Você está na página 1de 6

MÓDULO

Enzimas de
Restrição
Enzimas de Restrição: tesouras bioquímicas

Laboratório Virtual de Biotecnologia

Introdução usadas para fragmentar o material


Em 1953, Salvador Luria e genético, deixando as extremidades
Giuseppe Bertani da Universidade de das cadeias livres para poderem ser
Illinois e Jean Weigle do Instituto de ligadas, em tubos de ensaio, com
Tecnologia da Califórnia encontraram material genético humano (ou de
evidências de um sistema imunitário qualquer espécie) abrindo um imenso
primitivo em bactérias. Eles leque de possibilidades.
observaram que certas estirpes da
bactéria Escherichia coli eram
O que são enzimas de restrição?
resistentes a infecções provocadas por
As enzimas de restrição, ou
vários bacteriófagos (vírus que
endonucleases, são enzimas
infectam bactérias). O fenómeno
pertencentes a um grupo especial de
parecia ser uma propriedade da
enzimas designadas nucleases. Este
parede da bactéria que restringia o
grupo corresponde ao conjunto das
crescimento e a replicação de certos
enzimas que genericamente quebram
bacteriófagos. Em 1962, Werner Arber
as ligações fosfodiéster que unem os
forneceu as primeiras evidências de
nucleótidos adjacentes nas moléculas
que a resistência dessas bactérias se
de DNA. As enzimas de restrição
devia a um complexo de enzimas que
designam-se endonucleases porque
reconhecia selectivamente e destruía
clivam o DNA em posições internas,
DNA estranho à bactéria, impedindo
ao contrário das exonucleases que
assim que os vírus se replicassem.
digerem progressivamente o DNA das
Vários anos mais tarde, Werner
extremidades para o centro.
Arber e Stuart Linn conseguiram isolar
Existem três grupos principais de
extractos de E. coli que cortavam de
enzimas de restrição: tipo I, tipo II e
forma eficiente o DNA de
tipo III. As enzimas do tipo I e III
bacteriófagos. Estes extractos
reconhecem sequências específicas de
continham a primeira enzima de
DNA mas clivam-no em locais muito
restrição conhecida. Estava
afastados dessas sequências de
descoberta a mais poderosa
reconhecimento. Além disso, estas
ferramenta da Biotecnologia.
enzimas necessitam de ATP para se
O interesse pelas enzimas de
moverem ao longo da cadeia de DNA
restrição aumentou em 1973, quando
entre o local de reconhecimento e o
se percebeu que elas poderiam ser
local de restrição. Estes dois factos
2
tornam estes dois tipos de enzimas de As enzimas de restrição do tipo II
restrição pouco úteis na Biotecnologia. reconhecem sequências que
Por outro lado, as enzimas de normalmente têm entre quatro e oito
restrição do tipo II são ideais por duas nucleótidos de comprimento. Estas
razões principais: todas clivam o DNA sequências são normalmente
de forma previsível e consistente, palindrómicas, ou seja, as duas
dentro ou nas imediações do local de cadeias complementares apresentam
reconhecimento; e não necessitam de sequências idênticas quando lidas de
ATP, sendo que utilizam o magnésio 5’ para 3’. Por exemplo, a enzima
como cofactor. EcoRI reconhece a seguinte
Já se isolaram enzimas de sequência:
restrição do tipo II de vários 5’ GAATTC 3’
organismos. Actualmente, existem 3’ CTTAAG 5’
mais de 200 enzimas de restrição
Quando a EcoRI cliva o DNA, o
disponíveis comercialmente, tornando
resultado são dois fragmentos com a
possível cortar o DNA em mais de 100
seguinte disposição:
locais de reconhecimento diferentes.
5’ G AATTC 3’
O nome das enzimas de restrição
3’ CTTAA G 5’
reflecte a sua origem. Por exemplo, a
enzima EcoRI deve o seu nome ao O local de restrição, assim como a

organismo a partir do qual foi isolada sequência de reconhecimento, é

(E = Escherichia; co = coli; sempre o mesmo para cada enzima

R = estirpe RY13; I = primeira de restrição do tipo II. Estas enzimas

endonuclease identificada). Na tabela clivam o seu local de restrição de um

1 estão algumas enzimas de restrição de dois modos possíveis:

e o respectivo organismo a partir do 1) Clivam directamente no meio do

qual foram isoladas. local, originando extremidades

Organismo Nome da enzima de restrição


Bacillus amyloliquefaciens H BamHI
Escherichia coli RY13 EcoRI

Escherichia coli R245 EcoRII


Haemophilus aegyptius HaeIII

Haemophilus influenzae Rd HindII


Haemophilus influenzae Rd HindIII

Providencia stuartii 164 PstI

Tabela 1 – Alguns exemplos de enzimas de restrição e respectivo organismo de origem.

3
abruptas. Como exemplo deste tipo para uma determinada enzima do que
de extremidades, pode-se referir o uma molécula de DNA que contenha
caso da clivagem originada pela apenas algumas centenas de pares de
enzima de restrição HaeIII: bases.
A digestão de DNA por enzimas de
5’ GG CC 3’
restrição é um processo simples.
3’ CC GG 5’
Basta colocar o DNA em contacto com
2) Clivam num local que não o centro
a enzima à sua temperatura ideal
do local de restrição, originando
(geralmente 37ºC) em meio de
extremidades de cadeia simples
reacção e a enzima inicia o processo
complementares, chamadas coesivas.
de digestão clivando o DNA em vários
Como exemplo deste tipo de
fragmentos.
extremidades, pode-se referir o caso
da clivagem originada pela enzima de
Aplicações das enzimas de
restrição EcoRI:
restrição
5’ G AATTC 3’ As enzimas de restrição foram
3’ CTTAA G 5’ inicialmente utilizadas para criar

As extremidades coesivas são muito moléculas de DNA recombinante, uma

importantes na clonagem de genes. vez que certas enzimas clivam o DNA

Em geral, quanto maior for a deixando as extremidades coesivas.

molécula de DNA, maior será a Estas moléculas com extremidades

probabilidade de que ocorra um coesivas são posteriormente

determinado local de restrição. A acopladas com uma sequência de DNA

probabilidade de clivagem de uma de outra origem também digerida com

molécula de DNA é inversamente a mesma enzima de restrição, ou

proporcional ao tamanho do local de seja, com as mesmas extremidades

reconhecimento da enzima. Assim, coesivas, por intermédio de uma DNA

uma enzima que reconheça quatro ligase, formando-se uma nova

nucleótidos clivará uma determinada molécula de DNA recombinante.

molécula de DNA uma vez em cada Estas enzimas são também

256 pares de bases, enquanto que utilizadas na análise de cromossomas,

uma enzima que reconheça cinco através da realização de mapas de

pares de bases clivará a mesma restrição; sequenciação de DNA;

molécula uma vez em cada 1024 isolamento de genes; e investigação

pares de bases. O DNA humano, que forense.

contém mais de três biliões de pares Têm ainda um papel importante

de bases, terá mais locais de restrição no diagnóstico de certas doenças


genéticas onde uma mutação altera o

4
local de restrição de uma enzima,
sendo possível distinguir entre genes
normais e genes mutados pelo
número de fragmentos obtidos com
essa enzima de restrição. Este tipo de
análise designa-se análise de
polimorfismos de comprimento de
fragmentos de restrição (restriction
fragment length polymorphisms –
RFLP’s).

Questões de análise

1 – Descreva o modo de actuação de


uma enzima de restrição.

2 – Explique por que razão as


endonucleases do tipo I e III não são
utilizadas em Biotecnologia.

3 – Indique o tipo de extremidades


que se podem formar numa molécula
de DNA após a clivagem por uma
enzima de restrição.

4 – Indique três aplicações das


enzimas de restrição.

Você também pode gostar