HPLC 原理及應用

TODAY’S TOPICS
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主講人:蕭碧蓮
工研院能源與環境研究所

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中華民國九十九年六月十九日

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Separation Techniques
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Fractional Distillation
GC
TLC
LC(IC,GPC,HPLC…etc)
(
)
Electrophoresis
Filt ti
Filtration
Centrifugation
g

HPLC THEORY
(HPLC分析原理)
HPLC INSTRUMENTS
(HPLC分析儀器)
CONCLUSION (總結)

Why Use Liquid Chromatography
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„
„
„

Wide range
g of molecular weight
g
Variety of separation mechanism
N
Non-destructive
d t
ti and
d good
d mass capacity
it
Non-volatile sample
p without derivatization
Ionized or ionic compound
Near ambient
i
temperature
Large historical database

高效能液相層析儀 (利用高壓推動的方式加速層析) HPLC的應用 C的應用 : 胺基酸 胺基酸、蛋白質、核酸、碳氫 蛋白質 核酸 碳氫 化合物、農藥、藥物、殺蟲劑、食品、抗生素、 膽固醇 有機金屬 無機物 致癌物 有機合 膽固醇、有機金屬、無機物、致癌物、有機合 成物 ……分析 .HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY.TOPICS 1 „ „ HPLC THEORY (HPLC分析原理) HPLC INSTRUMENTS (HPLC分析儀器) „ „ „ „ „ „ „ chromatography簡稱層析。 chromatography之發展: GC→HPLC →IC →超臨界流體層析(SFC) „ „ — 係一種分離技術。 係一種分離技術 — 操作過程:利用含混合物之移動相(mobile phase)流經固定相(stationary phase) 。 CONCLUSION (總結) HPLC THEORY „ HPLC THEORY — 分離機制: o 混合物中各成分在固定相和移動相之間的分 配係數不同(即親和力不同) 。 o 各成分移動速率不同,而達到分離之目的。 — 化合物與固定相親和力較強,則沖提較慢 (即滯留時間長) — 化合物與移動相的親和力較強,則沖提較快 化合物與移動相的親和力較強 則沖提較快 (即滯留時間短)。 HPLC THEORY „ „ HPLC .

COLUMN OVEN (管柱恆溫器) „ „ . INJECTOR (注入系統) „ 4.HPLC THEORY HPLC THEORY HPLC 的數種分離方式 : „ 分配層析法 „ 吸附層析法 „ 離子層析法 „ 大小排除層析法 TOPICS 2 HPLC INSTRUMENTS HPLC分析儀器 所包含的元件 : „ „ „ HPLC THEORY (HPLC分析原理) HPLC INSTRUMENTS (HPLC分析儀器) CONCLUSION (總結) „ 1. DEGASSING SYSTEM (脫氣系統) 2 PUMP (幫浦) 2. 3.

DETECTOR (偵檢器) 7 DATA STATION (資料收集器) 7. 8.HPLC INSTRUMENTS „ „ „ „ „ HPLC INSTRUMENTS HPLC分析儀器 所包含的元件 : 5. COLUMN (分析管柱) 6. 其他週邊配備 HPLC INSTRUMENTS HPLC INSTRUMENTS „ „ „ DEGASSING SYSTEM (脫氣系統) 為什麼移動相會產生氣泡? 要如將氣泡排除? .

Isocratic elution (等位流洗) 2.HPLC INSTRUMENTS „ „ PUMP (幫浦) 功能 : 抽取移動相 → 使移動相能充滿、 移動於整個HPLC系統 HPLC INSTRUMENTS „ „ PUMP (幫浦) 1. Gradient elution (梯度流洗) HPLC INSTRUMENTS 幫浦 HPLC H 幫浦 HPLC H Isocratic elution (等位流洗) HPLC INSTRUMENTS Gradient elution (梯度流洗) .

HPLC INSTRUMENTS „ HPLC INSTRUMENTS Gradient Systems -Multi-pump gradient system one mobile bil phase h reservoir i per pump solvent blending g is after pump p p heads (high pressure gradient) HPLC INSTRUMENTS Gradient Systems -Single-pump gradient system t two tto four f mobile bil phase h reservoirs i g is before p pump p heads solvent blending (low pressure gradient) HPLC INSTRUMENTS .

HPLC INSTRUMENTS „ „ COLUMN OVEN (管柱恆溫器 (烘箱) ) 功能 : 使移動相 使移動相、HPLC分析管柱達恆 HPLC分析管柱達恆 溫狀態 → 恆溫狀態使分析圖譜穩定 → 縮短分析物滯留時間 HPLC INSTRUMENTS „ „ INJECTOR (注入系統) 原理 HPLC INSTRUMENTS „ INJECTOR (注入系統) „ 功能 : 注射樣品 HPLC INSTRUMENTS „ INJECTOR (注入系統) „ 何謂SAMPLE LOOP ? „ SAMPLE LOOP的功能 ? → 準確的控制樣品的 注射量 (volume) .

充填材 → 固定相、粒徑 孔徑 支持 、孔徑、支持 體…… „ HPLC INSTRUMENTS „ „ COLUMN (HPLC分析管柱) 功能 : 以不同的 PHASES (充填材) (充填材),提 提 供多樣化的樣品分析 HPLC INSTRUMENTS „ „ „ COLUMN (HPLC分析管柱) 充填材料 (COLUMN PACKING MATERIALS) : 材質 : C18(ODS)、C8、Silica、 Phenyl、NH2、CN、SAX、 SCX、C1 、C6……… . 自動取樣機 HPLC INSTRUMENTS COLUMN (HPLC分析管柱) 規格 : 1.HPLC INSTRUMENTS „ „ INJECTOR (注入系統) 分類 : 1. 長度 2. 內徑 3. 手動注射器 2.

HPLC INSTRUMENTS „ „ „ COLUMN (HPLC分析管柱) 充填材料 (COLUMN PACKING MATERIALS) : 粒徑 : 3μm、4μm、5μm、8μm、 10μm、12μm、15μm ……… HPLC INSTRUMENTS „ „ „ COLUMN (HPLC分析管柱) 充填材料 (COLUMN PACKING MATERIALS) : 支持體 : SILICA GEL BASED、 POLYMER BASED、 CAPSULE TYPE ……… HPLC INSTRUMENTS „ „ „ COLUMN (HPLC分析管柱) 充填材料 (COLUMN PACKING MATERIALS) : 孔徑 : 60Å(6nm)、100Å、120Å、150Å、 200Å 300Å … 200Å、300Å HPLC INSTRUMENTS „ „ COLUMN (HPLC分析管柱) 充填材料 (COLUMN PACKING MATERIALS) : ★ 充填材的 材質、粒徑、孔徑和支 持體… 持體 …等的不同,對於分析效果 有很大的差異 ! .

HPLC INSTRUMENTS HPLC INSTRUMENTS • COLUMN (HPLC分析管柱 (HPLC分析管柱)) „ DETECTOR (偵檢器) „ 功能 : 檢測由分離管柱分出之待測化合物 • 結構 : HPLC INSTRUMENTS „ DETECTOR (偵檢器) HPLC INSTRUMENTS „ „ „ 分類 : UV/VIS (紫外光/可見光) (紫外光/可見光)、螢光、 螢光 電化學、折射率、電導度、質譜、 FT IR 光散射 光學活性 FT-IR、光散射、光學活性 DETECTOR (偵檢器) UV/VIS DETECTOR (紫外光/可見光偵檢器) : ★ 適用於具有 UV/Vis 吸光性之結構體 ★ 不同化合物具有不同的波長吸收度 (物性) .

HPLC INSTRUMENTS ■ UV/VIS DETECTOR原理: 利用可見光及紫外光之燈管 (Lamp) (L ) 做為光源,通過濾光鏡調整色調後 ,經聚焦後通過單色光分光稜鏡, 再經過狹縫選擇波長,使成單一且 特定波長之光線,而後射入樣品管 中之水樣中,最後射入光電管中將 光能轉換為電器訊號,藉由樣本及 空白水樣間所吸收之光能量差,與 標準液之能量吸收值相比較,便可 律定樣本中之待測物濃度。 HPLC INSTRUMENTS ■ FLUORESCENE DETECTOR 原理 : 利用一強光(氙燈)照射樣品 管 ,其波長短足以激發樣品 中各成分放出螢光 ,再用光 再用光 電管和分光濾光設備測定所 發螢光強度;由螢光強度可 決定該成分的含量 ,同時由 螢光的波長,又可確認該成 分是什麼物質。 分是什麼物質 HPLC INSTRUMENTS „ „ DETECTOR (偵檢器) FLUORESCENE DETECTOR (螢光偵檢器) : ★ 僅適用於具有 螢光性之結構體 ★ 敏感度極高 HPLC INSTRUMENTS DETECTOR (偵檢器) „ REFRACTIVE INDEX DETECTOR (曲折率偵檢器) : „ ★ 分析化合物之折光率 (物性) ★ 常用於醣類分析 .

帶電體同時會在電場中運動,且受到電 場吸引或排斥 再利用一些特殊安排 場吸引或排斥,再利用一些特殊安排 (EX:四極體式)的電場,使碎片離子在運 動時,因質量不同而分開。 四極矩式分析器(Quadrupole Mass Spectromater)主要是由四支圓柱形的 電 極棒所組成,以四方形之對角線形 成雙曲 面排列,使其在棒中央形成一 個靜電場。 HPLC INSTRUMENTS DETECTOR (偵檢器) „ MASS SPECTROMETER DETECTOR (質譜儀偵檢器) : „ ★ 測量各個成分的質量以及它們的相對含量以及 其分子結構的能力 HPLC INSTRUMENTS „ 在相對的電極棒以電線相連接,施加直流電 壓(dc)及射頻電壓(rf)於其上,故在Y軸方向 上電極棒電壓為負電 上電極棒電壓為負電,X軸方向上電極棒電 軸方向上電極棒電 壓為正電,且射頻電壓(rf)與Y軸電壓的相位 差180 直流電壓與射頻壓在四極矩中間會 差180°。直流電壓與射頻壓在四極矩中間會 形成一電場,使得離子在其中產生一定規則 之振動軌跡,而不同質荷比(m/z)遵循不 同之振動軌跡 唯有呈穩定振動之離子才可 同之振動軌跡,唯有呈穩定振動之離子才可 通過四極矩而到達偵檢器被偵測到,其他呈 不穩定振動之離子則撞擊到四極矩上而被中 和。不同質荷比之離子在場中的解析能力( mass resolution)決定於加在電極棒上的dc 及rf電壓的比值 固定dc/rf的比值 並同時 及rf電壓的比值,固定dc/rf的比值,並同時 改變dc及rf的電壓,可使不同質荷比的離子 被偵測到。 .HPLC INSTRUMENTS ■REFRACTIVE INDEX DETECTOR原理 : 利用稜鏡使光線穿過樣本後色 散;入射光是單一波長光線, 其色散折射角與樣本的折射率 有關;將光電管放在一定的角 度上,樣本的折射率不同,則 折射到光電管的光線強度就不 同。 HPLC INSTRUMENTS ■MASS SPECTROMETER DETECTOR原理: 由於物質的分子,在高能射線的照射後 由於物質的分子 在高能射線的照射後 會離子化,同時也會分解成為一些碎片, 質譜即是由離子化碎片造成;而質譜儀 是使一群碎片離子通過磁場或電場後.

HPLC INSTRUMENTS „ TOPICS 3 DATA STATION (資料收集器) „ 數據接收 / 處理軟體 /軟體應用 „ „ CONCLUSION „ „ „ „ „ HPLC 包含4種分離模式(分配、吸附、離子、大小 排除) HPLC 以分析管柱(column) 將化合物分離,再經由 偵檢器及積分器,準確定性 偵檢器及積分器 準確定性 / 定量待測化合物 定量待測化合物。 不同phase的分析管柱,對單一種化合物的分析效果 有顯著的差異。 選擇適當的column&偵檢器方能有效分離及偵測待 測物。 column&moble l & bl phase&compounds之間.是必擇選 h & d 之間 是必擇選 其適切的搭配較能達到預期的分析效果。 HPLC THEORY (HPLC分析原理) HPLC INSTRUMENTS (HPLC分析儀器) CONCLUSION ((總結) END Thanks For Your Attention Any question ? .

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