cujo
material deverá ser inerte, a fibra é exposta e, se adotada a SPME em headspace, os
analitos voláteis são capturados na fase de vapor e expostos no injetor do
cromatógrafo gasoso para dessorção dos analitos (figura 1). Caso seja adotada
cromatografia líquida, os analitos adsorvidos na fibra, após contato com a matriz
líquida sob agitação, serão eluídos em solvente apropriado, que será posteriormente
introduzido no equipamento. As variáveis a serem otimizadas são: tempo de exposição
da fibra, temperatura, pH da matriz aquosa, concentração de sal adotado no salting-
out, volume de amostra e velocidade de agitação da amostra. Embora essa técnica
tenha alta sensibilidade, apresenta, como limitações, baixa reprodutibilidade para
quantificações e elevado custo.

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Figura 1 – Esquema da técnica de extração headspace combinada com a microextração
em fase sólida.

2.4 Extração em fase sólida


A extração em fase sólida (SolidPhaseExtaction-SPE) é bastante empregada
na extração e/ou na pré-concentração de analitos presentes em matrizes complexas,
principalmente quando é necessária a extração de moléculas anfóteras, que
apresentarão baixos rendimentos na ELL, por apresentar dois valores de pKa
referentes às porções ácida e alcalina da molécula. Esta técnica emprega adsorventes
compactados em cartuchos em forma de seringas. Os mecanismos de retenção são
idênticos àqueles envolvidos em cromatografia líquida em coluna. Um cartucho típico é
formado por um tubo de polipropileno contendo cerca de 50 a 500 mg de adsorvente,
com 40-60 µm de tamanho de partícula, fixado no tubo através de dois filtros. Em
geral, o procedimento de extração é dividido em cinco etapas: ativação do adsorvente,
para deixar os sítios ativos disponíveis; condicionamento do adsorvente com solvente
adequado, para ajustar as forças do solvente de eluição com o solvente da amostra;
introdução da amostra, quando ocorre a retenção do analito e, eventualmente, de
alguns interferentes; limpeza da coluna, para retirar os interferentes menos retidos que
o analito; e, por fim, a eluição e a recuperação do analito (QUEIROZ; COLLINS;
JARDIM, 2001)(CHEN et al., 2008).

Estão disponíveis comercialmente vários adsorventes, dentre eles carvão


ativado, alumina, sílica gel, silicato de magnésio (Florisil), fase quimicamente ligada e
polímeros. Os grupos mais frequentemente empregados como adsorventes à base de
sílica quimicamente ligada podem ser divididos em fase reversa (quando o adsorvente
é menos polar do que o solvente de eluição), fase normal (quando o solvente é menos
polar do que o adsorvente) e troca iônica (QUEIROZ; COLLINS; JARDIM, 2001). Na
análise de cocaína (COC) e benzoilecgonina (BE), é comum o emprego de cartuchos

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com adsorvente à base de sílica quimicamente ligada a um grupo apolar (C8) e outro
de troca catiônica, representado pelo ácido benzenossulfônico. Este tipo de
adsorvente é indicado pelo fato de as moléculas apresentarem grupo amina e
polaridades diferentes; o valor de pKa da COC equivale a 8,6 e a BE é uma molécula
anfótera, com valores de pKa correspondendo a 2,25 e 11,50 (CARVALHO et al.,
2013).Assim, estes cartuchos são efetivos para reter ambos os analitos: não polares e
catiônicos. Os analitos são fortemente retidos no adsorvente em pH até 6 pela
combinação de forças de Coulomb e interações não polares, o que permite uma série
de lavagens aquosas e com solventes orgânicos; por exemplo: a lavagem com água e
metanol remove contaminantes apolares, polares e aniônicos da matriz(CHEN et al.,
2008).

3. Métodos de triagem

Os métodos de triagem têm por objetivo selecionar classes de substâncias,


especialmente em situações nas quais não se tem conhecimento do provável agente
tóxico envolvido. Tais métodos são chamados de presuntivos e se caracterizam por
serem rápidos e direcionados a grupos químicos funcionais ou apresentarem maior
especificidade. São técnicas adotadas em triagem: os testes colorimétricos, a
cromatografia em camada delgada (CCD) e os imunoensaios. Por exemplo: os
métodos presuntivos empregados na identificação de drogas de apreensão são
baseados em testes colorimétricos, enquanto os imunoensaios são aplicáveis na
triagem de fármacos em matrizes biológicas. A cromatografia em camada delgada
(CCD) é aplicável à ampla variedade de matrizes (drogas de apreensão, alimentos,
matrizes biológicas etc).

3.1 Testes colorimétricos


Os testes colorimétricos se fundamentam na reação entre grupos químicos
funcionais dos analitos de interesse e dos reagentesquímicos que darão origem a
complexos coloridos. Os complexos coloridos podem sofrer variação na coloração, de
acordo com a concentração do analito na amostra e a presença de interferentes,
sendo, portanto, um teste com maior grau de subjetividade.
De forma geral, quanto maior a intensidade da coloração, maior a concentração
do analito. As colorações espectrais (vermelha, laranja amarela, verde, azul, violeta)
junto comrosa, marrom, cinza e preta são as mais comuns, mas pode haver variações
quando há mistura de analitos; por exemplo: uma coloração vermelho-amarronzada. É
recomendado empregar 1 mg do material teste (STEFENS, 1986) ou, quando se tratar

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de matriz complexa, aplicam-se os testes às frações ácida, alcalina e neutra obtidas
por ELL. O quadro 2 resume os testes colorimétricos gerais empregados na
identificação de grupos químicos e farmacológicos diversos(STEFENS, 1986).

Teste Composto (coloração)


salicilatos (violeta), adrenalina, dopamina,
Cloreto férrico noradrenalina e levodopa (verde), morfina,
apomorfina, paracetamol e fenol (azul)
canabinoidese triptamina (vermelha à violeta se
p-
diluído), cocaína, harmina e fenciclidina (vermelha e
dimetilaminobenzaldeído
não ocorre coloração violeta, se diluído)
alcaloides e aminas 1árias, 2árias, 3árias e 4árias
Dragendorff (amarela ou vermelha-alarajada ou laranja-
amarronzada)
Formaldeído-Ácido benzodiazepínicos (laranja), bromazepam e clozapina
sulfúrico (amarela), flunitrazepam (rosa), triptamina (marrom)
fenotiazinas(vermelha, rosa escuro, laranja, azul ou
Forrest
violeta)
clorpromazina (vermelha), fenotiazina, prometazina e
FPN trifluoroperazina (laranja), clomipramina, imipramina
(azul), promazina (vermelho-amarronzada)
carbamatos não aromáticos (preta), carbamatos N-
Furfuraldeído
substituídos não reagem
alcaloides (violeta, violeta-azulada, marrom-violeta,
Iodoplatina cinza-violeta). Aminas de baixo peso molecular não
reagem
xilazina (vermelho), prazosina (marrom-rosa),
cloroquina a 100°C(amarela), fenelzina (marrom),
metilbrometo e metilnitrato de atropina de hioscina
(marrom), anfetaminas, efedrinas, atropina, hioscina,
Liebermann hiosciamina, varfarina, levamizol (vermelha-
alaranjada), metadona e ibuprofeno (marrom-
alaranjada), apomorfina, morfina, naloxona,
buprenorfina, carbidopa, codeína, ibogaína,
mescalina, tubocuraina, verapamil, salbutamol (preta)
levamisol (cinza esverdeada), metildopa (marrom a
verde), noradrenalina (verde), solanina (violeta a azul),
desipramina (azul), clorpromazina e fenelzina (violeta),
codeína e colchicina (marrom), petazosina e perazina
Mandelin
(violeta), papaverina, terbutalina, maprotilina (cinza
esverdeada), harmina, xilasina, amitriptilina,
nortriptilina (verde), estricnina e tetraciclina (vermelha
à laranja), tubocurarina (marrom)
maprotilina (vermelha), anfetaminas e amitriptilina
(laranja a marrom), DOM (amarela), norcodeína e
solanina (amarela a violeta), oxicodona, salbutamol e
Marquis vancomicina(amarela), harmalina (marrom-
esverdeada), codeína, 6-monoacetilmorfina, morfina
(violeta), ácido lisérgico, lisergamina, naloxona
(marrom)

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anfetaminas (amarela a rosa) e gentamicina (violeta
Ninidrina
após aquecimento/4 min)

Quadro 2 – Testes colorimétricos aplicados na análise presuntiva de toxicantes.

Por sua simplicidade de padronização e aplicação, os testes colorimétricos são


frequentemente empregados nas análises presuntivas de drogas de abuso em campo
e nos serviços técnicos de toxicologia forense. Há recomendações internacionais para
a aplicação desses testes, tais como as monografias de drogas publicadas e
disponibilizadas na página eletrônica do Escritório de Crimes e Drogas da
Organização das Nações Unidas (United Nations Office on Drug and Crimes –
UNODC).
Os principais testes utilizados nas análises presuntivas de drogas de abuso são
teste de Duquenois (figura 2) e Fast Blue, para canabinoides; teste de Scott, para
cocaína, e Wagner, que diferencia o cloridrato de cocaína (precipitado marrom)de sua
forma básica (crack, não reage). Ainda são empregados testes colorimétricos para
anfetaminas, opioides, alucinógenos, etc. (Quadro 3) (UN, 1994)(TOOLE et al., 2018).
As composições dos reativos são apresentadas no Quadro 4 (STEFENS, 1986).

Os testes colorimétricos são complementados por testes de precipitação e


cristalização. Na análise presuntiva de metais tóxicos,por exemplo, pode ser
empregado o teste de Reinsh, no qual lâminas metálicas (zinco, ferro, cobre, alumínio,
platina) bem polidas são expostas à amostra em meio ácido e, caso estejam presentes
os metais arsênio, antimônio, bismuto, mercúrio e prata, ocorrerá intercâmbio de
cargas iônicas, ocorrendo a deposição do metal na superfície da lâmina. Por exemplo:
se for empregada uma lâmina de cobre e amostra for acidificadacom ácido clorídrico
concentrado (10:2 v/v), o depósito de coloração preta ou acinzentada indicará a
presença de arsênio, antimônio ou bismuto, enquanto o depósito de coloração
prateada indicará a presença de mercúrio ou prata. Qualquer matriz biológica ou
resíduo líquido de cena de crime pode ser utilizado nesse teste (STEWART;
STOLMAN, 1961).

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Figura 2 – Teste de Duquenois aplicado à amostra vegetal de Cannabis.

Toxicante Teste colorimétrico


Canabinoides Duquenois , Fast Blue
Cocaína Scott , Wagner (diferencia sais de base livre)
Benzodiazepínicos Liebermann (diazepam)
Anfetaminas e derivados Marquis, Simon
Mescalina Marquis, Liebermann
Psilocibina Marquis, Simon, Ehrlich
Opioides Marquis, Mandelin (morfina), Liebermann (petidina), Mecke
(fenciclidina)
LSD Ehrlich
Efedrinas Chen-Kao (khat, catinona e catina)
Quadro 3: Testes colorimétricos adotados para análise presuntiva de drogas.

Teste Composição dos reativos


Reagente A: dissolver 2 g de vanilina em 100 mL
de etanol 95%, adicionar 2,5 mL de
Duquenois-Levine
acetaldeídoReagente B: ácido clorídrico
concentradoReagente C: clorofórmio
Reagente A: solução de ácido acético 1%
(v/v)Reagente B: dissolver 1 g de sulfato de
Chen-Kao cobre II em 100 mL de água
Reagente C: dissolver 8 g de hidróxido de sódio
em 100 mL de água (hidróxido de sódio 2N)
Dissolver 1g de 4-(dimetilamina)-benzaldeído em
10 mL de metanol e depois adicionar
Ehrlich
cuidadosamente 10 mL de ácido ortofosfórico
concentrado
Reagente A: éter de petróleo
Reagente B: misturar sal Fast Blue com sulfato
Fast Blue de sódio anidro 1% (m/m)
Reagente C: solução aquosa de bicarbonato de
sódio 10%

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Dissolver 0,5 g de vanadato de amônio em 1,5
Mandelin mL de água e diluir para 100 mL com ácido
sulfúrico. Filtrar em fibra de vidro
Reagente A: adicionar de 8 a 10 gotas
(aproximadamente 0,25 mL) de solução de
Marquis formaldeído 37% em 10 mL de ácido acético
glacial
Reagente B: ácido sulfúrico concentrado
Dissolver 1 g de ácido selênico em 100 mL de
Mecke
ácido sulfúrico concentrado

Simon
Dissolver 0,9 g de nitroprussiato de sódio em 90
mL de água e adicionar 10 mL de acetaldeído.
Reagente A: solução de ácido clorídrico 16%
Tiocianato de cobalto Reagente B: dissolver 2,5 g de tiocianato de
cobalto (II) em 100 mL de água
Reagente A: dissolver 1 g de tiocianato de
cobalto (II) em 50 mL de ácido acético 10% (v/v),
Tiocianato de cobalto
depois adicionar 50 mL de glicerina
modificado (Scott)
Reagente B: ácido clorídrico
concentradoReagente C: clorofórmio
Misturar 1,27 g de iodina e 2 g de iodeto de
Wagner potássio, depois dissolver a mistura em 100 mL
de água
Reagente A: dissolver 1 g de 1,3-dinitrobenzeno
em 100 mL de metanol
Zimmermann
Reagente B: dissolver 15 g de hidróxido de
potássio em 100 mL de água

Quadro 4 – Composição dos reativos utilizados nos testes presuntivos de drogas de


abuso.

3.2 Cromatografia em camada delgada

A cromatografia em camada delgada (CCD) constitui técnica simples de


aplicação na triagem de compostos orgânicos e, quando associada a teste
colorimétrico ou de imunoensaio, pode ser adotada como técnica confirmatória. As
técnicas cromatográficas têm como fundamento a separação de compostos presentes
na mistura com base na afinidade dos analitos entre duas fases: estacionária e móvel.
A fase estacionária é uma camada fina formada por um sólido granulado (em geral
constituída de sílica-gel, mas pode ser também de alumina, poliamida etc.) depositada
sobre uma placa de vidro, alumínio ou outro suporte inerte. A fase móvel é um
solvente ou uma mistura de solventes cuja polaridade deve ser de acordo com a
natureza química das substâncias a serem separadas. Soluções-padrão do analito e o
extrato obtido na extração da amostra são aplicados cuidadosamente, em pontos
próximos ao extremo inferior da cromatoplaca, evitando-se que fiquem mergulhados

13
na fase móvel e mantidos a uma distância adequada entre as aplicações adjacentes. A
cromatoplaca é inserida em cuba de vidro previamente saturada com a fase móvel,
isto é, o solvente (ou mistura de solventes) é adicionado na cuba em quantidade
suficiente para banhar a base inferior da placa, mas previamente em repouso, para
saturar o ar no ambiente da cuba. Inicia-se o desenvolvimento cromatográfico, os
componentes da amostra são separados por diferenças de velocidade de arraste, em
função do avanço da fase móvel sobre a fase estacionária (capilaridade) e das
diferentes forças de interação com a fase estacionária (MOFFAT, 1986)(COLLINS;
BRAGA; BONATO, 2017).

Na CCD em fase normal, mais utilizada, a fase estacionária é polar e a móvel


apolar, ainda que os graus de polaridade da fase móvel possam ser planejados pela
mistura de solventes de modo a melhorar a separação. Em fase reversa, a fase
estacionária é apolar e a fase móvel polar. Desta forma, o princípio de separação se
baseia na polaridade dos analitos (MOFFAT, 1986).

Após o desenvolvimento, as placas são secas e reveladas, geralmente com


reativos cromogênicos que coram as substâncias de interesse (figura 3). Muitos
compostos sem nenhuma coloração podem ser visualizados quando iluminados por
uma luz UV, por se tornarem fluorescentes quando excitados por essas radiações, em
geral nos comprimentos de onda 254 nm e 366nm (COLLINS; BRAGA; BONATO,
2017).

A identificação da substância se dá pelo valor de Rf, o qual corresponde à


distância percorrida pelo analito em relação à distância percorrida pela fase móvel; o
resultado dessa relação, multiplicado por 100, corresponde ao hRf referenciado em
literatura para identificação dos compostos (MOFFAT, 1986).

14
Figura 3 – Representação esquemática da Cromatografia em Camada Delgada.
AS: solução padrão de ácido salicílico; Desc.: extrato de amostra com analito desconhecido.

3.3 Imunoensaios

Os imunoensaios constituem técnicas simples, rápidas e de fácil automatização


para processamento de alto número de amostras. Essa técnica requer baixo volume
de amostras biológicas. O princípio da técnica consiste na interação da molécula-alvo
(antígeno) com seu anticorpo correspondente.

O desenvolvimento de kits de imunoensaio se fundamenta na resposta imune


adaptativa dos organismos frente a um agente entendido pelo organismo como
agressor (antígeno). O contato com o antígeno desencadeia diversos eventos
celulares e moleculares para sua eliminação,os quais darão origem aos anticorpos.
Para obtenção dos anticorpos, ovelhas, coelhos ou cavalos são tratados pela
administração múltipla seriada da substância de interesse ligada à proteína de alto
peso molecular, como a albumina.Os anticorpos são isolados e empregados na
produção dos kits (STEWART, 1986).

A técnica se baseia na competição pela ligação aos anticorpos entre o analito


presente na amostra (livre) e o analito marcado presente no kit.O analito marcado,
também chamado de antígeno marcado ou traçador, só poderá se ligar ao anticorpo
específico dependendo da concentração do antígenos de interesse (não marcado) da
amostra; ou seja, há uma disputa pelos sítios de ligação dos anticorpos da molécula a
ser analisada. Anticorpos são proteínas de alto peso molecular (> 150kDa),
estruturadas em duas cadeias pesadas e duas cadeias leves em forma de “Y”. Cada
cadeia pesada está ligada covalentemente a uma cadeia leve por ligações
dissulfídicas, região dos braços abertos do “Y” onde ocorre a ligação antígeno-
anticorpo por interações do tipo forças eletrostáticas, pontes de hidrogênio, forças de
Van der Waals e hidrofóbicas (VAZ; TAKEI; BUENO, 2007).

O traçador pode ser o analito marcado com enzima nas técnicas do tipo EMIT
(Enzime-MultipliedImmunoassayTechnique), Elisa (Enzyme-
LinkedImmunosorbentAssay) ou marcado com um composto fluorescente FIA
(FluorescenceImmunoassay). Seja qual for o tipo, quando a amostra é aplicada, se
houver o analito de interesse, este irá competir com o analito marcado pelos vão
competir sítios de ligação dos anticorpos. Quando as moléculas do analito de
interesse se ligar aos anticorpos, os analitos marcados serão deslocados e reagirão
com um substrato adicionado ao sistema; por exemplo, se for uma enzima,esta,

15
quando não ligada ao anticorpo, fica ativa para reagir com um substrato, gerando um
sinal que pode ser medido por espectroscopia (figura 4). O mesmo princípio é aplicado
ao FIA, cujo sinal será a fluorescência e sua intensidade será inversamente
proporcional à concentração do analito na amostra. O sinal pode ser medido por
técnicas espectrométricas ou pode ser identificado visualmente como resultado
positivo ou negativo(HAND; BALDWIN, 2008).

Figura 4 – Esquema geral de imunoensaio enzimático.

Na imunocromatografia-IC (Immunochromatography), se emprega uma matriz


de membrana (nitrocelulose ou náilon) para fixação do anticorpo na forma de linhas e
o bloqueio com proteína inerte do restante da membrana. O revelador da interação Ag-
Ac é um corante solúvel, como ouro coloidal (róseo) ou prata coloidal (azul marinho),
ligado aos antígenos ou aos anticorpos e inserido próximo ao local de aplicação da
amostra. A amostra aplicada se liga ao conjugado colorido e migra por ação capilar,
revelando a formação de imunocomplexos pelo depósito do corante coloidal na linha
de captura e, consequentemente, pela formação de uma linha visível coberta por
acetato transparente para facilitar a visualização dos resultados do teste (VAZ; TAKEI;
BUENO, 2007).

Apesar da alta sensibilidade dos imunoensaios, a reação cruzada com outras


drogas, fármacos e interferentes endógenos podem gerar resultados falso-positivos e,
por isso, são empregados apenas na triagem – requerendo a confirmação de seus
resultados. A qualidade do teste de imunoensaio pode ser avaliada pelo valor preditivo
positivo (VPP), que determina a razão entre as amostras verdadeiramente positivas
(VP) e o total de amostras analisadas, possibilitando melhor visualização a respeito da
efetividade dos imunoensaios (DIETZEN et al., 2001), de acordo com a equação 1.

16
Equação 1: VPP = VP/(VP+FP)

Onde:

VPP= Valor preditivo positivo.

VP= Resultados verdadeiramente positivos.

FP= Resultados falso-positivos, ou seja, que resultaram positivos no imunoensaio e


negativos no método confirmatório.

Substâncias endógenas podem ter alto impacto no resultado, um kit


desenvolvido para urina pode não ser eficiente para plasma e vice versa. O efeito da
matriz pode ser minimizado pela diluição da amostra. De forma geral, urina, plasma e
soro são as matrizes mais adequadas para aplicação das técnicas por imunoensaio.

4. Métodos confirmatórios

A maioria dos métodos confirmatórios tem base na cromatografia; isto quer


dizer que a identificação do analito é precedida por sua separação. Os principais tipos
de cromatografia adotados nos métodos confirmatórios são a cromatografia em fase
gasosa (GasChromatography – GC) e a cromatografia líquida de alta eficiência(High
Performance LiquidChromatography – HPLC), em ambos os tipos, a fase estacionária
é fixada em uma coluna e a fase móvel em fluxo contínuo écomposta por gás (GC) ou
um líquido (HPLC) inerte. A coluna, por sua vez, é acoplada a um detector sensível o
suficiente para identificar os analitos no extrato obtido na preparação da amostra.
Vários detectores e tipos de colunas, computadores e softwares podem ser adaptados
aos sistemas cromatográficos instrumentais. Os resultados da detecção são
apresentados em forma de representação gráfica denominada cromatograma (figura
5).

A cromatografia é aplicável na confirmação de compostos orgânicos, enquanto


a confirmação de compostos inorgânicos requer o uso de instrumentos como absorção
atômica ou plasma acoplado indutivamente com espectrometria de massas ou
espectroscopia de emissão atômica.

A maioria dos métodos confirmatórios pode ser adotada na quantificação do


analito. Para tanto, é necessária a construção de uma curva de calibração com padrão
de referência certificado (analito isolado com pureza ou teor pré-determinado e
certificado).

17
A curva de calibração é construída pela análise de concentrações progressivas
do analito. As concentrações são plotadas no eixo x (variável independente), enquanto
as respostas (sinal) do equipamento ficam no eixo y (variável dependente). Os
resultados são modelados matematicamente por regressão linear, pelo método dos
mínimos quadrados (SAVITZKY; GOLAY, 1964), gerando uma equação de reta
(y=ax+b) a ser utilizada na quantificação do analito de teor desconhecido presente na
amostra autêntica. Através da curva, é possível avaliar a correlação entre as
concentrações ensaiadas e os sinais gerados pelo equipamento – dados pelo
coeficiente de determinação (r2)(figura 6).

Figura 5 – Representação esquemática de um cromatograma.


Fonte: Carvalho et al. (2020)(CARVALHO et al., 2020).

18
Figura 6 – Representação gráfica de uma curva de calibração.

4.1 Cromatografia gasosa

A cromatografia gasosa (GasChromatography – GC) é a técnica de escolha


para confirmação de compostos voláteis e termoestáveis. O equipamento de
cromatografia em fase gasosa é composto pelo reservatório contendo o gás de arraste
(cilindro) conectado ao sistema de injeção (injetor), que é operado em temperatura
adequada para volatilização dos analitos, sendo onde ocorre a mistura com a fase
móvel. A coluna recebe um fluxo contínuo do gás de arraste que deverá ser de alta
pureza e inerte, sendo recomendável adotar um sistema de filtragem que retire a
umidade e as impurezas antes de ingressar no equipamento. Nitrogênio ou hélio são
os mais utilizados; menos comuns são o hidrogênio e o argônio.

O injetor consiste de um cilindro de vidro, tipo sílica, inerte, embutido em um


corpo metálico, que permite aquecimento de forma homogênea e controlada para
vaporizar os analitos. Na injeção, podem ser feitas diluições do extrato com um
sistema de divisão (split) do fluxo do gás de arraste, que dirige uma parte do fluxo para
o interior da coluna e outra parte para fora do sistema. O extrato, geralmente líquido, é
introduzido no injetor com uma microsseringa e uma agulha de aço, a qual perfura
uma barreira de material tipo silicone (septum) que mantém o injetor livre de
vazamentos. Assim, o extrato é vaporizado e dirigido à coluna em temperatura de até
300 ºC.

A coluna é o componente mais importante do sistema cromatográfico, pois nela


irá ocorrer a separação dos componentes da mistura. As primeiras colunas usadas em

19
GC eram do tipo empacotadas, ou seja, tubos de aço ou vidro empacotados com a
fase estacionária, geralmente terra diatomácea (material sólido e poroso com tamanho
de partícula mais ou menos uniforme). Nessas colunas, a separação era realizada
pela adsorção do composto diretamente na fase estacionária, cromatografia
gás/sólido, ainda muito utilizada em análise de gases. Uma forma de melhorar a
capacidade de separação foi adicionar uma fina película de polímero líquido na
superfície do suporte (cromatografia gás/líquido) em colunas capilares; tal película
pode apresentar diferentes polaridades, tornando a técnica mais versátil (SKOOG;
JAMES HOLLER; NIEMAN, 2002). Enquanto as colunas empacotadas têm diâmetro
interno de uns poucos milímetros e podem ter longitude de uns poucos metros, as
colunas capilares podem ter diâmetros menores do que um milímetro e até 100 metros
de comprimento. Quanto menor o diâmetro da coluna e maior seu comprimento,
melhor a capacidade de separação dos compostos e, consequentemente, se obtém
melhor resolução.

A fina película de um polímero baseado em polisiloxano (silicone) pode ser


fabricada com ampla variedade de polaridades e com radicais substituídos, que
apresentam afinidades características para diferentes compostos. Há colunas
capilares com fases apropriadas para analisar compostos apolares (100%
metilpolisiloxano), levemente polares (5% fenil polisiloxano) e polares (carbowax). A
característica flexível permite que colunas capilares de 100 metros sejam alocadas no
forno cromatográfico. O fato de serem ocas possibilita tempos de retenção
relativamente curtos e seu menor diâmetro permite a operação com fluxos de gás
muito menores do que os empregados em colunas empacotadas. O fluxo de gás mais
baixo permite acoplar com detectores mais específicos, como espectrômetro de
massas, visto que o baixo fluxo do gás de arraste não atrapalha na manutenção do
vácuo – essencial nesse tipo de detector(GROB; BARRY, 2004).

O forno cromatográfico controla a temperatura com alta exatidão, sendo


possível aumentar a temperatura a uma velocidade constante. Assim, compostos
menos voláteis chegam ao detector em tempo razoável. Controlando-se o aumento
gradual de temperatura (rampa de temperatura), é possível separar compostos que
tenham tempos de retenção muito parecidos, além de acelerar a eluição de compostos
que ficariam retidos em temperaturas menores, encurtando, desta forma, o tempo total
de análise.

A extremidade oposta da coluna é conectada a um detector. À medida que os


compostos são eluidos, eles chegam ao detector que emite um sinal que é amplificado

20
e registrado na forma de traçado do cromatograma. Este tempo de retenção é
determinado experimentalmente com uma sustância padrão e é característico para
cada composto. O tempo de retenção é usado como critério de identificação. A ordem
de saída dos compostos depende da afinidade pela fase estacionária; quanto maior a
afinidade, maior o tempo de retenção e, portanto, o composto tende a sair por último.

O detector universal acoplável em GC mais empregado em análises


toxicológicas é o detector de ionização em chama (Flame Ionization Detector– FID).
De baixo custo e alta robustez, este detector se baseia na combustão de compostos
na chama produzida pela reação do hidrogênio com o oxigênio (MCWILLIAM;
DEWAR, 1958). Os compostos não suscetíveis à combustão, como água, CO2 e
compostos inorgânicos em geral, não apresentam sinal mensurável (PENTEADO;
MAGALHÃES; MASINI, 2008).Para análise de compostos orgânicos nitrogenados e
fosforados, foi feita uma modificação do FID e foi desenvolvido o detector de nitrogênio
e fósforo (do inglês NitrogenandPhosphorus Detector – NPD), sendo altamente
seletivo para compostos que contenham, na sua estrutura química, o elemento
nitrogênio ou fósforo, como muitos praguicidas e alguns medicamentos. Apresenta
melhor limite de detecção instrumental em relação ao FID, tendo como principais
limitações a curta vida útil da pérola alcalina presente no detector e a instabilidade no
tempo – o que prejudica as calibrações para a análise quantitativa (BURGETT;
SMITH; BENTE, 1977).

Segundo as recomendações preconizadas pela maioria das agências


regulatórias, a presença do toxicante é confirmada com confiabilidade se detectada
por pelo menos duas técnicas analíticas diferentes. Isto pode ser alcançado numa
única análise, se for utilizada a combinação da cromatografia gasosa ou líquida com o
sistema de detecção por espectrometria de massas (do inglês massspectrometry–
MS). Desta forma, a informação fornecida pelo tempo de retenção na coluna
cromatográfica é complementada pelo espectro de massas.

O detector por MS combina alta sensibilidade com alta seletividade, sendo a


técnica de melhor detectabilidade (capacidade de detectar baixas concentrações dos
analitos) e de melhor especificidade para a maior parte dos toxicantes. O
espectrômetro de massas separa íons positivos ou negativos, produzidos a partir de
átomos ou moléculas, de acordo com a razão massa/carga. O método de ionização
mais utilizado é o impacto de elétrons, que produz íons positivos quando as moléculas,
ao serem atingidas e ionizadas, perdem um elétron ou dois elétrons (mais raramente).
Além da molécula ionizada que perde um elétron (íon pai), são produzidos também

21
fragmentos. Os íons são acelerados em direção ao analisador de massas e, após
serem discriminados, chegam ao coletor de íons, que pode ser uma fotomultiplicadora
que amplificará o sinal permitindo, assim, sua detecção. Os sinais gerados pelos íons
molecular e pelos fragmentos são plotados num gráfico tendo, como variável
independente, (eixo x) a relação massa/carga (m/z) e, como dependente (eixo y), a
abundância, gerando, desta forma, o espectro de massas do composto.Esta técnica
tem sido aprimorada e bastante empregada na toxicologia forense; assim, é possível
dispor de equipamentos de cromatografia gasosa acoplada ao espectrômetro de
massas quadrupolo (GC-QMS), cromatografia gasosa acoplada a dois espectrômetros
de massa dispostos em sequência (GC-MS-MS), cromatografia gasosa acoplada ao
espectrômetro de massas do tipo íon trap (armadilha de íons) (GC-ITMS), além da
cromatografia líquida acoplada ao espectrômetro de massas do tipo íon trap (LC-
ITMS) e cromatografia líquida acoplada a dois espectrômetros de massas dispostos
em sequência (LC-MS-MS) (SMITH et al., 2007). Toda esta inovação busca a
identificação inequívoca do toxicante, mesmo que em concentrações extremamente
baixas, e a maior exatidão nas quantificações.

A GC-MS, pelas vantagens descritas, vem sendo empregada com preferência


na análise de muitas drogas, e seus metabólitos, em diferentes matrizes biológicas.
Esta técnica e a LC-MS são de eleição para confirmação, independentemente da
matriz biológica enfocada, dada sua especificidade,sendo considerada padrão
ouro(KRONE et al., 2010).

4.2 Cromatografia líquida de alta eficiência

A cromatografia líquida de alta eficiência, do inglês High Performance


LiquidChromatography (HPLC), se baseia na separação pela afinidade dos analitos
entre a coluna preenchida de micropartículas (fase estacionária) e o solvente
empregado na fase móvel, sob alta pressão. A HPLC é uma técnica instrumental
consagrada para a análise de fármacos e metabólitos, apresentando a vantagem de
ser adequada à análise de compostos termolábeis e polares, sem necessidade de
derivação, considerando que não é necessária a vaporização dos analitos, sendo
estes dissolvidos na fase móvel. Nesta técnica, a preparação da amostra é de suma
importância para a conservação da coluna cromatográfica. Em relação à
reprodutibilidade, ela é menos robusta do que a cromatografia gasosa, pois variáveis,
como pH e viscosidade da fase móvel, e outros fatores podem alterar sobremaneira o
perfil dos picos cromatográficos, dificultando a identificação e a quantificação dos

22
analitos. No entanto, quando padronizada, esta técnica é extremamente útil na análise
de medicamentos e seus metabólitos, podendo ser acoplada ao detector de arranjo de
diodos, do inglês DiodeArray Detector (DAD), que permite realizar uma varredura de
absorção da substância por espectroscopia na região do visível (VIS) ou do ultravioleta
(UV) e, ainda,ser acoplada ao detector de fluorescência, do inglês Fluorescence
Detector (FD), e à MS, melhorando a detectabilidade e a especificidade(COLLINS;
BRAGA; BONATO, 2017).

O acoplamento da HPLC à MS, mais conhecida por LC-MS


(LiquidCromatography-Mass Spectrometry), permitiu grande avanço na análise
confirmatória de compostos orgânicos polares e pouco voláteis e seus metabólitos.
Desta forma,LC-MS e GC-MS se tornaram técnicas complementares e desejáveis na
confirmação de ampla gama de compostos de interesse em análises toxicológicas
(SMITH et al., 2007).

4.3 Espectroscopia

As técnicas espectroscópicas podem ser acopladas à cromatografia ou


utilizadas como método único. Por exemplo: a espectrofotometria de absorção pode
ser empregada na quantificação de salicilatos, após reação colorimétrica com cloreto
férrico,e a espectroscopia de infravermelho pode ser empregada na confirmação de
drogas de abuso, após aplicação do teste presuntivo colorimétrico.

Os métodos espectroscópicos são baseados na medicação da quantidade de


radiação produzida (espectrometria de emissão) ou absorvida (espectrometria de
absorção) pelas moléculas ou pelas espécies atômicas de interesse. As regiões
espectrais que têm sido empregadas incluem raios gama, raios X, ultravioleta (UV),
visível, infravermelha (IV), micro-ondas e radiofrequência (RF). A radiação
eletromagnética é uma forma de energia que é transmitida através do espaço e pode
ser descrita como uma onda que possui, como características intrínsecas,
comprimento, frequência, velocidade e amplitude. Em contraste com as ondas
sonoras, a luz não requer nenhum meio para a sua transmissão, sendo também
transmitida no vácuo. A radiação pode ser considerada onda ou partícula; neste caso,
chamada fóton. A energia de um fóton é diretamente proporcional a sua frequência;
essa dualidade (partícula-onda) se aplica aos feixes de prótons, elétrons e outras
partículas elementares, que podem produzir interferência e difração, tipicamente
associadas a um comportamento ondulatório. As técnicas colorimétricas aproveitam
estes fenômenos para fins analíticos. Por exemplo: uma solução contendo íons de
cobre apresenta coloração azul porque absorve a cor complementar, amarela, da luz

23
branca e transmite a luz remanescente, azul. Quanto mais concentrada a solução de
cobre, mais luz amarela é absorvida e mais intensa é a cor azul da solução; assim, a
quantidade de luz amarela absorvida pode ser medida e relacionada à concentração
dos íons de cobre na solução (SKOOG; JAMES HOLLER; NIEMAN, 2002).

Na espectroscopia de absorção, a molécula absorve um fóton passando por


uma transição energética. A energia do fóton deve coincidir com a energia que a
molécula pode absorver, pois se trata de uma transição quantizada. Na medida em
que se alcança um nível maior de energia interna em cada processo, aumenta a
energia absorvida. Há três processos básicos nos quais a molécula pode absorver
radiação: (a) a molécula gira ao redor de vários eixos, de modo a absorver energia
atingindo níveis maiores de energia rotacional em uma transição rotacional – este
processo requer pouca energia e pode ocorrer nas regiões do infravermelho distante e
na região das micro-ondas, onde a energia é baixa demais para gerar transições
vibracionais e eletrônicas; (b) os átomos, ou grupo de átomos na molécula, vibram em
relação uns aos outros, a molécula absorve uma determinada quantidade de energia,
sendo levada a um nível de energia vibracional mais alto e, na medida em que a
energia aumenta, transições rotacionais e vibracionais se misturam e pode haver
absorção no infravermelho médio e distante; (c) os elétrons externos da molécula são
levados a níveis mais altos de energia, correspondendo a sua transição eletrônica –
neste processo, as longitudes de onda correspondem ao espectro visível e a UV
(SKOOG; JAMES HOLLER; NIEMAN, 2002).

As transições rotacionais e vibracionais podem se misturar às eletrônicas,


produzindo espectros com bandas largas e ausência de picos finos, que só podem ser
úteis se comparados com o espectro de um padrão. Espectros UV-VIS, para
identificação de compostos, são menos utilizados no campo forense porque
interferentes presentes na matriz podem impedir a obtenção de espectro confiável; por
outro lado, métodos cromatográficos acoplados a detectores de varredura na região do
UV-VIS, como HPLC-DAD, ainda são muito utilizados.

Medições espectrofotométricas UV-VIS diretas, sem acoplamento com técnica


cromatográfica, podem ser empregadas no diagnóstico da intoxicação por agentes
colinérgicos (praguicidas carbamatos e ortganofosforados), através da determinação
da inibição da acetilcolinesterase (WILSON; HENDERSON, 2007); por monóxido de
carbono, através da determinação da carboxihemoglobina(BEUTLER; WEST, 1984); e
por agentes metemoglobinizantes, pela determinação de metemoglobina(HEGESH et
al., 1970) etc.

24
Na espectroscopia na região do infravermelho, do inglês Infra Red (IR), os
grupos que vibram e absorvem energia na região IR o fazem numa certa faixa do
espectro, sendo que a longitude de onda exata vai ser influenciada pelos grupos
funcionais vicinais e pelo meio no qual esteja o analito. Os picos de absorção são mais
finos que os da UV-VIS e, portanto, são mais fáceis de identificar. Adicionalmente,
cada molécula vai ter um espectro completo único, sendo considerado umanfingerprint
da molécula. Grupos funcionais típicos, tais comoálcoois, hidroxila, carbonil éster,
olefina e hidrocarbonetos aromáticos insaturados, podem ser identificados. A molécula
pode ser identificada pela comparação do seu espectro de absorção IR com espectros
de substâncias conhecidas e catalogadas.

A espectrofotometria IR pode ser aplicada no monitoramento da qualidade do


ar, em toxicologia ocupacional e ambiental; por exemplo, na análise quali e
quantitativa do conteúdo de CO, CO2 e hidrocarbonetos (TWISS et al., 1955).Outra
aplicação é na análise de etanol no ar expirado, na qual o álcool é medido na banda
de 3.44μm, embora tenha baixa especificidade, podendo sofrer interferência de
acetona (WIGMORE; LANGILLE, 2009).

Na espectrometria de fluorescência, a intensidade da fluorescência é


proporcional à intensidade da fonte da radiação incidente. O uso de laser tem sido
bem acolhido, porque a radiação monocromática pode fornecer alta intensidade.
Também têm sido muito usadas tinturas fluorescentes na região do IV próximo (NIR).
Os lasers NIR são baratos e podem ser achados lasers de diodos sólidos (SKOOG;
JAMES HOLLER; NIEMAN, 2002).

A espectrometria de fluorescência apresenta altas detectabilidade e


especificidade, se fundamenta na propriedade de algumas moléculas, de emitir fótons
quando perdem energia absorvida, pois o fóton tem menor energia com longitude de
onda maior do que a que foi absorvida. Este fenômeno é conhecido como
fluorescência. Se estima que 5 a 10% de todas as moléculas apresentam este
fenômeno, especialmente quando atingidas pela radiação UV de alta energia. Muitos
compostos aromáticos e heterocíclicos fluorescem, especialmente se contêm grupos
como—OH, —NH2, e —OCH3, os quais aumentam a fluorescência. Compostos
policíclicos, como vitamina K e purinas, e nucleosídeos e polienos conjugados, como
vitamina K, são fluorescentes. A fluorescência depende do pH, pois só as formas
ionizadas, em alguns casos, ou não ionizadas, em outros, são fluorescentes. Por
exemplo: o fenol é fluorescente, mas o seu ânion não é. O aminoácido triptofano
fluoresce com excitação em cerca de 280 nm e máximo de emissão em cerca de 360

25
nm(HORVAI, 2014).As análises de anfetaminas ilícitas, tais como 3,4
metilenodioximetanfetamina (ecstasy) e metanfetamina(COSTA et al., 2009)(XU; YE;
LIAO, 2019), são exemplos da aplicação da detecção de fluorescência em análises
toxicológicas.

4.4 Espectrometria de massas

A espectrometria de massas (MS) é uma técnica instrumental que produz,


separa e detecta íons na fase gasosa. As amostras são introduzidas na fonte de
ionização com algum tipo de sistema de introdução de amostra – que irá depender da
natureza da amostra e dos analitos. Os analitos são geralmente neutros e devem ser
ionizados. A ionização pode ser realizada por altas temperaturas (plasma acoplado
indutivamente), por impacto de elétrons, por ação de laser ou por um electrospray. Os
íons produzidos são rapidamente transferidos ao ambiente de alto vácuo (10-4 - 10-
7
Torr) e podem ser separados, com base em sua relação massa/carga (m/z), com a
ajuda de um sistema que aplica campos elétricos e magnéticos (HOFFMANN;
STROOBANT, 2007).

Existem diferentes configurações de analisadores de massas, cada um com


suas vantagens e desvantagens, seus custos e suas aplicações. Uma vez separados
os íons, eles devem atingir o detector (multiplicador eletrônico ou fotomultiplicador),
que converte o íon em um sinal elétrico. Em seguida, serão registrados pelo sistema
de dados, gerando o espectro de massas. O espectro de massas é o ordenamento
das abundâncias de íons versus a relação massa/carga (m/z).A abundância reflete a
quantidade relativa de um íon particular, que chegou ao detector e que pode ser
relacionado com a concentração do analito na amostra com finalidade quantitativa
(SKOOG; JAMES HOLLER; NIEMAN, 2002)(SMITH et al., 2007). As relações m/z dos
fragmentos constituem o parâmetro qualitativo a ser usado na identificação do analito.
Por exemplo: se ionizar o metano para formar CH4+, em um instrumento com
resolução unitária, se espera observar dois sinais. Um sinal maior, em m/z 16
(costuma-se anotar M+, porque representa o íon molecular), estará acompanhado do
outro sinal, menos intenso, aproximadamente 1% do íon molecular, na m/z 17 (o M+1
para indicar um isótopo do íon molecular) (KÖPPEL; MCLAFERTY, 1984), que
corresponde ao isótopo 13C. As abundâncias de íons no eixo y do espectro de massas
são apresentadas como intensidade relativa, onde as intensidades de todos os íons
são normalizadas com relação ao íon mais abundante ou pico base (figura 7).
Espectros de massas de várias substâncias, obtidos por GC-MS, empregando-se o

26
modo de ionização por impacto de elétrons a 70kV, podem ser consultados no website
do NationalInstituteof Standards and Technology.

Figura 7 – Espectro de massas do metano.


Fonte: NIST Standard Reference Database 69. NIST Chemistry WebBook, 2018.Disponível
em https://webbook.nist.gov/cgi/cbook.cgi?ID=C74828&Mask=200#Mass-Spec. Acesso em: 4
ago. 2020.

Substâncias na forma pura e gasosa facilitam a identificação por MS; por isso,
a cromatografia gasosa representou a combinação perfeita para acoplamento dessas
técnicas, permitindo que os compostos volatilizados sejam primeiro separados na
coluna cromatográfica e depois introduzidos no espectrômetro de massas. Compostos
orgânicos voláteis e apolares são os ideais para análise em GC-MS, enquanto
moléculas polares e termolábeis são mais facilmente analisadas pela técnica de LC-
MS. A espectrometria de massas também permite a análise de amostras sólidas por
ablação a laser para compostos inorgânicos (GÜNTHER; HATTENDORF, 2005) e
orgânicos, como drogas de abuso, em amostras no modo de ionização e dessorção a
laser assistida por matriz (Matrix-assistedLaserDesorptionIonizationMass Spectrometry
– Maldi)(SKRIBA; HAVLICEK, 2018) .

4.5 Espectrometria de absorção atômica

27
A espectrometria atômica mede o elemento na sua forma atômica livre gasosa.
Assim, vários elementos podem ser determinados, no sangue, na urina, no fluido
cerebrospinal e em outros fluidos biológicos, pela aspiração direta da amostra diluída.
A espectrometria de absorção atômica (AtomicAbsortionSpectrometry – AAS) se
baseia na capacidade dos elementos em interagir com a radiação eletromagnética na
região UV-VIS do espectro. A propriedade de absorver radiação em comprimentos de
ondas específicos é usada como parâmetro de identificação do elemento. Quando a
AAS está associada a técnicas de separação (isolamento) e detecção específica é
considerada confiável para análises confirmatórias; um exemplo é a análise de
mercúrio pelo método de atomização por vapor frio, sendo este o único elemento
metálico que apresenta alta pressão de vapor em temperatura ambiente (SKOOG;
JAMES HOLLER; NIEMAN, 2002)(RUSSELL; SHELTON; WALSH, 1957). Esta técnica
é muito relevante em análises ambientais, ocupacionais e alimentares.

A fonte de radiação mais utilizada em AAS é a lâmpada de cátodo oco, que


consiste de um eletrodo fabricado com o mesmo material que vai ser analisado; assim,
se o elemento de interesse é o mercúrio, o eletrodo será fabricado com mercúrio. Ao
eletrodo é aplicado um potencial (cerca de 300 V) gerando uma descarga elétrica que
produzirá átomos do metal que compõe a lâmpada; tais átomos excitados emitem
radiação nos mesmos comprimentos de onda que serão absorvidos pelo analito de
interesse. A diminuição da absorbância é detectada por um fotomultiplicador que
representa o detector do sistema. O fotomultiplicador é precedido de um sistema
monocromador que permite a passagem de somente um comprimento de onda
selecionado para detectar o analito de interesse. O elemento é queimado na chama
que foi posicionada no caminho óptico do feixe vindo da fonte. O detector gera um
sinal que vai ser amplificado e registrado para ser relacionado com a absorbância e
com a concentração do elemento analisado(SKOOG; JAMES HOLLER; NIEMAN,
2002)(RUSSELL; SHELTON; WALSH, 1957).

Os elementos devem estar no estado gasoso para interagir com a radiação,


portanto, são utilizados nebulizadores, com auxílio de agente oxidante e combustível,
ambos no estado gasoso, que ajudam na nebulização da solução do
elemento,produzindo uma névoa que é levada à chama onde ocorre a atomização.A
chama é produzida pela queima, sob altas temperaturas, de um combustível,
geralmente metano, e promoverá a obtenção do elemento em estado gasoso atômico,
com seus elétrons em estado basal. Desta forma, os átomossão passíveis de ser
excitados em níveis de maior energia quando absorvem radiação em comprimento de

28
onda apropriado. A atomização é a etapa mais crítica na espectroscopia de chama e
limita a precisão do método devido a possíveis interferências.

A preparação de amostras para AAS com atomização por chama geralmente é


muito simples, na condição que não existam interferências químicas ou espectrais.
Tudo que é preciso é obter uma amostra em solução, filtrada para evitar partículas
sólidas. Para isto, as amostras são dissolvidas com ácidos (digestão ácida),
geralmente concentrados. A escolha do ácido ou da mistura de ácidos depende do tipo
de amostra e do analito que se procura analisar. Nas digestões mais simples, com
ácido clorídrico frio, pode-se dissolver uma amostra de cobre metálico; já uma amostra
de liga de titânio precisará de uma mistura de ácidos concentrados e altas
temperaturas, para conseguir se dissolver totalmente. Outras técnicas para
preparação de amostras permitem obter diretamente o elemento em estado gasoso.

Para análise de amostras sólida, de amostras com sólidos suspendidos, além


das amostras dissolvidas, é possível adotar a espectrometria de absorção atômica
com forno de grafite (GraphiteFurnaceAtomicAbsorptionSpectrometry – GFAAS).
Existem atomizadores especialmente desenhados para a análise acurada de sólidos.
Este forno é colocado no lugar da chama e não precisa de nebulizador nem de gases
oxidantes e combustíveis, mas precisa de um gás inerte (Ar). Uma amostra líquida é
colocada num tubo de grafite, no forno; o volume da amostra pode ser escolhido
dependendo da concentração do analito na amostra. Uma vez que a amostra é
colocada no tubo, este é aquecido pela aplicação de uma corrente elétrica suficiente
para eliminar a umidade, com ajuda de argônio, e depois a temperatura é aumentada
até eliminar os interferentes orgânicos presentes na matriz. Finalmente, na fase de
atomização do elemento, a temperatura pode chegar a 2.000ºC ou 3.000ºC e a
absorção é medida logo acima da superfície aquecida (SKOOG; JAMES HOLLER;
NIEMAN, 2002).

Os elementos arsênio, antimônio, estanho, selênio, bismuto e chumbo podem


ser separados de outras substâncias ou de matrizes, que podem interferir na análise,
pela conversão a hidretos, adotando-se um gerador de hidretos. Este método permite
analisar amostras que contenham estes elementos, pela geração rápida de hidretos
voláteis, adicionando-se uma solução a 1% de boro-hidreto de sódio. O hidreto volátil
é varrido para a câmara de atomização, constituída por um tubo de sílica que é
aquecido,no qual o hidreto se descompõe e o elemento atomizado absorve um
comprimento de onda adequado.

29
4.5 Plasma acoplado indutivamente à espectrometria de massas

Outra técnica adota para análise elementar é o plasma acoplado indutivamente


à espectrometria de massas (InductivelyCoupled Plasma Mass Spectrometry – ICP-
MS). O plasma é iniciado pela descarga de uma bobina tesla e o argônio, excitado
pela radiofrequência de uma bobina que rodeia a tocha de quartzo, é submetido ao
campo magnético alternante, com uma frequência na faixa entre 5 e 75 MHz e uma
potência de 1 a 2 kW. Os íons atômicos produzidos pelas altas temperaturas são
transferidos ao analisador de massas, de maneira eficiente, pela interface que consiste
de um cone de amostragem (sampler cone) e um skimmer cone que apresenta um
orifício pequeno o suficiente para manter o vácuo indispensável no MS (OLESIK,
1991).A maioria dos equipamentos comerciais de ICP-MS utiliza o analisador de
massas tipo quadrupolo para separar e selecionar os íons de interesse. Elementos
como lítio são quantificados em matrizes biológicas com rapidez e confiabilidade.
Análises de vários metais, como chumbo e arsênio, podem ser feitos com rapidez e
confiabilidade com ajuda do ICP-MS.

A fonte de íons adotada no ICP apresenta múltiplas vantagens para hifenação


com MS. As temperaturas do plasma (até 10.000 K) impedem a presença de
moléculas orgânicas, mas os elementos presentes na amostra são facilmente
ionizados e podem ser introduzidos no espectrômetro de massas MS, onde são
separados e analisados, com base na sua relação m/z, e depois detectados com
grande sensibilidade. Apesar de apresentar baixa interferência entre elementos, pode
ocorrer a supressão da ionização quando estão presentes grandes quantidades de
espécies facilmente ionizáveis. Por exemplo: a presença abundante de sódio aumenta
a densidade eletrônica do plasma, diminuindo a capacidade de ionização do
plasma(WILSCHEFSKI; BAXTER, 2019). O uso de um padrão interno é essencial para
a quantificação adequada. O padrão interno ideal seria o traçadorisotópico do mesmo
129
elemento que não esteja naturalmente presente na amostra; por exemplo, o I é o
traçador isotópico ideal na análise de iodo; no entanto, a disponibilidade de traçadores
isotópicos do mesmo elemento não é comum, sendo recomendável adotar um
elemento com potencial de ionização similar ao analito de interesse.

5.Confiabilidade dos resultados

A confiabilidade corresponde à garantia de que os resultados e as


interpretações geradas são irrefutáveis e que atendem à finalidade que motivou a
análise. A confiabilidade só pode ser alcançada dentro de um sistema de trabalho que

30
atenda padrões mínimos de qualidade. Portanto, são adotados sistemas de qualidade
em harmonia com as normas e recomendações nacionais e internacionais, as quais
tratam da qualidade laboratorial geral e são aplicadas à qualidade dos métodos
analíticos.

Em âmbito internacional, guias e recomendações podem ser acessados


através da Organização Internacional de Normalização (InternationalOrganization for
Standardization – ISO), da Organização para o Desenvolvimento e Cooperação
Econômica (Organization for EconomicCooperationandDevelopment – OECD), do
Conselho Internacional para Harmonização de Requisitos Técnicos para
Medicamentos de Uso Humano (InternationalConcil for
HarmonizationofTechnicalRequirements for Pharmaceuticals for Human Use – ICH),
da Agência Americana de Saúde e Segurança Ocupacional (OccupationalSafetyand
Health Administration – OSHA), da Agência de Proteção Ambiental dos Estados
Unidos da América (United States Environmental ProtectionAgency – EPA), do
Escritório das Nações Unidas sobre Drogas e Crime (United Nations Office
onDrugsand Crime – Unodc), da Academia Americana de Ciências Forenses
(American AcademyofForensic Science – AAFS), dentre outras.

Em âmbito nacional, podem ser consultados os guias, as recomendações e as


normas exarados pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (Anvisa), pela
Associação Brasileira de Normas Técnicas (ABNT), pelo Instituto Nacional de
Metrologia, Qualidade e Tecnologia(Inmetro),pela Sociedade Brasileira de Toxicologia
(Sbtox) e, ainda, pelo antigo Ministério do Trabalho e Emprego, para o âmbito da
toxicologia ocupacional.

O sistema de qualidade mais adotado em laboratórios analíticos no Brasil é o


guia ABNT NBR ISO/IEC 17025:2017, que especifica os requisitos gerais para
competência, imparcialidade e operação consistente dos laboratórios. É aplicável a
todas as organizações que realizam atividades de laboratório, independentemente do
número de funcionários. Nesse sistema, a imparcialidade, definida como a
objetividade, exige um comprometimento da gerência e uma garantia da ausência de
conflito de interesse, de modo que atividades de laboratório não sejam afetadas por
pressões externas. Nesse quesito, é exigido que os riscos que ameacem a
imparcialidade sejam identificados, para minimização ou eliminação através da
elaboração de um “plano de riscos”.

O fator imparcialidade inclui a seleção e o treinamento do pessoal, de forma


documentada,pela qual serão estabelecidos os requisitos de competência para

31
cumprir suas funções dentro do laboratório, assegurando a competência dos
envolvidos na análise. No quesito pessoal,são importantes a retenção de registros e a
exigência de procedimentos para seleção, determinação das competências e seu
monitoramento, autorizações, treinamento e supervisão. Todas as atividades, como
desenvolvimento de métodos, validação, verificação, análises críticas e interpretações,
devem ser autorizadas. O laboratório deve ter estrutura física adequada e acesso a
equipamentos (com procedimento de manuseio, transporte e armazenamento), de
modo a garantir a produção de resultados válidos. Além disso, as condições
ambientais para a realização das análises devem ser controladas, documentadas e
monitoradas. O acesso de pessoas deve ser controlado e restrito, havendo separação
efetiva entre áreas com diferentes atividades.

Para implantação do sistema de qualidade, deve haver a elaboração do manual


de Boas Práticas de Laboratório (BPL),no qual serão estabelecidos os procedimentos
operacionais e as práticas consideradas obrigatórias, com o intuito de assegurar a
qualidade e a correção do resultado produzido pelo laboratório.

Dentro do sistema de qualidade, faz parte dos requisitos a validação dos


equipamentos, dos métodos e dos processos. Os equipamentos devem possuir
registros, como histórico de localização, manutenções, evidência de checagem,
calibrações e defeitos apresentados. A validação dos equipamentos constitui parte
crítica do procedimento instrumental analítico. Cada característica de desempenho do
instrumento deve estar dentro das especificações do fabricante, em especial a
sensibilidade, a estabilidade, a linearidade, a especificidade e a precisão do
automostrador (autosampler), quando aplicável, devendo ser testadas e atestadas
pelo fabricante no momento da instalação. Os testes de desempenho devem ser
incorporados no sistema de qualidade dos métodos que incluem o equipamento.

Os métodos de triagem e confirmação devem ser validados, assim como a


coleta e o armazenamento de amostras, a emissão e a guarda de dados.

A validação de amostras deve ser aplicada, para estabelecer os critérios de


aceite de amostras, segundo sua autenticidade e viabilidade, e as situações que em
que será exigida nova amostragem. Neste processo, serão verificadas situações em
que amostras podem ser rejeitadas devido a questões relacionadas com sua
identidade, sua coleta ou sua manipulação.

Para todos os procedimentos e processos, deve haver procedimentos


operacionais padrão (POP) que forneçam a descrição detalhada das atividades. Por
exemplo: os procedimentos de cadeia de custódia das amostras; o manuseio e

32
preparação das amostras; o método analítico; a manutenção dos equipamentos; o
manejo dos arquivos, dentre outros. A responsabilidade pela implantação dos POP e
seu acesso de forma contínua, assim como a realização de auditorias frequentes
devem fica a cargo da unidade de garantia de qualidade (UGQ), a qual,
preferivelmente, deverá ser independente do laboratório e responder diretamente à
gerência da organização.

A seleção do método analítico deve ser preferencialmente dentre aqueles que


constam em guias e recomendações nacionais e internacionais. Quando tais métodos
normalizados precisam ser adaptados, há desenvolvimento de novo método ou os
normalizados serão usados fora do escopo original. A validação deverá ser realizada
de acordo com as normas específicas relacionadas à sua finalidade. Por exemplo: se
um método de quantificação de determinado fármaco em matriz biológica for
desenvolvido com finalidade forense, a validação deverá ser realizada de acordo com
as recomendações do Unodc, da AASF e da SBTOX, em harmonia com a RDC Nº
27/2012, da Anvisa, que dispõe sobre a validação de métodos bioanalíticos. Se o
método tem por objetivo a análise toxicológica de monitoramento ocupacional, OSHA
e portarias do Ministério do Trabalho e Emprego, relacionadas à exposição a
substâncias químicas (insalubridade), devem ser adotadas em harmonia com as da
Anvisa e Inmetro.

A validação permitirá demonstrar que o método é apropriado para o uso


pretendido. Métodos qualitativos terão apenas alguns parâmetros avaliados, como
seletividade, valor preditivo positivo, valor preditivo negativo e limite de detecção.
Métodos quantitativos incluem, além da seletividade e do limite de detecção, as figuras
de mérito linearidade, precisão intra e interensaio, efeito de matriz (quando se trata de
matrizes complexas), exatidão, limite de quantificação, robustez. Para métodos
bioanalíticos (aplicáveis a matrizes biológicas), os parâmetros efeito residual e
estabilidade devem fazer parte da validação. Os critérios de aceitação dependem da
norma e/ou da recomendação adotadas.

A disponibilidade de materiais de referência certificados e de brancos de matriz


é o requisito mais crítico na validação de métodos analíticos. Material de referência
certificado corresponde ao padrão de referência certificado (substância isolada, com
teores certificados, que pode se apresentar na forma sólida pura ou diluída em
solvente apropriado) ou à amostra de referência certificada (matriz contendo teores
certificados do analito).

33
É válida a afirmação de que não existe o melhor método analítico, mas sim o
mais adequado à finalidade proposta. Neste sentido, também é válida a afirmação de
que não existe melhor validação, mas sim a adequada ao escopo pretendido.

REFERÊNCIAS

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e ISO 45001: gestão da qualidade; ambiental e da segurança e saúde ocupacional
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BRASIL. ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária. RESOLUÇÃO – RDC Nº
53, DE 4 DE DEZEMBRO DE 2015. Estabelece parâmetros para a notificação,
identificação e qualificação de produtos de degradação em medicamentos
comsubstâncias ativas sintéticas e semissintéticas, classificados como novos,
genéricos e similares, e dá outras providências. DOU Nº 233, segunda-feira, 7 de
dezembro de 2015.

BRASIL. ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária. RESOLUÇÃO – RDC Nº


301, DE 21 DE AGOSTO DE 2019. Dispõe sobre as Diretrizes Gerais de Boas
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