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TESTE DE COOMBS DIRETO E INDIRETO

DOENÇA HEMOLÍTICA DO RECÉM-NASCIDO

Anticorpos maternos da classe IgG podem atravessar a placenta e lesar as hemácias fetais.
A doença hemolítica do recém nascido é observada com mais freqüência quando existe
incompatibilidade materno-fetal quanto ao antígeno D. Assim, mulheres Rh negativas,
cujos filhos são Rh positivos, podem ser imunizadas pelas células fetais, por ocasião do
parto. Geralmente este primeiro filho não sofrerá ação dos anticorpos maternos, mas um
segundo filho poderá ser prejudicado. Os anticorpos maternos, entrando na circulação fetal
através da placenta, fixam-se às hemácias e causam destruição destas células. Para
compensar a anemia resultante, a medula fetal responde excessivamente, assim como
outros órgãos hematopoiéticos. Como conseqüência evidencia-se eritroblastose, anemia e
hepato-esplenomegalia.

TESTE DE COOMBS

As imunoglobulinas, como outras proteínas, podem ser imunogênicas quando utilizadas


para imunizar indivíduos de outras espécies. A maioria das anti-imunoglobulinas geradas
desta maneira reconhecem as regiões conservadas de todos anticorpos de mesma classe. Os
anticorpos anti-imunoglobulinas foram inicialmente desenvolvidos por Robin Coombs para
estudar a anemia hemolítica do recém nascido e o teste para esta doença é denominado de
Teste de Coombs.

Teste de Coombs direto: Neste teste anticorpos maternos que atravessaram a placenta
podem ser detectados ligados nas hemácias Rh positivas do bebê. Para isso as hemácias do
bebê são coletadas, lavadas para remoção de anticorpos não ligados, e simplesmente
incubadas com anti-imunoglobulina humana. O teste é denominado de Coombs Direto pois
a aglutinação presente vai indicar a presença dos anticorpos anti-Rh ligados nas hemácias
do bebê.
PROCEDIMENTO:

-Em um tubo de ensaio adicionar 100 µ L de hemácias do recém nascido a ser testado, que
já foram previamente lavadas para remoção de possíveis anticorpos não ligados;
-Adicionar em seguida 100µ L de anti-IgG humana (soro de Coombs);
-Centrifugar o tubo a 1.000rpm por 2 minutos à temperatura ambiente;
-Para visualizar com maior precisão se houve aglutinação, derramar o sangue centrifugado
em uma lâmina de microscópio.

RESULTADO: Se aglutinar é sinal que o bebê já tinha anticorpos anti-D maternos da


classe IgG que atravessaram a placenta e se ligaram às suas hemácias promovendo sua lise
e fagocitose e haverá necessidade de transfusão sangüínea. Se não aglutinar, é porque não
houve passagem de anticorpos maternos anti-D através da placenta.

Teste de Coombs indireto: Este teste é para se detectar a presença de anticorpos anti-Rh
não aglutinantes no soro dos indivíduos Rh negativos. Neste teste o soro é inicialmente
incubado com hemácias do tipo “O Rh positivas”, que se ligarão caso os anticorpos anti-D
estejam presentes. Utiliza-se hemácias do tipo O para evitar a ligação cruzada de antígenos
A ou B cujos anticorpos também podem estar presentes no soro testado (por exemplo se o
indivíduo Rh negativo for do tipo sangüíneo O). Depois deste passo, as hemácias são
lavadas para retirar os anticorpos não ligantes e, em seguida incubadas com anti-
imunoglobulina. Este passo levará à aglutinação das hemácias indicando a positividade do
ensaio. Este mesmo ensaio é feito para determinar a presença do antígeno Du.

PROCEDIMENTO:

-Em um tubo de ensaio adicionar 100 µ L de soro da paciente Rh negativo a ser testado,
-Adicionar em seguida 100 µ L de hemácias O Rh positivas;
-Incubar por 5 minutos a temperatura ambiente;
-Encher o tubo com aproximadamente 2,0mL de solução salina para retirar excesso de
anticorpos não ligados;
-Centrifugar o tubo a 1.000rpm por 2 minutos à temperatura ambiente;
-Desprezar o sobrenadante na pia com cuidado para não jogar fora o botão de hemácias;
-Adicionar em seguida 100µ L de anti-IgG humana (soro de Coombs);
-Centrifugar o tubo a 1.000rpm por 2 minutos à temperatura ambiente;
-Para visualizar com maior precisão se houve aglutinação, derramar o sangue centrifugado
em uma lâmina de microscópio.

RESULTADO: Se aglutinar é sinal que a paciente tem anticorpos anti-D classe IgG em
seu soro que estão de forma perigosa atravessando a placenta e se ligando às hemácias Rh
positivas do bebê promovendo sua lise e fagocitose. Se não aglutinar, é porque não houve
sensibilização da mãe com este antígeno em gestações ou transfusões anteriores.
PROCEDIMENTO DO COOMBS INDIRETO PARA DETERMINAR PRESENÇA
DE ANTÍGENO Du (NÃO SERÁ FEITO NA AULA PRÁTICA)

1) Em um tubo de ensaio colocar 2 gotas de hemácias diluídas a 5% em salina;


2) Em seguida acrescentar, 2 gotas de Soro albumina bovina (BSA), utilizada para
diminuir a força normal de repulsão entre as hemácias (Potencial Zeta);
3) Em seguida acrescentar 2 gotas de anticorpo anti-D;
4) Centrifugar este tubo a 1.000rpm por 1 minuto, agitar suavemente e observar se ocorreu
aglutinação. Se for positiva, a presença de Rh positivo já está determinada. Se negativo,
prosseguir o ensaio;
5) Incubar o tubo a 37°C por 5 minutos;
6) Ao final iniciar as lavagens para a retirada dos anticorpos que não ligaram às hemácias.
Para isso, acrescentar 2,0 ml de salina ao tubo e centrifugar a 1.000 rpm por 1 minuto;
7) Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 3,0 ml de salina. Repetir a
centrifugação e o passo 7 por mais duas vezes;
8) Ao sedimento final, acrescentar 2 gotas de anti-imunoglobulina humana feita em
coelhos (Soro de Coombs);
9) Centrifugar a 1.000 rpm por 1 minuto;
10) Agitar suavemente e observar se houve ou não aglutinação.

Interpretação:

Se aglutinar: Du positivo
Se não aglutinar: Rh negativo