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LIQUIDO SEMINAL-
ESPERMATOBIOSCOPIA
PRUEBAS COMPLEMENTARIAS
RECOLECCION DE MUESTRA SEGÚN LA OMS
DATOS MUESTRA:
• Nombre del paciente
• Periodo de abstinencia, fecha, hora de recolección
• Se analizan 2 muestras de semen (tiempo transcurrido no debe ser menor 7 ni mayor de 3
semanas).
OBTENCIÓN DE LA MUESTRA:
MASTURBACIÓN
• Recoge en un consultorio o en el laboratorio
• Después de 48 hrs de abstinencia sexual
SE RECOGE EN UN FRASCO DE:
Vidrio de boca ancha, limpio, facilitado por el laboratorio
La muestra debe recibirse lo antes posible
En ningún momento depuse de más de 2 o 3 hrs de su toma
Se coloca en recipiente (debe estar tibio el recipiente para evitar la motilidad de los
espermatozoides)
Condones específicos (no de látex, alteran la viabilidad de los espermatozoides)
CARACTERÍSTICA DE LA MUESTRA:
La muestra debe ser completa
Se protege de temperaturas extremas (-20°C ni + 40°C)
MORFOLOGIA
Kruger y col. Informaron que si se realiza la evaluación morfológica del semen utilizando los criterios
estrictos desarrollados en el Hospital de Tygerberg este método es de gran valor predictivo en fertilidad.
Según estos autores se debe considerar como normal a aquel espermatozoide cuya cabeza tenga una
configuración oval con un acrosoma bien diferenciado que ocupe entre el 40 % y el 70 % de la cabeza
espermática.
De acuerdo a este sistema de clasificación se comprobó que la población de hombres normales posee
valores que están por encima del 14 % de formas morfológicamente normales.
MORFOLOGÍA.
• Normales: Mayor de 50 %
• Macrocéfalos: Menor a 0.5%
• Microcéfalos : Menor a 1.5%
• Cabezas dobles : Menor a 1.5%
• Cabezas dobles : Menor a 1.5%
• Cabezas ausentes :: Menor a 5%
• Amorfos : Menor a 40%
AGLUTINACIÓN:
ESACALA SEMICUANTITATIVA:
• Sin aglutinación
• +++ agrupamiento masivo
INMUNOLOGIA
PBAS PARA LA DETECCIÓN DE ANTICUERPOS UNIDO IMNUNOBEADS
Los anticuerpos anti espermáticos son detectados microscópicamente usando "inmunobeads", pequeñas
esferas de resinas a las que se acoplan anticuerpos. Si los anticuerpos anti espermáticos se hallan
unidos a la superficie de los espermatozoides, las células espermáticas se unirán a las "inmunobeads".
Espermatozoides negativos por este método son mezclados con el suero o el moco cervical a evaluar,
posteriormente se examina la unión a "inmunobeads".
UTILIDAD CLINICA
En algunos casos, factores inmunológicos pueden jugar un papel importante en la infertilidad. Los
anticuerpos anti espermáticos pueden ser producidos por el hombre y/o la mujer. El hombre puede
desarrollar anticuerpos anti espermáticos contra sus propios espermatozoides, y la mujer puede generar
anticuerpos contra los espermatozoides de su pareja.
Inmunobeads Directo:
Inmunobeads Indirecto:
MOST:
• Evalúa la resistencia de los espermatozoides al someterlos a aun estrés térmico, y su efecto en la
movilidad de los mismos.
Es un instrumento electrooptico que realiza una evaluación objetiva, segura y cuantitativa de la calidad
del semen, proporcionando un método infinitamente más objetivo en comparación con el método
tradicional, pudiendo llegar a un diagnóstico más efectivo del potencial fertilizador del paciente.
El equipo está basado en la digitalización de las oscilaciones de la densidad óptica, que los
espermatozoides móviles producen en una celda fotoeléctrica. Todo el proceso de lectura,
interpretación de los datos y la obtención de cada uno de los parámetros es controlado y procesado
mediante algoritmos matemáticos patentados por Medical Electronic Systems Ltd de Israel.
3- Morfología:
Este parámetro mide el porcentaje de espermatozoides con morfología normal. La morfología va de
acuerdo al tipo de movimiento, la deformidad del espermatozoide hace que se mueva con patrones
irregulares. La morfología por lo tanto es medida indirectamente, pero correctamente, hay una relación
bien establecida entre la morfología y su movimiento.
4- Espermatozoides funcionales:
El concepto de “espermatozoides funcionales” está descrito por la OMS como aquellos
espermatozoides que presentan movilidad progresiva útil y morfología normal. Proporciona una
medición directa y cuantitativa de la capacidad de fertilización, clasificando al semen como:
• Poca cantidad: 0-3 millones
• Media cantidad: 3-13 millones
• Buena cantidad: 13 o más millones
Mide la cantidad de espermatozoides con motilidad progresiva, que la que le confiere capacidad
fertilizadora.
• Valores esperados: Más de 26 millones/ml
ESPERMOGRAMA COMPUTARIZADO
Este estudio comprende, la evaluación computarizada del semen a través de un Sistema CASA además
de la determinación de parámetros seminales que han sido previamente establecidos en sus
correspondientes manuales por la Organización Mundial de la Salud.
La incorporación de los Sistemas CASA como metodología diagnóstica, significó un progreso real en
la estandarización del manejo del semen. El Sistema suministra un método objetivo de excelente
reproducibilidad, a través de un análisis directo de imágenes. El hecho de no utilizar muestras diluidas
y ser a la vez de rápida evaluación, permite una disminución en la variabilidad de los resultados que
pueden producirse utilizando otro tipo de metodología.
Además este Sistema suministra parámetros seminales que no pueden obtenerse, a través de estudios no
computarizados. Como por ejemplo determinar la velocidad media espermática en micrones por
segundo, la linearidad, velocidad promedio y velocidad rectilinea, y otros parámetros de la cinemática
espermática de gran importancia para el conocimiento de la gameta masculina.
VENTAJAS:
• Alta precisión
• Provisión de datos cuantitativos sobre la cinética de loe espermatozoides
2. CULTIVO DE SEMEN
• El cultivo de semen consiste en analizar el semen en busca de infecciones causadas por
bacterias, hongos, etc...
• En la mayoría de los casos, esta prueba se solicita en pacientes con síntomas de prostatitis u
orquitis.
Toma de muestra:
Todas las muestras deben tomarse con 72 hs de abstinencia sexual y retención urinaria mínima
de 3 horas. La abstinencia sexual permite detectar la mayor concentración de MO infectantes en
las vías espermáticas y glándulas anexas, como así también minimiza la contaminación con los
MO de la flora normal o colonizantes transitorios de la compañera sexual. El paciente, en el
momento de la realización del estudio, no debe presentar secreción uretral ni infección urinaria.
Interpretación de resultados:
Se considera una muestra positiva aquella cuyo recuento de colonias es ³ 103 UFC/ml de
bacterias de pato-genicidad reconocida o ³ 104 UFC/ml de bacterias potencialmente patógenas y
solamente una especie aislada.
El ensayo naranja de acridina mide la susceptibilidad del ADN del espermatozoide al ácido inducido
por la desnaturalización in situ por cuentificación del cambio metacromático del naranja de acridina
fluorescente del verde (ADN natural) al rojo (ADN desnaturalizado).
El naranja de acridina fluorescente se intercala entre las dobles cadenas de ADN como un monómetro
y liga las cadenas simples del ADN como un agregado.
El naranja de acridina monométrico vira al ADN natural o verde fluorescente mientras que el naranja
de acridina agregado al ADN desnaturalizado vira a rojo fluorescente49. El naranja de acridina puede
usarse tanto con el microscopio de fluorescencia como con citometría de flujo.
• Tinciones con naranja de acridina muestran una diferencia significativa entre los varones
fértiles y aquellos que son infértiles por diferentes patologías andrológicas.
• El valor de corte entre varones fértiles e infértiles varía entre el 20 y el 50%.
PROCEDIMIENTO:
Los espermatozoides pre y postseparación se incuban durante 5 minutos con 6 ug/ml de naranja de
acridina (Naranja de Acridina, Sigma chemical Co.), posterior a esta incubación se observaron 100
espermatozoides en el microscopio de fluorescencia. La fluorescencia verde en la cabeza indica DNA
de doble cadena y el DNA de cadena simple, que está desnaturalizado emite fluorescencia roja.
UTILIDAD CLÍNICA:
• Control de calidad de donantes de semen para bancos de esperma.
• Diagnóstico en pacientes con fertilidad reducida y espermograma aparentemente normal.
• Chequeo espermático para procedimientos de FIV.
• Evaluación de causas posibles en abortos recurrentes.
SIGNIFICACIÓN CLÍNICA:
Se basa en el principio que la naranja de acridina se enlaza al DNA doble cadena normal dando
fluorescencia verde y al DNA simple cadena desnaturalizado dando fluorescencia roja.
Un alto porcentaje de cabezas espermáticas rojas puede asociarse a un potencial de fertilidad
disminuido.
4. ENSAYO COMET
El ensayo comet, también conocido como electroforesis de células únicas para el análisis del ADN de
una sola célula, fue introducido por primera vez por Ostling y Johanson en 1984 y fue modificado
posteriormente en 1988. Cuando se descondensa el ADN del espermatozoide en el seno de un gel y se
somete a la acción de un campo eléctrico, las moléculas de ADN se desplazan y generan una imagen en
forma de cometa (de ahí el nombre de ensayo comet).
En los espermatozoides con ADN normal sólo se detecta fluorescencia de fondo, mientras que los
espermatozoides con ADN fragmentado (múltiples 3’-OH terminales) se tiñen con una fluorescencia
intensa. La fluorescencia puede detectarse tanto por citometría de flujo como a través de microcopia
fluorescente
6. TEST DE CROMATINA
PRUEBAS DE INVESTIGACION
PRUEBAS FUNCIONALES DEL ESPERMATOZOIDE:
1. Especies de oxigeno reactivo e infertilidad masculina
2. Prueba de unión a la zona pellucida humana
3. Prueba penetración del ovocito de hámster sin zona pellucida
REFERENCIAS:
Pruebas Funcionales
Test de Hiperactivación
Por medio de este test, es posible determinar los cambios en el modelo de movimiento de los
espermatozoides, luego de incubar las muestras en un medio de cultivo capacitante.
Utilizando un software desarrollado por Hamilton-Thorne Research es posible conocer la velocidad
curvilinea, la velocidad rectilinea, la linearidad porcentual de las gametas en estudio y el
desplazamiento lateral de la cabeza espermática.
Test de Sobrevida
Determinación de ATP
A través de una técnica bioluminiscente, es posible detectar cantidades muy pequeñas de ATP en las
células. Esta valoración permite conocer la fuente primaria de energía, utilizada por el espermatozoide
para mantener la movilidad.
Es un test simple de estudio del núcleo espermático. Dado que las cabezas de las gametas inmaduras
contienen histonas ricas en lisina, es posible teñirlas con una solución ácida de azul de anilina que
permite su fácil diferenciación de las gametas normales.
Triple Coloración
A través de esta técnica tricrómica que utiliza azul tripán, marron bismark y rosa de bengala, ha sido
posible estudiar la morfología espermática antes y después de la capacitación y de la reacción
acrosómica
Test Hiposmotico
LPOp
Test que determina la injuria producida por los radicales libres sobre la membrana plasmática. Ha sido
incorporado dentro de los tests de función espermatica, ya que permite conocer el stress oxidativo
producido por las sustancias oxígeno reactivas.
La causa de daño peroxidativo in vivo, podría demostrarse por la capacidad de los espermatozoides
humanos de generar sustancias oxígeno reactivas, como el anión superóxido o el peróxido de
hidrógeno. Ambas pueden iniciar el daño peroxidativo con la consiguiente pérdida de la función
espermática
Reacción Acrosomica
El estudio de la reacción acrosómica (RA) por medio de diferentes lectinas, ha demostrado ser un
método muy eficaz como prueba de la función espermática. Generalmente se estudia la RA espontánea
conjuntamente con la inducida por ionóforo de calcio.
Bacteriología
Esta sección del laboratorio tiene el cometido de completar los estudios diagnósticos y ofrecer una
gama más completa de determinaciones que están relacionadas con la fertilidad. Se incluyen entre
otras las determinaciones de ureaplasma urealyticum y chlamydia trachomatis, además de la
tipificación de gérmenes comunes
Estudios Inmunológicos
Mar Test
Inmunobead
inmunoglobulinas de superficie, sino su localización sobre las gametas. En este caso, el test permite
conocer la existencia de IgG, IgA e IgM, que tienen importantes implicancias funcionales.
Tanto el estudio del Mar –test como Immunobead, pueden realizarse en forma indirecta sobre moco
cervical, plasma seminal y suero sanguíneo del varón o mujer empleando en estos casos una suspensión
de espermatozoides normales.
Recuperación
Separación de espermatozoides
Se realizan también las técnicas de swim up, swim down o percoll, de acuerdo a la metodología
utilizada en los buenos laboratorios de la especialidad. La duración de las pruebas es de
aproximadamente 3 horas y las mismas consisten en seleccionar los espermatozoides traslativos
rápidos, que a su vez se capacitan en un medio de cultivo apropiado, manteniéndolos en una estufa a
37º C y en ambiente de CO2 al 5 %.
Bacteriología
Esta sección del laboratorio tiene el cometido de completar los estudios diagnósticos y ofrecer una
gama más completa de determinaciones que están relacionadas con la fertilidad. Se incluyen entre otras
las determinaciones de ureaplasma urealyticum y chlamydia trachomatis, además de la tipificación de
gérmenes comunes.