PCR básico:

Princípios, componentes, fatores críticos

 PCR – Reação em cadeia da polimerase

Método de síntese enzimática “in vitro” de

sequências de DNA ou seja amplificação de
segmentos de DNA.

Revisão de alguns conceitos importantes:

Estrutura do DNA http://www.johnkyrk.com/DNAanatomy.html
Replicação do DNA www.ncc.gmu.edu/dna/repanim.htm
 Como surgiu a idéia do PCR?
Polymerase Chain Reaction

…invented by Kary Mullis

while cruising in a
Honda Civic on
Highway 128 from San
Francisco to
Mendocino,

"It was quiet and

something just went,
Kary B. Mullis Click!"
Nobel Laureate, 1993
1983 Chemistry
 Como “fazer” DNA in vitro:

Célula PCR
ss DNA molde helicase, etc. Dna isolado (Temperatura)
dNTPs presente Adicionar

Primer primase Adicionar primers prontos

DNA DNA
Adicionar polimerase
Polymerase Pol III
Meio ambiente núcleo Tubo
 Fazer a síntese de sequências de DNA in vitro

DNA polimerase (cofatores)

dNTPs (ATP, CTP, GTP, TTP)
Primers (iniciadores)

1)Desnaturação
2)Ligação dos iniciadores – anelamento
3)Extensão

Diferentes Temperaturas
 Conjunto de banhos com diferentes temperaturas

1)Desnaturação 94-96°C
2)Ligação dos iniciadores – anelamento 50-65 °C
3)Extensão 72 °C

Banhos Termocicladores automáticos

 DNA polimerase

Como a enzima aguentaria altas temperaturas?

DNA polimerase termoestável – Thermus aquaticus

Taq DNA polimerase

 Thermus aquaticus

…bacteria descoberta em um geiser no parque natural de Yellowstone em 1965,

…vive em águas salgadas cuja temperatura varia entre 70o - 75o C,

…assim, a replicação do DNA deveria ocorrer em altas temperaturas.

DNA polimerase termoestável

 1 ciclo

Cada molécula de
DNA daria origem
a outra molécula
de DNA

E se
repetissem os
ciclos 30 – 40
vezes?
Quantidade de produto = 2N,, onde N = número de ciclos
 Animação PCR

http://www.maxanim.com/genetics/PCR/pcr.swf

www.dnalc.org/shockwave/pcranwhole.html

http://spine.rutgers.edu/cellbio/flash/pcr.htm

http://www.promega.com/paguide/animation/selector.htm?
coreName=pcr01

filme
Otimização da reação
Fatores críticos na otimização da PCR
Rendimento
Fatores físicos e químicos Especificidade
Sensibilidade

Físicos – evitar contaminações

Área física, tubos de reação, ponteiras com

barreira, pipetas, luvas, soluções, aliquotas,
controles (negativo)

Máquina de PCR – “ramp”

 Fatores Químicos - Componentes da reação
1) DNA molde ou template – qualidade, quantidade e
integridade (depende)
Quantidade – depende da complexidade do DNA
DNA genômico humano 500ng
DNA bacteriano 1-10ng
DNA plasmidial 0,1-1ng

Forma de extração e dosagem.

 1) DNA molde ou template – qualidade, quantidade e
integridade (depende)

Qualidade (impurezas, quelantes de Mg, RNA)

Reagentes utilizados na purificação podem inibir

a Taq DNA polimerase: sais, guanidina,
proteases, solventes orgânicos (fenol),
heparina, SDS
0,01% SDS inibe 90%
0,1% SDS inibe 99%
2) Iniciadores – sequência e concentração (temperatura)

- 15-30 bases de comprimento;

- conteúdo de G/C ~40-60%
- distribuição balanceada de domínios ricos em A/T e C/G
- não contenham estruturas secundárias;
- não tenham complementaridade c/ o par (ext 3´)
- Tm entre 55 – 65°C (anelamento- em torno de 5°C do
Tm), temperaturas similares.
- 0,1 – 0,6µM (depende)
- Sequências a serem introduzidas devem ser colocadas
na extremidade 5’ do primer
 Iniciadores

5’ATGCTTAGTCTGTTTATAGTCAGTGGATTGTTTAAAGGAGGTATA 3’
3’TACGAATCAGACAAATATCAGTCACCTAACAAATTTCCTCCATAT 5’
 Iniciadores
5’ATGCTTAGTCTGTTTATAGTCAGTGGATTGTTTAAAGGAGGTATA 3’
3’ TCCATAT 5’
5’-3’

5’-3’
5’ATGCTT 3’
3’TACGAATCAGACAAATATCAGTCACCTAACAAATTTCCTCCATAT 5’
 Iniciadores
5’ATGCTTAGTCTGTTTATAGTCAGTGGATTGTTTAAAGGAGGTATA 3’

5’ATGCTT 3’
3’ TCCATAT 5’ 5’ TATACCT 3’
Estruturas secundárias
3) DNA polimerase
Taq DNA polimerase – 0,1 – 0,5U/10µl reação
• Dificuldade de pipetar volumes pequenos na
presença de glicerol
• Atividade varia muito da empresa fornecedora
Insere 60 bases/seg na temperatura de 70 °C

0.25 0.5 1.0 2.0 U

Meia-vida de 40 minutos a 95°C

Geralmente adiciona A na extremidade 3’ dos produtos
Casos específicos:

- aumentar a fidelidade da reação

Taq insere 26 erros a cada 10-6
Enzimas “proof reading” (correção de leitura) 3 erros a
cada 10-6

- aumentar o rendimento

- DNA molde rico em G/C

- DNA molde maior que 5Kb

4) Concentração de MgCl2
Um dos fatores mais importantes – Mg2+ se complexam
aos dNTPs agindo como cofatores para a enzima.
- 1mM – 5 mM ( 1,5mM)
-Depende da presença de compostos que se ligam a íons
(dNTP, EDTA, citrato)
-Precipitação da solução de magnésio (vortex, 90°C 10’)
5) dNTPs

50 – 500µM (200µM)

Balanço entre dNTP e Mg2+

6) Tampão - pH

tampão, geralmente de tris, contendo um sal,

geralmente KCl (50mM), pH ótimo da Taq DNA polimerase
entre 8.3 e 9.0
7) Aditivos – aumentar o produto específico ou reduzir os
inespecíficos
•DMSO (1-10%),
•gelatina (0,1 – 1,0%),
•BSA (0.1mg/ml),
•detergente não-iônicos (0-0,5%)
• betaína (1M),
•formamida (1-10%)
•Glicerol (5 – 20%)
•PEG (5 – 15%)
Quando usar
Moldes ou primers ricos em G/C ou
que formam estruturas secundárias,
aumentar a estabilidade da enzima
8) Óleo mineral

Evitar evaporação
 Protocolo de reação

Tampão 10x 1µl

dNTPs 200mM 1µl

Taq DNA polimerase 0,1µl

Iniciadores (5mM) 1µl cada

DNA 1µl

Água DD 10µl q.s.p.

 Mo re/ Less/
Higher Lower
MgC l2 Mor e Product Less Product
Less Specificity Mor e Specificity

dNT Ps Mor e Product Less Product

Less Specificity Mor e Specificity

Primers Mor e Product Less Product

Less Specificity Mor e Specificity

Annealing Mor e Specificity Less Specificity

Tempera ture Less Product Mor e Product

Annealing T ime Mor e Product Less Specificity

Less Specificity Mor e Product

Extension Time Mor e Product Less Specificity

Less Specificity Mor e Product

Cyc les Mor e Product Less Specificity

Less Specificity Mor e Product

Taq* Mor e Product Less Product

Less Specificity Mor e Specificity
 Programa
1) Desnaturação
Inicial – 94 - 96°C 2 min.

Ciclos - 94 - 96°C 20-30 seg

(depende do tipo de tubo 500 ou 200µL, do conteúdo de

G/C, do tamanho do DNA molde, reduz a atividade da
enzima) 30 20 10 5 1 seg

Plasmídeo 10Kb
2) Anelamento

Depende da sequência dos iniciadores, otimizado

empiricamente
Tm = (A/T) x 2 + (C/G) x 4 (www.promega.com/biomath/)

Começar com 5 °C abaixo da Tm

3) Extensão – depende do tamanho do DNA a ser amplificado

Taq DNA polimerase insere 60 bases / segundo a 72 °C

(enzimas que fazem correção são mais lentas)
A cada 45 seg gera 1Kb
4) Número de ciclos

25 – 35 ciclos (pouco produto – produtos inespecíficos)

5) Extensão final

72 °C 5 – 10 min.
 Programa
95 °C – 2 min

95 °C – 30 seg
30 Ciclos
50-65 °C – 30 seg

72 °C – 30 seg

72 °C – 5 min

4 °C - 0
Aplicações
1) Amplificação de um produto específico,
por exemplo um gene de interesse

Etapas:
1 – Obter a sequência do gene de interesse (genBank)
2 – Desenhar os iniciadores específicos
3 – Fazer a amplificação
4 – Visualizar os produtos
 Sequência do gene de interesse
>gi|73544592|ref|XM_843098.1| protein phosphatase (LMJ_0496) mRNA,
ATGCCTCTAAAAGGGTTGAACGCCCTCAAGGGCAACACGCAAACTGTCCTCATCTCTCCTGTGCGCGACA
ATACTCTATTCTGATGGAGGATGATAAAATACGTGCCGGTGCGAGTAGCATGCAGGGGTGGCGAAGCAC
GATGGAGGACGCTCACGCTGTCTACCTCTCACTTCCCAACATGCCAGGAAACATTCGCGACGAAGACTGC
GCGATCGCCGCGGTCTTCGATGGCCACTGTGGTAGCAAGTTTGCACAGTCGTGCGCCGCAAACATCCGCG
ACTGGCTCACGTCAACCGATGCGTTCAAGAAGGGGAACTTCGAGAAGGCGCTGAAGGACGCTTACTGCAC
AGGCGACGTTGCTCTTCACAAAGCCATGCCAAACGAGCTGAGCGGCTGCACGGGCAACTGCGTTTTAATA
ATCCAAAACCATTTGTACTGCGCCAACACCGGCGATTCACGGGCGGTGTTGTGCCGGAATGGCGAGGCCA
TAGCGCTCAGCGAGGACCACAAGCCCACCAACCCTGCCGAGCGAGAGCGCATCATGAAGGCAGGAGGGTT
TGTGCAGGCTGGACGAGTTAACGGTATCCTGTCTCTCAGCCGGGCCTTCGGCGACTATGCGTTCAAGGAC
ATGAGTCTCAGGCCAGAGCAGATGGCCATCACGGTGACCCCAGACGTGTTCCACACCGAGCTGACTCCGC
ACGATGAGTTTGTCATCGTCGCGTGCGATGGCATCTGGGACATGATGACAAATGAAAAGGCGGTCGAGTT
TGTGCGCAACGAAGTTGCCGACCATGGCGACATATCTTTAGCATGTGAGCGGCTCATGAACGCGTGTCTC
GCGTCTACACCCACCTCCTACGGCACCGATAACATGACTATAATCATTCTCCAGTTCAAGAGCTTGTTCT
TGAAGAAGGTGGAGAGTAAGTTCTCTGCGGAGTGA
 Desenho dos iniciadores
>gi|73544592|ref|XM_843098.1| protein phosphatase (LMJ_0496) mRNA,
ATGCCTCTAAAAGGGTTGAACGCCCTCAAGGGCAACACGCAAACTGTCCTCATCTCTCCTGTGCGCGACA
ATACTCTATTCTGATGGAGGATGATAAAATACGTGCCGGTGCGAGTAGCATGCAGGGGTGGCGAAGCAC
GATGGAGGACGCTCACGCTGTCTACCTCTCACTTCCCAACATGCCAGGAAACATTCGCGACGAAGACTGC
GCGATCGCCGCGGTCTTCGATGGCCACTGTGGTAGCAAGTTTGCACAGTCGTGCGCCGCAAACATCCGCG
ACTGGCTCACGTCAACCGATGCGTTCAAGAAGGGGAACTTCGAGAAGGCGCTGAAGGACGCTTACTGCAC
AGGCGACGTTGCTCTTCACAAAGCCATGCCAAACGAGCTGAGCGGCTGCACGGGCAACTGCGTTTTAATA
ATCCAAAACCATTTGTACTGCGCCAACACCGGCGATTCACGGGCGGTGTTGTGCCGGAATGGCGAGGCCA
TAGCGCTCAGCGAGGACCACAAGCCCACCAACCCTGCCGAGCGAGAGCGCATCATGAAGGCAGGAGGGTT
TGTGCAGGCTGGACGAGTTAACGGTATCCTGTCTCTCAGCCGGGCCTTCGGCGACTATGCGTTCAAGGAC
ATGAGTCTCAGGCCAGAGCAGATGGCCATCACGGTGACCCCAGACGTGTTCCACACCGAGCTGACTCCGC
ACGATGAGTTTGTCATCGTCGCGTGCGATGGCATCTGGGACATGATGACAAATGAAAAGGCGGTCGAGTT
TGTGCGCAACGAAGTTGCCGACCATGGCGACATATCTTTAGCATGTGAGCGGCTCATGAACGCGTGTCTC
GCGTCTACACCCACCTCCTACGGCACCGATAACATGACTATAATCATTCTCCAGTTCAAGAGCTTGTTCT
TGAAGAAGGTGGAGAGTAAGTTCTCTGCGGAGTGA
 PCR
• DNA de Leishmania major
• DNTPs
• Taq DNA polimerase
• Tampão
• Primers
Visualização dos resultados

Produto de
tamanho
esperado
(920bp)

1 – Padrão de peso molecular

2 – Produto da PCR
3 – Controle negativo (sem DNA)
 2) Diagnóstico
Detecção de patógenos
3) Identificação de polimorfismos
4) Subclonagem
(inserção de sítios para enzima de restrição)

5) Mutagênese

6) Detecção de genes diferencialmente expressos

7) Determinação/ quantificação da expressão de genes

8) Forense / paleobiologia (cabelo, sangue, múmia)

9) Testes genéticos (fibrose cística, distrofia muscular)

10) Determinação de paternidade

11) Determinação de compatibilidade de tecidos/orgãos

...