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Manuscrito aceito

Em sílico e em vitro inibição do citocromo P450 3A por estilbenóides sintéticos

Loai Basheer, Keren Schultz, Yelena Guttman, Zohar Kerem

PII: S0308-8146 (17) 31022-1


DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2017.06.040
Referência: FOCH 21262

Aparecer em: Química Alimentar

Data de recebimento: 3 de janeiro de 2017

Data de revisão: 7 de maio de 2017

Data de aceitação: 6 de junho de 2017

Cite este artigo como: Basheer, L., Schultz, K., Guttman, Y., Kerem, Z., Em sílico e em vitro inibição do citocromo P450
3A por estilbenoides sintéticos, Química Alimentar ( 2017), doi: http://dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.
2017.06.040

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Em sílico e em vitro inibição do citocromo P450 3A por sintético

estilbenóides

Loai Basheer, Keren Schultz, Yelena Guttman, Zohar Kerem *

Instituto de Bioquímica, Ciência Alimentar e Nutrição, Faculdade de Agricultura Robert H. Smith,

Food and Environment, The Hebrew University of Jerusalem, PO Box 12, Rehovot 76100, Israel.

Loai.basheer@mail.huji.ac.il ; Keren.schultz@mail.huji.ac.il ; Yelena.guttman@gmail.com ;

Zohar.kerem@mail.huji.ac.il

RESUMO

Inibição do citocromo P450 3A4 (CYP3A4), a principal enzima que metaboliza a droga, por

compostos dietéticos recentemente atraíram maior atenção. Avaliando a potência do

muitos compostos inibidores conhecidos é uma tarefa tediosa e demorada, mas pode ser

alcançados usando ferramentas de computação. Aqui, o CDOCKER e o Glide serviram para projetar o modelo

inibidores para caracterizar as características moleculares de um inibidor. Avaliando nitro-

estilbenoides, ambas as abordagens sugeriram que o nitrostilbeno é um inibidor mais fraco do CYP3A4 do que

resveratrol e mais forte do que dimetoxi-nitrostilbeno. Nitrostilbeno e resveratrol, mas não

dimetoxi-nitrostilbeno, envolvem interações eletrostáticas na cavidade da enzima, e com o

haem. Em vitro avaliação da capacidade inibitória apoiou o em sílico previsões,

sugerindo que avaliar as interações eletrostáticas de um composto com a prótese

grupo permite a previsão da potência inibitória. Uma vez que ambos os programas produziram resultados relacionados,

sugere-se que para CYP3A4, as ferramentas de computação podem permitir a identificação rápida de potentes

inibidores dietéticos.

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Palavras-chave: CYP3A4 / Resveratrol / Nitrostilbeno / Di-metoxi-nitrostilbeno / Microssomas /

Docking.

Abreviações: CYP, citocromo P450; P450s, enzimas do citocromo P450; RLM, fígado de rato

microssomas.

* Autor correspondente : Instituto de Bioquímica, Ciência Alimentar e Nutrição, The Robert H. Smith Faculty

of Agriculture, Food and Environment, The Hebrew University of Jerusalem, PO Box 12, Rehovot 76100, Israel.

Telefone: + 972-8-9489278; Endereço de email: zohar.kerem@mail.huji.ac.il (Z. Kerem)

1. Introdução

As enzimas do citocromo P450 (P450s) são de grande importância no metabolismo de uma ampla gama

de compostos endógenos e xenobióticos, incluindo hormônios, lipídios, drogas e alimentos

produtos (Basheer & Kerem, 2015; De Montellano, 2005; Denisov, Makris, Sligar, &

Schlichting, 2005). Entre as enzimas P450, o CYP3A4 é conhecido por ser a principal enzima envolvida

no metabolismo de drogas e está envolvida no metabolismo de mais de 50% das drogas comercializadas que dependem

na eliminação metabólica (Topletz, Dennison, Barbuch, Hadden, Hall, & Renbarger, 2013).

Potenciais interações entre novas moléculas e CYP3A4 são rotineiramente avaliadas durante o

estágios iniciais de desenvolvimento de drogas (Guengerich, 2008; Wienkers & Heath, 2005), mas alimentos

compostos derivados dificilmente são estudados, e as características moleculares que formam os inibidores naturais

mal foram avaliados. Ainda assim, somos aconselhados a comer antes de tomar muitos medicamentos, e estamos

não é aconselhável evitar suplementos dietéticos durante um regime de medicação. Nossos médicos não

tenha um banco de dados para abordar e dar recomendações fundamentadas. Estabelecer tal banco de dados

a partir de resultados de pesquisas, que até onde sabemos, não existe, é uma tarefa sem fim.

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Ferramentas de computação modernas podem fornecer previsões para uma triagem inicial, mas o molecular

recursos e regras para previsões válidas precisam ser definidos.

CYP3A4 é o CYP proeminente no fígado e intestino humanos, e também é expresso no

próstata, rins, pulmões e cérebro (Basheer & Kerem, 2015; Galetin, Gertz, & Houston, 2010;

Nebert, Wikvall, & Miller, 2013). O sítio ativo do CYP3A4 demonstra notável

flexibilidade (Ekroos & Sjögren, 2006), e contém um grupo de prótese heme em que o ferro é

ancorado pelas quatro ligações do grupo heme, e um quinto ligante proximal de um conservado

cisteína, com uma molécula de água atuando como o sexto ligante distal na forma livre de substrato

(Denisov, Makris, Sligar e Schlichting, 2005). Como a maioria dos outros CYPs, catalisa um

reação de monooxigenase (por exemplo, inserção de um átomo de oxigênio em um substrato orgânico enquanto

outro átomo de oxigênio é reduzido a água (De Montellano, 2005).

Vários estilos e principalmente t- Resveratrol (trans-3, 5, 4 ′ - trihidroxistilbeno), um dietético

polifenol encontrado na casca da uva e vinho tinto, foi mostrado para inibir CYP3A4 e tem sido

sugeriu que pode atuar como um inativador irreversível da enzima baseado em mecanismo (Chan

& Delucchi, 2000; Chi, Lin e Hou, 2012; Detampel, Beck, Kr uma Henb você hl, & Huwyler, 2012;

Piver, Berthou, Dreano e Lucas, 2001; Regev-Shoshani, Shoseyov, & Kerem, 2004). Isto

a inibição baseada no mecanismo ocorre quando um substrato / inibidor de CYP3A4 forma um reativo

intermediário no sítio ativo CYP3A4 (Chan & Delucchi, 2000; Correia & de Montellano,

2005), sugerindo a modificação do heme como um alvo importante para inibidores. Clínico

e estudos com ratos descobriram que a administração de resveratrol aumentou a área sob a curva (AUC)

valores de vários medicamentos devido à inibição do CYP3A4 (Chi, Lin, & Hou, 2012; Chow,

Garland, Hsu, Vining, Chew, Miller, et al., 2010). Assim, a ingestão de grandes quantidades de, por

exemplo, o resveratrol fornece um bom modelo para demonstrar como os compostos dietéticos podem

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aumentam a biodisponibilidade e, portanto, a toxicidade dos medicamentos que sofrem extensa

metabolismo de passagem por CYP3A4 (Detampel, Beck, Kr uma Henb você hl, & Huwyler, 2012).

Muitas abordagens têm servido para explorar a inibição do CYP3A4 por moléculas da dieta:

Estrutura quantitativa - estudos de relacionamento de atividades (QSAR) demonstraram a importância

de uma molécula ' s hidrofobicidade e disponibilidade de ligações de hidrogênio na produção

interações robustas com CYP3A4 (Handa, Nakagome, Yamaotsu, Gouda, & Hirono, 2013;

Lewis, Lake e Dickins, 2006). Um estudo da influência da lipofilicidade nas interações de

estilbenos com CYP3A4 revelou que metoxi-estilbenos têm CI mais baixo 50 valores e mais altos

afinidade para CYP3A4, em comparação com t- resveratrol ou seus glicosídeos (Regev-Shoshani,

Shoseyov, & Kerem, 2004). Outras indicações de uma correlação positiva entre o

lipofilicidade de uma molécula e potencial inibição do CYP3A4 foram relatados em vários estudos

(Basheer, Schultz, Fichman, & Kerem, 2015; Didziapetris, Dapkunas, Sazonovas, & Japertas,

2010). Os três grupos fenólicos do resveratrol (Ar-OH) são doadores de ligações H fortes e fracos

Aceitadores de títulos H (Kubinyi, 2005; Laurence, Brameld, Graton, Le Questel, & Renault, 2009;

Wegiel, Mauer, Edgar e Taylor, 2013). Recentemente, mostramos que adicionar uma ligação de hidrogênio

aceitador para o anel A do aldeído de resveratrol leva à perda de várias interações no

Local de ligação do CYP3A4 e menos inibição da enzima do que o observado para o resveratrol (Basheer,

Schultz, Fichman, & Kerem, 2015).

CDOCKER (DOCKER baseado em CHARMm), oferece todas as vantagens da flexibilidade total do ligante

(incluindo ligações, ângulos, diedros), a família CHARMm de campos de força, a flexibilidade do

Mecanismo CHARMm e tempos de computação razoáveis (Wu, Robertson, Brooks, & Vieth,

2003). Glide (acoplamento de ligante baseado em grade com energia) foi projetado para funcionar como

perto de uma busca exaustiva do espaço posicional, orientacional e conformacional

disponível para o ligante, como é viável, mantendo a velocidade computacional suficiente para rastrear

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grandes bibliotecas (Friesner, Banks, Murphy, Halgren, Klicic, Mainz, et al., 2004). Ambos os modelos

pode fornecer uma visão diferente sobre as interações proteína-ligante, portanto, eles são usados em

estudos neste campo (Ahmed, Goldgur, Hu, Guo, & Cheung, 2013).

No presente trabalho, objetivando identificar determinantes estruturais que podem reger a inibição.

potência de uma molécula contra CYP3A4, nós rastreamos o docking de virtualmente modificados

estilbenoides no sítio ativo do CYP3A4. Optamos por avaliar os efeitos da adição de

um aceitador de ligação H e o aumento da capacidade de aceitação de elétrons, por um grupo nitro; e também

o aumento da hidrofobicidade, pelos grupos metoxi, sobre a capacidade inibitória do

molécula para CYP3A4. Consequentemente, projetamos nitroestilbenos modelo com

interação gradual prevista com o heme no sítio ativo, para nos permitir caracterizar

características moleculares inibitórias. Nitrostilbeno e dimetoxi-nitrostilbeno foram selecionados para úmido

síntese, para verificar em vitro o software propôs ordem de inibição. Metabolismo da testosterona

em microssomas de fígado de rato (RLM) foi usado como um em vitro modelo da inibição de CYP3A por

os estilbenos e um em sílico simulações de acoplamento, ie CDOCKER e Glide, estavam acostumados a

prever essas interações.

2. Materiais e métodos

2.1. Padrões e produtos químicos

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t- Resveratrol (trans-3,4 ′, 5-trihidroxistilbeno, 99%), testosterona (99%), cetoconazol (98%),

Os padrões de 3,5-dimetoxibenzaldeído (> 97%) e 1-iodo-4-nitrobenzeno (98%) eram

adquirido da Sigma Aldrich (Israel). Testosterona [1,2,6,7- 3 H (N)] - foi comprado de

Perkin Elmer (Boston, MA). Todos os outros produtos químicos e reagentes foram adquiridos da Sigma

Aldrich, salvo indicação em contrário.

2.2. Síntese química

Nitrostilbeno e 3,5-dimetoxi-nitrostilbeno foram sintetizados de acordo com (Sun, Hoshino,

Jermihov, Marler, Pezzuto, Mesecar, et al., 2010) Resumidamente, 3,5-dimetoxi-benzaldeído era

usado para formar 3,5-dimetoxi-alqueno (1,3-dimetoxi-5-vinilbenzeno), que se acoplou a 1-

iodo-4-nitrobenzeno para produzir 3,5-dimetoxi-nitrostilbeno. O produto foi então hidrolisado

ao nitrostilbeno (Fig. 1). 1 H NMR e 13 Os espectros de C NMR dos produtos foram obtidos com um

Espectrômetro de RMN de 200 MHz Bruker (Bruker Biospin GmbH, Rheinstetten, Alemanha).

2.2.1. Formação de 1,3-dimetoxi-5-vinilbenzeno

Brometo de metil trifenilfosohônio (4,3 g, 12,05 mmol) e amida de sódio (0,47 g, 12,05

mmol) em éter dietílico seco (15 ml) foram agitados à temperatura ambiente em uma atmosfera de nitrogênio

durante a noite. Uma solução de 3,5-dimetoxi-benzaldeído (0,99 g, 6 mmol) foi adicionada ao

mistura de reação gota a gota sob nitrogênio durante 30 min a -10 ° C. Após 10 min, a reação

mistura foi aquecida à temperatura ambiente e agitada durante 2 h. A mistura de reação foi então

filtrado e o solvente foi removido por vácuo para produzir óleo amarelo que foi purificado usando

cromatografia em coluna de gel de sílica (hexano: diclorometano 1: 1) para produzir o produto puro

1,3-dimetoxi-5-vinilbenzeno, 787,8 mg (rendimento: 80%). 1 H NMR (200 MHz, CDCl 3, ppm): δ

3,79 (s, 6H), 5,24 (dd, J = 10,8, 0,8 Hz, 1H), 5,72 (dd, J = 17,4, 0,8 Hz, 1H), 6,38 (t, J = 2,2

6
Hz, 1H), 6,56 (d, J = 2,2 Hz, 2H), 6,64 (dd, J = 17,4, 6,6 Hz, 1H). 13 C NMR (200 MHz, CDCl 3,

ppm): δ 55,4 (CH 3), 100,1, 104,4 (CH), 114,4 (CH 2), 136,9 (CH). 139,7, 161,0 (C).

2.2.2. Síntese de 3,5-dimetoxi-4'-nitro-trans-estilbeno

Em um frasco de fundo redondo, 1-iodo-4-nitrobenzeno (540,2 mg, 1,80 mmol) foi adicionado a um

mistura de brometo de tetrabutilamônio (878,2 mg, 2,72 mmol), acetato de potássio (286,6 mg,

2,92 mmol), diacetato de paládio (21 mg, 0,09 mmol) e alceno aromático 4 (328,8 mg, 2,00

mmol). Esta mistura foi então agitada em DMF (20 ml) à temperatura ambiente sob azoto. O

mistura reaccional foi aquecida a 80 ° C durante 3 h e depois arrefecida à temperatura ambiente. Dietil

éter (50 ml) foi adicionado e a camada orgânica foi lavada com água (3 x 50 ml) e depois

seca sobre sulfato de sódio anidro. A solução foi concentrada e o resíduo foi

purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica (hexano: diclorometano, 1: 1) para produzir o

produto 3,5-dimetoxi-4'-nitrostilbeno, 177,6 mg (rendimento: 35%). 1 H NMR (200 MHz, CDCl 3,

ppm): δ 3,84 (s, 6H), 6,46 (t, J = 2,2 Hz, CH), 6,69 (d, J = 2,2 Hz, CH), 7,15 (d, J = 6,4 Hz,

CH), 7,61-7,65 (m, 2H), 8,20-8,24 (m, 2H). 13 C NMR (200 MHz, CDCl 3, ppm): δ 55,4 (CH 3),

101,0, 105,1, 124,1,126,8, 126,9 (CH), 128,3 (C), 133,3 (CH), 138,1, 143,7, 161,1 (C).

2.2.3. Síntese de 3,5-dihidroxi-4'-nitro-trans-estilbeno

A solução de 3,5-dimetoxi-4'-nitrostilbeno (42,5 mg, 0,15 mmol) em diclorometano seco

(5 ml) foi arrefecido a -20 ° C. BBr 3 ( 85 µ 1, 0,89 mmol) foi diluído em diclorometano seco

(0,097 mL) e adicionado lentamente à massa de reação a -20 ° C sob uma atmosfera de nitrogênio seco. O

solução foi deixada aquecer lentamente até a temperatura ambiente e foi agitada continuamente durante 2 h

à temperatura ambiente. A massa de reação foi então vertida em água gelada e o composto

foi extraído com acetato de etilo. A camada orgânica foi lavada com água e salmoura. O

solvente foi removido a vácuo para produzir o produto em bruto, que foi purificado por coluna de gel de sílica

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cromatografia (acetato de etila / hexano 2: 8 como eluente) para produzir 28,9 mg do composto do título puro

(rendimento: 75%). 1 H NMR (200 MHz, MeOD, ppm): δ 6,82 (t, J = 2,2 Hz, 1H), 7,07-7,22 (m, 4H),

7,57-7,61 (m, 2H), 7,97 (m, 1H), 8,28-8,39 (m, 1H). 13 C NMR (600 MHz, MeOD, ppm):

δ 104,5, 118,1, 123,0, 125,3, 128,7, 129,7 (CH), 130,5, 130,8, 146,3, 152,9 (C).

2.3. Preparação de microssomas de fígado de rato

Os microssomas de fígado de rato (RLM) foram preparados a partir de ratos Sprague-Dawley machos adultos (175 - 199 g)

de acordo com um protocolo publicado (Basheer, Schultz, Fichman, & Kerem, 2015; Basheer,

Schultz, & Kerem, 2016). Todos os experimentos foram conduzidos de acordo com o Animal

Diretrizes de cuidado e uso da Universidade Hebraica e foram aprovadas pelo National

Conselho de Pesquisa para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Cinco fígados foram colhidos de

ratos, pesados, congelados em nitrogênio líquido, picados e armazenados a -80 ° C até o uso. Na hora de

o experimento, fígados picados foram perfundidos com tampão de homogeneização gelado (50 mM

Tris, pH 7,5, KCl 150 mM) na proporção de 5 ml de tampão de homogeneização por 1 g de fígado. Fenil

fluoreto de metilsulfonil (1 mM) foi adicionado imediatamente antes da homogeneização. Fígados eram

homogeneizado usando um homogeneizador motorizado. O homogenato foi centrifugado a 10.000 g

por 10 min a 4 ° C. O sobrenadante foi então coletado e centrifugado novamente a 100.000 g para

70 min a 4 ° C para produzir peletes microssomais. Os microssomos foram ressuspensos em lavagem gelada

tampão (pirofosfato de tetrassódio 100 mM e EDTA 10 mM, pH 8,8) e novamente peletizado por

centrifugação a 100.000 g durante 70 min a 4 ° C para produzir microssomas. Os pellets microssomais

foram então ressuspensos em tampão Tris gelado (50 mM, pH 7,5) contendo glicerol a 50%,

aliquotado em frascos (0,2 ml por frasco) e armazenado a -80 ° C até o uso. Proteína microssomal

a concentração foi determinada usando um ensaio de proteína de Bradford, que foi calibrado usando

albumina de soro bovino.

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2.3. Metabolismo da testosterona por CYP3A microssomal

A interação de CYP3A com testosterona foi determinada pelo ensaio de água tritiada,

adaptado de (Gonz uma Lez e Piferrer, 2002). As reações foram realizadas em placas de 96 poços (Nunc,

Roskilde, Dinamarca) e todas as amostras foram testadas em triplicado. RLM foram descongelados em gelo e

100 µg foram adicionados a cada poço com tampão de reação (K 10 mM 2 HPO 4, KCl 100 mM, 1 mM

EDTA, ditiotreitol 1 mM, pH 7,4) contendo testosterona 8 nM (1, 2, 6, 7- 3 H (N)) e 1,5

mM NADPH. Cetoconazol, resveratrol e nitrostilbenos foram inicialmente dissolvidos em 30%

metanol e sonicado e, em seguida, as soluções estoque foram preparadas em tampão de reação (máximo

a concentração de metanol em cada poço foi de 0,95%). Todos os tratamentos foram ensaiados em triplicado com

os seguintes controles: um controle de tampão contendo o tampão de reação em vez do inibidor

(sem tratamento), um controle de metanol contendo 0,95% de metanol em vez do inibidor (para

explicar os possíveis efeitos deste solvente) e um controle RLM sem microssomas (para fornecer

o valor de fundo). As reações foram então incubadas por 4 h com agitação contínua no

temperatura ótima de 37 ° C. As reações foram interrompidas pela adição de 1 ml de éter etílico e

então agitado em vórtice. As camadas de éter e aquosa foram separadas por 10 min e o

o material foi então transferido para -80 ° C durante 15 min para congelar completamente a fase aquosa. O

fase aquosa foi deixada por 1 h na capela química para permitir que quaisquer vestígios de éter evaporassem

completamente. A fase aquosa foi agitada com 2 volumes (400 µl) de revestido com dextrano (0,5%)

pasta de carvão (5% de carvão revestido em tampão de fosfato) por 1 min e centrifugado a 3000 g em

4 ° C por 5 min. O sobrenadante (300 µl) foi coletado em frascos de cintilação e misturado com 5

ml de fluido de cintilação. 3 H foi medido como desintegração por 5 min usando um líquido de cintilação β

contador (Canberra-Packard Tri-Crab 1600, CA).

2.4. Software de modelagem e simulação computacional

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A estrutura cristalina do CYP3A4 humano, conforme determinado com cetoconazol (Ekroos & Sjögren,

2006) e disponível no banco de dados de proteínas (PDB entrada 2V0M), foi usado para a proteína

modelagem neste estudo. Os esboços da estrutura do ligante foram obtidos usando ChemDraw Ultra 8.0

e a minimização de energia dos ligantes foi alcançada com Chem3D Ultra 8.0 (CambridgeSoft

Corporation, EUA). Ligantes em um molfile MDL foram carregados no Discovery Studio 4.0

(Accelrys Inc., San Diego, CA). A ferramenta Clean Geometry foi usada para minimizar a estrutura

energia, e as conformações foram geradas usando o protocolo Gerar Conformações

e o método Best (outros parâmetros foram mantidos nos valores padrão). 2V0M representa um

estrutura de cristal tetramérica de CYP3A4 contendo quatro cadeias (A - D). Cadeia D foi escolhida para

as simulações baseadas na propriedade de deslocamento isotrópico. A segunda molécula de

cetoconazol, que foi identificado em uma orientação antiparalela acima do primeiro cetoconazol

molécula, foi removido. As alças extracelulares e intracelulares também foram removidas, uma vez que

eles foram previstos para não fazer parte do local de ligação. Antes da análise, o átomo de ferro no

o grupo heme foi restringido a preservar sua ligação aos átomos de nitrogênio do heme após o

aplicação do campo de força CHARMm. A proteína foi preparada usando o Prepare Protein

protocolo e um site de ligação foi criado usando o protocolo Define and Edit Binding Site.

(Parâmetros padrão foram usados.) Cada conformação de ligante que foi gerada anteriormente

foi sobreposto ao cetoconazol do 2V0M, de acordo com a especificação de alinhamento

(80% estérico e 20% eletrostático) e as cinco principais conformações com o maior grau de

similaridade ao cetoconazol foram escolhidos para as simulações de docking. Ancoragem dos ligantes

(cetoconazol, resveratrol, nitrostilbeno e dimetoxi-nitrostilbeno) foi realizado usando o

Protocolo CDOCKER. Após o docking, a ferramenta Ligand Interactions foi usada para analisar o

interações de ligante no local de ligação, e a análise final foi feita manualmente. Todos os protocolos

e as ferramentas estão disponíveis no Discovery Studio 4.0, Accelrys.

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O encaixe deslizante foi realizado usando a plataforma Schrodinger Suite 2016 (Schrodinger, New York,

NOVA IORQUE). A proteína foi processada, modificada e refinada seguindo as etapas da Proteína

Assistente de preparação e cadeias laterais ausentes e loops foram preenchidos usando Prime. Ligantes eram

preparado usando a tarefa LigPrep, e as conformações recebidas foram introduzidas no Glide

encaixe. Os campos de força OPLS3 foram usados para parametrizar a proteína e os ligantes. Deslizamento padrão

opções para precisão padrão foram usadas, com exceção de usar o "Metal Coordination

Ferramenta de restrição ”e o número de poses“ para incluir ”e“ para escrever ”foram definidos como 30

e 10, respectivamente. Após o docking, a ferramenta “Ligand Interactions” foi usada para analisar o

interações de ligante no local de ligação e a análise final foi feita manualmente. Todos os protocolos

e as ferramentas estão disponíveis na plataforma Schrodinger Suite 2009.

2,5. Análise estatística

Para o ensaio de inibição, os valores da porcentagem da atividade de controle foram dados como médias ±

erros padrão de três repetições. A análise estatística foi realizada usando o JMP v.10 estatístico

software (SAS Institute, Inc., Cary, NC, EUA). A análise de variância foi usada para determinar

diferenças significativas (P <0,05). As médias foram ainda comparadas, usando o teste de Tukey-Kramer,

e as diferenças foram consideradas significativas quando P <0,05.

3. Resultados

3.1. Inibição da atividade do CYP3A microssomal por nitrostilbeno e dimetoxi-

nitrostilbeno

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A inibição da atividade do CYP3A microssomal (RLM) foi medida como a redução na liberação

de água tritiada através da hidroxilação de testosterona radiomarcada [1,2,6,7- 3 H (N)].

As taxas de inibição foram expressas como porcentagem de atividade após a adição de estilbenoides como

em comparação com misturas de reação não corrigidas (Fig. 2). Cetoconazol, um inibidor específico de

CYP3A4, serviu como um controle positivo, mostrando a maior inibição com um IC calculado 50 =

14 µM (Fig. 2A). O resveratrol também demonstrou uma inibição dependente da dose, começando em 5 µM

e um IC calculado 50 = 28 µM (Fig. 2B). Uma baixa capacidade inibitória foi encontrada para ambos

nitrostilbeno e dimetoxi-nitrostilbeno. O efeito inibitório do nitrostilbeno foi maior

do que o análogo dimetoxilado, com um IC calculado 50 valor de 118 µM para

nitrostilbeno, enquanto o IC 50 valor de dimetoxi-nitrostilbeno não pôde ser alcançado dentro

a faixa de concentrações testadas (Figs. 2C e 2D). As diferenças na capacidade inibitória

entre nitrostilbeno e dimetoxi-nitrostilbeno, e o controle só foi observado em

concentrações superiores a 75 µM.

3.2. Análise computacional

A orientação e a ligação de resíduos de cetoconazol inferida a partir da estrutura de raios-X de

CYP3A4 humano (PDB entrada 2V0M) serviu de modelo para as simulações das interações

de resveratrol, nitrostilbeno e dimetoxi-nitrostilbeno com a enzima. Para validar o

adequação do modelo de encaixe selecionado, primeiro encaixamos o cetoconazol e verificamos que seu

a ligação ao local de ligação do CYP3A4 foi restaurada ao estado inicial, como no 2V0M original

estrutura. Com base na simulação de cetoconazol-docking, o sítio de ligação pode ser descrito em

termos de três características principais: uma região hidrofóbica sólida, doadores / aceitadores de ligação H e

interações eletrostáticas. O cluster hidrofóbico inclui o alquil e alquil - interações pi

entre os resíduos de CYP3A4 Leu210, Phe241, Ile301, Ala305 e Leu482, e o clorado

anel aromático e anel imidazol da molécula de cetoconazol. O principal doador de H-bond


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resíduo é CYP3A4 Arg372, que interage com o átomo de oxigênio cetônico do cetoconazol,

enquanto os átomos de oxigênio de Ala370 servem como aceitadores de ligações H. O átomo de nitrogênio do heme

grupo fornece mais ancoragem à molécula por meio de suas interações eletrostáticas (ânion -

pi) com o anel imidazol de cetoconazol (Fig. 3A). Entre os ligantes testados, cetoconazol

teve a pontuação de docking mais alta com a energia CDOCKER mais baixa (-40,8 kcal / mol, Fig. 3).

A docagem por deslizamento do cetoconazol forneceu resultados semelhantes, mostrando a maior parte do CYP3A4

resíduos interagentes encontrados na simulação CDOCKER. Mapa de interação bidimensional

destaca a importância dos aminoácidos hidrofóbicos para a ligação do cetoconazol no

sítio de ligação do CYP3A4 e aponta para empilhamento pi-pi do anel imidazol com o heme

grupo protético, além da ligação H e formação de pontes salinas com resíduos de CYP3A4.

De acordo com o modelo Glide, o cetoconazol teve a maior pontuação de docking entre os testados

ligantes (-83,3 kcal / mol), como no modelo anterior (Figs. 5A e 5B).

As interações do resveratrol com resíduos e heme no sítio ativo assemelham-se em grande parte àquelas

de cetoconazol. Ainda assim, existem algumas diferenças: sendo uma molécula menor do que o cetoconazol,

o resveratrol é incapaz de formar uma porção significativa das interações hidrofóbicas como em

o caso do cetoconazol com os resíduos Leu210, Phe241 e Ile301. Por outro lado, o B

anel de resveratrol é capaz de envolver interações hidrofóbicas e eletrostáticas adicionais no

sítio de ligação, como segue: interações alquil-pi entre o anel B do resveratrol e resíduos

Ala305 e Leu482, bem como interações pi – pi empilhadas com dois anéis de pirrolo do heme

grupo; enquanto as interações cátion-pi e ânion-pi foram observadas com o ferro heme e

nitrogênio, respectivamente, bem como uma interação alquil-pi adicional entre o anel A e

Ala370. Os átomos de hidrogênio dos três grupos hidroxila do resveratrol atuam como doadores de ligações H

e ligar Ala370 e Glu374 (anel A) e Thr309 (anel B; Fig. 3B). O CDOCKER geral

a energia calculada para o resveratrol foi de -25,5 kcal / mol (Fig. 3), indicando que a afinidade de

13
o resveratrol para a enzima é menor do que o cetoconazol, apoiando o em vitro

observação de uma menor capacidade inibitória do resveratrol. Ancoragem de resveratrol por deslizamento

gera achado com grande semelhança com os obtidos pelo modelo CDOCKER, mostrando o

interações pi-pi empilhadas do anel B do resveratrol com o heme e a ligação H através do

três grupos hidroxila. A pontuação de acoplamento Glide calculada do resveratrol é -53,8 kcal / mol

(Figs. 5C e 5D).

O encaixe do nitrostilbeno no local de ligação resulta em uma semelhança limitada com o encaixe do

resveratrol: os anéis B de ambos os compostos estão situados perto do grupo heme, mas

nitrostilbeno forma um ângulo de torção diferente para a ponte de estilbeno, e o anel A formado

menos interações com resíduos localizados distais do grupo heme, em comparação com o resveratrol

(Fig. 4A). Há uma interação eletrostática notável entre o grupo nitro e o heme, o

o oxigênio carregado negativamente interage com o ferro heme e o nitrogênio carregado positivamente

interage com os nitrogênios carregados negativamente no heme e com o átomo de enxofre Cys442. UMA

a interação pi-pi empilhada foi calculada entre o anel B do nitrostilbeno e um dos

anéis hem-pirrole. Uma interação hidrofóbica adicional é formada entre o orbital pi de

o anel A de nitrostilbeno e Ile120 (pi-alquil). Um dos grupos hidroxila do nitrostilbeno

participa da ligação de hidrogênio, agindo como um doador de ligação H convencional para o oxigênio Arg106 (Fig.

4A). Uma pontuação de docking de -16,0 kcal / mol foi calculada para o nitrostilbeno (Fig. 4). The Glide

modelo também demonstrou as interações eletrostáticas de nitrostilbeno no sítio de ligação por

destacando as pontes de sal estabelecidas entre o grupo nitro da molécula com o

haem. A ligação H dos grupos hidroxila no anel A com resíduos CYP3A4 também são

demonstrado (Figs. 6A e 6B). A pontuação de docking Glide do nitrostilbeno foi de -55,7 kcal / mol,

ligeiramente mais baixo do que o resveratrol, mas a orientação de encaixe deste último encontrada ser mais próxima do

haem.

14
Uma orientação inversa é prevista para o acoplamento de dimetoxi-nitrostilbeno, com um menor

mudança do heme em comparação com nitrostilbeno e resveratrol (Fig. 4B). Aqui, o anel A é

localizado acima do grupo heme e forma pi – pi empilhamento e pi - interações alquil com o

haem e Ala370, respectivamente. O grupo nitro interage eletrostaticamente com os resíduos Phe57,

Arg372 e Glu374. Ambos os átomos de oxigênio do grupo nitro servem como aceitadores de ligações H para

Hidrogênios Arg372 (Fig. 4B). A energia CDOCKER calculada de dimetoxi-nitrostilbeno

verificou-se ser -15,2 kcal / mol, ligeiramente superior ao do análogo hidrolisado (Fig. 4).

A orientação inversa para o docking de dimetoxi-nitrostilbeno também é prevista pelo

modelo de deslizamento, e as pontes de sal formadas entre o grupo nitro e resíduos de CYP3A4,

distalmente do heme (Figs. 6C e 6D). A pontuação de docking calculada de dimetoxi-

nitrostilbeno foi -46,7 kcal / mol, que é maior do que as pontuações dos outros estilbenos testados.

Discussão

Estudos que destacam a importância e relevância clínica da inibição do CYP3A4 por

polifenóis dietéticos foram revisados recentemente (Basheer & Kerem, 2015). O aumento no plasma

concentrações de vários medicamentos após a administração de resveratrol vão bem com

efeitos inibitórios do resveratrol no CYP3A4 em vitro e na Vivo que estão bem documentados em

a literatura (Basheer, Schultz, Fichman, & Kerem, 2015; Chan & Delucchi, 2000; Chi, Lin,

& Hou, 2012; Chow, et al., 2010; Detampel, Beck, Kr uma Henb você hl, & Huwyler, 2012; Piver,

Berthou, Dreano, & Lucas, 2001; Regev-Shoshani, Shoseyov, & Kerem, 2004). Anteriormente,

O mapeamento de QSAR e farmacóforo serviu para elucidar as funcionalidades moleculares que são

empregue por um inibidor potente. Usando essas ferramentas, lipofilicidade e ligação H foram sugeridas

como as principais características que determinam a natureza de uma molécula ' interação s com CYP3A4

(Didziapetris, Dapkunas, Sazonovas, & Japertas, 2010; Ekins, de Groot, & Jones, 2001; Lewis,

Lake e Dickins, 2006). Um estudo anterior apóia a importância de uma molécula


15
lipofilicidade por suas interações com CYP3A4, usando metoxi-estilbenos sintéticos e

demonstrando seu menor IC 50 valores e maiores afinidades para CYP3A4, em comparação com qualquer

resveratrol ou seus glicosídeos (Regev-Shoshani, Shoseyov, & Kerem, 2004). Apresentando um

grupo aldeído no anel A do resveratrol, como um aceitador de ligação H, leva a uma diminuição da capacidade de

inibir CYP3A4. Simulação de ancoragem permitiu explicar o em vitro resultados, destacando o

importância das interações eletrostáticas de um inibidor potencial no sítio ativo da enzima,

além de interações hidrofóbicas e ligações H (Basheer, Schultz, Fichman, & Kerem,

2015). No entanto, o poder dos estudos de docking para prever a inibição de enzimas é geralmente

considerado limitado, devido à necessidade de compreender também a dinâmica molecular na

interação de enzimas e substratos / inibidores. Para CYP3A a imagem é mais complexa devido

à multiplicidade de enzimas e de túneis que conduzem uma molécula aos bancos ativos.

Procurando por recursos que irão contribuir para a nossa compreensão da interação de moléculas no

sítio ativo, selecionamos a adição de grupos nitro aos estilbenos. Grupos nitro podem aumentar

potencial eletrostático molecular, devido à sua forte capacidade de atrair elétrons (Zhang, Shu,

Huang, Zhao, & Dong, 2005), e também são considerados bons aceitadores de títulos H (Jeffrey &

Saenger, 2012; Looger, Dwyer, Smith e Hellinga, 2003). Aqui, seguindo as preliminares

simulações de acoplamento, um grupo nitro no reativo 4 ' posição do resveratrol foi selecionada para

estudos posteriores, bem como um nitrostilbeno di-metoxilado com maior lipofilicidade.

Embora se esperasse que produzisse inibidores melhores, as modificações descritas na verdade levaram a

IC 50 s do CYP3A4, em comparação com o efeito inibitório do resveratrol. Além disso, o nitrostilbeno foi

mostrou ser um inibidor mais potente do que o dimetoxi-nitrostilbeno mais lipofílico. IC 50

valores, calculados aqui para cetoconazol e resveratrol, caem conforme o esperado na faixa relatada

por outros, apoiando, portanto, a validade do nosso ensaio (Liu, Wang, Huang, Zhang, Xu, & Tian,

2011; Pandit, Mukherjee, Ponnusankar, Venkatesh, & Srikanth, 2011; Piver, Berthou, Dreano,

16
& Lucas, 2001). Essas descobertas também estão de acordo com Sun e colegas de trabalho (2010) que

relataram baixos efeitos inibitórios do nitrostilbeno em relação à aromatase (CYP19) em comparação com

resveratrol e um efeito inibitório mais forte do que dimetoxi-nitrostilbeno (Sun, et al., 2010).

Cálculos por cada pontuação de energia CDOCKER e cálculos de modelo Glide suportam e

explicar a ordem do IC 50 valores observados em vitro: O cetoconazol tem a maior afinidade com

CYP3A4, seguido por resveratrol, nitrostilbeno e dimetoxi-nitrostilbeno. Ambas as simulações

mostraram que o cetoconazol se liga coordenadamente a uma região hidrofóbica sólida próxima ao ativo

local, além de suas interações eletrostáticas e hidrofóbicas com o heme e formando

várias ligações H (Figs. 3A, 5A e 5B). Três propostas de interações hidrofóbicas de

cetoconazol envolve aminoácidos-chave previamente identificados por QSAR para o ligante - CYP3A4

interação (Phe241, Ile301 e Leu482; (Handa, Nakagome, Yamaotsu, Gouda, & Hirono,

2013). Em geral, o resveratrol envolve menos interações hidrofóbicas do que o cetoconazol,

o que pode explicar sua menor afinidade pelo CYP3A4 e o aumento da energia CDOCKER.

Ao contrário do cetoconazol, o resveratrol forma fortes interações hidrofóbicas e eletrostáticas com

o grupo heme e seus átomos de ferro / nitrogênio, e forma ligações H com mais resíduos do que

cetoconazol no local ativo. Esses recursos podem apontar para o papel da interação com o

heme-ferro (Ortiz de Montellano, 2008; Poulos, 2014), e a contribuição do eletrostático

interações com o grupo de próteses heme (Basheer, Schultz, Fichman, & Kerem, 2015).

Três dos resíduos envolvidos na interação com o resveratrol foram sugeridos como sendo chave

aminoácidos, dois para ligação H (Thr309 e Glu374) e um para interações hidrofóbicas

(Leu482; (Handa, Nakagome, Yamaotsu, Gouda, & Hirono, 2013).

Apesar de uma congruência parcial entre os anéis B do resveratrol e do nitrostilbeno, o último

encaixado na cavidade da enzima em uma orientação diferente em relação ao grupo heme, o que levou

a partir da maioria dos resíduos hidrofóbicos e de ligação H adjacentes ao heme.

17
Em vez disso, o anel B do nitrostilbeno se coordena com um anel pirrol no heme através de pi - pi

empilhamento; e o grupo nitro forma atrações eletrostáticas com o ferro heme / nitrogênios e

Enxofre Cys442, de acordo com o potencial eletrostático deste grupo funcional (Zhang, Shu,

Huang, Zhao e Dong, 2005). A outra porção da molécula interage com a chave distal

resíduos (Arg106 e Ile120; (Handa, Nakagome, Yamaotsu, Gouda, & Hirono, 2013).

pontuação de docking notavelmente mais baixa e a capacidade inibitória mais baixa podem indicar a importância

das interações com aminoácidos hidrofóbicos específicos no local de ligação, como Ala305,

Ala370 e Leu482, e a menor contribuição das atrações eletrostáticas mais altas com o

heme, que foram calculados para o nitrostilbeno em comparação com o resveratrol.

As simulações sugerem que dimetoxi-nitrostilbeno doca em uma orientação oposta

em comparação com nitrostilbeno e resveratrol, com o anel dissubstituído (A) localizado acima do

haem. Esta orientação forneceu ao composto interações hidrofóbicas entre o pi

orbital do anel A de dimetoxi-nitrostilbeno e o heme e Ala370, e eletrostático

atrações e ligação H ao grupo nitro. Isso pode explicar por que aumentar a lipofilicidade por

adicionar dois grupos metoxi não contribuiu para a afinidade ou a inibição do

enzima. Orientação de encaixe semelhante foi observada para tri-acetoxi estilbeno quando o anel A,

substituído por dois grupos acetoxi nas posições 3 e 5 também acoplado inversamente ao resveratrol

e outros análogos acetoxilados, e também era um inibidor mais fraco (Basheer, Schultz, &

Kerem, 2016).

Embora a energia CDOCKER calculada para o nitrostilbeno seja um pouco menor do que a de

dimetoxi-nitrostilbeno, esta diferença expressa e se correlaciona com a capacidade inibitória

observado no em vitro ensaio. Além disso, esta descoberta foi ainda mais reforçada pelo Glide

simulação, enquanto a energia de acoplamento para nitrostilbeno encontrada ser notavelmente menor do que isso

do dimetoxi-nitrostilbeno. Uma comparação das simulações de interação para esses dois

18
análogos podem apontar para a contribuição das atrações eletrostáticas com o heme para o

ligando ' s afinidade para CYP3A4 e apóiam uma conclusão semelhante de um estudo anterior (Basheer,

Schultz, Fichman, & Kerem, 2015).

4. Conclusões

O uso de em sílico cálculos de encaixe resultaram em boas previsões da ordem de

capacidade inibitória entre várias moléculas, embora, dependendo do modelo e

algoritmos usados, os valores individuais podem ser diferentes. Modificações informativas de um composto,

com o objetivo de retratar os vários modos de interação dentro de uma enzima ' s site ativo,

demonstrar que, de fato, apenas o encaixe pode fornecer essas previsões iniciais. O acordo

entre os dois métodos de cálculo e os experimentos in vitro ' resultados apóiam o poder de

encaixe nessas previsões. Este último está de acordo com as características conhecidas de

CYP3A4, a saber: uma gama notável de substratos (Basheer & Kerem, 2015; Poulos, 2014)

e casos relatados de dois substratos que atingem o sítio ativo juntos (Ekroos & Sj ö gren,

2006). Especificamente, uma melhor inibição foi alcançada por mais interações com hidrofóbicos

resíduos na vizinhança do sítio ativo (ou seja, o grupo protético heme) e por eletrostática

atrações, particularmente entre a molécula e o ferro / nitrogênio do heme. A adição

de um grupo nitro que aumentou o potencial eletrostático, e levou a uma maior afinidade, também

aumentou a inibição quando o grupo nitro foi coordenado com o heme, ao invés de distal

Resíduos de CYP3A4 (nitrostilbeno vs. dimetoxi-nitrostilbeno).

Os resultados apresentados aqui estendem a base da estrutura - relação de atividade para inibição de

Atividade do CYP3A4 por compostos dietéticos. A importância do potencial eletrostático do

ligante e, principalmente, sua afinidade com o grupo protético da enzima, adiciona poder ao

19
cálculos baseados em computador e suporta cálculos de encaixe para previsões válidas de potentes

inibidores de CYP3A4. À medida que as ferramentas de simulação melhoram, bancos de dados baseados em computador de potentes

CYP3A4 pode ser estabelecido e usado por profissionais para prever alimentos-medicamentos e dietéticos

interações medicamentosas.

Declaração de conflito de interesse

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

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Legendas das figuras:

Figura 1. Estruturas químicas: resveratrol (A), nitrostilbeno (B) e dimetoxi-estilbeno (C).

Figura 2. Inibição da formação de água tritiada mediada por CYP3A4: Redução em microssomal

Atividade do CYP3A4 em diferentes concentrações de cetoconazol (A), resveratrol (B),

nitrostilbeno (C) e dimetoxi-nitrostilbeno (D). Os resultados são expressos como o

porcentagem da atividade do controle. Os dados são médios ± Valores SE de três

replica. Letras diferentes indicam diferenças significativas em P <0,05 conforme determinado por

ANOVA, seguida do teste de Tukey-Kramer.

23
Fig. 3. Modelo de docking CDOCKER dos ligantes no local de ligação do CYP3A4,

mostrando os resíduos de interação: cetoconazol (A, energia CDOCKER = -40,8

kcal / mol), resveratrol (B, energia CDOCKER = -25,5 kcal / mol). Ligantes são mostrados

como bastões cinza e os resíduos do receptor são mostrados como bastões verdes. Títulos são mostrados com

linhas tracejadas coloridas da seguinte forma: interações hidrofóbicas em magenta, eletrostática

interações em marrom e ligações de hidrogênio em verde.

Fig. 4. Modelo de docking CDOCKER dos ligantes no local de ligação do CYP3A4,

mostrando os resíduos interagindo: nitrostilbeno (A, energia CDOCKER = -16,0

kcal / mole) e dimetoxi-estilbeno (B, energia CDOCKER = -15,2 kcal / mole). Ligantes

são mostrados como bastões cinza e os resíduos do receptor são mostrados como bastões verdes. Títulos são

mostrado com linhas tracejadas coloridas da seguinte forma: interações hidrofóbicas em magenta,

interações eletrostáticas em marrom e ligações de hidrogênio em verde.

Fig. 5. Modelo de acoplamento de Glide dos ligantes no local de ligação do CYP3A4: acoplamento

orientações de cetoconazol (A, Glide docking energy = -83,3 kcal / mol) e

resveratrol (C, Glide docking energy = -53,8 kcal / mol). Ligantes são mostrados em cinza

bastões e resíduos de receptor são mostrados como bastões verdes; Diagramas dos dois

interação dimensional de cetoconazol (B) e resveratrol (D) com CYP3A4

resíduos.

Fig. 6. Modelo de acoplamento de Glide dos ligantes no local de ligação do CYP3A4: acoplamento

orientação do nitrostilbeno (A, Glide docking energy = -55,7 kcal / mol) e

dimetoxi-nitrostilbeno (C, energia de acoplamento de Glide = -46,7 kcal / mol). Ligantes são

mostrado como bastões cinza e os resíduos do receptor são mostrados como bastões verdes; Diagramas do

interação bidimensional de nitrostilbeno (B) e dimetoxi-nitrostilbeno (D) com

Resíduos de CYP3A4.

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Luzes:

• As habilidades dos análogos do modelo do resveratrol para inibir o CYP3A4 são simuladas no

silico e em vitro.

• As interações hidrofóbicas no sítio ativo do CYP3A4 são cruciais para a capacidade inibitória

da molécula.

• As atrações eletrostáticas com o heme aumentam o efeito inibitório da molécula sobre

CYP3A4.

• A adição de um grupo nitro ao resveratrol levou a uma diminuição maciça da concentração hidrofóbica

interações.

• Docking fornece uma boa ferramenta para prever as interações de compostos dietéticos com

CYP3A4.

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