Enzimas de Restrição Enzimas de Restrição: tesouras bioquímicas
Laboratório Virtual de Biotecnologia
Introdução usadas para fragmentar o material
Em 1953, Salvador Luria e genético, deixando as extremidades Giuseppe Bertani da Universidade de das cadeias livres para poderem ser Illinois e Jean Weigle do Instituto de ligadas, em tubos de ensaio, com Tecnologia da Califórnia encontraram material genético humano (ou de evidências de um sistema imunitário qualquer espécie) abrindo um imenso primitivo em bactérias. Eles leque de possibilidades. observaram que certas estirpes da bactéria Escherichia coli eram O que são enzimas de restrição? resistentes a infecções provocadas por As enzimas de restrição, ou vários bacteriófagos (vírus que endonucleases, são enzimas infectam bactérias). O fenómeno pertencentes a um grupo especial de parecia ser uma propriedade da enzimas designadas nucleases. Este parede da bactéria que restringia o grupo corresponde ao conjunto das crescimento e a replicação de certos enzimas que genericamente quebram bacteriófagos. Em 1962, Werner Arber as ligações fosfodiéster que unem os forneceu as primeiras evidências de nucleótidos adjacentes nas moléculas que a resistência dessas bactérias se de DNA. As enzimas de restrição devia a um complexo de enzimas que designam-se endonucleases porque reconhecia selectivamente e destruía clivam o DNA em posições internas, DNA estranho à bactéria, impedindo ao contrário das exonucleases que assim que os vírus se replicassem. digerem progressivamente o DNA das Vários anos mais tarde, Werner extremidades para o centro. Arber e Stuart Linn conseguiram isolar Existem três grupos principais de extractos de E. coli que cortavam de enzimas de restrição: tipo I, tipo II e forma eficiente o DNA de tipo III. As enzimas do tipo I e III bacteriófagos. Estes extractos reconhecem sequências específicas de continham a primeira enzima de DNA mas clivam-no em locais muito restrição conhecida. Estava afastados dessas sequências de descoberta a mais poderosa reconhecimento. Além disso, estas ferramenta da Biotecnologia. enzimas necessitam de ATP para se O interesse pelas enzimas de moverem ao longo da cadeia de DNA restrição aumentou em 1973, quando entre o local de reconhecimento e o se percebeu que elas poderiam ser local de restrição. Estes dois factos 2 tornam estes dois tipos de enzimas de As enzimas de restrição do tipo II restrição pouco úteis na Biotecnologia. reconhecem sequências que Por outro lado, as enzimas de normalmente têm entre quatro e oito restrição do tipo II são ideais por duas nucleótidos de comprimento. Estas razões principais: todas clivam o DNA sequências são normalmente de forma previsível e consistente, palindrómicas, ou seja, as duas dentro ou nas imediações do local de cadeias complementares apresentam reconhecimento; e não necessitam de sequências idênticas quando lidas de ATP, sendo que utilizam o magnésio 5’ para 3’. Por exemplo, a enzima como cofactor. EcoRI reconhece a seguinte Já se isolaram enzimas de sequência: restrição do tipo II de vários 5’ GAATTC 3’ organismos. Actualmente, existem 3’ CTTAAG 5’ mais de 200 enzimas de restrição Quando a EcoRI cliva o DNA, o disponíveis comercialmente, tornando resultado são dois fragmentos com a possível cortar o DNA em mais de 100 seguinte disposição: locais de reconhecimento diferentes. 5’ G AATTC 3’ O nome das enzimas de restrição 3’ CTTAA G 5’ reflecte a sua origem. Por exemplo, a enzima EcoRI deve o seu nome ao O local de restrição, assim como a
organismo a partir do qual foi isolada sequência de reconhecimento, é
(E = Escherichia; co = coli; sempre o mesmo para cada enzima
R = estirpe RY13; I = primeira de restrição do tipo II. Estas enzimas
endonuclease identificada). Na tabela clivam o seu local de restrição de um
1 estão algumas enzimas de restrição de dois modos possíveis:
e o respectivo organismo a partir do 1) Clivam directamente no meio do
qual foram isoladas. local, originando extremidades
Organismo Nome da enzima de restrição
Bacillus amyloliquefaciens H BamHI Escherichia coli RY13 EcoRI
Escherichia coli R245 EcoRII
Haemophilus aegyptius HaeIII
Haemophilus influenzae Rd HindII
Haemophilus influenzae Rd HindIII
Providencia stuartii 164 PstI
Tabela 1 – Alguns exemplos de enzimas de restrição e respectivo organismo de origem.
3 abruptas. Como exemplo deste tipo para uma determinada enzima do que de extremidades, pode-se referir o uma molécula de DNA que contenha caso da clivagem originada pela apenas algumas centenas de pares de enzima de restrição HaeIII: bases. A digestão de DNA por enzimas de 5’ GG CC 3’ restrição é um processo simples. 3’ CC GG 5’ Basta colocar o DNA em contacto com 2) Clivam num local que não o centro a enzima à sua temperatura ideal do local de restrição, originando (geralmente 37ºC) em meio de extremidades de cadeia simples reacção e a enzima inicia o processo complementares, chamadas coesivas. de digestão clivando o DNA em vários Como exemplo deste tipo de fragmentos. extremidades, pode-se referir o caso da clivagem originada pela enzima de Aplicações das enzimas de restrição EcoRI: restrição 5’ G AATTC 3’ As enzimas de restrição foram 3’ CTTAA G 5’ inicialmente utilizadas para criar
As extremidades coesivas são muito moléculas de DNA recombinante, uma
importantes na clonagem de genes. vez que certas enzimas clivam o DNA
Em geral, quanto maior for a deixando as extremidades coesivas.
molécula de DNA, maior será a Estas moléculas com extremidades
probabilidade de que ocorra um coesivas são posteriormente
determinado local de restrição. A acopladas com uma sequência de DNA
probabilidade de clivagem de uma de outra origem também digerida com
molécula de DNA é inversamente a mesma enzima de restrição, ou
proporcional ao tamanho do local de seja, com as mesmas extremidades
reconhecimento da enzima. Assim, coesivas, por intermédio de uma DNA
uma enzima que reconheça quatro ligase, formando-se uma nova
nucleótidos clivará uma determinada molécula de DNA recombinante.
molécula de DNA uma vez em cada Estas enzimas são também
256 pares de bases, enquanto que utilizadas na análise de cromossomas,
uma enzima que reconheça cinco através da realização de mapas de
pares de bases clivará a mesma restrição; sequenciação de DNA;
molécula uma vez em cada 1024 isolamento de genes; e investigação
pares de bases. O DNA humano, que forense.
contém mais de três biliões de pares Têm ainda um papel importante
de bases, terá mais locais de restrição no diagnóstico de certas doenças
genéticas onde uma mutação altera o
4 local de restrição de uma enzima, sendo possível distinguir entre genes normais e genes mutados pelo número de fragmentos obtidos com essa enzima de restrição. Este tipo de análise designa-se análise de polimorfismos de comprimento de fragmentos de restrição (restriction fragment length polymorphisms – RFLP’s).
Questões de análise
1 – Descreva o modo de actuação de
uma enzima de restrição.
2 – Explique por que razão as
endonucleases do tipo I e III não são utilizadas em Biotecnologia.
3 – Indique o tipo de extremidades
que se podem formar numa molécula de DNA após a clivagem por uma enzima de restrição.
